專利名稱：含有包含極性和非極性部分的類脂的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及化合物和脂質(zhì)體以及所述組合物、化合物或脂質(zhì)體在治療，尤其是基因治療(特別是基因遞送)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療的一方面涉及將外源性核酸(例如DNA)引入細胞中，這樣其表達的蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生所需治療功能1a。
這類治療的實例包括插入TK、TSG或ILG基因用以治療癌癥；插入CFTR基因用以治療囊性纖維化；插入NGF、TH或LDL基團用以治療神經(jīng)變性疾病和心血管疾??；插入IL-1拮抗劑基因用以治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；插入HIV抗原和TK基團用以治療AIDS和CMV感染；插入抗原和細胞因子以用作疫苗；以及插入β-球蛋白用以治療血紅蛋白病癥，例如地中海貧血。
目前許多基因治療使用腺病毒基因載體，例如Ad3或Ad5-或者其它基因載體。但它們的使用存在著嚴重的問題2a。這促進了較低危險的非病毒基因轉(zhuǎn)染方法的開發(fā)3a。
非病毒載體也是本領(lǐng)域已知的。本質(zhì)上，非病毒基因治療需要能模仿病毒而且是非病原性的載體?；诤怂釒в胸撾姾?，已開發(fā)了兩類陽離子性非病毒載體(這兩種都用于縮聚核酸)脂質(zhì)體和聚合物。它們與DNA得到的復(fù)合物(分別稱為脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplexes)和聚合物復(fù)合物(polyplexes))仍是陽離子性的，因此有助于陰離子細胞表面的胞飲作用(細胞攝取)。一旦內(nèi)在化，復(fù)合物則會遭受附圖1所示的三種命運。
較大潛力的非病毒轉(zhuǎn)染體系涉及使用陽離子性脂質(zhì)體4a。在這一點上，已經(jīng)使用陽離子脂質(zhì)體將DNA4a、mRNA5a、反義寡核苷酸6a、蛋白質(zhì)7a和藥物8a轉(zhuǎn)染到細胞中，所述陽離子脂質(zhì)體通常由中性磷脂和陽離子類脂組成。多種陽離子脂質(zhì)體有市售4a，9a，并且最近合成了許多新的陽離子類脂10a。這些脂質(zhì)體的功效已通過體外4a和體內(nèi)11a試驗得到證明。
脂質(zhì)體通過類脂分子自我組配形成。陽離子脂質(zhì)體常使用陽離子類脂和中性“助劑”類脂的混合物配制。DOPC(1)和DOPE(2)就是這樣兩種中性助劑類脂，之所以對它們這樣稱謂，是因為它們趨于提高陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染能力，還可幫助陽離子類脂形成脂質(zhì)體。此外，在所有的助劑類脂中，2是最常用的并且已經(jīng)清楚地證明了其構(gòu)成的脂質(zhì)復(fù)合物增進轉(zhuǎn)染(基因遞送和表達)，這歸因于其特殊的融合特性2b。相反，DODAP(3)(于pH 4.0下)2C和DOTAP(4)都是陽離子類脂。這些結(jié)構(gòu)通過靜電與DNA結(jié)合。
一種最常用的陽離子脂質(zhì)體系由中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺(常稱為“DOPE”)和陽離子類脂3β-[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽甾醇(常稱為“DC-Chol”)12a組成。
多種已經(jīng)進行臨床試驗的制劑證明了脂質(zhì)體作為藥物傳遞物質(zhì)的價值6b，它們可有效地將待傳遞的藥物分子包囊到它們的內(nèi)水層中。陽離子脂質(zhì)體通過靜電與質(zhì)粒DNA相互作用，但本身不包囊核酸。如此得到的顆粒(被稱為脂質(zhì)復(fù)合物(LDs))能很好地在體內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。
盡管已知的陽離子脂質(zhì)體具有一定的功效，但仍需要進一步優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體在人類基因治療中的基因轉(zhuǎn)染效率10a。隨著人類基因組工程接近完成，預(yù)期被描述為基因治療的用于治療目的的基因應(yīng)用將推動醫(yī)學(xué)革命。本文中，雖然不如病毒技術(shù)有效，但科學(xué)委員會逐漸認識到，非病毒傳遞是人類應(yīng)用的最安全選擇。
隨著包括許多不同現(xiàn)有技術(shù)因素的復(fù)合大分子結(jié)構(gòu)(病毒蛋白質(zhì)或肽、脂質(zhì)體、聚合物、靶向策略和神秘特性)的出現(xiàn)，這一領(lǐng)域在近十年得到了顯著的發(fā)展。
WO 01/48233教導(dǎo)了一種基于三元復(fù)合物的體系，該復(fù)合物由病毒核心肽Mu、質(zhì)粒DNA和陽離子脂質(zhì)體(LMD)組成。該平臺技術(shù)在體外獲得了良好的成功，預(yù)示了體內(nèi)前景。但是對于所有現(xiàn)存非病毒技術(shù)，仍需進一步開發(fā)以在體內(nèi)獲得治療作用。
為此，制劑必需在生物體液(血漿、肺粘液)中實現(xiàn)顆粒穩(wěn)定性并仍保持有效的轉(zhuǎn)染能力。
這種要求是所有現(xiàn)存技術(shù)的主要障礙之一。目前的穩(wěn)定制劑[1，2]僅沒有實現(xiàn)什么轉(zhuǎn)染，大多數(shù)現(xiàn)有有效轉(zhuǎn)染物質(zhì)的應(yīng)用范圍由于這種不穩(wěn)定性而受到了極大的限制[3-7]。
給藥后(系統(tǒng)應(yīng)用后的血液或者肺局部給藥后的粘液)，帶電荷的復(fù)合物與鹽和生物大分子接觸，導(dǎo)致強力膠態(tài)聚集并在它們的表面吸收生物活性物質(zhì)(調(diào)理素)[8-11]?；蜉d體發(fā)生巨變，這種變化可包括沉淀、導(dǎo)致顆粒被巨噬細胞清除的蛋白質(zhì)結(jié)合和導(dǎo)致其破壞的表面混亂。應(yīng)用最廣泛的穩(wěn)定制劑包括表面接枝的無毒聚乙二醇(PEG)鏈[12，13]、對于大多數(shù)大分子具有較大排除(exclusion)體積的中性聚醚。據(jù)報道，偏巧顯示出所需穩(wěn)定性的制劑喪失了它們的基因轉(zhuǎn)染能力，這可能是由于它們降低了對細胞的非特異性親和性或者失去了它們必需的核內(nèi)體破裂特性[14，15]。
另一種避免生物體液對脂質(zhì)復(fù)合物的破壞作用的方法是嘗試模仿性質(zhì)并用多糖覆蓋類脂雙層的表面[16，17]。
1991年報道了十八碳-9-炔酸(6)顯示出DNA結(jié)合特性8b。十八碳-9-炔酸的表觀DNA解離常數(shù)為1.8mM；它抑制拓撲異構(gòu)酶(topisomerase)I-介導(dǎo)的DNA篩選結(jié)合，但不抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I介導(dǎo)的超螺旋質(zhì)粒DNA的松弛。此外，脂肪酸對DNA聚合酶α具有弱抑制作用。
十八碳-9-炔酸。
炔屬脂肪酸可以選擇性地抑制血小板脂氧合酶(LOX)。例如十八碳-9，12-二炔酸使Fe(III)-LOX不可逆地失活9b。
十八碳-9，12-二炔酸。
細胞色素P4504A4(CYP4A4)是一種與肺有關(guān)的細胞色素P450，其將前列腺素和花生四烯酸代謝為它們的ω-羥基化產(chǎn)物。前列腺素在調(diào)節(jié)生殖、血管和炎癥系統(tǒng)中起著重要作用。據(jù)顯示，十八碳-17-炔酸是CYP4A4的底物結(jié)合帶的有效抑制劑10b。
十八碳-17-炔酸十八碳-5-炔酸(塔里酸)抑制C.tomentosicollis卵的孵化11b。
十一碳-10-炔酸，抑制細胞色素P4504A1抑制劑，抑制大鼠肝微粒體中乙醇胺特異性的磷脂堿交換反應(yīng)12b。
十一碳-10-炔酸多種炔屬脂肪酸，例如十八碳-8，10，12-三炔酸已顯示出是環(huán)氧合酶的強抑制劑和5-脂氧合酶的弱抑制劑13b。
十八碳-8，10，12-三炔酸炔屬脂肪酸二十碳-5，8，11-三炔酸抑制哺乳動物肝谷光甘肽S-轉(zhuǎn)染酶14b。
二十碳-5，8，11-三炔酸結(jié)合熒光和/或金屬-螯合類脂的脂質(zhì)體提供了作為細胞生物世界中的探針的潛在應(yīng)用，例如在非病毒基因治療中監(jiān)測包囊DNA的發(fā)展。使用亞乙基二胺四乙酸(EDTA)端基已合成出了共軛的二炔基類脂，該類脂能螯合鑭離子15b。這些類脂(各具有兩個共軛的炔屬脂肪?；?如二炔基))已成功地結(jié)合到脂質(zhì)體中，然后使其聚合。熒光研究表明，二炔基官能團(未聚合的類脂)和共軛的烯烴(聚合后)可用作鑭離子的敏化劑。
可進行聚合并包囊鑭離子的二炔屬類脂-一種潛在的分子探針15b。
當結(jié)合到脂質(zhì)體中并與UV光接觸時，二炔基磷脂已顯示出可進行聚合反應(yīng)16b。這類體系比未聚合的類脂更穩(wěn)定，適于作為緩釋藥物傳遞體系。
在UV光輻射下可進行聚合的二炔基磷脂16bJunichi等17b報道了(WO 95/03035)具有提高的穩(wěn)定性的聚合的脂質(zhì)體用于口服釋放藥物的用途。可將口服釋放的藥物化合物包囊到聚合的脂質(zhì)體中，然后遞送到小腸。脂質(zhì)體的磷脂成分通過含雙鍵的烯基和炔基磷脂進行聚合。這類聚合提高了強度，產(chǎn)生較低流動性的脂質(zhì)體?；谠撛颍删酆系牧字荒茉诜遣《净蛑委熤刑峁┯邢薜膽?yīng)用，除非聚合過程是可逆的。另一方面，脂質(zhì)體學(xué)血液中必須是穩(wěn)定的，但另一方面，一旦進入細胞內(nèi)，它們又須是不穩(wěn)定的；體外研究表明，流動性(以及對于HII相的暫時親和性)對于改善轉(zhuǎn)染似乎是最重要的。
通過脂質(zhì)體內(nèi)聚合反應(yīng)，二炔基磷脂酰膽堿顯示出體外抗血栓作用。這種穩(wěn)定性可能是聚合的磷脂酰膽堿不會凝固沉淀的原因18b。
2001年顯示，當配制成含DOPE的陽離子脂質(zhì)體時，陽離子類脂雙胍鹽-二炔(BGDA)在體外具有高效轉(zhuǎn)染能力19b。二炔基官能團的存在提供了發(fā)生聚合的可能性，因此是基因轉(zhuǎn)染的一種新支架。通過研究可聚合區(qū)域的作用，進一步開拓了類脂/DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的視野。
陽離子類脂BGDA19b本發(fā)明致力于現(xiàn)有技術(shù)的問題。
本發(fā)明一方面提供一種組合物，該組合物含有(i)包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基(hydrocarbyl)，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目，和(ii)治療劑。
本發(fā)明另一方面，提供一種脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包含類脂化合物，其中該類脂化合物包含至少一個非極性部分和極性部分，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目；其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC和DO(14-炔)PC。
本發(fā)明另一方面，提供一種包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目；其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC、DO(14-炔)PC、DO(4-炔)PE和DO(14-炔)PE。
本發(fā)明另一方面，提供一種類脂化合物在制備用于治療遺傳性疾病或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該化合物是包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目。
本發(fā)明另一方面，提供治療用的本發(fā)明化合物、組合物或脂質(zhì)體。
本發(fā)明另一方面，提供化合物、組合物或脂質(zhì)體在制備用于治療遺傳性障礙或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面，提供一種由本發(fā)明化合物或者本發(fā)明方法制備的化合物形成的陽離子脂質(zhì)體。
本發(fā)明另一方面，提供一種制備陽離子脂質(zhì)體的方法，該方法包括由本發(fā)明化合物或者本發(fā)明方法制備的化合物形成陽離子脂質(zhì)體。
本發(fā)明另一方面，提供治療用的本發(fā)明陽離子脂質(zhì)體或者由本發(fā)明方法制備的陽離子脂質(zhì)體。
本發(fā)明另一方面，提供本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)體或者由本發(fā)明的方法制備的陽離子脂質(zhì)體在制備用于治療遺傳性障礙或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面，提供核苷酸與下列的任何一種或多種物質(zhì)的組合產(chǎn)品本發(fā)明化合物，由本發(fā)明方法制備的化合物、本發(fā)明脂質(zhì)體、由本發(fā)明方法制備的脂質(zhì)體、本發(fā)明組合物或者由本發(fā)明方法制備的組合物。
本發(fā)明另一方面，提供治療用的本發(fā)明組合產(chǎn)品。
本發(fā)明另一方面，提供本發(fā)明的組合產(chǎn)品在制備用于治療遺傳性障礙或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面，提供一種藥物組合物，該組合物包含本發(fā)明化合物、由本發(fā)明方法制備的化合物、本發(fā)明組合物或由本發(fā)明方法制備的組合物與一種藥物，以及任選的可藥用稀釋劑、載體或賦形劑混合。
