一種極性糖脂提取物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在于提供棘皮動物極性糖脂的提取物及其應(yīng)用，用于制備可提高、改善神經(jīng)分化的食品藥品，具有促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育或預(yù)防神經(jīng)性疾病的效果。本發(fā)明提取純化了海參、海膽、海星極性糖脂，并將其作用于神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果表明三種棘皮動物極性糖脂提取物可以明顯提高神經(jīng)細(xì)胞分化率，對促進(jìn)、改善神經(jīng)分化具有顯著的效果。因此，可將棘皮動物極性糖脂提取物作為一種組分或輔料配合制成產(chǎn)品。本發(fā)明中棘皮動物極性糖脂提取物的制備方法成本低，操作方法較為簡單，所得棘皮動物極性糖脂提取物經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育的效果，可用于開發(fā)安全有效的用以提高未成熟個體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，以及預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的食品或藥品。
【專利說明】
一種極性糖脂提取物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于活性物質(zhì)篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種極性糖脂提取物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長與分化是人的一種重要生理現(xiàn)象，不僅與幼兒期智力發(fā)展有關(guān)，且與老年易發(fā)的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默綜合癥(AD)、帕金森綜合癥(PD)等密切相關(guān)。神經(jīng)分化以軸突形成為主要特征，包括神經(jīng)突(包括樹突和軸突)起始、延伸、分支以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，這對于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)元損傷后再生至關(guān)重要。若在此過程中發(fā)生故障，會引起各種疾病和病癥，包括智力低下、神經(jīng)退行性疾病等。因此，正常的神經(jīng)生長、分化不僅人類身體健康的關(guān)鍵因素，同時對于人類推動的社會發(fā)展也有十分重要的意義。
[0003]在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，極性糖脂的含量及種類變化與神經(jīng)組織形態(tài)發(fā)育具有相關(guān)性。以神經(jīng)節(jié)苷脂(gangl1sides’GLS)為例，發(fā)育早期神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)一些結(jié)構(gòu)較簡單的神經(jīng)節(jié)苷脂，如單糖基神經(jīng)節(jié)苷脂GD3和GM3。隨著突起和突觸的生長，四糖基神經(jīng)節(jié)苷脂GMl和GDl含量迅速增加，最終在成熟體內(nèi)，神經(jīng)節(jié)苷脂的種類和含量達(dá)到穩(wěn)定。無論在體外培養(yǎng)的原代海馬、背根節(jié)神經(jīng)元(DRG)原代培養(yǎng)還是PC12細(xì)胞中，經(jīng)體外經(jīng)誘導(dǎo)分化，均呈現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂含量顯著增高的現(xiàn)象。此外有研究發(fā)現(xiàn)，向PC12細(xì)胞中加入外源性神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著增強(qiáng)神經(jīng)生長因子(NGF)功能，促進(jìn)神經(jīng)再生。這不僅預(yù)示了外源性極性糖脂可促進(jìn)、改善神經(jīng)分化以及再生的可能性，也驅(qū)使學(xué)者們不斷致力于研究神經(jīng)分化通路，神經(jīng)營養(yǎng)活性物質(zhì)的作用機(jī)制，有利于更好地開發(fā)具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的食物、藥物。
