V光、γ-射線或者甚至微波)照射局部腫瘤部位來實(shí)現(xiàn)。可替選地，可通過向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康?包含以下化合物的藥物組合物來使細(xì)胞與所述藥劑接觸，所述化合物例如阿霉素、博來霉 素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素 C、鬼白毒素、維拉帕米，或者更優(yōu) 選地，順鉑。所述藥劑可通過將其與溶瘤腺病毒組合來制備并作為組合的治療性組合物或 藥盒使用。
[0106]直接使核酸(特別是DNA)交聯(lián)的藥劑也在考慮之內(nèi)以促進(jìn)DNA損傷，產(chǎn)生與溶瘤腺 病毒的協(xié)同的抗贅生物組合?？墒褂庙樸K類藥劑例如順鉑，以及其它DNA烷化劑。順鉑已被 廣泛地用于治療癌癥，其中在臨床應(yīng)用中使用的有效劑量為:每3周，20mg/m 2，持續(xù)5天，總 共3個(gè)療程。順鉑不能經(jīng)口吸收，因此必須通過靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射遞送。博來 霉素和絲裂霉素 C是通過靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用的另一些抗癌劑。博來霉素 的典型劑量為l〇mg/m2，而絲裂霉素 C的這一劑量為20mg/m2。
[0107]損傷DNA的藥劑還包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和染色體分離的化合物。這樣的化 學(xué)治療性化合物包括阿霉素(也稱為多柔比星）、依托泊苷、維拉帕米、鬼白毒素等。當(dāng)廣泛 地用于在臨床環(huán)境中治療贅生物時(shí)，如下施用這些化合物:對(duì)于阿霉素而言，以21天的時(shí)間 間隔以2 5mg/m2至7 5mg/m2的劑量靜脈內(nèi)推注；對(duì)于依托泊苷而言，以3 5mg/m2至50mg/m2的劑 量靜脈內(nèi)注射或者以雙倍的靜脈內(nèi)劑量口服。
[0108] 破壞核酸前體和亞基的合成和保真度的藥劑也可導(dǎo)致DNA損傷。因此已開發(fā)了多 種核酸前體。特別可用的是已進(jìn)行大量測(cè)試并且容易獲得的藥劑。因此，如5-氟尿嘧啶(5-FU)的藥劑優(yōu)先被贅生物組織利用，使得該藥劑特別地可用于靶向贅生物細(xì)胞。盡管毒性很 大，但是5-FU可應(yīng)用于多種載體(包括局部載體），然而通常利用以3至15mg/kg/天的劑量進(jìn) 行靜脈內(nèi)施用，或者作為替代，可施用5-FC并在靶組織或靶細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0109] 導(dǎo)致DNA損傷并且已得到廣泛使用的其它因素包括通常稱為γ-射線、X-射線和/ 或直接遞送至腫瘤細(xì)胞的放射性同位素。其它形式的DNA損傷因子也在考慮之內(nèi)，例如微波 和UV輻射。最可能的是，所有這些因子對(duì)DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的裝配 和維持造成廣泛的損傷。X-射線的劑量范圍為：日劑量50倫琴至200倫琴持續(xù)長時(shí)間（3周至 4周），至單劑量2000倫琴至6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍廣泛變化，并且取決于同位 素的半衰期、所發(fā)射的放射強(qiáng)度和類型以及贅生物細(xì)胞的攝取。
[0110] 免疫治療可作為聯(lián)合治療的一部分與突變?nèi)芰霾《窘閷?dǎo)的治療組合使用。聯(lián)合治 療的一般方法在下文進(jìn)行了討論。一般來說，腫瘤細(xì)胞必需攜帶一些可適用于靶向，即不存 在于大多數(shù)其它細(xì)胞上的標(biāo)志物。存在很多腫瘤標(biāo)志物，并且其中的任一種均可適用于在 本發(fā)明的背景下進(jìn)行靶向。常見的腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿腫瘤 相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原（Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B和p 155。CAR、整合 素或其它細(xì)胞表面分子的特異性抗體可用于鑒定腺病毒可充分感染的細(xì)胞。CAR是腺病毒 受體蛋白。腺病毒的五鄰體基底(penton base)介導(dǎo)病毒附著于整合素受體和顆粒內(nèi)化。
