Ory-1001聯(lián)合放療和化療用于治療人三陰性乳腺癌的用圖
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體涉及一種小分子藥物0RY-1001聯(lián)合放射療法和/ 或化療用于治療乳腺癌，特別是人三陰性乳腺癌的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人賴氨酸特異性去甲基化酶（Human lysine specific demethylase 1，LSD1)是 胺氧化酶家族成員之一，在黃素腺噪呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)的 參與下，LSD1特異性地去除組蛋白H3上第四位（H3K4)和第九位（H3K9)賴氨酸殘基上的 二甲基和一甲基修飾[1]。此外，LSD1還能去除其它一些非組蛋白底物上的甲基化修飾，例 如p53、DNMT1和E2F1等[2'3]。LSD1在多種腫瘤中高表達，包括前列腺癌、未分化的成神經(jīng) 細胞瘤、雌激素陰性的乳腺癌[4]、膀胱癌和結(jié)直腸癌等。LSD1高表達與基底樣乳腺癌細胞 差的預后相關(guān)，且對聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP)抑制劑具有敏感性[5]。同時我們實 驗也發(fā)現(xiàn)，過表達LSD1能夠增強促進三陰性乳腺癌細胞生長和促進DNA雙鏈斷裂修復。因 此，LSD1成為腫瘤等疾病的重要的、潛在的藥物作用靶標[6 8]。
[0003] 因此，利用選擇性強、高效、低毒的去甲基化酶抑制劑來抑制LSD1功能是治療 腫瘤的一種新途徑。目前LSD1的抑制劑主要有反苯環(huán)丙胺類抑制劑、底物多肽類似物 和多胺類LSD1小分子抑制劑等。由于LSD1屬于胺氧化酶家族，因此胺氧化酶的抑制劑 被首先用來考察是否抑制LSD1。最早發(fā)現(xiàn)的LSD1抑制劑為反苯環(huán)丙胺又名強內(nèi)心百 樂明（tranylcypromine，TCP，結(jié)構(gòu)見圖1)，TCP在臨床上被用來治療抑郁癥，它能夠抑 制LSD1活性，但是其對胺氧化酶家族的選擇性較差。由0RYZ0N Genomics S.A.公司開 發(fā)的高度選擇性、強勁的LSD1抑制劑0RY-1001，其ICM〈20nM，結(jié)合LSD1能力是TCP的 100倍，結(jié)構(gòu)見圖2。它是一個LSD1選擇性抑制劑，對其它依賴FAD的氧化酶類（ΜΑ0-Α/ B，IL4Il，KDMlB>100yM，SM0X 7μΜ)沒有顯著的抑制活性。用該化合物處理急性髓性 白血病中的ΤΗΡ-1細胞，能夠劑量依賴的促進ΤΗΡ-1細胞分化，并進一步促進細胞調(diào)亡。 0RY-1001能夠抑制急性慢性白血病MV(4 ;11)細胞的增殖和克隆形成，還能顯著地抑制接 種MV(4 ;11)小鼠模型的腫瘤生長[6'9]。
[0004] 2014 年，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA)批準了第一個 LSD1特異型抑制劑0RY-1001進行I/II A期臨床試驗，用于治療急性髓系白血?。ˋML)[1°]。藥物抑制LSD1后會影響細胞多個基因的表達，使得白血病母細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎７只?胞，同時也降低了白血病干細胞的增殖和存活能力。0RY-1001能夠顯著地降低急性淋巴白 血?。ˋLL)小鼠模型中腫瘤細胞的負荷和延長小鼠的存活時間。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC)為雌激素受體（estrogen receptor, ER)、孕激素受體 (erogesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)均陰性表達的乳腺癌，約 占乳腺癌的10% -22%，被認為是一種獨立的臨床病理類型，具有侵襲性強、預后差和缺乏 特異性治療方法等特點[11]。鑒于以上0RY-1001對白血病細胞強的抑制作用，我們認為有 必要在三陰性乳腺癌細胞系中系統(tǒng)研究0RY-1001對放射治療和聯(lián)合紫杉醇化療在臨床前 的作用，為以后開展該藥物對三陰性乳腺癌臨床應用提供臨床前的相關(guān)實驗基礎和技術(shù)指 導。
[0005] 之前我們發(fā)明了一種連續(xù)低劑量輻射富集乳腺癌干細胞的方法（CN104152434A)。 在該研究基礎之上，我們增加0RY-1001藥物處理，然后進行連續(xù)低劑量輻射，利用細胞克 隆形成實驗和流式細胞技術(shù)FACS篩選標記的乳腺癌干細胞技術(shù)，研究0RY-1001是否影響 由連續(xù)低劑量輻射富集得到的乳腺癌干細胞的比例和它們的輻射抗性，這對于該藥物能否 用于以后乳腺癌臨床輻射治療有著重要的指導意義。