本發(fā)明另一方面，提供一種藥物組合物，該組合物包含本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)體或者通過本發(fā)明方法制備的陽離子脂質(zhì)體與一種藥物，以及任選的可藥用稀釋劑、載體或賦形劑混合。
本發(fā)明的某些另外方面在所附的權(quán)利要求書中進行了定義。
我們研究了促進核內(nèi)體水解(例如探索隨核內(nèi)體成熟轉(zhuǎn)變?yōu)槿苊阁w的pH降低)、細胞特異性靶向(脂肽)、DNA縮合、核靶向以及最后的提高脂質(zhì)復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性并同時保持融合性的問題。
據(jù)信，本發(fā)明化合物或組合物的主要優(yōu)點是它們可用于制備用于基因治療的陽離子脂質(zhì)體，特別是將核酸(包括基因和反義DNA/RNA)遞送到細胞(體外、體內(nèi)或離體)用以進行有益治療。
基因治療物質(zhì)通常是靜脈內(nèi)給藥。矛盾地是，陽離子脂質(zhì)體須在血液中穩(wěn)定，但一旦進入細胞又須是不穩(wěn)定的，使被遞送的核酸釋放出來。血液中的血清組分降低了現(xiàn)有陽離子脂質(zhì)體的生物活性，導(dǎo)致治療核酸的清除或被替代，因此體內(nèi)結(jié)果很差。我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明炔屬化合物的體外轉(zhuǎn)染活性與DOPE相當。據(jù)認為，碳-碳三鍵比雙鍵更能耐受氧化，并且還可增強膜的剛性。因此炔屬化合物在血清中具有較強穩(wěn)定性，由此可以改善體內(nèi)效果。
我們廣泛地研究了本發(fā)明范圍內(nèi)的化合物，觀察到了有益效果。尤其是，我們研究了DOPC、DOPE、DODAP和DOTAP的各自三個C18(5、6和7)和兩個C17(8和9)單炔屬脂肪酸的相應(yīng)類似物。
十八碳-4-炔酸(5) 十八碳-9-炔酸(6)十八碳-14-炔酸(7) 十七碳-9-炔酸(8) 十七碳-14-炔酸(9)
各種類脂的五種單炔屬類似物，即DOPC(1)、DOPE(2)、DODAP(3)和DOTAP(4)的合成已經(jīng)完成。這些類脂應(yīng)能較好地在分子間包裝，由此提供較低流動性的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)并延長這類脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)周期。
據(jù)認為，-C≡C-三鍵的存在是有益的，因為它與-C＝C-雙鍵相比，更不易于氧化20b，因此一般來說不易被親電試劑進攻21b。此外，雙鍵對于順式/反式異構(gòu)化不穩(wěn)定，但三鍵不會發(fā)生這類異構(gòu)化。酸性條件和UV光可加速這種過程。DOPE中的順式雙鍵為DOPE轉(zhuǎn)染能力所必需是很有可能的，使得含DOPE的脂質(zhì)體容易形成HII相，因此發(fā)生融合(見下)。異構(gòu)化為更穩(wěn)定的反式形式可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染特性的降低，或甚至完全喪失21c。
具有順式雙鍵的類脂，例如DOPE導(dǎo)致其組分的膜具有流動性。據(jù)認為，炔屬類似物，例如DO(9-炔)PE認為具有較強的剛性，因此增強了其組成脂質(zhì)體在體內(nèi)的穩(wěn)定性。
Rürup等4b的研究顯示，DOPC的9-炔類似物(DO(9-炔)PC，33)的層狀的凝膠向液晶(Lβ/Lα)的轉(zhuǎn)化溫度(Tm)大約為15℃，該溫度比標準DOPC(-18℃)高(-3.4℃)。此外，它們的研究還顯示，隨著三鍵朝著遠離脂肪?；溨虚g位置的方向的移動，Tm增高(附圖11)，這與烯基(雙鍵)類似物相同。
因此，相應(yīng)的DOPE-類似物不僅在Lβ/Lα轉(zhuǎn)化上，而且在Lα/HII相變方面都表現(xiàn)出相似的行為。標準DOPE的層狀液晶-轉(zhuǎn)化的六角形(Lα/HII)相變溫度(Th)為10℃21b。由于其對于HII相的親和性，DOPE被稱為融合類脂，因為當膜融合時，其結(jié)構(gòu)中間體與雙層(Lα)向HII相轉(zhuǎn)變的中間結(jié)構(gòu)類似。據(jù)認為，是這種融合特性使包含DOPE的脂質(zhì)體通過脂質(zhì)體和核內(nèi)體膜的融合進行有效轉(zhuǎn)染，使質(zhì)粒DNA釋放進入胞漿。
由于低Th，不可能在37℃(或者實際上是在25℃)和pH7.0的生理條件下制備DOPE的脂質(zhì)體?；贒O(9-炔)PC的Tm比DOPC，高約15℃，那么DO(9-炔)PE的Tm可高于DOPE約15℃。更重要的是，DO(9-炔)PE的Tn可高于DOPE約15℃。如果這樣，與使用所述類脂本身相比，可在室溫(RT)下比較容易地制備包含我們的類脂，如DOPE的單炔基類似物的陽離子脂質(zhì)體。最終，這可以得到較低正電荷的陽離子LMDs，產(chǎn)生轉(zhuǎn)染顆粒，這種顆粒不僅由于較好的分子內(nèi)包裝作用具有更好的穩(wěn)定性，固而具有更強剛性結(jié)構(gòu)的雙層結(jié)構(gòu)，而且由于顆粒更接近中性而更穩(wěn)定。非病毒基因治療在體內(nèi)受到多種問題的阻礙，問題之一是血液中存在多種帶負電荷的組分。這些可標記通過靜電相互作用而破壞的陽離子LMDs，或者更簡單地是可置換陰離子mu-DNA復(fù)合物。本發(fā)明的炔屬類似物可產(chǎn)生對于聚集和對于破壞性的陰離子實體更穩(wěn)定的更多的載體。
發(fā)明的廣泛方面本文中使用的術(shù)語“炔屬烴基”是指包含至少C和H的具有至少一個-C≡C-鍵的基團，該基團可任選地包含一個或多個其它適合的取代基。這類取代基的實例可以包括鹵素、烷氧基、硝基、純烴基(hydrocarbon group)、N-?；?、環(huán)狀基團等。取代基除可以是環(huán)狀基團外，取代基還可組合形成環(huán)狀基團。如果烴基包括一個以上的C，則這些碳不一定彼此相連。例如，至少兩個碳可以通過適合的元素或基團相連。因此，烴基可包含雜原子。適合的雜原子對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說是顯而易見的，包括例如硫、氮和氧。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，“X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基”是指該X或每個X包含一個并且僅包含一個C≡C鍵。
本文中使用的術(shù)語“烴基”是指包含至少C和H的基團，該基團可任選地包含一個或多個其它適合的取代基。這類取代基的實例包括鹵素、烷氧基、硝基、純烴基、N-?；?、環(huán)狀基團等。取代基除可以是環(huán)狀基團外，取代基還可組合形成環(huán)狀基團。如果烴基包括一個以上的C，則這些碳不一定彼此相連。例如，至少兩個碳可以通過適合的元素或基團相連。因此，烴基可包含雜原子。適合的雜原子對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說是顯而易見的，包括例如硫、氮和氧。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，烴基是純烴基。
在此，術(shù)語“純烴”是指任何一個烷基、鏈烯基、炔基、?；@些基團可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的，或者指芳基。術(shù)語純烴還包括其中已任選地被取代的那些基團。如果純烴是其上具有取代基的支鏈結(jié)構(gòu)，則取代基可以位于純烴的骨架或者側(cè)鏈上；或者取代基可以位于純烴的骨架和側(cè)鏈上。
從廣義上說，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物含有(i)包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的部分，其中X是炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目，和(ii)治療劑。
從廣義上說，本發(fā)明提供一種包含類脂化合物的脂質(zhì)體，其中所述類脂化合物包含至少一個非極性部分和極性部分，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目；其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC和DO(14-炔)PC。
從廣義上說，本發(fā)明提供一種包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目；其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC、DO(14-炔)PC、DO(4-炔)PE和DO(14-炔)PE。
從廣義上說，本發(fā)明提供一種類脂化合物在制備治療遺傳障礙或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該化合物是包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目。
在本發(fā)明上述廣義方面的某些優(yōu)選實施方案中，X或者至少一個X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，炔屬烴基是炔基。
為便于說明，下面在適合章節(jié)標題下對本發(fā)明的這些和其它方面進行討論。但各章節(jié)的教導(dǎo)不必限于每個特定章節(jié)。
優(yōu)選方面本發(fā)明化合物可以是陰離子類脂。
該化合物優(yōu)選是中性類脂。
該化合物優(yōu)選是陽離子類脂。
極性部分極性端基(PHG)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，極性端基可以由適合的類脂衍生。術(shù)語“類脂”可以指基于脂肪酸或者與之密切相關(guān)的化合物，例如它們相應(yīng)的醇或者鞘氨醇堿的化合物。
在優(yōu)選方面，極性端基由磷脂類、神經(jīng)酰胺類、三?；视?、溶血磷脂類、磷脂酰絲氨酸類、甘油類、醇、烷氧基化合物、一?；视汀⑸窠?jīng)節(jié)苷脂類、鞘磷脂類、腦苷脂類、磷脂酰膽堿類、磷脂酰乙醇胺類、磷脂酰肌醇類(PI)、二酰基甘油、磷脂酸類、甘油基碳水化合物、多元醇和磷脂酰甘油類。
在一個優(yōu)選方面，極性端基由磷脂類、神經(jīng)酰胺類、三?；视?、溶血磷脂類和磷脂酰絲氨酸類衍生。
極性端基優(yōu)選由磷脂衍生。
磷脂優(yōu)選是中性或陰離子性磷脂。
在一個優(yōu)選方面，磷脂選自磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，例如二油酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
極性端基優(yōu)選由3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)或3-N，N，N-三甲氨基(ammonio)丙烷-1，2-二醇(TAP)衍生。
在一個優(yōu)選方面，極性端基(PHG)可以是基團-W-連接基團-HG，其中W選自CH2、O、NR1和S，其中R1是H或烴基，其中連接基團是任選的連接基團，且HG是端基。
端基(HG)可以是極性的或非極性的。當HG是非極性基團時，它通過-C(O)W-連接基團-而具有極性。本發(fā)明的定義包括這類端基，條件是當與-C(O)W-連接基團-基團相連時，-C(O)W-連接基團-HG是極性的并且HG是極性的。
在一個方面，端基(HG)可以是烷基。在該方面，烷基優(yōu)選包含至少5個碳，例如它是C5-100烷基，C5-80烷基，C5-60烷基，C5-50烷基，C5-40烷基，C5-30烷基或C5-20烷基。
在一個方面，端基(HG)衍生自磷脂類、神經(jīng)酰胺類、三酰基甘油類、溶血磷脂類、磷脂酰絲氨酸類、甘油類、醇、烷氧基化合物、一?；视?、神經(jīng)節(jié)苷脂類、鞘磷脂類、腦苷脂類、磷脂酰膽堿類、磷脂酰乙醇胺類、磷脂酰肌醇類(PI)、二酰基甘油、磷脂酸類、甘油基碳水化合物、多元醇和磷脂酰甘油類。
在一個優(yōu)選方面，端基是下式基團 或者下式基團 其中R獨立地選自H和烴基，m是1-10且n是1-10。
R優(yōu)選選自H和C1-6烷基，更優(yōu)選選自H和C1-3烷基，更優(yōu)選選自H和甲基。
m優(yōu)選是1-5，更優(yōu)選是1、2或3。
n優(yōu)選是1-5，更優(yōu)選是1、2或3。
連接基團-W-連接基團-HG的連接基團可以是任何適合的基團。典型的連接基團是烴基。
本文中使用的術(shù)語“烴基”是指包含至少C和H的基團，該基團可任選地包含一個或多個其它適合的取代基。這類取代基的實例可以包括鹵素、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)狀基團等。取代基除可以是環(huán)狀基團外，取代基還可組合形成環(huán)狀基團。如果烴基包括一個以上的C，則這些碳不一定彼此相連。例如，至少兩個碳可以通過適合的元素或基團相連。因此，烴基可包含雜原子。適合的雜原子對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說是顯而易見的，包括例如硫、氮和氧。烴基的非限制性實例是?；?。
典型的烴基是純烴基。在此術(shù)語“純烴基”是指任何一個烷基、鏈烯基、炔基，這些基團可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的，或者指芳基。術(shù)語純烴基還包括其中已任選地被取代的那些基團。如果純烴基是其上具有取代基的支鏈結(jié)構(gòu)，則取代基可以位于純烴基的骨架或者側(cè)鏈上；或者取代基可以同時位于純烴基的骨架和側(cè)鏈上。
在一個優(yōu)選方面，至少一個任選的連接基團不存在。在一個優(yōu)選方面，不存在任選的連接基團。
當一個或多個或者所有任選的連接基團不存在時，通常選擇具有一個或多個-OH的那些由其衍生極性端基的基團/化合物。這使得在非極性部分與極性部分之間能夠提供簡單的酯鍵。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，當存在任選的連接基團時，兩個或多個W基團可與連接基團的同一個原子相連或者不與之相連?？梢韵胍?，在某些方面，兩個或多個W基團與連接基團的不同原子相連。