[0111] 本領(lǐng)域技術(shù)人員參考"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版，1980。基 于所治療對(duì)象的狀況，將有必要進(jìn)行一些劑量變化。在任何情況下，負(fù)責(zé)施用的人員將確定 用于個(gè)體對(duì)象的合適劑量。此外，對(duì)于人施用，制劑應(yīng)滿足Π )Α生物標(biāo)準(zhǔn)局(FDA Office of Biologies standards)所要求的無菌度、熱原性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0112] 除將溶瘤腺病毒治療與化學(xué)治療和放射治療組合之外，還考慮到與其它基因治療 的組合將是有利的。例如，將溶瘤腺病毒的靶向同時(shí)與p5 3的靶向組合可產(chǎn)生改善的抗癌治 療?？梢韵氲降兀幋a多肽的任何腫瘤相關(guān)基因或核酸均可以以此方式靶向，例如p21、Rb、 APC、DCC、NF-1、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-1、MEN-1、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、ra s、my c、 neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl^Pabl〇
[0113] 還可有利地將抗血管生成治療與本文中公開的溶瘤腺病毒治療組合。特別地，貝 伐單抗（Avastin?，Genentech/Roche)是一種血管生成抑制劑，其為減慢新血管生長的藥 物。其被許可用于治療多種癌癥，包括結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌(在USA之外）、成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤（USA和日本）、腎癌和卵巢癌。貝伐單抗是抑制血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF_A)的一種人源化單克隆抗體。VEGF-A是在多種疾病 中（特別是在癌癥中）刺激血管生成的化學(xué)信號(hào)。貝伐單抗是美國最早可在臨床上使用的血 管生成抑制劑。
[0114] 還考慮到，可將上述治療與所有類型的外科手術(shù)組合實(shí)施。約60%的癌癥患者將 經(jīng)受一些類型的外科手術(shù)，其包括預(yù)防性、診斷性或分期性、治療性和姑息性外科手術(shù)?？?將這些類型的外科手術(shù)與其他治療(例如溶瘤腺病毒治療)聯(lián)合使用。
[0115] 治療性外科手術(shù)包括切除，其中物理去除、切除和/或破壞癌組織的全部或一部 分。腫瘤切除指物理去除腫瘤的至少一部分。除腫瘤切除之外，通過外科手術(shù)的治療包括激 光外科手術(shù)、冷凍外科手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微鏡控制的外科手術(shù)(莫氏外科手術(shù)）。還考慮 到，可將本發(fā)明與去除淺表性癌癥、初癌或偶然量的正常組織聯(lián)合使用。
[0116] 在切除一部分或全部癌細(xì)胞、癌組織或腫瘤之后，可在體內(nèi)形成腔?？赏ㄟ^用另外 的抗癌治療灌注、直接注射、全身性施用或局部施用該區(qū)域來完成治療?？芍貜?fù)這樣的治 療，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12個(gè)月。這些治療也可具有不同的劑量。此外，在涉及多于一種單一治療類型（即構(gòu)建體、抗 癌劑和外科手術(shù)）的治療中，這些治療類型之間的時(shí)間段可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或約24小時(shí)；為約1、2、3、4、5、6或7天;為約1、 2、3、4或5周；以及為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月，或者更久。
[0117] 還應(yīng)指出的是，上述任意治療本身可證明是有用的。在此方面，以組合提及的化學(xué) 治療和非突變?nèi)芰霾《局委熞矐?yīng)當(dāng)理解為考慮了這些方法可單獨(dú)采用。
[0118] IV.篩選方法
[0119] 在腺病毒△ 24和不能夠結(jié)合Rb的其它突變腺病毒的情況下，Rb途徑必需是缺陷型 的以使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯病毒蛋白。要求Rb途徑是缺陷型的意指其不能夠抑制E2F的轉(zhuǎn)錄-激 活活性。如果E2F的活性未受到抑制，則其激活細(xì)胞基因和腺病毒DNA的轉(zhuǎn)錄。E2F可逃避抑 制的方式的實(shí)例包括但不限于:Rb不能夠結(jié)合E2F(即，E1A與Rb結(jié)合）、E2F過表達(dá)、Rb比E2F 少以及其中Rb保持磷酸化的情況。
[0120]另外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在對(duì)象中鑒定Thl極化的免疫應(yīng)答對(duì)本發(fā)明溶瘤腺病毒的 成功治療具有預(yù)示性。而且，Th2應(yīng)答的存在可以是未響應(yīng)的指示。一種特別的Thl標(biāo)志物是 IL-12p70。此外，可評(píng)估高水平的針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（例如NLRP4)的抗體，并且如果發(fā)現(xiàn)則 預(yù)測(cè)響應(yīng)于溶瘤病毒治療。