[0004]棘皮動物(Echinodermata)是一類生活在海底、身體呈輻射對稱型的無脊椎動物的統(tǒng)稱，包括蛇尾綱、海百合綱、海膽綱、海星綱和海參綱等5個綱。其中海參、海膽不僅是健康有益的食物，且富含多種生理活性物質(zhì)，所以一直被當(dāng)作名貴的滋補(bǔ)食品或藥材;而海星基本無食用價值，但體內(nèi)卻含有多種具抗菌、抗腫瘤、降壓的活性物質(zhì)。此外，由于地域的局限性，海洋活性物質(zhì)的發(fā)展較慢，雖近年來不斷有研究報道了從棘皮動物體內(nèi)分離得到的活性物質(zhì)具有提高免疫力、抑癌、降血脂、降血壓、神經(jīng)保護(hù)等作用，而關(guān)于其在神經(jīng)生長、神經(jīng)分化的作用，還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

:
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在于提供一種從棘皮動物中獲得的極性糖脂提取物及其應(yīng)用，可用于制備促進(jìn)、改善神經(jīng)分化，預(yù)防神經(jīng)類疾病的食品或藥品。
[0006]本發(fā)明中首先提供極性糖脂提取物，其具體制備方法如下:
[0007]I)取棘皮動物可食部分，凍干研磨后篩分獲得干粉；
[0008]2)取樣品干粉，加入氯仿和甲醇混合液浸提(1:1?5，v/v)，離心獲得上清液；
[0009]3)將浸提液加水渦旋振蕩經(jīng)水萃取，離心收集上層甲醇-水相，并向下層氯仿溶液中加入KCl溶液和甲醇(1:1?6，v/v)再次萃取，合并上層溶液。將其經(jīng)活化的CS固相萃取柱萃取，甲醇洗脫，收集洗脫液獲得棘皮動物脂質(zhì)粗提物。
[0010]將洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析，展開劑為氯仿-甲醇-水(10?20:2?6:1，v/v)，收集Rf值為0.8?0.9的條帶，將條帶濃縮得到樣品粉末；
[0011]4)將步驟3)得到的樣品粉末溶于氯仿-甲醇-水(6?15:3?10:1，v/v)，進(jìn)行離子交換柱層析;然后經(jīng)含有0.1?1.0mo 1/L乙酸錢的氯仿-甲醇-水(1:1?2:3?10，v/v)溶液線性洗脫，洗脫液濃縮后得到最終的棘皮動物極性糖脂成分。
[0012]本發(fā)明的提供的棘皮動物極性糖脂提取物用于制備用于促進(jìn)、改善神經(jīng)分化，預(yù)防神經(jīng)類疾病的制品。
[0013]所述的制品，為食品或藥物，所述藥物為口服給藥制劑或腸胃外給藥制劑，包括粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、腸溶衣片劑、膠囊劑等。
[0014]本發(fā)明的棘皮動物極性糖脂提取物的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棘皮動物極性糖脂提取物可明顯提高神經(jīng)細(xì)胞分化率，增加神經(jīng)分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，即對促進(jìn)、改善神經(jīng)分化具有顯著的效果。可將棘皮動物脂質(zhì)提取物作為一種組分或輔料配合制成產(chǎn)品。本發(fā)明中棘皮動物脂質(zhì)提取物的制備方法成本低，操作方法簡單，所得棘皮動物脂質(zhì)提取物經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好的促進(jìn)、改善神經(jīng)分化的效果，可用于開發(fā)安全、有效改善幼兒神經(jīng)發(fā)育，預(yù)防老年易發(fā)神經(jīng)退行性疾病的食品或藥品。
【附圖說明】
[0015]圖1:本發(fā)明實(shí)施例海洋棘皮動物極性糖脂提取物對NGF介導(dǎo)的PCl2細(xì)胞分化的影響。正常對照組細(xì)胞幾乎不分化，添加了 10ng/mL NGF的模型對照組分化率接近50%，添加了 50yg/mL海參、海膽、海星極性糖脂提取物的實(shí)驗(yàn)組相比對照組，PC12細(xì)胞分化率分別提高了41%、36.3%、30.3%，具有極顯著性差異(P〈0.01)，且與牛腦GMl對比，具有更好的活性效果，而未經(jīng)純化的海洋棘皮動物脂質(zhì)粗提物未能顯著提高分化率(P>0.05)。表明，提取于海洋棘皮動物的脂質(zhì)粗提物，經(jīng)純化后得到的極性糖脂提取物，可顯著提高實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞的分化率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]