W-W-連接基團-HG的W選自CH2、O、NR1和S，其中R1是H或烴基。
在一個優(yōu)選方面，W是O或NR1。
R1優(yōu)選是H或純烴基。
R1優(yōu)選是H、C1-30、C1-25、C1-20、C1-15、C1-10、C1-5或C5-15烴基。
R1優(yōu)選是H、C1-30、C1-25、C1-20、C1-15、C1-10、C1-5或C5-15純烴基。
R1優(yōu)選是H、C1-30、C1-25、C1-20、C1-15、C1-10、C1-5或C5-15任選取代的烷基。
R1優(yōu)選是H、C1-30、C1-25、C1-20、C1-15、C1-10、C1-5或C5-15未取代的烷基。
非極性部分X如上所述，X是烴基鏈?！盁N基鏈”是指直鏈烴基。
在下面的定義中，鏈長是指部分X中直接相連的原子的最長鏈。應(yīng)該理解，鏈不包括末端碳的環(huán)狀取代基或取代基的原子。
在一個優(yōu)選方面，X是選自可任選取代的烷基、可任選取代的鏈烯基和可任選取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基含有3-30個碳原子，例如10-25個碳原子，15-20個碳原子，15、16、17或18個碳原子。
炔屬烴基優(yōu)選衍生自選自下列的脂肪酸 十八碳-4-炔酸(5) 十八碳-9-炔酸(6)十八碳-14-炔酸(7) 十七碳-9-炔酸(8) 十七碳-14-炔酸(9)在一個優(yōu)選方面，X是選自可任選取代的C6-C24炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為6-24個原子的可任選取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為10-18個原子的可任選取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為16或17個原子的可任選取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自未取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自未取代的C6-C24炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為6-24個原子的未取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自未取代的C10-C18炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為10-18個原子的未取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自未取代的C16或C17炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是選自鏈長為16或17個原子的未取代的炔基的基團。
在一個優(yōu)選方面，X是純烴基鏈。“純烴基鏈”是指直鏈純烴基。
當X包含一個或多個雙鍵時，優(yōu)選至少一個雙鍵，更優(yōu)選每個雙鍵都是順式構(gòu)型的。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基的C≡C與該炔屬烴基的末端相距2-15個碳。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基的C≡C與該炔屬烴基的末端相距2個碳。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基的C≡C與該炔屬烴基的末端相距3個碳。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基的C≡C與該炔屬烴基的末端相距7個碳。
在一個優(yōu)選方面，炔屬烴基的C≡C與該炔屬烴基的末端相距13個碳。
Y如上所述，Y是O或CH2。
在一個優(yōu)選方面，Y是CH2。
在一個優(yōu)選方面，當Y是CH2時，鏈X-Y-Z包含偶數(shù)個原子。應(yīng)該清楚，X-Y-Z的鏈長是X-Y-Z部分中直接相連的原子的最長鏈。應(yīng)該清楚，鏈不包括末端碳的環(huán)狀取代基或取代基的原子。
在一個優(yōu)選方面，鏈X-Y-Z包含偶數(shù)個原子。
Z如上所述，Z是任選的烴基。
在一個優(yōu)選方面，Z是烷基。
在一個優(yōu)選方面，Z是C1-C10，優(yōu)選C1-C6，優(yōu)選C1-C3烷基。Z優(yōu)選是-CH2-。
化合物在一個方面，化合物是下式化合物 其中p是至少1，例如1-10000，1-1000，1-100，1-50，1-20，1-10，優(yōu)選1-5，優(yōu)選1、2或3，并且其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
由其可衍生具有給定p值的極性端基的適宜化合物的實例如下
在一個方面，化合物是下式化合物
其中p是1-10，優(yōu)選1-5，優(yōu)選1、2或3，并且其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
在一個方面，化合物是下式化合物 在一個方面，化合物是下式化合物 化合物優(yōu)選包含至少兩個非極性部分，其中每個非極性部分獨立地選自式X-Y-Z-的非極性部分。
在一個優(yōu)選方面，化合物是下式化合物 其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
在一個方面，化合物是下式化合物 其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
在一個方面，化合物包含至少三個非極性部分，其中每個部分獨立地選自式X-Y-Z-的非極性部分。
在一個優(yōu)選方面，化合物是下式化合物
其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
在一個優(yōu)選方面，化合物是下式化合物 其中每個W、X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供下式化合物 其中R獨立地選自H和烴基，n是1-10，m是1-10。此外，本發(fā)明提供·與核苷酸序列混合或結(jié)合的化合物·用于治療的化合物·化合物用于制備治療遺傳障礙或病癥或疾病的藥物的應(yīng)用·由化合物形成的陽離子脂質(zhì)體·制備陽離子脂質(zhì)體的方法，包括由化合物形成陽離子脂質(zhì)體·陽離子脂質(zhì)體及其應(yīng)用·藥物組合物，其含有的化合物與藥物以及任選的可藥用稀釋劑、載體或賦形劑混合·S或R異構(gòu)體形式，優(yōu)選R異構(gòu)體形式的化合物-ZYX優(yōu)選是式CpH2p-3的基團，其中p是3-30，優(yōu)選10-25，優(yōu)選15-20，優(yōu)選15、16、17或18個碳原子。
下面描述本發(fā)明其他高度優(yōu)選的方面。本發(fā)明可提供
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18炔基。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C14炔基和未取代的C15炔基。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自CH3(CH2)12C≡C-、CH3CH2CH2C≡C(CH2)10-、CH3(CH2)7C≡C(CH2)5-、CH3(CH2)6C≡C(CH2)5-和CH3CH2C≡C(CH2)10-。
·下式化合物
其中X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18炔基，其中極性端基衍生自磷脂的極性端基。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C14炔基和未取代的C15炔基，其中極性端基衍生自磷脂的極性端基。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自CH3(CH2)12C≡C-、CH3CH2CH2C≡C(CH2)10-、CH3(CH2)7C≡C(CH2)5-、CH3(CH2)6C≡C(CH2)5-和CH3CH2C≡C(CH2)10-，其中極性端基衍生自磷脂的極性端基。
·下式化合物
其中X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18炔基，其中極性端基衍生自類脂的極性端基，所述類脂選自磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)和3-N，N，N-三甲氨基丙烷-1，2-二醇(TAP)。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C14炔基和未取代的C15炔基，其中極性端基衍生自類脂的極性端基，所述類脂選自磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)和3-N，N，N-三甲氨基丙烷-1，2-二醇(TAP)。
·下式化合物 其中X2和X3獨立地選自CH3(CH2)12C≡C-、CH3CH2CH2C≡C(CH2)10-、CH3(CH2)7C≡C(CH2)5-、CH3(CH2)6C≡C(CH2)5-和CH3CH2C≡C(CH2)10-，其中極性端基衍生自類脂的極性端基，所述類脂選自磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)和3-N，N，N-三甲氨基丙烷-1，2-二醇(TAP)。
其它方面組合物的治療劑優(yōu)選是核苷酸序列?；衔飪?yōu)選與核苷酸序列混合或結(jié)合。
核苷酸序列可以是可用于治療，例如基因治療的部分或完全的表達體系。
在優(yōu)選方面，本發(fā)明化合物與縮合的多肽/核酸復(fù)合物混合得到非病毒的核酸遞送載體?？s合的多肽/核酸復(fù)合物優(yōu)選包括WO 01/48233中公開的那些。WO 01/48233涉及非病毒的核酸遞送載體，其包含縮合的多肽/核酸復(fù)合物和陽離子類脂，其中的復(fù)合物包含(a)感興趣的核酸序列(NOI)；和(b)一種或多種包裝病毒核酸的多肽或其衍生物，所述多肽或其衍生物(i)能與NOI結(jié)合；且(ii)能縮合NOI；并且其中NOI與多肽是異種的。多肽或其衍生物優(yōu)選能與核酸復(fù)合物結(jié)合。多肽或其衍生物優(yōu)選能縮合核酸復(fù)合物。核酸復(fù)合物優(yōu)選與多肽或其衍生物是異種的。
本發(fā)明化合物可用于部分或全部置換WO 01/48233中的陽離子類脂。因此在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供·一種非病毒的核酸遞送載體，該載體包括縮合的多肽/核酸復(fù)合物、陽離子類脂和本發(fā)明化合物，其中該復(fù)合物包含(a)感興趣的核酸序列(NOI)；和(b)一種或多種包裝病毒核酸的多肽或其衍生物，所述多肽或其衍生物(i)能與NOI結(jié)合；且(ii)能縮合NOI；并且其中NOI與多肽是異種的。
·一種非病毒的核酸遞送載體，該載體包括縮合的多肽/核酸復(fù)合物和本發(fā)明化合物，其中該復(fù)合物包含(a)感興趣的核酸序列(NOI)；和(b)一種或多種包裝病毒核酸的多肽或其衍生物，所述多肽或其衍生物(i)能與NOI結(jié)合；且(ii)能縮合NOI；并且其中NOI與多肽是異種的。
本發(fā)明化合物可以與脂質(zhì)體結(jié)合或者配制成微膠粒形式以有助于其給藥。
另一方面，可將本發(fā)明化合物配制到蝸牛殼形(cochleate)的遞送載體中。蝸牛殼形的遞送載體代表了一種新的口服釋藥技術(shù)平臺。蝸牛殼形載體是穩(wěn)定的磷脂-陽離子沉淀，其由單純的天然存在的物質(zhì)，例如磷脂酰絲氨酸和鈣組成。蝸牛殼形載體是一種有前景的納米體系，它能包囊疏水性的、兩性的、帶負電荷或正電荷的部分。
一方面，本發(fā)明化合物是分離或純化形式的。例如，化合物可以呈非生物系統(tǒng)，例如體內(nèi)中存在的形式或一定純度。
本發(fā)明化合物可配制成藥物組合物，該組合物包含本發(fā)明化合物與任選的可藥用載體、稀釋劑、賦形劑或輔劑混合。
藥物組合物本發(fā)明還提供藥物組合物，該組合物包含治療有效量的本發(fā)明物質(zhì)與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
這是包含治療有效量的藥物活性物質(zhì)或者由該物質(zhì)組成的組合物。它優(yōu)選包括可藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。治療用的可藥用載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域眾所周知的，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯，1985年)中所述?？筛鶕?jù)預(yù)期給藥途徑和標準的制藥實踐選擇藥物載體、賦形劑或稀釋劑。除載體、賦形劑或稀釋劑外，藥物組合物可包含作為上述物質(zhì)的任何適宜的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、包衣劑、增溶劑。
藥物組合物理想地是呈無菌形式。它可以呈單位劑量形式并且通常被密封在容器中提供。也可以以多個單位劑量形式提供。
本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物可包括一種或多種下列物質(zhì)防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、芳香劑、矯味劑、鹽(本發(fā)明化合物本身可以呈可藥用鹽形式提供)、緩沖劑、包衣劑、抗氧化劑、助懸劑、輔劑、賦形劑和稀釋劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。
