009 .Methods Enzymol .463:169-189)。與常規(guī)使用的原核系統(tǒng) 不同，巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)具有專用的高容量蛋白分泌途徑，這極大簡化了上游 和下游蛋白質(zhì)純化兩者(Gasser等，2013.Future Microbiol .8:191-208)。此外，作為酵母 生物體，巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)不產(chǎn)生內(nèi)毒素，消除了在生物醫(yī)學應用之前對費力 且低效的內(nèi)毒素去除步驟的需求(Vogl等，2013.Curr .Opin.Biotechnol .Doi :pii : S0958-1669(13)00038-4.10.1016/j .copbio. 2013.02.024)。盡管巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)被廣泛用于重組蛋白的高水平表達，但對于在這種工業(yè)相關宿主中生產(chǎn)LST來說 存在兩個主要障礙:缺少從野生型溶葡球菌素基因的表達，以及野生型蛋白序列的異常糖 基化。
【附圖說明】
[0010] 圖1A-1B描繪了野生型LST基因中主要有害序列的作圖。圖1A是所檢查的嵌合WT-SYN基因的示意圖。在圖1B中，顯示了一組嵌合基因的LST表達水平，正如通過SDS-PAGE蛋白 質(zhì)條帶的定量密度測量法所測量的。
[0011] 圖2描繪了檢查去糖基化對LST活性的影響的實驗結(jié)果。已發(fā)現(xiàn)，非常規(guī)的序列子 突變提高非糖基化LST的性能。在培養(yǎng)上清液的2倍連續(xù)稀釋液上進行使用金黃色葡萄球菌 (S.aureus)SA113的MIC測定。示出了每個酶的每種稀釋液的0D650讀數(shù)。注意，三種活性最 高的酶在512倍至1024倍稀釋水平之間達到MIC-50。誤差條表示標準偏差。
[0012] 圖3描繪了分析非糖基化LST變體的活性的實驗結(jié)果。示出的結(jié)果來自于檢查LST 變體的抗細菌效能的實驗，正如通過最低抑制濃度(MIC)測定法所測量的。評估純化的酶的 連續(xù)稀釋液對金黃色葡萄球菌（S. aureus)菌株SA113的生長抑制。示出的結(jié)果是生長24小 時后的0D650讀數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明涉及一種用于在酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)非糖基化溶葡球菌素(LST)變體蛋白 的方法。所述生產(chǎn)方法包括將LST變體核酸分子導入到巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) 中，以產(chǎn)生表達LST的巴斯德畢赤酵母（P . pastoris )生物體，將所述巴斯德畢赤酵母 (P.pastoris)生物體在生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，以及從所述生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)分離 所述非糖基化LST蛋白或蛋白變體。在優(yōu)選實施方式中，所述LST核酸分子包括SEQ ID NO:3 的合成的野生型LST核酸分子、SEQ ID _:5的合成的1^!'變體核酸分子（也稱為1^丁 (S126P))或SEQ ID N0:7的合成的LST變體核酸分子(也稱為LST(T126A))。下述生產(chǎn)方法也 是優(yōu)選的，即，在所述生產(chǎn)方法中，生物反應器包含低鹽Bifidius選擇培養(yǎng)基(BSM)，并在整 個培養(yǎng)期間維持在20°C下。在使用本發(fā)明方法的生產(chǎn)的基礎上，本發(fā)明還包括SEQ ID NO:8 的非糖基化LST變體蛋白、SEQ ID NO: 4的非糖基化LST變體蛋白（也稱為LST(SI26P)蛋白） 和SEQ ID NO:6的LST變體蛋白（也稱為LST(T127A)蛋白）。另外，本發(fā)明提供了編碼所述LST 變體蛋白的重組核酸分子，以及載體例如表達載體和帶有這些載體的重組宿主細胞。
[0014]已顯示，本發(fā)明的非糖基化LST變體蛋白具有與野生型LST蛋白相近水平的防止細 菌生長的活性，并因此可以被提供在藥物組合物中，用于抑制細菌生長的方法中。本發(fā)明的 生產(chǎn)變體LST蛋白的方法，提供了避免產(chǎn)生內(nèi)毒素的成本效益高的高效方法。結(jié)果，本發(fā)明 還包括治療性蛋白以及這些蛋白在預防或治療細菌感染中的應用。
[0015]發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明涉及從酵母表達系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)高效、高水平生 產(chǎn)LST的方法?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，LST在酵母系統(tǒng)中的低水平表達可歸因于轉(zhuǎn)錄提前終止，這通過 去除這些富含A/T的基因區(qū)段以產(chǎn)生更平衡的核苷酸分布來克服。對于野生型LST的異常糖 基化問題來說，已顯示在兩個共有序列段Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr之一處的異常N-連接 的糖基化嚴重損害野生型LST(SEQ ID N0:1)的活性。盡管位于中央的Asn-Ser-Thr(NST)序 列子中N-連接的天冬酰胺(N125)的突變消除了糖基化，但它也造成催化性能降低90%。相 反，所述序列子的第二和第三氨基酸處的置換允許分泌具有完全野生型LST活性的均勻地 非糖基化的LST變體(SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6)。使用本發(fā)明的方法，可以在小規(guī)模生物 反應器中以約500mg/L的量生產(chǎn)LST變體，并且可以使用簡單的兩步純化方法以高純度回收 該材料的50%。本發(fā)明的表達系統(tǒng)產(chǎn)生大量表現(xiàn)出野生型催化活性的LS頂每，并且沒有污染 的內(nèi)毒素。
