減弱bace1和ps1相互作用的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默癥的組合物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及減弱BACE1和PS1相互作用的物 質(zhì)在制備治療阿爾茨海默癥的組合物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默癥（Alzheimer's Disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是造 成老年癡呆的最主要病因之一?；颊吲R床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、記憶力衰退、人格異常等。 AD的主要病理學(xué)特征為病人大腦內(nèi)形成的致密淀粉樣蛋白斑塊（Senile plaques)和神經(jīng) 纖維絲纏結(jié)（Neurofibrillary Tangles, NFTs)。在AD病例中，家族遺傳性病例約占5%， 對(duì)運(yùn)類例的研究顯示，APP、PSEN 1和P沈N 2基因上的突變與AD發(fā)病直接相關(guān)，其他絕大 部分散發(fā)病例的致病機(jī)理尚不清楚。對(duì)于阿爾茨海默癥發(fā)病原因最重要的假說是β-淀粉 樣蛋白假說，該假說認(rèn)為淀粉樣蛋白斑塊的主要成分Αβ在AD的疾病發(fā)生過程中起根本性 作用。在復(fù)雜的遺傳因素和環(huán)境因素長(zhǎng)期作用下，神經(jīng)細(xì)胞異常地大量產(chǎn)生A β，積累形成 Α0寡聚體和淀粉樣蛋白斑塊。Αβ通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)（包括自由基反應(yīng)、線粒體氧化損 傷和異常的炎癥反應(yīng)等），直接或間接地作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致突觸功能異常和神 經(jīng)元損傷，同時(shí)引起小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞激活，加速神經(jīng)纖維絲纏結(jié)的形成。此外， A0寡聚體與突觸功能異常的關(guān)系尤其密切，可W抑制突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，從而損傷突觸的 可塑性及記憶的形成。而對(duì)于Αβ的異常積累，除了由分泌酶剪切活性的異常調(diào)節(jié)所導(dǎo)致， 還極有可能是因神經(jīng)系統(tǒng)不能對(duì)產(chǎn)生的Aβ進(jìn)行有效清除。
[0003] Αβ是I型跨膜蛋白ΑΡΡ經(jīng)過β-分泌酶和丫-分泌酶順序剪切后的產(chǎn)物。淀 粉樣蛋白前體蛋白ΑΡΡ在細(xì)胞內(nèi)有兩種代謝途徑：1) α -分泌酶在A β序列內(nèi)剪切ΑΡΡ，生 成sAPPa和C83，C83被丫-分泌酶繼續(xù)剪切后產(chǎn)生長(zhǎng)度較短的膚段Ρ3片段。2)ΑΡΡ經(jīng) BACE1剪切生成的C99膚段繼續(xù)被丫 -分泌酶剪切產(chǎn)生有35至43個(gè)氨基酸殘基的淀粉樣 蛋白膚段，其中具有40個(gè)氨基酸殘基的A β 40占膚段組成的絕大部分，而能夠引起致密淀 粉樣斑塊的聚集的Aβ 42則只占10%。β -分泌酶是一種I型天冬氨酸蛋白酶，在大腦神 經(jīng)元中有豐富的表達(dá)，亞細(xì)胞定位富集于具有較低抑的內(nèi)體、高爾基體小泡等酸性亞細(xì)胞 結(jié)構(gòu)。丫-分泌酶是由 Presenilin，化cast;rin，APHl (Anterior Pharynx Defective 1)和 Pen-2(Presenilin Enhance;r-2)四種跨膜蛋白組裝形成的蛋白復(fù)合體，目前認(rèn)為運(yùn)四種組 分為構(gòu)成具有天冬氨酸蛋白酶活性的丫-分泌酶所必需，其中，Presenilin是丫-分泌酶 復(fù)合體的蛋白酶催化亞基。β-分泌酶和丫-分泌酶在生理?xiàng)l件下都有多種底物，并且運(yùn)些 底物的剪切產(chǎn)物在神經(jīng)發(fā)育過程W及神經(jīng)元功能等多方面的信號(hào)調(diào)節(jié)都發(fā)揮了重要功能。 而β-分泌酶和Τ-分泌酶也可能通過蛋白質(zhì)間相互作用形成剪切復(fù)合體對(duì)于ΑΡΡ發(fā)揮蛋 白水解功能。
[0004] 目前通過抑A批準(zhǔn)在多國(guó)上市的用于AD臨床治療的藥物分為兩類，第一類屬于乙 酷膽堿醋酶抑制劑，包括多奈贓齊，利斯的敏和加蘭他敏，能通過抑制乙酷膽堿的降解，增 加膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，改善認(rèn)知；第二類是美金剛，它是一個(gè)NMDA受體的非競(jìng)爭(zhēng)性括抗 劑，被認(rèn)為可W保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。但是它們都只能起到暫時(shí)緩解癥 狀的作用，無法從根本上治療阿爾茨海默癥。近期處于研發(fā)或者臨床實(shí)驗(yàn)階段的抗AD藥物 包括分泌酶調(diào)節(jié)物（丫-secretase mo化lators，GSMs)、A0寡聚體形成抑制劑、抗炎癥藥 物、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)劑、降低膽固醇的藥物W及抗氧化藥物等。