一種用于治療結(jié)核患者的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組合物，尤其涉及一種用于治療結(jié)核患者的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]Notch信號通路是一條高度保守的信號途徑，廣泛存在于從無脊椎動物到脊椎動物等多個物種。1917年，Morgan及其同事在果繩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種基因，如果該基因的功能部分缺失可導致果蠅翅緣出現(xiàn)缺口，故命名該基因為Notch基因。20世紀80年代中期，ArtavanisTsakonas研究組首次克隆了該基因。Notch基因在被發(fā)現(xiàn)后很長的一段時間內(nèi)并未引起人們的注意，直到近幾年，人們發(fā)現(xiàn)Notch信號在細胞分化和個體發(fā)育中起決定性的作用，而成為發(fā)育學、細胞生物學、免疫學、腫瘤學等多個領(lǐng)域的研究熱點。
[0003]Notch信號途徑由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)和CSL (—類DNA結(jié)合蛋白)等組成。目前在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)了 4種Notch同源體，包括Notchl、Notch2、Notch3和 Notch4 ；5 種同源配體:Delta_l、Delta-3、Delta-4、Jagged-U Jagged-2 以及兩類下游靶基因:Hes和Hey家族。
[0004]Notch受體是單次跨膜蛋白，可廣泛表達于從無脊椎動物到哺乳動物等多種物種，在各個物種之間，Notch家族的成員結(jié)構(gòu)具有高度保守性。Notch基因編碼的是單鏈跨膜受體蛋白，其分子量約300kD，由2753個氨基酸殘基組成。成熟Notch受體分子是由胞外區(qū)(extracellular Notch, ECN)、跨膜區(qū)(Notch transmembrane, NTM)和胞內(nèi)區(qū)(intracellular Notch, ICN)部分組成。其胞外區(qū)含有29?36個串聯(lián)排列的表皮生長因子樣重復序列(Epidermalgrowth factor repeats，EGFR)(果繩和哺乳動物的Notchl和Notch2為36個，哺乳動物的Notch3為34個，Notch4為29個)[19]和3個富含半胱氨酸的Notch/LIN-12 (線蟲中Notch同源物)重復序列(Lin/Notch repeats, LNR)，它們的主要功能是結(jié)合配體后使之活化。其中第11、12個EGF樣重復序列介導與配體的相互作用。NOTCH胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，N1))是其活性形式，由 5部分構(gòu)成:(1)RAM(RBP_jkappa associated molecular)結(jié)構(gòu)區(qū)，可與DNA結(jié)合蛋白CSL結(jié)合(在哺乳類為CBF1，即 C—promoterbinding protein 1) ; (2) 6 個細胞分裂周期基因 10 (celldivis1n cyclegene 10，cdclO)重復區(qū)，可介導Notch與其他蛋白之間的相互作用，在NOTCH信號通路中起重要作用，是激活Notch的增強子；(3)2個核定位信號(nuclearlocalizat1n signal，NSL) ; (4) 0ΡΑ 谷氨酰胺豐富區(qū)(glutamine-rich reg1n) ； (5)富含 PEST 序列區(qū)域，PEST 為脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)構(gòu)成的四肽序列，與Notch受體的穩(wěn)定性有關(guān)。
[0005]Notch信號通路可以調(diào)控細胞的分化、增殖、存活和凋亡，在胚胎/成體血管發(fā)生、免疫細胞的發(fā)育和功能中具有決定性作用，因此與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性病變以及免疫系統(tǒng)功能調(diào)控等生理病理過程密切相關(guān)。
[0006]Notch信號在免疫系統(tǒng)中的早期研究集中在造血系統(tǒng)和胸腺內(nèi)淋巴細胞的發(fā)生、分化與成熟過程。后來發(fā)現(xiàn)，Notch信號在外周成熟淋巴細胞的分化增殖過程中同樣發(fā)揮著重要作用，它是τ細胞由多能干細胞向T細胞定型過程中的必需因子，調(diào)控T/B細胞譜系的產(chǎn)生，近年來人們還發(fā)現(xiàn)，Notch信號對固有免疫也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]目前，結(jié)核病是嚴重危害人類健康的重大傳染性疾病，加強結(jié)核菌感染過程中重要免疫分子的鑒定和分析，對于理解結(jié)核病的發(fā)病機制、開發(fā)新的干預、治療手段十分重要。