除本發(fā)明化合物外，它們也可包含其它治療活性物質(zhì)。在使用兩種或多種治療劑的情況下，它們可以單獨給藥(例如在不同時間和/或通過不同途徑)，因此它們不總是存在于單一組合物中。因此本發(fā)明范圍內(nèi)包括聯(lián)合治療。
給藥途徑本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物可以適于通過任何適當?shù)耐緩浇o藥。例如它可以經(jīng)口(包括頰或舌下)、直腸、鼻、局部(包括頰、舌下或透皮)、陰道或非胃腸(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑給藥。這類組合物可以通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如將一種或多種活性成分與適宜的載體混合。
可采用不同的藥物釋放系統(tǒng)施用本發(fā)明的藥物組合物，這取決于所需的給藥途徑。例如Langer(Science 2491527-1533(1991))以及Il1um和Davis(Current Opinions in Biotechnology 2254-259(1991))描述了藥物傳遞體系。下面將詳細討論用于藥物傳遞的不同給藥途徑本發(fā)明的物質(zhì)可以單獨給藥，但通常以藥物組合物形式施用-例如當根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標準的制藥實踐，將所述物質(zhì)與適合的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合。
例如對于立即、延遲、調(diào)整、延緩、脈沖或控制釋放應(yīng)用，所述物質(zhì)可以以片劑、膠囊、卵形藥劑、酏劑、溶液或混懸液形式給藥(例如經(jīng)口服或局部)，這些形式可包含芳香劑或著色劑。
片劑可包含賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘油；崩解劑，例如淀粉(優(yōu)選玉米、土豆或木薯淀粉)、淀粉甘醇酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽；和制粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，也可包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯和滑石。
類似形式的固體組合物也可用作明膠膠囊的填料。這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖(milk sugar)或高分子量的聚乙二醇類。對于水性混懸液和/或酏劑，可將物質(zhì)與各種甜味劑或芳香劑、著色劑或染料，與乳化劑和/或助懸劑以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油及其組合物混合。
給藥(傳遞)途徑包括、但不限于下列的一種或多種口服(如以片劑、膠囊或可攝食溶液形式)、局部、粘膜(如以鼻噴霧劑或吸入氣霧劑形式)、經(jīng)鼻、非胃腸(如以注射劑形式)、胃腸道、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、子宮內(nèi)、眼內(nèi)、皮內(nèi)、顱骨內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、皮下、眼(包括玻璃體內(nèi)或前眼房內(nèi))、透皮、直腸、頰、經(jīng)陰莖、陰道、硬腦膜外、舌下。
應(yīng)該清楚，并非所有的物質(zhì)都需要經(jīng)同種途徑施用。同樣，如果組合物包含一種以上的活性成分，則這些成分可以以不同的途徑施用。
如果本發(fā)明的物質(zhì)經(jīng)非胃腸給藥，則這類給藥方式的實例包括下列的一種或多種靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、頭蓋骨內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥所述物質(zhì)；和/或使用輸液技術(shù)給藥。
(I)口服適于口服的藥物組合物可以呈膠囊或片劑；粉末或顆粒劑；溶液、糖漿或混懸液(水性或非水性液體的)；可食泡沫體或whips；或者乳液形式。片劑或硬明膠膠囊可包含乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊可包含植物油、蠟、脂肪、半固體或者液體多元醇等。乳液和糖漿可包含水、多元醇和糖類。為制備混懸液，可使用油(如植物油)以產(chǎn)生水包油或者油包水混懸液。用于口服的活性物質(zhì)可使用延遲崩解和/或活性物質(zhì)在胃腸道中吸收的物質(zhì)(如可使用單硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯)包衣或者將二者混合。因此，可實現(xiàn)活性物質(zhì)在許多小時內(nèi)緩慢釋放，并且如果需要，可以避免活性物質(zhì)在胃中降解。可以配制口服藥物組合物，以促進活性物質(zhì)根據(jù)特定pH或酶條件在特定的胃腸道部位釋放。
(II)透皮給藥適于透皮給藥的藥物組合物可以呈獨立的貼劑形式，該貼劑用以保持與受試者的表皮緊密接觸較長時間。例如，活性成分可通過離子電滲從貼劑中釋放出來。(離子電滲記載于Pharmaceutical Research，3(6)318(1986)。
(III)局部給藥或者，本發(fā)明物質(zhì)可以以栓劑或陰道栓劑形式給藥，或者它可以以凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、霜劑、軟膏或粉劑形式局部應(yīng)用。本發(fā)明物質(zhì)還可經(jīng)皮或透皮給藥，例如通過使用皮膚貼劑。它們還可以通過肺部或直腸途徑給藥。它們還可以通過眼的途徑給藥。對于眼用，可將化合物配制成等滲的、pH調(diào)節(jié)過的、無菌鹽水中的微粉化懸浮液或者優(yōu)選配成等滲的、pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的溶液，其中任選混合有防腐劑，如氯芐烷銨(benzylalkonium chloride)。或者它們例如用凡士林配制在軟膏中。
對于皮膚的局部應(yīng)用，可將本發(fā)明物質(zhì)配制成適合的軟膏形式，其中包含懸浮于或溶解于例如一種或多種下列物質(zhì)的混合物中的活性化合物礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘呖蓪⑺鼞腋』蛉芙庥诶缗c一種或多種下列物質(zhì)的混合物中配制成適合的洗劑或霜劑礦物油、脫水山梨醇一硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、吐溫60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟基硬脂醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
(IV)直腸給藥適于直腸給藥的藥物組合物可以呈栓劑或者灌腸劑形式。
(V)經(jīng)鼻給藥適于經(jīng)鼻給藥的藥物組合物可以適于固體載體，如粉末(粒徑優(yōu)選為20-500微米)。粉末可以以吸入方式給藥，即由與鼻接近的盛有粉末容器快速經(jīng)鼻吸入?；蛘?，適于經(jīng)鼻給藥的組合物也可使用液體載體，如鼻噴霧劑或滴鼻劑。這些組合物可以包括活性成分的水溶液或油溶液。
通過吸入的給藥組合物可以以特殊應(yīng)用裝置，如加壓氣溶膠、噴霧器或吸入器供應(yīng)?？梢越M裝這些裝置，以便于提供預(yù)定劑量的活性成分。
(VI)陰道給藥適于陰道給藥的藥物組合物可以呈子宮套、棉球、霜劑、凝膠、糊劑、泡沫體或者噴霧劑形式。
(VII)胃腸外給藥如果本發(fā)明的物質(zhì)進行非胃腸給藥，則這類給藥方式的實例包括一種或多種下列方式靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、頭蓋骨內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥物質(zhì)；和/或通過使用輸液技術(shù)給藥。
對于非胃腸給藥，物質(zhì)最好以無菌水溶液形式應(yīng)用，所述溶液可包含其它物質(zhì)，例如足以使溶液與血液等滲的鹽或葡萄糖。如果需要，水溶液應(yīng)是適當緩沖的(優(yōu)選pH為3-9)。采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的標準制藥技術(shù)很容易在無菌條件下制備適宜的非胃腸制劑。
經(jīng)皮“經(jīng)皮”是指通過穿越皮膚進入血流的通道傳遞化合物。
透粘膜“透粘膜”是指通過化合物穿越粘膜組織進入血流的通道傳遞化合物。
透過尿道或尿道內(nèi)“透過尿道”或“尿道內(nèi)”是指藥物在尿道內(nèi)的傳遞，這樣藥物接觸并透過尿道壁進入血流。
滲透促進或透過促進作用“滲透促進”或“透過促進”是指皮膚或粘膜組織對于所選擇的藥理活性化合物的可滲透性增強，這樣化合物滲透透過皮膚或粘膜組織的速率增高。
滲透促進劑可包括，例如二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、癸基甲基亞砜(CIOMSO)、聚乙二醇單月桂酸酯(PEGML)、甘油單月桂酸酯、卵磷脂、1-取代的氮雜環(huán)庚烷酮類，尤其是1-N-十二烷基氮雜環(huán)庚烷酮(可以以AzoneTM商品名購自Nelson Research & Development Co.，Irvine，CA)、醇類等。
載體或介質(zhì)(vehicles)“載體”或“介質(zhì)”是指適合于化合物給藥的載體物質(zhì)，包括本領(lǐng)域已知的任何這類物質(zhì)，例如任何液體、凝膠、溶劑、液體稀釋劑或增溶劑等，它們是無毒的并且與組合物的任何組分之間不發(fā)生有害的相互作用。
可藥用載體的實例包括，例如水、鹽溶液、醇、硅酮、蠟、凡士林、植物油、聚乙二醇類、丙二醇、糖、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、表面活性劑、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
表皮藥物釋放(轉(zhuǎn)染體(Transfersomes))轉(zhuǎn)染體(“攜帶體”)是能跨越屏障并且能在應(yīng)用與目標位置之間轉(zhuǎn)染物質(zhì)的復(fù)合物，更常見地是囊狀的兩組分和多組分聚集體。轉(zhuǎn)染體由德國慕尼黑的IDEA Corporation銷售，TRANSFERSOME是該公司的注冊商標。轉(zhuǎn)染體透皮藥物釋放技術(shù)可用于各種大分子的控制和非侵入性釋放以及改善小分子，包括代謝性酶拮抗劑和/或本發(fā)明藥物的釋放。
可將轉(zhuǎn)染體優(yōu)化，用以獲得非常柔軟的和可自我調(diào)節(jié)的膜。因此它們是可變形的并可以最終有效地穿過微孔屏障，甚至在可利用通道比聚集體的平均尺寸小得多的時候。轉(zhuǎn)染體制劑通常由懸浮于水基溶液中的中性兩親化合物組成，其中任選地包含生物相容的表面活性劑。囊狀轉(zhuǎn)染體由圍繞水性核心的類脂雙層構(gòu)成，并且還包含至少一種能軟化膜的組分。因此轉(zhuǎn)染體的雙層比脂質(zhì)體膜更柔軟，甚至是亞穩(wěn)態(tài)的。從而轉(zhuǎn)染體囊通過局部調(diào)整至周圍的壓力很容易改變其形狀。
皮膚是最佳生物屏障之一。其最外部的角質(zhì)層，其占皮膚的厚度不足10％，但對皮膚的通透性屏障的貢獻卻超過了80％。該機體保護層由重疊的、無生機的角質(zhì)細胞組成，這些細胞以柱狀叢方式排列，被與細胞膜共價連接的多層狀類脂層密封并且非常密實。通常，細胞間的類脂層的平均數(shù)量和有序程度朝著皮膚表面的方向增加。這種增加是連續(xù)但非線性的，接近表面的局部水含量降低。盡管如此，最大皮膚屏障位于角質(zhì)層的內(nèi)半層，這里已經(jīng)形成細胞間的類脂密封層，但尚未受到皮膚細胞脫離的危及。
轉(zhuǎn)染聚集體跨越皮膚是囊膜柔韌性、親水性和保持囊的完整性的能力的作用，此時聚集體的形狀發(fā)生明顯變化。當將轉(zhuǎn)染體囊的混懸液置于皮膚表面時，水從相對干燥的皮膚表面蒸發(fā)，囊開始變干。由于轉(zhuǎn)染體主要成分的強極性，膜上的大量親水性基團受助于該膜的柔軟性，囊被吸引到皮膚屏障中鄰接細胞間的狹窄縫隙處的較高水含量的區(qū)域，由此使囊透過皮膚。這種作用與囊的非常強的變形能力一起，使轉(zhuǎn)染聚集體暫時打開微小的“縫隙”，水分一般過這種縫隙從皮膚蒸發(fā)出來。由此產(chǎn)生了比原始微孔寬兩個數(shù)量級的皮膚細胞間的通道。這種新的活性通道足以容納可變形的囊，囊保持了其完整性，而只是改變其形狀以適合于該通道。沿著角質(zhì)層中產(chǎn)生的“有效路徑”或“有效通道”，轉(zhuǎn)染體到達皮膚深層的高水含量區(qū)。在此，囊進行(再)分布。由于轉(zhuǎn)染體太大，不能進入局部血管，它們流經(jīng)毛細血管區(qū)，到達皮下組織，在此積聚。
盡管已穿過皮膚角質(zhì)層(stratum corneum)的小分子通常由皮膚通過血液循環(huán)清除，但借助轉(zhuǎn)染體囊釋放的藥物使藥物在皮膚深層發(fā)生積聚。由于其大小，囊被皮膚緩慢清除，因此結(jié)合的藥物可在該部位積聚。因而轉(zhuǎn)染體介入的重要藥物的給藥趨于使藥物分布到應(yīng)用部位下的深層組織。
血腦屏障(BBB)可以設(shè)計藥物組合物以使其通過血腦屏障(BBB)。例如，可選擇能透過BBB的載體，如脂肪酸、肌醇或膽甾醇。載體可以是通過腦內(nèi)皮細胞中的特異性轉(zhuǎn)染體系進入腦的物質(zhì)，如類胰島素生長因子I或II。載體可以與活性物質(zhì)偶聯(lián)或者包含活性物質(zhì)或與活性物質(zhì)混合。可以使用脂質(zhì)體以透過BBB。WO 91/04014描述了一種脂質(zhì)體釋放體系，其中活性物質(zhì)可以被包囊/包埋并且其中通常被轉(zhuǎn)染透過BBB的分子(如胰島素或類胰島素生長因子I或II)存在于脂質(zhì)體外表面。美國專利4704355中也討論了脂質(zhì)體釋放體系。