[0121] Th 1 標(biāo)志物包括 IL-1 β、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IFN- γ、TNF-α、TNF-β、GMCSF、經(jīng) 切割的胱天蛋白酶3、新蝶呤和β2-微球蛋白（02-microglobuin) Jhl表面標(biāo)志物包括 CXCR3、CCR5、CCR1 以及 IL-12 受體 β? 和 a 鏈。Th2 標(biāo)志物包括 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、 TGF0 和磷酸化 STAT3。Th2 表面標(biāo)志物包括 CXCR4、CCR3、CCR4、CCR7、CCR8、IL-1 受體和 CD30。 腫瘤相關(guān)抗原包括 BRAF、CABYR、CRISP3、CSAG3、CTAG2、DHFR、FTHL17、GAGE1、LDHC、MAGEA1、 MAGEA3、MAGEA4、MAGEB6、MAPK1、MICA、MUC1、NLPR4、NYES01、P53、PBK、PRAME、S0X2、SPANXA1、 SSX2、SSX4、SSX5、TSGA10、TSSK6、TULP2、XAGE2和ZNF165。特別地，檢測(cè)CABYR、MAGEA1、 MAGEA3、MAGEB6、NLPR4、NYES01、PBK和ZNF165中的1、2、3、4、5、6、7個(gè)或全部8個(gè)。
[0122] 可使用抗體來檢測(cè)腺病毒蛋白（例如ΕΙΑ)、Rb以及Rb途徑的其它蛋白質(zhì)、Th 1應(yīng)答、 Th2應(yīng)答或腫瘤相關(guān)抗原。在本發(fā)明的某些方面，可產(chǎn)生一種或更多種與多種抗原具有免疫 反應(yīng)性的抗體。這些抗體可用于本文下文所述的多種診斷或治療應(yīng)用。
[0123] 本文中使用的術(shù)語"抗體"旨在廣泛指任何免疫結(jié)合劑，例如以6，181、184、18〇和 IgE。一般來說，IgG和/或IgM是優(yōu)選的，因?yàn)槠涫窃谏砬闆r下最常見的抗體并且因?yàn)槠渥?容易在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下制備。用于制備和表征抗體的方法在本領(lǐng)域中也是公知的(參見，例如 Harlow和Lane( 1988)，其通過引用并入本文）。
[0124] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了與至少一種物質(zhì)連接以形成抗體綴合物的針對(duì)抗 原的抗體以及所翻譯的蛋白質(zhì)、多肽和肽。為了提高抗體分子作為診斷劑或治療劑的效力， 常規(guī)地連接或共價(jià)結(jié)合至少一種期望分子或部分或者與其形成絡(luò)合物。報(bào)道分子被定義為 可使用測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)的任何部分。已與抗體綴合的報(bào)道分子的非限制性實(shí)例包括酶、放射 性標(biāo)記、半抗原、焚光標(biāo)記、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子、生色團(tuán)、發(fā)光分子、光親和分子、著色 顆?；蚺潴w例如生物素。
[0125] 抗體綴合物的某些實(shí)例是其中抗體與可檢測(cè)標(biāo)記連接的那些綴合物。"可檢測(cè)標(biāo) 記"是由于其特異性的功能特性和/或化學(xué)特征而可被檢測(cè)的化合物和/或元素，其使用允 許檢測(cè)和/或者進(jìn)一步量化(如果期望的話)其所連接的抗體。
[0126] 可使用抗體作為腺病毒蛋白的探針通過western印跡分析來確定細(xì)胞群中的Rb表 達(dá)或腺病毒基因表達(dá)。檢測(cè)到的病毒蛋白水平將指示該細(xì)胞中是否正在發(fā)生病毒蛋白表 達(dá)。
[0127] 可采用用于檢測(cè)生物組分(例如參與腺病毒復(fù)制或者細(xì)胞Rb或p53途徑的蛋白質(zhì)、 多肽或肽）的免疫檢測(cè)方法。一些免疫檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫 測(cè)定(RIA)、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、生物發(fā)光測(cè)定和Western印跡等 等。多種可用免疫檢測(cè)方法的步驟已在科學(xué)文獻(xiàn)例如Doolittle和Ben-Zeev( 1999) ;Gulbis 和Galand(1993) ;De Jager等（1993) ;Nakamura等（1987)中進(jìn)行了描述，每一篇均通過引用 并入本文。