[0017]進行實驗以在酵母中表達LST基因。所探索的第一種酵母系統(tǒng)是釀酒酵母 (3&(^1^1'〇1115^68〇616￥18136)，在其中對野生型1^1'基因（3￡(>)10腸:2)進行克隆和表達。 然而，盡管存在在培養(yǎng)上清液中可以檢測到裂解活性這一事實，但表達得率不佳。用于實驗 的下一個系統(tǒng)是巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)。由于內(nèi)毒素的缺少和高的固有的重組蛋白 表達和分泌能力，巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)作為用于治療性蛋白質(zhì)的成本效益高的生 產(chǎn)平臺得到普遍應用。因此，在嘗試從酵母生物體獲得更高表達得率的努力中，將野生型 LST基因（SEQ ID N0:2)克隆到巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9中，并轉(zhuǎn)化到 巴斯德畢赤酵母（P. pas tor is)菌株GS115中。這種構(gòu)建物刪除了野生型LST本源的前原 (pre-pro)序列，并將該酶融合到來自于巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)的a交配因子分泌信 號。然而，在誘導GS115宿主后，通過搖瓶培養(yǎng)上清液的SDS-PAGE分析未能檢測到LS頂每(SEQ ID N0: 1)。對于其他基因報道了類似的結(jié)果，其中已發(fā)現(xiàn)表達水平低至不可檢測 (Sinclair，G?和F.Y. Choi ? 2002 .Protein Expr. Pur if ? 26:96-105)。已知蛋白質(zhì)從巴斯德 畢赤酵母(P. pastor is)的分泌是涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和通過分泌途徑向培養(yǎng)基轉(zhuǎn) 運的多步過程。對于給定蛋白質(zhì)靶來說，這些步驟中的任一步都可能是限速的（Delic等， 2013.FEMS Microbiol.Rev.doi:10.1111/1574-6976.12020;Love等，2012.PL〇S One 7: e37915)。因此，盡管巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)用于生物治療劑生產(chǎn)具有優(yōu)勢，但獲得 高水平表達是困難的。
[0018]最初認為，在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中缺少LST的任何可檢測的表達是與 酵母宿主相比細菌基因中的不同密碼子偏好(表1)的結(jié)果，但是對野生型LST基因的更仔細 的檢查也揭示出三個表現(xiàn)出明顯高的A+T含量的DNA區(qū)段(野生型LST基因（SEQ ID N0:2) 252丁444了4了4六了611^4267(3￡〇10勵：11))。因此，也可能的是，野生型基因的一個或多個內(nèi) 部區(qū)段起到轉(zhuǎn)錄提前終止信號的作用（Scorer等，1993.661^136:111-119;3(^11代11^.11. 和J.G.Wessels.1998.Curr.Genet.33:151-156)。
[0019]表 1
[0021] CAI，密碼子適應指數(shù);CBI，密碼子偏好指數(shù);Fop，最適密碼子的頻率。
[0022] 為了同時解決這些潛在問題，合成了編碼野生型LST酶的人工基因一一合成的LST 或SYN LST(SEQ ID N0:3)，以滿足兩個總體目標：（1)替換巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)的 優(yōu)選的密碼子用法，以及（2)平衡具有不成比例的A+T含量的區(qū)段的A+T/C+G分布。在SYN基 因中，大多數(shù)密碼子被巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)的最優(yōu)選的密碼子代替。然而，為了破 壞長段A/T堿基，在需要時插入巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)的使用頻率第二高的Thr和 Val密碼子。具體來說，偶爾將ACC(14.5%使用率)代替ACT(22.4%使用率）用于Thr，并將 GTC(14.9%)代替GTT(26.9%)用于Val。野生型和SYN基因的特征的差異列于表1中。與野生 型基因相反，從巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)表達SYN基因在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生顯著量的 酶(在搖瓶培養(yǎng)物中~80mg/L)。
[0023]為了鑒定造成表達不良的野生型LST基因的具體區(qū)域，構(gòu)建了一組嵌合的WT-SYN 基因。通過一系列研究追蹤對表達受損貢獻最大的序列，在所述研究中，將組成性野生型基 因序列系統(tǒng)地一分為二，并將每一半用相應的SYN序列替換。對來自于兩個得到的構(gòu)建物的 表達進行面對面比較，并將得率較低的嵌合體送入下一輪野生型序列劈分和替換中。圖1A 示出了嵌合構(gòu)建物和野生型LST基因中的主要有害序列的圖。盡管野生型LST表達的完全失 敗不能被追溯到基因的任何單一區(qū)域，但已發(fā)現(xiàn)有害序列不是均勻分布的（圖1B)。重要的 是，表達得率不良的最重要的決定簇被局限到位于野生型基因（SEQ ID N0:2)中228至276 位核苷酸的49個堿基對的區(qū)段(Chi8)。
[0024] 隨后進行實驗以檢查LST表達受損的機制。野生型和SYN基因的228至276位堿基對 的詳細序列比較揭示出，關鍵差異位于富含A+T的區(qū)域(252至267位核苷酸）內(nèi)，并不是與任 何代表性高度不足的密碼子偏好相關(表2)。
[0025]表 2
[0027] 252至267位核苷酸帶有下劃線。
[0028]為了證實該富含A+T區(qū)域的調(diào)控作用，將野生型的富含A+T的區(qū)段(252至267位核 苷酸)拼接在SYN LST基因中，產(chǎn)生構(gòu)建物SYN+AT。這個基因本質(zhì)上是嵌合基因Chi8的目標 更狹隘的子系。此外，通過用相應的SYN序列替換，將同樣的富含A+T的區(qū)段從野生型LST基 因中缺失，由此產(chǎn)生基因WT-AAT，其是基因SYN+AT的