【申請人】通過對棘皮動物極性糖脂提取物的檢測，最后確定了其具有促進(jìn)、改善神經(jīng)分化有效成分的制備方法，排除了棘皮動物中其它物質(zhì)對活性效果的干擾，進(jìn)而促成了本發(fā)明。
[0017]以下采用實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0018]實(shí)施例1:海參脂質(zhì)粗提取物的制備
[0019]第一步，取去除內(nèi)臟的海參，-400C凍干，研磨后篩分獲得干粉。
[0020]第二步，稱取樣品粉末20g，氯仿/甲醇(l:2，v/v)浸提一次，渦旋振蕩Imin后靜置lOmin，離心收集上層提取液;殘?jiān)寐确?甲醇(3:1，ν/ν)后重復(fù)浸提2?3次，合并兩次上清液經(jīng)過濾獲得浸提液。
[0021 ]第三步，將浸提液加水渦旋振蕩，充分萃取后，離心收集上層甲醇-水相；向下層氯仿溶液中加入0.0lmol/L KCl溶液和甲醇(1:3，v/v)再次萃取，合并上層溶液。然后上樣于活化的CS固相萃取柱，甲醇洗脫，將洗脫液旋蒸至干，獲得海參脂質(zhì)粗提物。
[0022]實(shí)施例2:海參極性糖脂提取物的制備
[0023 ]第一步，取海參可食部分，-40 °C凍干，研磨后篩分獲得干粉；
[0024]第二步，稱取樣品粉末10g，氯仿/甲醇(1:1，v/v)浸提一次，渦旋振蕩Imin后靜置1min;離心收集上層提取液，殘?jiān)寐确?甲醇(1:1，v/v)后重復(fù)浸提2?3次，合并兩次上清液經(jīng)過濾獲得浸提液；
[0025]第三步，將浸提液加水渦旋振蕩，充分萃取后，離心收集上層甲醇-水相；向下層氯仿溶液中加入0.0lmol/L KCl溶液和甲醇(1:1，v/v)再次萃取，合并上層溶液。然后上樣于活化的CS固相萃取柱，甲醇洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析(TLC)，其中展開劑為氯仿/甲醇/水(10:2:1, v/v)。將Rf值為0.8?0.9的條帶樣品濃縮獲得樣品粉末。
[0026]第四步，將樣品粉末溶于適量氯仿-甲醇-水(6:3:1，v/v)溶解，進(jìn)行陰離子交換柱層析;然后經(jīng)氯仿-甲醇-水(1:1:3，v/v)線性洗脫，收集洗脫液，濃縮可得到最終的海參極性糖脂10.13mg。
[0027]實(shí)施例3:海膽極性糖脂提取物的制備
[0028]第一步，取海膽的可食部分，-40°C凍干，研磨后篩分獲得干粉；
[0029]第二步，稱取樣品粉末40g，氯仿/甲醇(l:2，v/v)浸提一次，渦旋振蕩Imin后靜置1min;離心收集上層提取液，殘?jiān)寐确?甲醇(3:1，ν/ν)后重復(fù)浸提2?3次，合并兩次上清液經(jīng)過濾獲得浸提液；
[0030]第三步，將浸提液加水渦旋振蕩，充分萃取后，離心收集上層甲醇-水相；向下層氯仿溶液中加入0.0lmol/L KCl溶液和甲醇(1:3，v/v)再次萃取，合并上層溶液。然后上樣于活化的CS固相萃取柱，甲醇洗脫，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析(TLC)，其中展開劑為氯仿/甲醇/水(15:3:1, v/v)。將Rf值為0.8?0.9的條帶樣品濃縮獲得樣品粉末。
[0031]第四步，將樣品粉末中溶于適量氯仿-甲醇-水(10:5:1，v/v)溶解，進(jìn)行陰離子交換柱層析;然后經(jīng)氯仿-甲醇-水(1:2:8，v/v)線性洗脫，收集洗脫液，濃縮可得到最終的海膽極性糖脂38.02mg。
[0032]實(shí)施例4:海星極性糖脂提取物的制備
[0033]第一步，取海星的可食部分，-40°C凍干，研磨后篩分獲得干粉；
[0034]第二步，稱取樣品粉末40g，氯仿/甲醇(l:5，v/v)浸提一次，渦旋振蕩Imin后靜置1min;離心收集上層提取液，殘?jiān)寐确?甲醇(5:1，ν/ν)后重復(fù)浸提2?3次，合并兩次上清液經(jīng)過濾獲得浸提液；
[0035]第三步，將浸提液加水渦旋振蕩，充分萃取后，離心收集上層甲醇-水相；向下層氯仿溶液中加入0.0lmol/L KCl溶液和甲醇(1:6，v/v)再次萃取，合并上層溶液。然后上樣于活化的CS固相萃取柱，甲醇洗脫，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析(TLC)，其中展開劑為氯仿/甲醇/7K(20:6:1, v/v)。將Rf值為0.8?0.9的條帶樣品濃縮獲得樣品粉末。