[0008]針對上述目的，本發(fā)明人在以SNP位點作為遺傳標志的研究中，發(fā)現(xiàn)Notch家族的成員之一 Notch4是結(jié)核病的易感基因，在結(jié)核病人外周血單核細胞中Notch4表達顯著增高并能抑制IL-6的產(chǎn)生。同時還發(fā)現(xiàn)Notch4分子能夠降低小鼠抵抗分枝桿菌感染的能力，調(diào)控了分枝桿菌感染過程中的宿主的免疫反應，抑制結(jié)核桿菌誘導的巨噬細胞細胞因子的產(chǎn)生。進一步的研究發(fā)現(xiàn)Notch4的胞內(nèi)活性形式NI⑶4與TLR信號通路中的兩個重要分子TRAF6和TAK1存在相互作用。NICD4能夠抑制TAK1的磷酸化進而抑制下游MAPKs和NF- κ Β信號通路的激活和細胞因子的產(chǎn)生，而ΝΙ⑶4對ΤΑΚ1活化的抑制是通過抑制TAK1-Lys63位的多聚泛素化而不是通過增加TAK1的降解來實現(xiàn)的。同時NI⑶4與TRAF6存在互作并能夠抑制TRAF6的自泛素化進而抑制了其作為泛素連接酶的功能，最終Notch4通過抑制TRAF6的泛素化來抑制TAK1-Lys63的多聚泛素化。同時，為進一步確認其他Notch受體對結(jié)核桿菌誘導的巨噬細胞炎癥因子產(chǎn)生的影響，我們利用Notch信號的化學阻斷劑處理小鼠的腹腔巨噬細胞，觀察結(jié)核分枝桿菌刺激后巨噬細胞炎癥因子的分泌。Compound E和DAPT是兩種Notch信號的化學阻斷劑，可以抑制γ-促分泌酶(γ-secretase)活性，阻斷Notch受體胞內(nèi)段切割，從而抑制Notch信號通路的激活。結(jié)果表明，抑制Notch信號通路可以顯著上調(diào)結(jié)核桿菌誘導的IL-6和IL-12b的表達。此外，Notch信號通路抑制劑可有效阻斷NICD的產(chǎn)生，進而增強小鼠抵抗分枝桿菌感染的能力。
[0009]基于本發(fā)明人的上述研究及發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的主題是一種用于治療結(jié)核患者的組合物，其特征在于，包括Notch信號通路抑制劑。
[0010]在發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述Notch信號通路抑制劑為所有能抑制notch信號通路的物質(zhì)中的任意一種或幾種。
[0011]所述Notch信號通路抑制劑優(yōu)選為包括notch信號通路的化學阻斷劑，能抑制notch基因功能的siRNA、shRNA片段，能抑制notch蛋白功能的單克隆抗體或者多肽中的任意一種或幾種。
[0012]所述Notch信號通路抑制劑優(yōu)選為Notch信號通路的化學阻斷劑。
[0013]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述化學阻斷劑優(yōu)選自Compound E和DAPT中的任意一種或兩種，所述化學阻斷劑為Compound E和DAPT的混合物時，兩者可以以任意比混合使用。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述化學阻斷劑的作用靶點包括抑制γ-促分泌酶的活性；阻斷Notch受體胞內(nèi)段切割。
[0015]本發(fā)明的另一個主題是上述所述組合物的應用方法，包括通過注射所述組合物的方式，還可以包括將所述組合物制成片劑或口服液的方式進行給藥。
[0016]本發(fā)明所述的用于治療結(jié)核患者的組合物，是通過實驗驗證其功能，才得以使用的，在用于治療結(jié)核患者過程中，副作用小，治療過程簡便靈活，可有效達到治愈的目的。
【附圖說明】
[0017]圖Ι-a為實施例1中熒光定量PCR檢測M.tb感染W(wǎng)T和Notch4基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞IL-6的表達情況；
[0018]圖Ι-b為實施例1中熒光定量PCR檢測M.tb感染W(wǎng)T和Notch4基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞IL-12b的表達情況；
[0019]圖2為實施例1中ELISA檢測M.tb感染W(wǎng)T和Notch4基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞IL-6的表達情況；
[0020]圖3-a為實施例1中熒光定量PCR檢測Compound E (10 μ Μ)處理小鼠腹腔巨噬細胞IL-6的表達情況；
[0021]圖3-b為實施例1中熒光定量PCR檢測Compound Ε(10μΜ)處理小鼠腹腔巨噬細胞IL-12b的表達情況；
[0022]圖3-c為實施例1中熒光定量PCR檢測DAPT (10 μ Μ)處理小鼠腹腔巨噬細胞IL-6的表達情況；
[0023]圖3-d為實施例1中熒光定量PCR檢測DAPT(lOyM)處理小鼠腹腔巨噬細胞IL-12b的表達情況；
[0024]圖4-a是實施例2中免疫印跡及ELISA同步檢測結(jié)核病人外周血單核細胞中Notch4蛋白的表達及血清中IL-6的表達情況；
[0025]圖4-b是實施例2中統(tǒng)計分析外周血單核細胞中Notch4蛋白高表達和低表達結(jié)核病人血清中IL-6的表達情況(*P〈0.05);
[0026]圖5是實施例3中ELISA檢測No