[0006] 表觀遺傳藥物與化療藥物的聯(lián)合應用能提高腫瘤的臨床治療效果。例如低劑量硫 P坐噪呤（acetazolamide，AZA)聯(lián)合組蛋白去乙?；敢种苿〩DACi(Entinostat)可以延長 非小細胞肺癌患者的生存時間，并可增加腫瘤對紫杉醇等化療藥物的敏感性[12]。因此，我 們利用細胞增殖實驗、克隆形成實驗和小鼠異種移植模型，研究LSD1抑制劑0RY-1001聯(lián)合 紫杉醇化療藥物是否對三陰性乳腺癌細胞的生長和原位異種移植小鼠模型腫瘤的增長有 抑制作用。
[0007] 總之，在已有的研究基礎之上，發(fā)明人模擬臨床放射治療和聯(lián)合藥物化療手段，利 用體內(nèi)外的細胞學實驗和小鼠模型，充分研究0RY-1001應用在乳腺癌治療方面的臨床前 作用，旨在為以后該藥物應用于三陰性乳腺癌甚至其它實體腫瘤的臨床治療提供較為扎實 的實驗依據(jù)和技術(shù)方案，從而達到治療腫瘤延長病人預后的根本目的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種人賴氨酸特異性去甲基化酶LSD1/KDM1A的抑制劑 0RY-1001應用在人乳腺癌放射治療和/或聯(lián)合化療中臨床前的方法。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種0RY-1001分別在人三陰性乳腺癌細胞放射 治療和該藥物與紫杉醇藥物聯(lián)合在人乳腺癌細胞化療中應用的方法。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療三陰性乳腺癌的藥物組合物，所述藥物組合 物包括治療有效量的紫杉醇或其藥學上可接受的鹽，以及治療有效量的LSD1的抑制劑，所 述LSD1的抑制劑優(yōu)選選自反苯環(huán)丙胺類抑制劑、底物多肽類似物和多胺類LSD1小分子抑 制劑，更優(yōu)選選自式I所示的LSD1抑制劑0RY-1001 :
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述治療有效量的紫杉醇或其藥學上可接受的 鹽和治療有效量的LSD1的抑制劑按照順序依次給藥于需要的受試者。
[0013] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，其中所述治療有效量的紫杉醇或其藥學上可接受 的鹽的給藥發(fā)生在治療有效量的LSD1的抑制劑的給藥之前。
[0014] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述組合物具有治療性的協(xié)同作用。
[0015] 在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供所述的藥物組合物在制備用于治療三陰性乳 腺癌的藥物的應用。
[0016] 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供所述的藥物組合物在制備用于增強三陰性乳 腺癌的預后的藥物的應用。
[0017] 在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供LSD1的抑制劑在制備聯(lián)合放射療法和/或化 療用于治療乳腺癌，特別是人三陰性乳腺癌的試劑中的用途。
[0018] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中LSD1的抑制劑優(yōu)選選自反苯環(huán)丙胺類抑制 劑、底物多肽類似物和多胺類LSD1小分子抑制劑，更優(yōu)選選自式I所示的LSD1抑制劑 0RY-1001 ：
[0020] 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的0RY-1001在人三陰性乳腺癌細胞放射治療中 應用的方法包括：1)培養(yǎng)乳腺癌細胞系，經(jīng)過0RY-1001藥物處理，培養(yǎng)一段時間后，連續(xù)多 次低劑量輻射處理細胞，通過細胞克隆形成實驗和流式細胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)0RY-1001降低原來 低劑量輻射富集的乳腺癌干細胞的比例和乳腺癌干細胞對輻射的抗性。
[0021] 優(yōu)選地，所述低劑量輻射處理為通過6°Co進行低劑量輻射處理。
[0022] 優(yōu)選地，所述低劑量為1. 5_4Gy。
[0023] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)一段時間為培養(yǎng)1-2周。
[0024] 優(yōu)選地，所述共計輻射次數(shù)為三次。