聚合物釋放/治療劑治療劑還可與聚合物相連而被釋放。有人提出，聚合物基治療劑是有效的釋放體系，其通常包含一種或多種與聚合物分子相連的待釋放治療劑，聚合物分子被用作載體。治療劑排列于共聚物骨架上，與聚合物一起被載入靶細胞。
可將治療劑偶聯(lián)、融合、混合、結(jié)合或連接到聚合物上。治療劑與聚合物之間的偶聯(lián)可以是永久的或暫時的，并且可包括共價或非共價的相互作用(包括離子作用、疏水性力、范德華作用等)。偶聯(lián)的確切方式并不重要，只要治療劑能與聚合物一起基本上被帶入靶細胞。為簡便起見，包括與聚合物載體相連的治療劑的整體被稱為“聚合物-治療劑軛合物”。
可使用任何適宜的聚合物，例如天然的或合成的聚合物，載體聚合物優(yōu)選是合成聚合物，如PEG。載體聚合物更優(yōu)選是生物惰性分子。特別的聚合物實例包括聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺型胺(PAMAM)樹枝狀聚合物(dendrimers)、HEMA、線型聚酰胺型胺聚合物等。可以使用任何適于連接治療劑與聚合物的連接基團。連接基團優(yōu)選是可生物降解的連接基團。在與胞外或胞內(nèi)環(huán)境接觸時，可生物降解的連接基團的使用能夠控制治療劑的釋放。高分子量大分子不能被動擴散進入細胞，反而被作為膜包圍的囊泡而吞沒。一旦進入囊泡，胞內(nèi)酶可作用于聚合物-治療劑軛合物，致使治療劑釋放。受控的胞內(nèi)釋放消除了與許多藥物有關(guān)的毒副作用。
此外，治療劑可以透過本領(lǐng)域已知的方法軛合、連接到任何適宜的聚合物上，并被遞送。治療劑尤其可包括任何被稱為“第二種治療劑”的分子，如下面章節(jié)中描述的多肽、核酸、大分子等。特別是，治療劑可包括如別處所述的前藥。
可選擇起始聚合物的能力以使聚合物-治療劑軛合物的工程滿足所需特性。可精確定制聚合物(和由此的聚合物-治療劑軛合物)的分子量以及其電荷和疏水性。適宜聚合物-治療劑軛合物的優(yōu)點包括制備經(jīng)濟、穩(wěn)定(較長的有效期)以及免疫原性和副作用降低。此外，由于滲透性和保留(EPR)作用增強，聚合物-治療劑軛合物尤其可用于靶向腫瘤細胞，其中生長的腫瘤對于循環(huán)的大分子和大顆粒具有更多的“縫隙”，使它們易于進入腫瘤內(nèi)部。還觀察到積聚增加以及低毒性(通常為游離治療劑毒性的10-20％)。使用超支化樹枝狀分子，例如PAMAM樹枝狀分子是特別有益的，因為它們可制造單分散的組合物，并且連接位點具有機動性(位于樹枝狀分子的內(nèi)部或外部)?？舍槍μ囟ò麅?nèi)環(huán)境定制聚合物-治療劑軛合物，例如與聚酰胺型胺聚合物軛合的那些的pH。這使得藥物僅在當聚合物治療劑遭遇特定pH或pH范圍，即在特定胞內(nèi)小室內(nèi)才被釋放。聚合物治療劑軛合物還可包括靶向工具，例如免疫球蛋白或抗體，它們將聚合物-治療劑軛合物導(dǎo)向包含靶的某些組織、器官或細胞，例如特定的抗原。該文獻中在別處也描述了其它靶向工具，它們也是本領(lǐng)域已知的。
聚合物-治療劑的特定實例包括“Smancs”，包括用于治療白血病的苯乙烯-馬來酸酐共聚物與抗腫瘤蛋白質(zhì)新制癌菌素的軛合物和PEG(聚乙二醇)與L-天冬酰胺酶的軛合物；PK1(HPMA共聚物與抗癌藥阿霉素的軛合物)；PK2(類似于PK1，但還包括靶向原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌的半乳糖基)；HPMA共聚物與抗癌藥喜樹堿的軛合物；HPMA共聚物與抗癌藥紫杉醇的軛合物；HPMA共聚物-鉑鹽(platinate)等。任何這些聚合物-治療劑軛合物都適于共同載入本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細胞。
劑量水平通常，醫(yī)師將確定最適合于個體患者的實際劑量。針對特定患者的特定劑量水平和給藥頻率可以不同并且將取決于多種因素，包括使用的特定化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間的長短、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄速率、藥物的聯(lián)用、特定病癥的嚴重程度以及進行治療的個體。本發(fā)明的治療劑和/或藥物組合物可以按照每日1-10次，例如每日1或2次的方案給藥。
對于針對人類患者的口服和非胃腸給藥，治療劑的每日劑量可以單次或分次給藥。
根據(jù)需要，治療劑可以以0.01-30mg/kg體重，例如0.1-10mg/kg，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重的劑量給藥。本文提及的劑量自然是平均情況的舉例。當然，存在應(yīng)使用較高或較低劑量范圍的個體情況。
治療有效量“治療有效量”是指有效實現(xiàn)其預(yù)期目的的治療劑的量。雖然個體患者的需求可能不同，但確定每種氧化氮加成物的有效量的最佳范圍是本領(lǐng)域的一般知識。通常根據(jù)多種因素選擇使用本發(fā)明化合物和/或組合物治療病癥的給藥方案，所述因素包括患者的種類、年齡、體重、性別、飲食和醫(yī)療狀況、機能障礙的嚴重程度、給藥途徑、藥理學(xué)考慮如使用的特定化合物的活性、效力、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)特性、是否使用藥物釋放體系以及化合物是否作為聯(lián)合用藥的一部分施用，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可根據(jù)這些因素進行調(diào)整。因此，實際采用的給藥方案可以有很大不同，故可以偏離本文所述的優(yōu)選給藥方案。
個體本文采用的術(shù)語“個體”是指脊椎動物，尤其是哺乳動物。該術(shù)語包括、但不限于馴養(yǎng)動物、比賽動物、靈長類和人類。
藥物聯(lián)用通常，治療劑可與一種或多種其它藥理活性物質(zhì)聯(lián)合使用。其它治療劑有時被稱為輔助治療劑。
患者“患者”是指動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。
可藥用鹽治療劑可以以其本身和/或可藥用鹽形式給藥，例如其酸加成鹽或堿鹽或者其溶劑化物，包括其水合物。適宜鹽的綜述參見Berge等，J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19。
如果合適，可藥用鹽通常很容易有所需的酸或堿制備。鹽可以從溶液中沉淀出來并通過過濾收集，或者通過蒸發(fā)溶劑回收。
適宜的酸加成鹽由形成無毒鹽的酸形成，實例是鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、琥珀酸鹽、蔗糖鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘甲酸鹽。
適宜的堿鹽由形成無毒鹽的堿形成，實例是鈉鹽、鉀鹽、鋁鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽和二乙醇胺鹽。
疾病狀態(tài)本發(fā)明化合物或組合物可用于治療WO-A-98/05635中列出的疾病。為便于參考，下面給出所列的部分疾病癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病、發(fā)熱、心血管作用、出血、血液凝固與急性期反應(yīng)、惡病質(zhì)、厭食、急性感染、HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫性疾病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓生成；腫瘤生長、入侵和擴散、血管生成、轉(zhuǎn)染瘤、惡性瘤、腹水和惡性胸膜滲漏；腦缺血、局部缺血性心臟病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、阿爾茨海默氏癥、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、結(jié)節(jié)性脈管炎、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎、齒齦炎；銀屑病、變應(yīng)性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松懈癥；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和手術(shù)傷口愈合；鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、濕疹、過敏癥；再狹窄、充血性心衰、子宮內(nèi)膜異位、動脈粥樣硬化或endosclerosis。
此外，本發(fā)明化合物或組合物可用于治療WO-A-98/07859中列出的疾病。為便于參考，下面給出所列出的人或獸醫(yī)學(xué)中的部分疾病細胞因子與細胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(如用于治療免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細胞生長；治療癌癥和許多自身免疫疾病以及預(yù)防移植排斥或者引發(fā)腫瘤免疫性)；調(diào)節(jié)造血作用，如治療骨髓或淋巴疾病；促進骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長，如用于傷口愈合、治療燒傷、潰瘍以及牙周疾病和神經(jīng)變性；抑制或活化濾泡刺激性激素(調(diào)節(jié)生育)；趨化/化學(xué)增活活性(例如使特定類型的細胞轉(zhuǎn)染到損傷或感染部位)；止血與溶栓活性(如用于治療血友病和中風(fēng))；抗炎活性(用于治療如敗血癥性休克或節(jié)段性回腸炎)；作為抗微生物劑；例如代謝或行為的調(diào)節(jié)劑；作為止痛劑；治療特殊缺陷疾??；治療如銀屑病。
此外，本發(fā)明的組合物還可用于治療WO-A-98/09985中所列出的疾病。為便于參考，下面給出所列出的部分疾病巨噬細胞和/或T細胞抑制活性和因此產(chǎn)生的抗炎活性；抗免疫活性，即對細胞和/或體液免疫反應(yīng)的抑制作用，包括與炎癥無關(guān)的反應(yīng)；抑制巨噬細胞和T細胞粘附胞外基質(zhì)組分和粘連蛋白的能力，以及上調(diào)T細胞中受體表達；抑制不希望的免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、與超敏性有關(guān)的炎癥、過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原疾病和其他自身免疫疾病、與動脈粥樣硬化癥有關(guān)的炎癥、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心搏停止、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸道窘迫綜合癥或其他心肺疾病、與胃潰瘍有關(guān)的炎癥、潰瘍性結(jié)腸炎和其他胃腸道疾病、肝纖維化、肝硬化或其他肝病、甲狀腺炎或其他腺體疾病、血管球性腎炎或其他腎和泌尿道疾病、耳炎或其他耳-鼻-咽喉疾病、皮炎或其他皮膚病、牙周疾病或其他牙科疾病、睪丸炎或附睪-睪丸炎、不育癥、睪丸損傷或其他免疫相關(guān)性雙睪癥、胎盤機能不良、胎盤功能低下(insufficiency)、習(xí)慣性流產(chǎn)、驚厥、驚厥前提以及其他免疫和/或炎癥相關(guān)性婦科疾病、后眼色素層炎、中間眼色素層炎、前眼色素層炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)視網(wǎng)膜炎、眼色素層視網(wǎng)膜眼、視神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥，如視網(wǎng)膜炎或帶斑囊樣水腫(cystoid macular oedema)、交感神經(jīng)性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、免疫和炎癥構(gòu)成的變性fondus disease、炎癥構(gòu)成的眼部損傷、由感染引起的眼部炎癥、增殖性玻璃體-視網(wǎng)膜病、急性缺血性視神經(jīng)病、疤痕過度，如青光眼過濾(filtration)術(shù)后、對抗眼移植物的免疫和/或炎癥反應(yīng)以及其他免疫和炎癥相關(guān)性眼科疾病、與自身免疫疾病或病癥或病癥有關(guān)的炎癥(發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其他器官的、免疫和/或炎癥的抑制將是有益的)、帕金森氏癥、治療帕金森氏癥產(chǎn)生的并發(fā)癥和/或副作用、AIDS相關(guān)性癡呆綜合HIV相關(guān)性腦病、Devic病、Sydenham舞蹈病、阿爾茨海默氏癥和其他變性疾病、CNS的病癥或障礙、炎癥構(gòu)成的中風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥、免疫和炎癥構(gòu)成的精神病、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、Guillaim-Barre綜合癥、Sydenham chora、重癥肌無力、大腦假性腫瘤、唐氏綜合癥、亨廷頓病、肌萎縮性硬化、CNS壓迫或CNS損傷所致炎癥或者CNS感染、肌肉萎縮和營養(yǎng)失調(diào)所致炎癥、以及中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥相關(guān)性疾病、病癥或障礙、損傷后炎癥、膿毒性休克、感染性疾病、外科手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或者副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用、基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥及副作用，如由于使用病毒載體所致的感染，或者與AIDS有關(guān)的炎癥、用于防止或抑制激素和/或細胞免疫反應(yīng)、通過減少單核細胞或淋巴細胞的量來治療或者緩解單核細胞或白血球的增殖性疾病，如白血病、預(yù)防和/或治療天然或人工細胞、組織和器官如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人工皮膚組織移植中的移植物排斥反應(yīng)。