除此之外，Αβ免疫療法W及 激素療法等治療方法也正被用于臨床研究和實(shí)驗(yàn)。丫-分泌酶抑制劑也屬于一類分泌酶調(diào) 節(jié)物，一直受到廣泛關(guān)注和研究，它們能夠通過抑制丫 -分泌酶的天冬氨酸蛋白酶活性而 減少A β產(chǎn)生，但因其對(duì)丫 -分泌酶其他剪切底物（如Notch、E-ca化erin等）的剪切抑制 等毒副作用而在臨床實(shí)驗(yàn)中療效甚微。 陽〇化]綜上，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步開發(fā)對(duì)于AD的臨床治療有效但副作用較低的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供減弱BACE1和PS1相互作用的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默 癥的組合物中的用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1 0ACE1)和早老蛋 白UPS1)之間相互作用的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默癥的組合物（藥物）中的用途。
[0008] 在本發(fā)明的另一方面，提供減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間 相互作用的物質(zhì)在制備下調(diào)（細(xì)胞水平）Αβ的組合物（藥物）中的用途；較佳地，所述的 Αβ包括：（細(xì)胞內(nèi)）總Αβ，Αβ42，Αβ40和/或Αβ38。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相 互作用的物質(zhì)包括：3 α -木通祗酸（3 α -Akebonoic acid)。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相 互作用的物質(zhì)是對(duì)β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和丫-分泌酶的活性無影響的物質(zhì)。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相 互作用的物質(zhì)不包括對(duì)β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和丫-分泌酶的活性產(chǎn)生影響的物 質(zhì)。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療阿爾茨海默癥或用于下調(diào)Αβ的藥物組 合物，所述的組合物包括：減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相互作用 的物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 在一個(gè)選例中，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相互 作用的物質(zhì)在藥物組合物中的含量是有效量的。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和早老蛋白1之間相 互作用的物質(zhì)包括：3α -木通祗酸；較佳地，所述的減弱β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和 早老蛋白1之間相互作用的物質(zhì)是對(duì)β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1和丫-分泌酶的活性 無影響的物質(zhì)。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療阿爾茨海默癥或用于下調(diào)A β的藥盒， 所述的藥盒中包括：容器，W及裝于該容器中的所述的藥物組合物。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選治療阿爾茨海默癥的潛在物質(zhì)或下調(diào) Α0 (細(xì)胞內(nèi)Αβ水平）的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：
[0017] (1)將候選物質(zhì)與β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1相互作用的體系接 觸；
[0018] (2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1相互作用的影 響；
[0019] 若所述候選物質(zhì)可抑制（包括：減弱、阻斷或解離）β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1 與早老蛋白1相互作用，則表明該候選物質(zhì)是治療阿爾茨海默癥的潛在物質(zhì)或下調(diào)Αβ的 潛在物質(zhì)。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選例中，在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1 與早老蛋白1相互作用的體系中；和/或
