陰性對(duì)照。
[0033]在向反應(yīng)體系加入NAD+前，先加入終濃度為10mmol/L的3-氨基苯甲酰胺(3AB)預(yù)孵育5分鐘后，再按上述無(wú)細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系進(jìn)行多聚ADP核糖化反應(yīng)。待檢測(cè)藥物組則分別加入不同濃度梯度的GW3965，進(jìn)行多聚ADP核糖化反應(yīng)。體系孵育完成后，開(kāi)始進(jìn)行多聚ADP核糖化水平測(cè)定及PARP1酶活性檢測(cè)。
[0034]在上述無(wú)細(xì)胞蛋白體系中，將重組組蛋白H1與PARP1重組組蛋白1、NAD+、單鏈斷裂DNA和GW3965 (終濃度分別為1 μ mol/L, 3 μ mol/L, 5 μ mol/L)，進(jìn)行孵育。
[0035]分別采用下述步驟1)和步驟2)中的方法檢測(cè)上述中的PARP1活性。
[0036]1)應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，并用特異性抗多聚ADP核糖鏈的檢測(cè)抗體(Ant1-PARPolymer Monoclonal Antibody)(購(gòu)自 Trevigen 公司，型號(hào)為 4335-MC-100)，對(duì)多聚 ADP核糖化程度進(jìn)行半定量檢測(cè)，檢測(cè)方法參見(jiàn)Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&HuangK.PARP-1 suppresses adiponectin express1n through poly (ADP-ribosyl) at1n ofPPAR gamma in cardiac fibroblasts.Card1vascular research，2009，81(1):98-107.據(jù)此，可對(duì)PARP1自身及其對(duì)目標(biāo)蛋白多聚ADP核糖化的水平進(jìn)行檢測(cè)。
[0037]2)采用PARP1活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定PARP1活性，檢測(cè)步驟參見(jiàn)PARP1活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)。
[0038]實(shí)施例2利用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
[0039]在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選擇HepG2 (來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。發(fā)明人采用不同濃度的22 (R)-羥基膽固醇(簡(jiǎn)寫(xiě)為22(1?)-!10，1'09013171和6￥3965處理 Η印G2 細(xì)胞。處理方法參見(jiàn) Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&Huang K.PARP-1suppresses adiponectin express1n through poly(ADP-ribosyl)at1n of PPAR gammain cardiac fibroblasts.Card1vascular research，2009，81 (1):98-107.
[0040]H印G2 細(xì)胞分別給予 GW3965(i1、l ymol/L、3ymol/L、5ymol/L)或煙酸(iv、
1ymol/L、5 ymol/L、10 μπιοΙ/L)刺激24小時(shí)，上述括號(hào)中的濃度均為終濃度。
[0041]使用PARP1活性檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Trevigen，產(chǎn)地美國(guó)，型號(hào)為4676-096-K)檢測(cè)PARP1活性，具體方法參照該試劑盒的說(shuō)明書(shū)。其中，以3AB(10mmOl/L)作為陽(yáng)性對(duì)照，煙酸作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，##P < 0.01。
[0042]蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表達(dá)程度。(具體步驟方法見(jiàn)參考文獻(xiàn) Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&Huang K.PARP-1 suppressesadiponectin express1n through poly(ADP-ribosyl)at1n of PPAR gamma in cardiacfibroblasts.Card1vascular research,2009,81(1):98-107.)
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044]1、實(shí)施例2利用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果
[0045]實(shí)施例2中，采用不同濃度的LXRa激動(dòng)劑，即GW3965分別處理Η印G2細(xì)胞。經(jīng)PARP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PARP1活性證實(shí)，濃度分別為1 μ mo 1 /L、3 μ mo 1 /L、5 μ mo 1 /LGW3965均可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)PARP1活性產(chǎn)生濃度依賴性地抑制作用(如圖1所示)。
[0046]與此同時(shí)，使用核糖化(PAR)抗體檢測(cè)顯示，上述濃度的GW3965可顯著降低Η印G2細(xì)胞內(nèi)蛋白核糖化水平(如圖2所示)。
[0047]實(shí)施例2中的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，分別給予GW3965(終濃度為1 μ mol/L，3 μ mol/L，5 μ mol/L, 24h)的刺激，并不影響IfepG2細(xì)胞內(nèi)的PARP1蛋白表達(dá)水平(如圖3所示)。
[0048]2、實(shí)施例1利用無(wú)細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系檢測(cè)結(jié)果
[0049]實(shí)施例1中無(wú)細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系研究發(fā)現(xiàn)，LXR a激動(dòng)劑與PARP1蛋白，重組組蛋白，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及DNA—起孵育，在無(wú)細(xì)胞蛋白體系中，將重組組蛋白1與卩厶1犯1、熟0+、0嫩和(^3965(1，3，5 411101/1)分別進(jìn)行孵育，可以從圖4中看出，上述濃度的GW3965、濃度賴性地降低了 PARP1活性。與PARP1/NAD+/DNA組相比##P < 0.01，具有顯著性差異。圖5中蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無(wú)細(xì)胞蛋白體系中孵育體系蛋白的多聚核糖化水平。從圖5中也可以獲得與圖4相一致的結(jié)論。
[0050]以上這些結(jié)果顯示，上述LXR a激動(dòng)劑能夠直接抑制PARP1活性。
[0051]近年的研究發(fā)現(xiàn)PARP1通過(guò)調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄在心血管疾病以及腫瘤的發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。如:腫瘤的發(fā)生已經(jīng)被證實(shí)與PARP1的過(guò)度激活密切相關(guān)，而使用PARP1的抑制劑可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。目前已經(jīng)開(kāi)展了數(shù)個(gè)PARP1抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療的臨床藥物研究。另亦有大量研究證實(shí)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PARP1催化活性明顯增強(qiáng)，而在大量的心血管疾病動(dòng)物模型中，給予PARP1抑制劑處理后，可以發(fā)現(xiàn)PARP1抑制劑發(fā)揮了明顯的積極有效的作用。而將PARP1抑制劑應(yīng)用于心血管疾病治療的臨床藥物研究目前還在進(jìn)行中。
[0052]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為I型多聚ADP核糖合成酶抑制劑的應(yīng)用。2.一種抑制I型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，其特征在于，選用3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為I型多聚ADP核糖合成酶抑制劑，通過(guò)無(wú)細(xì)胞I型多聚ADP核糖合成酶酶促反應(yīng)和/或利用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)3-[3-[[[2_氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2，2_聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽對(duì)I型多聚ADP核糖合成酶的活性的抑制作用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種抑制I型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，其特征在于，3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的濃度為I μ mol/L至5 μ mol/L04.3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為治療與I型多聚ADP核糖合成酶相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。5.3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為治療心血管疾病、腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及3-[3-[[[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽(簡(jiǎn)寫(xiě)為GW3965)作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑。上述GW3965是一種LXR激動(dòng)劑同時(shí)作為膽固醇類似物并無(wú)通常腫瘤藥物或其他1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑的細(xì)胞毒作用，可以預(yù)期其安全性?？梢宰鳛橹委熌懝檀枷嚓P(guān)疾病如心血管疾病、腫瘤等疾病的藥物而廣泛應(yīng)用。
【IPC分類】A61P9/00, A61K31/195, A61P43/00, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105232507
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510729324
【發(fā)明人】黃愷, 張馮筱, 羅希
【申請(qǐng)人】黃愷
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月30日