治療這包括任何有益于人或非人動物的治療應(yīng)用。哺乳動物的治療是特別優(yōu)選的。人和獸類的治療均在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
治療可能與存在的病癥有關(guān)，或者治療可以是預(yù)防性的。它可以是成人、青少年、嬰兒、胎兒或前述的任何部分(如器官、組織、細胞或核酸分子)。
治療用活性劑可以通過任何適合的途徑并且以任意適合的劑量給藥。劑量可以在較寬限度內(nèi)變化，這取決于治療的性質(zhì)、被治療個體的年齡和病癥等，醫(yī)師將最終確定使用的適合劑量。然而，不受任何特定劑量的約束，本發(fā)明化合物的日劑量為1μg-1mg/kg體重可能是合適的。如果合適，常?？梢灾貜?fù)給藥。如果發(fā)生副作用，根據(jù)良好的臨床實踐，可以減少給藥的量和/或頻率。
多晶型形式/不對稱碳本發(fā)明的治療劑可以以多晶型形式存在。
本發(fā)明的治療劑可包含一個或多個不對稱碳原子，因此以兩種或多種立體異構(gòu)體形式存在。在治療劑包含鏈烯基或亞鏈烯基的情況下，也可以存在順式(E)和反式(Z)異構(gòu)現(xiàn)象。本發(fā)明包括治療劑的單獨的立體異構(gòu)體，并且如果合適，還包括其單獨的互變異構(gòu)體，以及它們的混合物。
治療劑或其適合的鹽或衍生物的立體異構(gòu)體混合物的分離可以通過常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)，如分餾結(jié)晶、色譜或者HPLC，得到非對映異構(gòu)體或者順式與反式異構(gòu)的分離。治療劑化合物的單個對映體也可以由相應(yīng)的光學(xué)純中間體制備或者通過拆分制備，例如如果適當，使用適合的手性載體經(jīng)HPLC制備相應(yīng)的外消旋體，或者通過分餾結(jié)晶非對映異構(gòu)體鹽來制備，該鹽由相應(yīng)的外消旋體與適合的光學(xué)活性酸或堿的反應(yīng)形成。
同位素變化本發(fā)明還包括所有適合的同位素變化的治療劑或者其可藥用鹽。本發(fā)明的同位素變化的治療劑或其可藥用鹽被定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量不同于自然界中通常存在的原子質(zhì)量的原子置換的治療劑。可結(jié)合到治療劑和其可藥用鹽中的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。某些同位素變化的治療劑和其可藥用鹽，例如其中結(jié)合了放射性同位素如3H或14C的那些，可用于藥物和/或底物組織分布研究。由于其制備簡單和具有可檢測性，氚代，即3H和碳14，即14C同位素是特別優(yōu)選的。此外，用同位素，如氘，即2H取代可以提供由較高的代謝穩(wěn)定性產(chǎn)生的某些治療優(yōu)點，例如體內(nèi)半衰期增加或減少劑量要求，因此在某些情況下是優(yōu)選的。本發(fā)明的同位素變化的治療劑和其可藥用鹽通?？梢允褂眠m合的同位素變化的適宜試劑通過常規(guī)方法制備。
前藥本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員將清楚，本發(fā)明治療劑可以由前藥得到。前藥的實例包括具有某些保護基的前藥，它們可能不具有這樣的藥理活性，但在某些情況下，可以給藥(例如口服或者經(jīng)非胃腸)并再在之后在體內(nèi)被代謝形成具有藥理活性的本發(fā)明治療劑。
前體部分(Pro-Moiety)還應(yīng)該清楚，例如H.Bundgaard，Elsevier，1985在“前藥的設(shè)計”中所述(該文獻的公開內(nèi)容在此引作參考)，被稱為“前體部分”的某些部分可置于治療劑的適合官能團上。這類前藥也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
衍生物本文使用的術(shù)語“衍生物”或“衍生的”包括化學(xué)修飾的治療劑。這類化學(xué)修飾的示例是用鹵素、烷基、?；虬被脫Q氫。
化學(xué)修飾在本發(fā)明的一個實施方案中，治療劑可以是經(jīng)化學(xué)修飾的治療劑。
本發(fā)明的化學(xué)修飾的治療劑可以增強或減弱治療劑與靶之間的氫鍵合作用、電荷作用、疏水性作用、范德華力或偶極作用。
一方面，被鑒別的治療劑可用作開發(fā)其他化合物的模型(例如模板)。
下面將通過僅參照附圖以舉例形式進一步詳細地描述本發(fā)明，其中附圖1是示意圖；附圖2是反應(yīng)方案；附圖3是結(jié)構(gòu)和棒形圖；附圖4是反應(yīng)方案；附圖5是反應(yīng)方案；附圖6是反應(yīng)方案；附圖7是反應(yīng)方案；附圖8是反應(yīng)方案；附圖9是反應(yīng)方案；附圖10是反應(yīng)方案；附圖11是曲線圖；附圖12是棒形圖；附圖13是棒形圖；附圖14是棒形圖；附圖15是棒形圖；附圖16是棒形圖；附圖17是棒形圖；附圖18是棒形圖；
附圖19是棒形圖；附圖20是棒形圖；附圖21是棒形圖；附圖22是棒形圖；附圖23是棒形圖；和附圖24是棒形圖。
具體實施例方式
實施例實施例1DOPE、DSPE和DSPC直接購自Sigma-Aldrich、Poole、Dorset，UK；DO(14-炔)PE和DO(14-炔)PC按照附圖4-7和附圖2所述合成。測定了1∶1摩爾比的助劑類脂∶DC-Chol的陽離子脂質(zhì)體中的這些化合物的轉(zhuǎn)染特性。這些研究的數(shù)據(jù)如附圖9圖示。
單炔屬脂肪酸的合成合成了五種單炔屬脂肪酸(見下)三種三鍵位置不同(分別在4、9和14位)的C18脂肪酸(5、6和7)和兩種C17脂肪酸(8和9，三鍵位置分別在9和14位)。
十八碳-4-炔酸(5) 十八碳-9-炔酸(6) 十八碳-14-炔酸(7) 十七碳-9-炔酸(8) 十七碳-14-炔酸(9)然后用五種脂肪酸制備每一下列類脂的單炔屬類似物
DOPC(1) DOPE(2) DODAP(3) DOTAP(4)這向我們提供了總計二十種的系列類脂。
DO(4-炔)PC(32) DO(14-炔)PC(34) DO(9-炔)PC(33) DH(9-炔)PC(35) DH(14-炔)PC(36)五種單炔屬DOPC類似物 DO(4-炔)PE(37) DO(14-炔)PE(39) DO(9-炔)PE(38) DH(9-炔)PE(40) DH(14-炔)PE(41)五種單炔屬DOPE類似物
DO(4-炔)DAP(42) DO(14-炔)DAP(44) DO(9-炔)DAP(43) DH(9-炔)DAP(45) DH(14-炔)DAP(46)五種單炔屬DODAP類似物 DO(4-炔)TAP(47) DO(14-炔)TAP(49) DO(9-炔)TAP(48) DH(9-炔)TAP(50) DH(14-炔)TAP(51)五種單炔屬DOTAP類似物十八碳-4-炔酸(5)、十八碳-9-炔酸(6)和十七碳9-炔酸(8)的合成如下制備十八碳-4-炔酸(5)(反應(yīng)方案1-附圖4)。首先，在溫和的酸催化條件下，將DHP與PPTS反應(yīng)，生成戊-4-炔-1-醇的THP保護的衍生物(10)，產(chǎn)率為91％。同時，通過公知的Finkelstein鹵素交換反應(yīng)將1-溴十三碳烷轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性較強的其碘代類似物(11；80％產(chǎn)率)。
在產(chǎn)生SN2與1-碘代十三碳烷的反應(yīng)所需的炔陰離子的HMPA的存在下，用BuLi脫去端基炔10的保護。該步驟為中等產(chǎn)率(49％)。12的酸催化水解使伯醇基暴露，隨后在丙酮中用Jone′s試劑(CrO3，濃H2SO4)氧化該伯醇基，以69％產(chǎn)率得到十八碳-4-炔酸(5)。
類似地，合成十八碳-9-炔酸(反應(yīng)方案2-附圖5)。首先，用DHP和PPTS以幾乎定量的產(chǎn)率(91％)以THP-醚形式保護8-溴-辛-1-醇的羥基。偶聯(lián)1-癸炔與反應(yīng)性較強的15(cf14)，以良好的產(chǎn)率(72％)得到內(nèi)炔產(chǎn)物(16)。在MeOH中，使用TsOH的THP-水解，以92％產(chǎn)率得到烷醇17，然后用Jone′s試劑氧化，得到白色粉末的修飾酸6(76％)。
以合成十八碳-9-炔酸幾乎相同的方式合成十七碳-9-炔酸(8；反應(yīng)方案3-附圖6)，不同僅在于使用1-壬炔作為引入內(nèi)C-C三鍵的試劑(相對于1-癸炔)。
十八碳-14-炔酸(7)和十七碳-14-炔酸(9)的合成如同前面的合成步驟，制備十八碳-14-炔酸(7)的原料是12-溴十二烷-1-醇(反應(yīng)方案4-附圖7)。定量地進行伯醇基團的THP-保護，得到22。然后用Finkelstein交換反應(yīng)生成反應(yīng)性較強的碘代類似物(23)。
在我們改進的炔脫質(zhì)子化-烷基化方法條件下，將戊-1-炔與23反應(yīng)，以良好的產(chǎn)率(59％)得到24。用PPh3Br2/PPh3將THP-醚官能團直接轉(zhuǎn)化為溴化物(25)(76％)；然后使所得溴-炔(25)與CN-進行SN2反應(yīng)，得到脂肪酰基鏈homologation。堿水解腈基(26)，導(dǎo)致引入羧酸酯基，以極好的產(chǎn)率(94％)得到十八碳-14-炔酸(7)。
以幾乎類似的方式(反應(yīng)方案5-附圖8)制備十七碳-14-炔酸(9)。唯一的區(qū)別是需要以兩步引入內(nèi)炔基官能團(相對的是一步)，由于原料易得，以兩步法將THP-醚官能團轉(zhuǎn)化為溴化物(酸催化的水解釋放伯醇基，該基團與CBr4和PPh3進行SN2反應(yīng)，得到所需的溴化物)。DOPC-、DOPE-、DODAP-和DOTAP-類似物的合成DOPC-類似物(如33)的合成包括活化脂肪酸(如6)形成?；溥蚧?imidazolides)，然后在DBU的存在下與sn-甘油基-3-膽堿磷酸(GPC)反應(yīng)。平均產(chǎn)率為大約60％。DOPE類似物(如38)的合成通過使用乙醇胺使DOPC-類似物進行兩相(氯仿/水)酶促磷脂酰轉(zhuǎn)染反應(yīng)來實現(xiàn)，產(chǎn)率為約90％(反應(yīng)方案6-附圖9)。
以類似方式，以定量產(chǎn)率合成了DODAP-類似物(如43)。用硫酸二甲酯處理DODAP化合物，得到硫酸甲酯鹽形式的DOTAP類似物(如48)，產(chǎn)率在70-80％之間(反應(yīng)方案7-附圖10)。
轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)導(dǎo)言如上所述合成DOPC、DOPE、DODAP和DOTAP的單炔屬類似物。用于比較的標準類脂(DOPC、DOPE和DOTAP(鹽酸鹽))購自Sigma-Aldrich，Poole，Dorset，UK。我們的發(fā)明，陽離子性膽甾醇基類脂N1-膽甾醇氧羰基-3，7-二氮雜壬烷-1，9-二胺(CDAN)-靜電荷＝+1.6(pH 7.4)。用我們先前基團22合成CDAN(見下)，現(xiàn)在以與DOPE的1∶1摩爾比的制劑形式(TrojeneTM，Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL，USA)使用。
用TLC或HPLC檢測類脂的純度。所有的類脂都在氬氣氣氛下，在-80℃下，以濃度為5mg/ml或10mg/m的無水二氯甲烷的儲備溶液形式貯存。為制備陽離子脂質(zhì)體，在氬氣氣氛下，將類脂通過注射劑加到園底燒瓶中，再加入新鮮蒸餾的二氯甲烷，如果需要，使?jié)舛葹榧s2.5mg/ml。然后，加入4mM HEPES pH7.0(1ml)，將該兩相體系渦旋混合。在25℃下減壓除去有機溶劑形成脂質(zhì)體混懸液，然后在水浴超聲波儀中超聲2-5分鐘。加入雙蒸水，如果需要，使總體積恢復(fù)為1ml。以5mg/ml的終濃度制備所有脂質(zhì)體溶液。用pH Boy(CamlabLtd.，Over，Cambridgeshire，UK)檢測脂質(zhì)體混懸液的pH，并用濃鹽酸和濃氫氧化鈉的水溶液將其pH調(diào)至7.0±0.1。
脂質(zhì)體通過濾過兩層100nm聚碳酸酯濾膜(IsoporeTMMembraneFilters，Millipore(UK)Ltd.，Watford，Hertfordshire，UK)被擠出10次(擠出機，Northern Lipids，Inc.，Vancouver，BC，Canada)。對于每次制備，用光子相關(guān)分光鏡(PCS)(CoulterN4 PlusSubmicron Particle Sizer，Beckman Coulter，High Wycombe，Buckinghamshire，UK)測定脂質(zhì)體的粒徑分布。對于包含磷脂的脂質(zhì)體，用Stewart測定法23檢測磷脂濃度。在每一種情況下，觀察到最終類脂的濃度為4.7±0.1mg/ml。對于不含磷脂的脂質(zhì)體，擠出中的類脂損失也是不可避免的。對于所有快速基礎(chǔ)的脂質(zhì)體混懸液，類脂總濃度假定為4.7mg/ml。對于緩慢擠出，類脂總濃度假定為4.3mg/ml。非常緩慢擠出的脂質(zhì)體則僅擠出三次，其類脂總濃度假定為4.7mg/ml。
LMDs(脂質(zhì)體Mu∶DNA)的形成包含β-半乳糖苷酶基因(pNGVL1-nt-beta-gal；7.53kbp)的質(zhì)粒DNA在-80℃下以1.2mg/ml的濃度的等份冷凍物形式貯存；如先前所述合成μ(mu)肽(腺病毒核心肽[H2N-Met-Arg-Arg-Ala-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ser-His-Arg-Arg-Met-Arg-Gly-Gly-CO2H])7，并在4℃以1mg/ml濃度等份保存。在快速渦旋混合下，以1∶0.6(w/w)的比例將質(zhì)粒DNA加到4mM HEPES中的mu中制備Mu-DNA復(fù)合物。通過以1∶12(w/w)的比例復(fù)合mu-DNA顆粒與陽離子脂質(zhì)體(如上制備的)制備LMDs，這樣全部配方的所有LMDs基本上都是陽離子性的。對于每次制備，通過PCS測定LMDs的粒徑分布。