[0036]第四步，將樣品粉末中溶于適量氯仿-甲醇-水(15:10:1，v/v)溶解，進(jìn)行陰離子交換柱層析;然后經(jīng)氯仿-甲醇-水(1:4:10，v/v)線性洗脫，收集洗脫液，濃縮可得到最終的海星極性糖脂31.13mg。
[0037]實(shí)施例5:棘皮動物極性糖脂提取物促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的作用
[0038]一、材料和方法
[0039](I)細(xì)胞模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組
[0040]常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞至對數(shù)生長期，適宜密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板。待24h細(xì)胞貼壁后加入含不同濃度NGF(0、5、10和20ng/L)的2%FBS-RPMI培養(yǎng)基，持續(xù)孵育144h，每隔24h拍照并統(tǒng)計細(xì)胞的分化率。將細(xì)胞可正常存活、分化率達(dá)50 %時的NGF濃度及作用時間作為模型組條件。
[0041 ] (2)細(xì)胞分化率測定
[0042]細(xì)胞培養(yǎng)條件和布板方法同(I)，待24h細(xì)胞貼壁后，分為模型對照組(10ng/mLNGF)、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別添加50yg/mL的實(shí)施例1得到的海參脂質(zhì)粗提物以及實(shí)施例2中的海參極性糖脂、實(shí)施例3中的海膽極性糖脂、實(shí)施例4中的海星極性糖脂(均含10ng/mLNGF)，持續(xù)孵育6天后進(jìn)行拍照，并對細(xì)胞分化率、軸突長度、軸突數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計。
[0043](3)免疫熒光測定突觸素和生長蛋白GAP-43的表達(dá)
[0044]細(xì)胞布板及培養(yǎng)方法同(I)。對照模型組和實(shí)驗(yàn)組孵育24h后，經(jīng)常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)法處理，其中抗體依照說明書加入對應(yīng)的一抗溶液(Synaptophysin和GAP-43)，焚光二抗孵育后，PBS緩沖液充分洗滌，DAPI復(fù)染20min。最后激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。
[0045](4)RT_qPCR法測定突觸素和生長蛋白GAP-43的表達(dá)
[0046]細(xì)胞布板及培養(yǎng)方法同(I)，添加受試物孵育24h后，采用Trizol法提取PC12細(xì)胞總RNA。計算RNA的純度和含量，并檢測RNA的完整性。取Iyg RNA在25yL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成cDNA，4°C下保存待用。然后按照SYBR Green I Master Mix說明書用RT-qPCR檢測各目的基因mRNA的表達(dá)量。各個基因的mRNA表達(dá)量以β-actin mRNA表達(dá)量作為內(nèi)參校正，并將對照模型組定為100%。
[0047]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0048]NGF可維持低血清狀態(tài)下PC12細(xì)胞的存活，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化成具有神經(jīng)特性的細(xì)胞。確定NGF誘導(dǎo)分化細(xì)胞模型為:10ng/mL NGF、孵育6天。實(shí)施例2、3、4中純化制得的棘皮動物極性糖脂可明顯促進(jìn)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化，海參、海膽、海星極性糖脂可分別提高細(xì)胞分化率61%、47%、30%，軸突長度大于胞體4倍的細(xì)胞均顯著增加(？〈0.05)，而實(shí)施例1中的海參脂質(zhì)粗提物未明顯促進(jìn)細(xì)胞分化(P>0.05)。此外，添加了棘皮動物極性糖脂的實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，突觸素和生長蛋白GAP-43的mRNA水平均顯著上升(P〈0.01)。綜合表觀指標(biāo)，表明經(jīng)純化的棘皮動物極性糖脂提取物(實(shí)施例2、3、4)相比于棘皮動物脂質(zhì)粗提物(實(shí)施例1)、模型組對促進(jìn)、改善神經(jīng)分化具有更加顯著的效果。