[0025] 在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明的0RY-1001與紫杉醇藥物聯(lián)合在人三陰性乳腺 癌細胞化療中應用的方法包括：2)0RY-1001聯(lián)合紫杉醇作用乳腺癌細胞，通過CCK-8細胞 增殖實驗和細胞克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥顯著抑制乳腺癌細胞體外的增殖和克隆 形成；通過小鼠原位異種移植實驗，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥顯著抑制體內(nèi)小鼠模型中腫瘤的生 長。
[0026] 優(yōu)選地，所述細胞學實驗中0RY-1001濃度為5-20 μ M，紫杉醇濃度為ΙΟΟηΜ。
[0027] 優(yōu)選地，所述細胞學實驗中0RY-1001濃度為10 μ M，紫杉醇濃度為ΙΟΟηΜ。
[0028] 優(yōu)選地，所述小鼠模型中小鼠為BALB/c(nu/nu)裸鼠。
[0029] 優(yōu)選地，所述小鼠模型中0RY-1001所用濃度為10-30 μ g/kg/天，給藥方式為灌胃 給藥；紫杉醇濃度為10-30mg/kg，給藥方式為尾靜脈注射，一周兩次。
[0030] 優(yōu)選地，所述小鼠模型中0RY-1001所用濃度為20 μ g/kg/天，給藥方式為灌胃給 藥；紫杉醇濃度為20mg/kg，給藥方式為尾靜脈注射，一周兩次。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] 由于當前對于三陰性乳腺癌尚無有效的治療方法來改善患者的預后，本發(fā)明一方 面提供了 LSD1抑制劑0RY-1001應用在三陰性乳腺癌放射治療和聯(lián)合紫杉醇化療方法中 的臨床前作用，為后續(xù)該藥物應用在乳腺癌臨床治療提供了實驗依據(jù)并具有一定的指導意 義；一方面提供了一種系統(tǒng)、可靠的0RY-1001小分子應用在三陰性乳腺癌輻射治療和聯(lián)合 紫杉醇化療的方法，為后續(xù)進一步改善三陰性乳腺癌的良好預后提供了依據(jù)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為反苯環(huán)丙胺的結(jié)構(gòu)式。
[0034] 圖2為0RY-1001的結(jié)構(gòu)式。
[0035] 圖3顯示0RY-1001處理前后乳腺癌細胞系的甲基化變化情況。
[0036] 圖4顯示0RY-1001降低了由連續(xù)低劑量福射引起的乳腺癌細胞系中的腫瘤干細 胞的富集比例。
[0037] 圖5顯示MDA-MB-231細胞在0RY-1001聯(lián)合紫杉醇處理之后生長被顯著抑制。
[0038] 圖6顯示三陰性乳腺癌細胞在接受0RY-1001聯(lián)合紫杉醇處理后細胞的生長增殖 受到明顯抑制。
[0039] 圖7顯示0RY-1001聯(lián)合紫杉醇有效抑制小鼠腫瘤生長。
【具體實施方式】
[0040] 可以通過以下兩種方法鑒定0RY-1001是否能夠降低由低劑量輻射富集的乳腺癌 干細胞的比例或者0RY-1001是否降低乳腺癌干細胞對輻射的抗性也就是0RY-1001是否提 高由乳腺癌干細胞對輻射的敏感性：
[0041] 鑒定方法一：
[0042] 將經(jīng)過0RY-1001給藥的乳腺癌細胞再經(jīng)連續(xù)低劑量輻射照射處理后進行生物學 鑒定，首先是通過抗體識別乳腺癌腫瘤干細胞表面特異性抗原CD44+CD24 /k?，利用流式細 胞儀對細胞系中⑶44+⑶24 /lOT的比例進行分析，若細胞系中的⑶44 +⑶24 /lOT比例降低，則 說明相比對照組，經(jīng)過0RY-1001給藥后降低了細胞中乳腺癌干細胞比例和數(shù)目。
[0043] 鑒定方法二：
[0044] 以一定數(shù)目乳腺癌細胞接種到6孔板，經(jīng)過0RY-1001給藥處理后，再用連續(xù)低劑 量輻射處理該細胞，培養(yǎng)一段時間后，對形成的細胞克隆固定染色統(tǒng)計數(shù)目。理論上講腫瘤 干細胞的比例降低之后細胞增殖及克隆形成能力都會減弱，所以只要實驗中0RY-1001細 胞克隆數(shù)目減少克隆變小也可以認為乳腺癌干細胞比例減少。
[0045] 可以通過以下三種方法鑒定0RY-1001聯(lián)合化療藥紫杉醇是否抑制體內(nèi)外的乳腺 癌細胞的生長和腫瘤的增長。
[0046] 鑒定方法一：CCK-8細胞增殖實驗
[0047] 分別對乳腺癌細胞系經(jīng)過適當濃度藥物0RY-1001、紫杉醇及0RY-1001聯(lián)合紫杉 醇、雙陰性處理后，以一定數(shù)目將細胞接種到96孔板進行CCK-8細胞增殖實驗，24小時培 養(yǎng)后，每天固定時間加入CCK-8藥物檢測細胞的0D值，對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。如果 0RY-1001聯(lián)合化療藥紫杉醇抑制細胞的