細胞轉(zhuǎn)染在37℃/5％CO2的潮濕氣氛下，使Panc-1細胞保持在RPMI/10％FCS/1％青霉素-鏈霉素(GibcoTM，Invitrogen Corporation，Paisley，Scotland，UK)。在轉(zhuǎn)染前24小時，以500μl培養(yǎng)基中將30000個細胞每孔接種到48孔微量滴定板(Corning Costar，Merck Ltd.，Lutterworth，Leicestershire，UK)上。作為對照，將質(zhì)粒DNA(0.5μg，200μl培養(yǎng)基)加入孔中。作為陽性對照，將200μl培養(yǎng)基中的1.5μl TransfastTM(Promega Corporation，Madison，WI，USA；按供應(yīng)商的方法制備的)與質(zhì)粒DNA(0.5μg)復(fù)合并加到孔中。向各孔中加入5μl(0.5μg DNA)的LMD制劑。所有的實驗進行一式四份。將該滴定板渦旋30秒，在37℃下保溫1小時。然后取出培養(yǎng)基，加入500μl新鮮培養(yǎng)基。將細胞在37℃下再保溫24小時。
在37℃/5％CO2的潮濕氣氛下，將COS-7細胞保持在DMEM/10％FCS/1％青霉素-鏈霉素(GibcoTM)中。轉(zhuǎn)染前24小時，以500μl培養(yǎng)基每孔10000個細胞每孔接種到48孔微量滴定板中(CorningCostar)。如上制備質(zhì)粒DNA和TransfastTM對照。向每孔中加入5μl(0.5μgDNA)的LMD制劑。所有的實驗進行一式四份。將該滴定板渦旋30秒，在37℃下保溫1小時。然后取出培養(yǎng)基，加入500μl新鮮培養(yǎng)基。將細胞在37℃下再保溫24小時。
β-半乳糖苷酶測定和總蛋白質(zhì)測定對孔中的培養(yǎng)基通氣并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(GibcoTM)洗滌細胞層。在室溫下，將每孔的細胞溶解在150μl溶解試劑(按照供應(yīng)商的方法制備的；β-Gal Reporter Gene Assay，Roche DiagnosticsGmbH，D-68305 Mannheim，Germany)30分鐘。溶解后，等量的50μl和20μl的每孔混懸液分別用于測定β-半乳糖苷酶活性和細胞總蛋白質(zhì)的測定(以標準化結(jié)果)。
β-gal測定中，將100μl底物試劑加到96孔微量培養(yǎng)板(CorningCostar)中的50μl細胞混懸液中。將該培養(yǎng)板在室溫保溫30分鐘。使用注射50μl引發(fā)試劑的微量培養(yǎng)板光度計(Anthos Lucy 1，Labtech International Ltd.，Ringmer，East Sussex，UK)進行自動引發(fā)(加入底物試劑后產(chǎn)生的酶活性增高)并在30秒后測定酶活性。
用20μl細胞溶解液或牛血清白蛋白作為校準內(nèi)標，并加入200μlBCA試劑(按照供應(yīng)商的規(guī)定)通過BCA測定法(Pierce，Rockford，IL，USA)定量測定細胞蛋白質(zhì)的量。在室溫保溫30分鐘后，用微量培養(yǎng)板閱讀器(Anthos Lucy 1)在570nm進行比色測定。β-半乳糖苷酶活性以RLU/μg蛋白質(zhì)表示。下列附圖的X-軸表示對照和助劑類脂或者陽離子類脂(如附圖標題中所述)。
DOPC-類似物在陽離子脂質(zhì)體制劑中，通常觀察到DOPC消除或嚴重減弱轉(zhuǎn)染，參見DOPE24。CDAN∶助劑類脂，1∶1(mol/mol)脂質(zhì)體的LMDs的轉(zhuǎn)染結(jié)果如下所示(附圖12)。轉(zhuǎn)染水平均非常低。用DO(4-炔)PC代替DOPC致使任何轉(zhuǎn)染能力幾乎全部喪失。但DO(9-炔)PC和DO(14-炔)PC也能夠轉(zhuǎn)染，如果不比DOPC好的話。
用COS-7細胞的相同LMDs的轉(zhuǎn)染結(jié)果如附圖13所示。DOPC和Transfast轉(zhuǎn)染效果一樣好。再者，用DO(4-炔)PC取代DOPC致使轉(zhuǎn)染能力下降。DO(14-炔)PC轉(zhuǎn)染得比DOPC稍好，但DO(9-炔)PC轉(zhuǎn)染是DOPC的大約兩倍。已經(jīng)證明，DO(9-炔)PC即使不比DOPC更好，也與DOPC能同樣好地轉(zhuǎn)染通過兩種細胞系(Panc-1和COS-7細胞)。
DOPE-類似物附圖14顯示了CDAN∶助劑類脂，1∶1脂質(zhì)體的LMDs的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)(COS-7細胞)。當助劑類脂是DOPE或DO(9-炔)PE時，轉(zhuǎn)染水平較高并且大致相同；用DO(4-炔)PE或DO(14-炔)PE代替時，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染下降達約67％。
下面是用CDAN∶助劑類脂，3∶2脂質(zhì)體組成的LMDs，用Panc-1細胞獲得的一套下列結(jié)果(附圖15)。DOPE轉(zhuǎn)染大約為最接近的炔屬類似物(DO(9-炔)PE)的兩倍，盡管絕對水平相當?shù)?。DO(4-炔)PE和DO(14-炔)PE轉(zhuǎn)染得非常差。附圖14中觀察了相同類型的炔屬類似物。
CDAN∶助劑類脂，1∶1脂質(zhì)體的LMDs針對Panc-1細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果如下所示(附圖16)。在誤差棒內(nèi)，DOPE、DO(4-炔)PE和DO(9-炔)PE良好地轉(zhuǎn)染并且大致水平相同。DO(14-炔)PE轉(zhuǎn)染水平大約是DOPE的一半。
隨著CDAN∶助劑類脂比率的降低，脂質(zhì)體和LMDs的陽性電荷也越少，下面顯示的結(jié)果(附圖17)是針對CDAN∶助劑類脂，2∶3摩爾比的脂質(zhì)體的LMDs(Panc-1細胞)的。在此DOPE的轉(zhuǎn)染水平低于Transfast。有趣地是，所有單炔屬類似物的轉(zhuǎn)染都好于DOPE。DO(4-炔)PE和DO(9-炔)PE轉(zhuǎn)染最好，最高可以比DOPE好五倍。在所有的單炔屬類似物中，DO(14-炔)PE轉(zhuǎn)染最差。
附圖18顯示前面實驗的重復(fù)(針對Panc-1細胞)。脂質(zhì)體不是新鮮制備的，但LMDs是新鮮制備的。注意類似類型的存在，而不是DO(4-炔)PE的轉(zhuǎn)染水平已降至大致Transfast的水平。再者，用DO(9-炔)PE取代DOPE的轉(zhuǎn)染相對增強導(dǎo)致了大約6倍的提高。由于例如細胞周期階段的因素，難以比較不同實驗的絕對值。因此，我們包括了“對照”CDAN∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體的LMDs。這些LMDs轉(zhuǎn)染得與由CDAN∶DO(9-炔)PE，2∶3脂質(zhì)體組成的LMDs一樣好。
DOTAP-類似物附圖19顯示了針對Panc-1細胞的完全是由DOTAP或DOTAP-類似物脂質(zhì)體組成的LMDs的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)。除DO(14-炔)TAP之外，所有類似物(包括標準DOTAP)的轉(zhuǎn)染都不如陽性對照Transfast好。所有類似物的轉(zhuǎn)染都好于DOTAP；DO(14-炔)TAP轉(zhuǎn)染比DOTAP提高了六倍。
使用COS-7細胞的DOTAP脂質(zhì)體的LMDs的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)如下所示(附圖20)。在誤差范圍內(nèi)，Transfast和DOTAP的轉(zhuǎn)染類似。用DOTAP取代DO(4-炔)TAP導(dǎo)致轉(zhuǎn)染減少約40％；用DO(14-炔)TAP取代導(dǎo)致轉(zhuǎn)染活性幾乎完全喪失。DO(9-炔)TAP的轉(zhuǎn)染比標準的DOTAP好約1.5倍。在使用由DO(4-炔)TAP到DO(9-炔)TAP，再到DO(14-炔)TAP的單炔屬類似物實驗時觀察到的這種情況也見于使用DOPE-類似物時。
下面(附圖21)是DOPE∶陽離子類脂，1∶1脂質(zhì)體的LMDs(Panc-1細胞)的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)。所有的轉(zhuǎn)染都不如Transfast，但好于單純的DOTAPLMDs。轉(zhuǎn)染水平非常低。用DO(4-炔)TAP或DO(9-炔)TAP取代DOTAP導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的較小增加，但在DOPE∶DOTAP脂質(zhì)體中，用DO(14-炔)TAP置換DOTAP時，觀察到轉(zhuǎn)染水平增高7倍。
用膽甾醇取代DOPE導(dǎo)致下面的結(jié)果(附圖22)。再次觀察到了較低的轉(zhuǎn)染水平(Panc-1細胞)。用DO(4-炔)TAP置換DOTAP幾乎消除了轉(zhuǎn)染作用，使用DO(14-炔)TAP置換則導(dǎo)致轉(zhuǎn)染活性損失約30％。但DO(9-炔)TAP的轉(zhuǎn)染與DOTAP一樣好。
最后一組轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)是針對脂質(zhì)體組成為DOPE∶陽離子類脂，1∶1(附圖23)或者膽甾醇∶陽離子類脂，1∶1(附圖24)的LMDs，和COS-7細胞的。純DOTAP脂質(zhì)體(100％DOTAP)的轉(zhuǎn)染好于DOTAP∶Chol，后者的轉(zhuǎn)染好于DOTAP∶DOPE。所有DOTAP-類似物的轉(zhuǎn)染不如DOTAP∶DOPE，1∶1，或者與其大致相同。
DO(4-炔)TAP∶膽甾醇，1∶1和DO(14-炔)TAP∶膽甾醇，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染與純DOTAP脂質(zhì)體一樣好。使用COS-7細胞時，DOTAP∶膽甾醇，1∶1和DO(9-炔)TAP，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染僅有DO(4-炔)TAP∶膽甾醇，1∶1脂質(zhì)體的一半那樣好。
總結(jié)與結(jié)論·當配制成CDAN∶助劑類脂，1∶1(摩爾比)脂質(zhì)體時，使用Panc-1細胞時，DO(9-炔)PC和DO(14-炔)PC的轉(zhuǎn)染與DOPC一樣好。在使用COS-7細胞時，DO(9-炔)PC的轉(zhuǎn)染是DOPC的兩倍。
·DOPE和DO(9-炔)PE非常好地轉(zhuǎn)染COS-7細胞并且程度與CDAN∶助劑類脂，1∶1脂質(zhì)體類似。DO(4-炔)PE和DO(14-炔)PE的轉(zhuǎn)染是DOPE的約1/3。
·使用摩爾比3∶2的CDAN∶助劑類脂組成的脂質(zhì)體時，DOPE的轉(zhuǎn)染好于所有的單炔屬類似物(Panc-1細胞)。最好的類似物是DO(9-炔)PE，其轉(zhuǎn)染是DOPE的一半。但所有轉(zhuǎn)染水平都非常低。
·在誤差范圍內(nèi)，CDAN∶類脂助劑，1∶1脂質(zhì)體中，使用Panc-1細胞時，DOPE、DO(4-炔)PE和DO(9-炔)PE的轉(zhuǎn)染都同等良好。
·進一步減少LMDs的正電荷，CDAN∶助劑類脂，2∶3脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染與相應(yīng)的1∶1脂質(zhì)體一樣好，當助劑類脂是DOPE則有所不同。DO(4-炔)PE和DO(9-炔)PE的轉(zhuǎn)染要比DOPE好至多6倍。
·CDAN∶DO(9-炔)PE，2∶3脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染同CDAN∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體的一樣好。
·DOTAP和DOTAP∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染不如CDAN∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體。DOTAP的轉(zhuǎn)染水平通常較差。
·純DOTAP-類似物脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染好于純DOTAP脂質(zhì)體的。DO(14-炔)TAP脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比DOTAP好至多6倍(Panc-1細胞)。
·在COS-7細胞下，僅純DO(9-炔)TAP脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染與DOTAP脂質(zhì)體一樣好。DO(14-炔)TAP顯示幾乎根本沒有轉(zhuǎn)染作用。
·純DOTAP或DOTAP-類似物脂質(zhì)體以及相應(yīng)的DOTAP∶DOPE，1∶1或DOTAP-類似物∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體表現(xiàn)出類似情況的轉(zhuǎn)染能力。制劑中包括DOPE顯示出對轉(zhuǎn)染作用的影響。DO(14-炔)TAP∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比DOTAP∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體好約7倍(Panc-1細胞)。
·使用DOTAP∶膽甾醇，1∶1脂質(zhì)體，DO(9-炔)TAP的轉(zhuǎn)染與DOTAP一樣好(Panc-1細胞)。
