Gw3965作為parp1抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及將3-[3-[[[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2,2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為PARP1抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]3_ [3_ [ [ [2_氯_3_ (二氣甲基)苯基]甲基](2，2_聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽，簡(jiǎn)寫為GW3965，分子量為618.51，化學(xué)式為C33H31C1F3N03.HC1，CAS號(hào)為405911-17-3。
[0003]GW3965屬于羥化膽固醇類似物，具有降低膽固醇的作用。在目前已有的研究中主要作為肝臟X受體(LXR)的激動(dòng)劑，即激活LXR，例如激活基因LXRa (肝臟X受體α亞型)，因此上述藥物均被廣泛應(yīng)用于LXR相關(guān)的研究中。
[0004]1型多聚ADP核糖合成酶，簡(jiǎn)寫為PARP1，PARP1是一種廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞的核酶。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激引起DNA斷裂損傷時(shí)，PARP1通過結(jié)合斷裂DNA發(fā)生構(gòu)象改變而活化。活化的PARP1以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為底物，以其酶促作用通過轉(zhuǎn)移腺苷二磷酸核糖(ADP)飾目標(biāo)蛋白和自身(即多聚ADP核糖化反應(yīng))，從而改變目標(biāo)蛋白和自身的生物學(xué)活性。目前應(yīng)用于科研中的PARP1抑制劑有數(shù)種，其中最為常見的有:3_氨基苯甲酰胺(簡(jiǎn)寫為3AB)，N-(6-氧代-5，6- 二氫菲啶_2_基)_2_(N，N- 二甲基氨基)乙酰胺鹽酸鹽(簡(jiǎn)寫為PJ34)。而應(yīng)用于臨床藥物試驗(yàn)的研究的PARP1抑制劑有BMN-673、CEP-9722、Rucaparib、KU-0059436、IN0-1001等，在腫瘤治療及主動(dòng)脈夾層等疾病治療中有明確療效。已有的研究認(rèn)為膽固醇升高與腫瘤的發(fā)病率明確相關(guān)，但目前尚無膽固醇相關(guān)藥物對(duì)此方面的證據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供3_ [3_ [ [ [2_氯_3_ ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的新用途，即作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑進(jìn)行應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0007]3-[3-[ [ [2-氯_3_ ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(簡(jiǎn)寫為GW3965)作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑，可以抑制1型多聚ADP核糖合成酶的活性。
[0008]—種抑制1型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，在該方法中，選用3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑，通過無細(xì)胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反應(yīng)和/或利用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)GW3965對(duì)1型多聚ADP核糖合成酶的活性的抑制作用。
[0009]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)所述3_[3_[[[2_氯_3_( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽的濃度為1 μ mol/L至5 μ mol/L時(shí)，其對(duì)1型多聚ADP核糖合成酶的活性的具有抑制作用。
[0010]本發(fā)明還提出，3-[3_[ [ [2-氯-3-( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為治療與1型多聚ADP核糖合成酶相關(guān)疾病的藥物進(jìn)行廣泛應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明還提出，3_[3_[ [ [2-氯-3-( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽作為治療與1型多聚ADP核糖合成酶相關(guān)的心血管疾病藥物的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明具有的有益效果:
[0013]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了 GW3965這種羥化膽固醇類似物不僅可以作為L(zhǎng)XR激動(dòng)劑而且同時(shí)對(duì)PARP1有抑制作用，上述發(fā)現(xiàn)尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道。上述GW3965作為膽固醇類似物并無通常腫瘤藥物或其他PARP1抑制劑的細(xì)胞毒作用，可以預(yù)期其安全性?？梢宰鳛橹委熌懝檀枷嚓P(guān)疾病如腫瘤等疾病的藥物而廣泛應(yīng)用。