[0021] 步驟（2)包括：檢測(cè)測(cè)試組的體系中β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1 相互作用情況，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的β位淀粉樣 前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1相互作用的體系；
[0022] 如果測(cè)試組中β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1的相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué) 上弱于（優(yōu)選顯著弱于，如弱20% W上，較佳的弱50% W上厘佳的弱80% W上）對(duì)照組， 就表明該候選物質(zhì)是治療阿爾茨海默癥的潛在物質(zhì)或下調(diào)Aβ的潛在物質(zhì)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)包括（但不限于）：小分子化合物，針對(duì)β位淀 粉樣前體蛋白裂解酶1和/或早老蛋白1或其上下游蛋白或通路設(shè)計(jì)的調(diào)控β位淀粉樣 前體蛋白裂解酶1和/或早老蛋白1的表達(dá)、活性、作用方式、作用時(shí)間的物質(zhì)。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，采用免疫沉淀法，酵母雙雜交法，巧光素酶報(bào)告基因法，巧光共 振能量轉(zhuǎn)移法，Split-TEV法等方法來確定β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1與早老蛋白1相 互作用的強(qiáng)弱。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自：細(xì)胞體系（或細(xì)胞培養(yǎng)物體系）、亞細(xì)胞體系 (或亞細(xì)胞培養(yǎng)物體系）、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。
[00%] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和 /或動(dòng)物試驗(yàn)，W從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于治療阿爾茨海默癥或下調(diào)A β有用 的物質(zhì)。
[0027] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0028] 圖1、BACE1/PS1相互作用W及分泌酶抑制劑和調(diào)節(jié)劑對(duì)其影響。
[0029] (A)U20S細(xì)胞檢測(cè)瞬時(shí)過表達(dá)的CFP-PS1與BACE1-YFP蛋白亞細(xì)胞共定位。
[0030] 度)肥K293T細(xì)胞檢測(cè)瞬時(shí)過表達(dá)的PS1 (化（全長(zhǎng)））和PS1-NTF與3' HA-BACE1 的免疫共沉淀。圖中，β-Gal作為免疫沉淀的陰性對(duì)照。
[0031] (C)巧光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè) CFP-PSl/APHlaL-YFP，CFP-PS1/NCT-YFP，CFP-PS1/ BACE1-YFP，BACE1-CFP/YFP-PS1之間的能量轉(zhuǎn)移效率，W CFP-YFP作為陽性對(duì)照， BACE1-CFP/YFP作為陰性對(duì)照。
[0032] (D)在肥K293MSR細(xì)胞中用Split-TEV法檢測(cè)蛋白間相互作用，NTEV-KvBetal/ Kvl. 1-CTEV 作為陽性對(duì)照，NTEV-KvBetal/APHlakCTEV 和 NTEV-KvBetal/BACEl-CTEV 作為 陰性對(duì)照，檢測(cè) PSl-NTF-NTEV/APHlakCTEV，APHlakNTEV/PSl-NTF-CTEV，PSl-NTF-NTEV/ BACEl-CTEV，BACEl-NTEV/PSl-NTF-CTEV 相互作用信號(hào)。
[0033] 巧）檢測(cè)丫 -分泌酶抑制劑 k685, 458 和 BMS-708163, BACEl 抑制劑 BSI-IV 度ACEl inhibitor IV，購自Ca化iochem)，丫-分泌酶調(diào)節(jié)劑E2012(由銀杏樹藥業(yè)合成）對(duì)于PSl/ BACE1在Split-TEV實(shí)驗(yàn)中的相互作用信號(hào)影響W及在細(xì)胞Αβ 42產(chǎn)生的抑制作用。化合 物均用1 μ Μ濃度處理細(xì)胞。
[0034] 圖2、3 α -木通祗酸（3 α -Akebonoic acid)對(duì)于PS1/BACE1相互作用和細(xì)胞產(chǎn)生 A 0的影響。
[0035] (A) 3 α-Akebonoic acid 化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0036] 度）10μΜ 濃度下 3α-Akebonoic acid 對(duì)于 NTEV-KvBetal/Kvl. 1-CTEV 和 PS 1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV在Sp 1 it-TEV實(shí)驗(yàn)中相互作用信號(hào)的影響。Vehic 1 e :溶液對(duì)照。
[0037] (C)10μM濃度下3α-Akebonoicacid對(duì)于肥K293APPsw