·DOTAP∶DOPE或DOTAP-類似物∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染都比純DOTAP脂質(zhì)體的少一半(COS-7細胞)。所有DOTAP∶DOPE，1∶1脂質(zhì)體具有類似的轉(zhuǎn)染作用。
·DOTAP∶膽甾醇和DO(9-炔)TAP∶膽甾醇，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染與純DOTAP脂質(zhì)體的一半一樣好(COS-7細胞)。DO(4-炔)TAP∶膽甾醇和DO(14-炔)TAP∶膽甾醇，1∶1脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染與純DOTAP脂質(zhì)體的一樣好。
我們合成并測試了已知的油?；愔囊幌盗腥矊兕愃莆锏捏w外轉(zhuǎn)染能力。在生物評價這些類脂的轉(zhuǎn)染效力期間，我們認識到在每個系列的類脂(除DODAP系列外)中，至少有一個炔屬脂肪酰基類似物與其相應(yīng)的標準油?；愔粯雍?，如果不比它更好的話?；谌I在氧化性上比雙鍵更穩(wěn)定的前提，這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染與其標準品一樣好的那些類似物是適合的體外代用品。此外，三鍵應(yīng)賦予脂質(zhì)體更強的剛性，因此延長了這些脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間。十分清楚，這兩方面的穩(wěn)定性都是可取的。
DO(9-炔)PC(33)和DO(9-炔)PE(38)是最佳磷脂類似物，表明用雙鍵直接取代三鍵不影響體外轉(zhuǎn)染。并且，這些類脂不僅轉(zhuǎn)染良好，而且據(jù)觀察，DOPE-類似物∶CDAN脂質(zhì)體的制備比相應(yīng)的DOPE∶CDAN脂質(zhì)體的制備更容易。這可能是DOPE的脂肪?；湹木薮罄p結(jié)(增強流動性)與生硬的膽甾醇基CDAN(增強剛性)的相反作用的結(jié)果；用三鍵取代DOPE的雙鍵，這種纏結(jié)程度大大降低。這可導(dǎo)致對摻入CDAN的較少對抗，因此較易于配制脂質(zhì)體。同樣，相對于CDAN而言，可能更易于包括增加量的DOPE-類似物。
更重要的是，已經(jīng)顯示相對于CDAN而言，增加中性DOPE類似物的比例(由此減少陽離子脂質(zhì)體ad LMDs的正電荷)不影響轉(zhuǎn)染，這不同于標準DOPE。帶有較少的正電荷的這些LMDs提供了第三種程度的穩(wěn)定性。血液中的陰離子物質(zhì)可以經(jīng)靜電吸引LMDs，可能會標記它們使其破壞，或者更簡單地是，置換mu-DNA復(fù)合物。較少電荷的LMDs將較長時間地循環(huán)，給予顆粒達到其靶組織/細胞的機會。
使用Panc-1細胞，DOTAP∶DO(14-炔)TAP的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)好于DOTAP；使用COS-7細胞，DO(9-炔)TAP轉(zhuǎn)染較好。用不同的助劑類脂得到了不同結(jié)果。
前面說明書中提及的所有出版物在此都引作參考。在不偏離本發(fā)明范圍和實質(zhì)的情況下，所述本發(fā)明方法和體系的各種修飾和變化對于專業(yè)技術(shù)人員是顯而易見的。雖然本發(fā)明用相關(guān)特定優(yōu)選實施方案進行描述，但應(yīng)該清楚，要求保護的本發(fā)明不應(yīng)不適當?shù)厥芟抻谶@些特定的實施方案。的確，對于化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員而言是顯而易見的所述實現(xiàn)本發(fā)明的方式的各種修飾也包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，其含有(i)包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目，和(ii)治療劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是中性類脂。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是陽離子類脂。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中p是1-10，優(yōu)選1、2或3，并且每個X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是下式化合物
6.權(quán)利要求1的組合物，包括至少兩個非極性部分，其中每個部分獨立地選自式X-Y-Z-的非極性部分。
7.權(quán)利要求2的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中每個X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中每個X、Y和Z彼此獨立地進行選擇。
9.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中的極性端基衍生自磷脂類、神經(jīng)酰胺類、三?；视?、溶血磷脂類、磷脂酰絲氨酸類、甘油類、醇、烷氧基化合物、一?；视汀⑸窠?jīng)節(jié)苷脂類、鞘磷脂類、腦苷脂類、磷脂酰膽堿類、磷脂酰乙醇胺類、磷脂酰肌醇(PI)類、二?；视?、磷脂酸、甘油基碳水化合物、多元醇和磷脂酰甘油類。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中的極性端基衍生自磷脂。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中的磷脂是中性或陰離子磷脂。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中的極性端基衍生自選自下列的類脂磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)和3-N，N，N-三甲基氨基丙烷-1，2-二醇(TAP)。
13.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中極性端基(PHG)具有式-W-連接基團-HG，其中W選自CH2、O、NR1和S，其中R1是H或烴基，其中連接基團是任選的連接基團，并且HG是端基。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中端基是下式的基團 或者下式的基團 其中R獨立地選自H和烴基，m是1-10且n是1-10。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中R選自H和C1-6烷基。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中R選自H和C1-3烷基。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中R選自H和甲基。
18.權(quán)利要求14-17任一項的組合物，其中m是1-5，優(yōu)選1、2或3。
19.權(quán)利要求14-18任一項的組合物，其中n是1-5，優(yōu)選1、2或3。
20.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中X是可任選取代的炔基。
21.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中X是未取代的炔基。
22.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中X是未取代的C6-C24炔基。
23.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中X是未取代的C10-C18炔基。
24.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中X是未取代的C16或C17炔基。
25.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中炔屬烴基的C≡C與炔屬烴基的末端距離2-15個碳。
26.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中炔屬烴基的C≡C與炔屬烴基的末端距離2、3、7或13個碳。
27.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中Y是CH2。
28.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中當Y是CH2時，鏈X-Y-Z包含偶數(shù)個原子。
29.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中鏈X-Y-Z包含偶數(shù)個原子。
30.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中Z是烷基。
31.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中Z是C1-C10，優(yōu)選C1-C6，優(yōu)選C1-C3烷基。
32.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中Z是-CH2-。
33.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C10-C18炔基。
34.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中X2和X3獨立地選自未取代的C14炔基和未取代的C15炔基。
35.權(quán)利要求1的組合物，其中的化合物是下式化合物 其中X2和X3獨立地選自CH3(CH2)12C≡C-、CH3CH2CH2C≡C(CH2)10-、CH3(CH2)7C≡C(CH2)5-、CH3(CH2)6C≡C(CH2)5-和CH3CH2C≡C(CH2)10-。
36.權(quán)利要求33、34或35的組合物，其中的極性端基衍生自磷脂的極性端基。
37.權(quán)利要求33、34或35的組合物，其中的極性端基衍生自類脂的極性端基，所述類脂選自磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、3-N，N-二甲氨基丙烷-1，2-二醇(DAP)和3-N，N，N-三甲基氨基丙烷-1，2-二醇(TAP)。
38.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中的治療劑是核苷酸序列。
39.一種包含類脂化合物的脂質(zhì)體，其中類脂化合物包含至少一個非極性部分和極性部分，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目，其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC和DO(14-炔)PC。
40.權(quán)利要求39的脂質(zhì)體，其特征為權(quán)利要求2-37任一項的特征。
41.一種類脂化合物，其包含至少一個非極性部分和極性部分，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基并且其中m是非極性部分的數(shù)目，其中該化合物不是DO(4-炔)PC、DO(9-炔)PC、DO(14-炔)PC、DO(4-炔)PE和DO(14-炔)PE。
42.權(quán)利要求41的類脂化合物，特征為權(quán)利要求2-37任一項的特征。
43.權(quán)利要求39或40的脂質(zhì)體或者權(quán)利要求39或40的化合物，其是與核苷酸序列混合或結(jié)合的。
44.權(quán)利要求1-38任一項的組合物、權(quán)利要求39或40的脂質(zhì)體或者權(quán)利要求41或42的化合物，用于治療。
45.(i)權(quán)利要求1-38任一項的組合物，(ii)權(quán)利要求39或40的脂質(zhì)體，或者(iii)權(quán)利要求41或42的化合物在制備用于治療遺傳性疾病或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用。
46.類脂化合物在制備用于治療遺傳性障礙或病癥或疾病的藥物中的應(yīng)用，其中的化合物是包括至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基，且其中m是非極性部分的數(shù)目。
47.制備陽離子脂質(zhì)體的方法，包括由類脂化合物形成陽離子脂質(zhì)體，所述類脂化合物包含至少一個非極性部分和極性部分，其中非極性部分是式X-Y-Z-的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH2，并且Z是任選的烴基，其中的極性部分是式-[T]mPHG的基團，其中[T]m是選自C(O)、NH、NR1、NHC(O)、C(O)NH、NR1C(O)、C(O)NR1和CH2的任選基團，其中R1是烴基，其中PHG是極性端基，且其中m是非極性部分的數(shù)目。
48.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-38任一項的組合物和可藥用稀釋劑、載體或賦形劑。
49.基本上如本文所述的和任何一張附圖所涉及的組合物。
50.基本上如本文所述的和任何一張附圖所涉及的化合物或陽離子脂質(zhì)體。
51.基本上如本文所述的和任何一張附圖所涉及的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種組合物，該組合物含有(i)包含至少一個非極性部分和極性部分的類脂化合物，其中非極性部分是式X－Y－Z－的基團，其中X是包含一個C≡C鍵的炔屬烴基，Y是O或CH
文檔編號A61P43/00GK1561199SQ02819285
公開日2005年1月5日 申請日期2002年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月30日
發(fā)明者S·費勒特徹, M·R·喬根森, A·D·米勒 申請人:三菱化學(xué)株式會社