[0128] 在抗原檢測(cè)方面，所分析的生物試樣可以是懷疑含有抗原的任何試樣，例如，如組 織切片或樣品、經(jīng)均化的組織提取物、細(xì)胞、細(xì)胞器、上述任一含抗原組合物的分離和/或純 化形式，或者甚至是與細(xì)胞或組織接觸的任何生物流體，包括血液和/或血清，但優(yōu)選組織 試樣或提取物。
[0129] -般來說，免疫復(fù)合物形成的檢測(cè)在本領(lǐng)域中是公知的并且可通過應(yīng)用多種方法 實(shí)現(xiàn)。這些方法一般基于標(biāo)記或標(biāo)志物的檢測(cè)，所述標(biāo)記或標(biāo)志物例如那些放射性標(biāo)簽、熒 光標(biāo)簽、生物標(biāo)簽和酶標(biāo)簽中的任一種。涉及這些標(biāo)記的使用的美國專利包括3，817,837、 3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275，149和4,366,241，每一篇均通過引用 并入本文。當(dāng)然，如本領(lǐng)域中已知的，通過使用第二結(jié)合配體(例如二抗和/或者生物素/親 和素配體結(jié)合布置)可發(fā)現(xiàn)額外的優(yōu)點(diǎn)。
[0130] 可在治療之前、期間或之后對(duì)腫瘤進(jìn)行活組織檢查并對(duì)其進(jìn)行上述測(cè)試以確定膠 質(zhì)瘤細(xì)胞是否存在?；罱M織檢查方案的一個(gè)實(shí)例如下。立體定向活組織檢查是將金屬探針 精確地導(dǎo)入腦瘤中，切下腦瘤的一小片并取出使得可在顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在局部麻 醉下將患者轉(zhuǎn)運(yùn)至MRI或CAT掃描套間并使框架(frame)與頭皮相連?？蚣艿?針"與顱骨的 外板相連以剛性固定(框架將不會(huì)并且不能從該點(diǎn)向前移動(dòng)直至活組織檢查完成）。獲得掃 描(MRI或CT)。神經(jīng)外科醫(yī)生對(duì)掃描進(jìn)行檢查并確定針對(duì)靶標(biāo)的最安全軌道或途徑。這意味 著避開了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。確定靶標(biāo)的空間坐標(biāo)并選擇最佳途徑。在全身麻醉下進(jìn)行活組織檢 查。在進(jìn)入點(diǎn)之上產(chǎn)生小的切口并經(jīng)顱骨鉆取小孔。對(duì)"硬腦膜"進(jìn)行穿孔并向靶標(biāo)緩慢地 導(dǎo)入活組織檢查探針。取出活組織檢查樣品并將其置于保存流體中以用于在顯微鏡下進(jìn)行 檢測(cè)。通常，活組織檢查套間中有病理學(xué)家，使得可快速確定活組織檢查的成功。
[0131] V.實(shí)施例
[0132] 包括以下實(shí)施例以證明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到， 以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實(shí)踐中起良好作用的技術(shù)，并且因 此可認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到可在所 公開的具體實(shí)施方案中進(jìn)行多種改變并且仍獲得相似或類似的結(jié)果而不偏離本發(fā)明的概 念、精神和范圍。更具體地，將顯而易見的是，可用在化學(xué)和生理上均相關(guān)的某些物質(zhì)替代 本文中所述的物質(zhì)同時(shí)將獲得相同或類似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的所有 這些類似替代和改變均被認(rèn)為在如所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
[0133] 實(shí)施例1-方法
[0134] 在德克薩斯州休斯敦（Houston Texas)的MD安德森癌癥中心（MD Anderson Cancer Center)在研究人員贊助的IND下開始DNX-2401對(duì)高級(jí)膠質(zhì)瘤的1期、劑量遞增、兩 部分研究。為了符合本研究，要求患者患有經(jīng)組織學(xué)上證實(shí)的復(fù)發(fā)性高級(jí)惡性膠質(zhì)瘤。本研 究的A組評(píng)價(jià)將單劑量的DNX-2401直接瘤內(nèi)注射到經(jīng)活組織檢查確定的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤的生 長區(qū)中，而B組評(píng)價(jià)將分開劑量的病毒注射到切除膠質(zhì)瘤后的切除床中。兩個(gè)研究組的起始 劑量均為1〇 7(例如1 X 1〇7)病毒顆粒(vp)，并計(jì)劃以半對(duì)數(shù)增量將劑量遞增至31(Vp。本研究 的主要目的是確定將DNX 2401原位注射到人腦瘤中的安全性、耐受能力、可行性和生物學(xué) 效應(yīng)。
[0135] 使A組患者通過針接受直接的瘤內(nèi)注射并按組群(cohort)經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)劑量遞增