tch信號(hào)通路抑制劑對(duì)M.tb誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6產(chǎn)生的影響情況；
[0027]圖6是實(shí)施例3中免疫印跡檢測(cè)Notch信號(hào)通路抑制劑對(duì)M.tb誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TAK-1磷酸化水平的影響情況；
[0028]圖7是實(shí)施例3中免疫印跡檢測(cè)Notch信號(hào)通路抑制劑對(duì)M.tb誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPKs和NF- κ B磷酸化水平的影響情況；
[0029]圖8 - a為實(shí)施例3中ELISA檢測(cè)p-38抑制劑對(duì)M.tb誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6的影響情況；
[0030]圖8 - b為實(shí)施例3中ELISA檢測(cè)Jnk抑制劑對(duì)M.tb誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6的影響情況；
[0031]圖9是實(shí)施例3中Notch信號(hào)通路抑制劑阻斷Notch信號(hào)后，免疫共沉淀檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TAK1泛素化情況；
[0032]圖10是實(shí)施例4中Notch信號(hào)通路抑制劑處理組和未處理組結(jié)核菌感染小鼠肺組織荷菌量；
[0033]圖11是實(shí)施例4中Notch信號(hào)通路抑制劑處理組和未處理組結(jié)核菌感染小鼠肺組織分枝桿菌抗酸染色；
[0034]圖12是實(shí)施例4中Notch信號(hào)通路抑制劑處理組和未處理組結(jié)核菌感染小鼠肺組織HE染色。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1——Notch4通過(guò)影響巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病負(fù)調(diào)作用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0036]實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析:
[0037]1、分離野生型和Notch4基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，在體外用結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在mRNA水平上檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與野生型小鼠相比，Notch4基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6和IL-12b表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1所示)，ELISA檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，Notch4能夠抑制結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)(圖2所示)。
[0038]2、為進(jìn)一步確認(rèn)Notch信號(hào)通路的阻斷對(duì)結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，我們利用Notch信號(hào)的化學(xué)阻斷劑處理小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，觀察結(jié)核分枝桿菌刺激后巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。將Compound E和DAPT兩種Notch信號(hào)通路的化學(xué)阻斷劑，用于抑制γ-促分泌酶(γ-secretase)活性，阻斷Notch受體胞內(nèi)段切割，從而抑制Notch信號(hào)通路的激活。Notch信號(hào)阻斷劑處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24h后，再用M.tb感染不同的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明，抑制或切斷Notch信號(hào)通路可以顯著上調(diào)結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的IL-6和IL-12b的表達(dá)(圖3所示)。
[0039]可見(jiàn)，只要存在一種物質(zhì)可以阻斷或抑制Notch信號(hào)通路，即可提高巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療結(jié)核患者的目的。
[0040]實(shí)施例2——結(jié)核病人中，Notch4的表達(dá)影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0041]實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析:
[0042]同時(shí)檢測(cè)了結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中Notch4表達(dá)及血清中IL_6的表達(dá)，結(jié)果顯示，Notch4高表達(dá)結(jié)核病人血清中的IL-6水平低于Notch4低表達(dá)結(jié)核病人(圖4所示)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即Notch4蛋白表達(dá)與IL-6表達(dá)之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，Notch4能夠抑制體內(nèi)結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
[0043]實(shí)施例3——Notch信號(hào)通路對(duì)TAK1活性的抑制作用及Notch信號(hào)通路抑制劑在抗結(jié)核治療中的作用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0044]實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析:
[0045]使用Compound E和DAPT兩種Notch信號(hào)的化學(xué)阻斷劑作為Notch信號(hào)通路抑制劑，進(jìn)行了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。體外，我們?nèi)⌒∈蟾骨痪奘杉?xì)胞，用Notch信號(hào)通路抑制劑處理24小時(shí)后，再用分枝桿菌感染不同的時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，檢測(cè)TAK1及下游MAPKs和NF- κ B信號(hào)通路磷酸化水平的變化，結(jié)果顯示，與未經(jīng)Notch信號(hào)通路抑制劑處理組相比，阻斷Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-6的表達(dá)(圖5所示)，可以上調(diào)TAK1的187，192，412位點(diǎn)磷酸化水平(圖6所示)，同時(shí)JNK和p38的磷酸化水平在感染后15分鐘也明顯上調(diào)(圖7所示)。使用MAPKK抑制劑阻斷JNK和p38的磷酸化后，檢測(cè)分枝桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生。具體為，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用Notch信號(hào)通路抑制劑作用24h后再用激酶抑制劑刺激30min，M.tb刺激12h后ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與未經(jīng)Notch信號(hào)通路抑制劑處理組相比，阻斷Notch信號(hào)通路后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6的分泌水平下降更為明顯(圖8所示)。那么這種抑制作用是否也是通過(guò)抑制TAK1-Lys63多聚泛素化實(shí)現(xiàn)呢？我們?nèi)⌒∈蟾骨痪奘杉?xì)胞，用Notch信號(hào)通路抑制劑處理24小時(shí)后檢測(cè)內(nèi)源的TAK1泛素化，結(jié)果顯示，阻斷Notch信號(hào)通路可以增強(qiáng)TAK1的總泛素化及K63位點(diǎn)的多聚泛素化，與基因敲除小鼠中的結(jié)果一致(圖9所示)。
[0046]實(shí)施例4——更明確地評(píng)估Notch信號(hào)通路抑制劑在分枝桿菌感染小鼠體內(nèi)的作用
[0047]實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析:
[0048]建立了小鼠結(jié)核菌感染模型，在結(jié)核菌感染后的第二天開(kāi)始給予治療，隔日腹腔注射Notch信號(hào)通路抑制劑，28天后處死小鼠，檢測(cè)小鼠肺組織中的荷菌量，結(jié)果顯示，與未治療組相比，Notch信號(hào)通路抑制劑治療組小鼠肺組織中的荷菌數(shù)顯著下降(圖10所示)，肺組織冰凍切片抗酸染色及病理HE染色也顯示，Notch信號(hào)通路抑制劑治療組感染小鼠肺組織中抗酸桿菌的數(shù)量較未治療組感染小鼠顯著下降(圖11所示)，肺組織病理?yè)p傷明顯減輕(圖12所示)，說(shuō)明Notch信號(hào)通路抑制劑可以增強(qiáng)小鼠抵抗分枝桿菌感染的能力。以上實(shí)驗(yàn)證明，Notch信號(hào)通路抑制劑可以增強(qiáng)泛素化介導(dǎo)的TAK1激活進(jìn)而促進(jìn)MAPKs和NF- κ B信號(hào)通路激活及炎癥因子產(chǎn)生，從而增強(qiáng)機(jī)體有效抵抗分枝桿菌感染的能力，可以成為結(jié)核病治療的潛在靶點(diǎn)。
[0049]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于治療結(jié)核患者的組合物，其特征在于，包括Notch信號(hào)通路抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其特征在于，所述Notch信號(hào)通路抑制劑為所有能抑制notch信號(hào)通路的物質(zhì)中的任意一種或幾種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述組合物，其特征在于，所述Notch信號(hào)通路抑制劑包括notch信號(hào)通路的化學(xué)阻斷劑，能抑制notch基因功能的siRNA、shRNA片段，能抑制notch蛋白功能的單克隆抗體或者多肽中的任意一種或幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述組合物，其特征在于，所述Notch信號(hào)通路抑制劑為Notch信號(hào)通路的化學(xué)阻斷劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其特征在于，所述化學(xué)阻斷劑選自CompoundE和DAPT中的任意一種或兩種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述組合物，其特征在于，所述化學(xué)阻斷劑為CompoundE和DAPT的混合物時(shí)，兩者可以以任意比混合使用。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其特征在于，所述化學(xué)阻斷劑的作用靶點(diǎn)包括抑制T -促分泌酶的活性；阻斷Notch受體胞內(nèi)段切割。8.一種如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的組合物的使用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物的使用，其特征在于，包括通過(guò)注射所述組合物的方式。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物的使用，其特征在于，包括將所述組合物制成片劑或口服液的方式進(jìn)行給藥。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療結(jié)核患者的組合物，包括Notch信號(hào)通路抑制劑，所述Notch信號(hào)通路抑制劑為所有能抑制notch信號(hào)通路的物質(zhì)中的任意一種或幾種，所述Notch信號(hào)通路抑制劑優(yōu)選為包括notch信號(hào)通路的化學(xué)阻斷劑，能抑制notch基因功能的siRNA、shRNA片段，能抑制notch蛋白功能的單克隆抗體或者多肽中的任意一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種上述所述組合物的使用。本發(fā)明所述的用于治療結(jié)核患者的組合物，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能，才得以使用的，在用于治療結(jié)核患者過(guò)程中，副作用小，治療過(guò)程簡(jiǎn)便靈活，可有效達(dá)到治愈的目的。
【IPC分類】A61K48/00, A61K38/00, A61P31/06, A61K39/395, A61K45/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105233289
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510719291
【發(fā)明人】戈寶學(xué), 鄭瑞娟
【申請(qǐng)人】上海市肺科醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月29日