[0049]實(shí)施例6:棘皮動物極性糖脂提取物有效組分制劑
[0050]分別取實(shí)施例2、3、4中的海參、海膽、海星極性糖脂提取物15mg，微粉硅膠20g，糊精400g，淀粉580g，上述成分經(jīng)攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅畛錇镮g/顆的膠囊，可制成膠囊1000顆。其中每顆膠囊含有效成分棘皮動物極性糖脂提取物0.015mg。
[0051 ]實(shí)施例7:棘皮動物極性糖脂提取物有效組分制劑
[0052]分別取實(shí)施例2、3、4中的棘皮動物極性糖脂提取物20mg，藥用淀粉100g，混合均勻后，用適量乙醇制粒，整粒，壓片得到片劑，每片0.2g。其中每片含棘皮動物極性糖脂提取物0.004mgo
[0053]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種極性糖脂提取物，其特征在于，所述的棘皮動物極性糖脂提取物的制備方法如下: 1)取棘皮動物可食部位，研磨后獲得粉碎后的樣品； 2)取粉碎后的樣品，加入氯仿和甲醇混合液進(jìn)行浸提，離心分離殘?jiān)蜕锨逡海锨逡航?jīng)過濾獲得浸提液； 3)將浸提液經(jīng)水萃取，離心分離上層甲醇-水相溶液和下層氯仿溶液;將甲醇-水相溶液經(jīng)活化的CS固相萃取柱進(jìn)行萃取，用甲醇洗脫，收集洗脫液； 將洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析，展開劑為氯仿-甲醇-水溶液，收集Rf值為0.8?0.9的條帶，將條帶濃縮得到樣品粉末； 4)將步驟3)得到的樣品粉末溶于氯仿-甲醇-水溶液，進(jìn)行離子交換柱層析;然后經(jīng)含有一定濃度乙酸銨的氯仿-甲醇-水溶液進(jìn)行線性洗脫，洗脫液濃縮后得到最終的棘皮動物極性糖脂成分。2.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟2)中的氯仿和甲醇混合液，其中氯仿和甲醇的體積比為1:1?5。3.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟2)中的上清液還包含有用氯仿和甲醇溶液對殘?jiān)俅谓岖@得的浸提液。4.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟3)中的甲醇-水相溶液還包含有向下層氯仿溶液中加入0.0lmol/L的KCl溶液和甲醇進(jìn)行萃取獲得的上層溶液。5.如權(quán)利要求4所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的KCl溶液和甲醇的體積比為1:1?6。6.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟3)的展開劑中氯仿、甲醇、水的體積比為10?20:2?6:1。7.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟4)的氯仿-甲醇-水溶液中，氯仿、甲醇、水的體積比為6?15:3?1:1。8.如權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物，其特征在于，所述的步驟4)中含有乙酸銨的氯仿-甲醇-水溶液，其中乙酸銨濃度為0.1?1.0moI/L，氯仿、甲醇、水的體積比為1:1 ?4:3 ?109.權(quán)利要求1所述的棘皮動物極性糖脂提取物在制備用于促進(jìn)或改善神經(jīng)分化的制品中的應(yīng)用。10.—種用于促進(jìn)或改善神經(jīng)分化的制品，其特征在于，所述的制品包含有權(quán)利要求所述的棘皮動物極性糖脂提取物。
【文檔編號】A61P25/00GK105920046SQ201610404534
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】徐杰, 王曉旭, 叢培旭, 薛長湖, 李兆杰, 曹建
【申請人】中國海洋大學(xué)