【附圖說明】
[0014]圖1-圖5為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0015]圖1 和圖 2，Η印G2 細(xì)胞分別給予 GW3965(ii，l，3，5ymol/L)，或煙酸(iv，l，5，10 μ mol/L)刺激24小時(shí)。
[0016]圖1包括圖1A至圖1B，分別為PARP1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)測(cè)定PARP1活性；3AB(10mmol/L)作為陽(yáng)性對(duì)照，煙酸作為陰性對(duì)照。與對(duì)照組相比，##P < 0.01。圖1A為不同濃度的GW3965對(duì)PARP1活性的影響；圖1B為不同濃度的煙酸對(duì)PARP1活性的影響。
[0017]圖2中添加了不同濃度的GW3965利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表達(dá)程度。
[0018]圖3中蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示在分別給予GW3965(l，3，5ymol/L，24h)的Η印G2細(xì)胞的全蛋白抽提物中多聚核糖化蛋白及PARP1表達(dá)程度。
[0019]圖4和圖5中在無細(xì)胞蛋白體系中，將重組組蛋白Η1與PARP1，NAD+，DNA和GW3965(1，3，5 μπιοΙ/L)進(jìn)行孵育。
[0020]圖4中PARP1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)測(cè)定PARP1活性。與PARP1/NAD+/DNA組相比##P<0.01。圖4包括圖4A和圖4B ;其中圖4A為不同濃度的GW3965對(duì)PARP1活性的影響；其中圖4B為不同濃度的煙酸對(duì)PARP1活性的影響。
[0021]圖5蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無細(xì)胞蛋白體系中孵育體系蛋白的多聚核糖化水平。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0023]本發(fā)明實(shí)施例所涉及的方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的技術(shù)手段可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例所述的實(shí)驗(yàn)方法。
[0024]以下實(shí)施例分別應(yīng)用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系研究三種藥物對(duì)PARP1酶活性的抑制作用。
[0025]參考相關(guān)的文獻(xiàn)(HuangD, Yang C,ffang Y, Liao Y，&Huang K.PARP-1 suppressesadiponectin express1n through poly(ADP-ribosyl)at1n of PPAR gamma in cardiacfibroblasts.Card1vascular research，2009，81 (1):98-107.)，分別構(gòu)建了體外無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系及活性測(cè)定試驗(yàn)體系，以進(jìn)行GW3965對(duì)PARP1活性的作用效果檢測(cè)。
[0026]實(shí)施例中，所述3- [3- [[ [2-氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2，2-聯(lián)苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸鹽酸鹽(簡(jiǎn)寫為GW3965)購(gòu)自sigma，型號(hào)G6295-5MG。
[0027]實(shí)施例1利用無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系檢測(cè)
[0028]利用PARP1活性檢測(cè)試劑盒構(gòu)建無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系能在體外環(huán)境中激活PARP1酶的活性。
[0029]實(shí)施例中使用的PARP1活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Trevigen公司，產(chǎn)地美國(guó)，型號(hào)為4676-096-Ko
[0030]PARP1活性檢測(cè)試劑盒包括緩沖液、PARP1重組蛋白、NAD+、單鏈斷裂DNA、重組組蛋白 1 (Histone HI)。
[0031 ] 按照PARP1活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行配置無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系，具體操作步驟如下:在緩沖液中加入50ng PARP1重組蛋白(PARP1 protein)、終濃度為10mmol/L NAD\終濃度為20mg/mL單鏈斷裂DNA后。組成緩沖液的各組分在反應(yīng)體系中的終濃度分別為:Tris-HCl (pH 8.0)的終濃度為100mmol/L、MgCl2的終濃度為20mmol/L、二硫蘇糖醇的終濃度為lmmol/L。配置完成后，于37°C恒溫箱中共孵育25分鐘。
[0032]在上述無細(xì)胞PARP1酶促反應(yīng)體系中，選用重組組蛋白1 (Histone HI)作為目標(biāo)蛋白(所述Histone HI為PARP1重組蛋白的目標(biāo)蛋白，能被多聚ADP核糖化修飾)，選用3-氨基苯甲酰胺(3AB)作為PARP1抑制劑并同時(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，選用煙酸(nicotinicacid)作為