用于誘導細胞自噬的方法及組成物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明關于在患有細胞自噬（autophagy)缺陷的個體誘導細胞自噬的方法，特別 是一種通過對個體投予靈芝萃取物而用于在患有細胞自噬缺陷的個體中誘導細胞自噬的 方法。
【背景技術】
[0002] 細胞自嗤（autophagy)或稱"自體消化過程（selfdigestionprocess) "，為一 種重要的生理過程，其靶向細胞質中的成分，諸如要于溶酶體中降解的蛋白質、蛋白質聚集 體（aggregates)和胞器。細胞自噬過程對于維持神經恒定性也是必要的，且其功能失調 (dysfunction)與多種疾病有直接關聯(lián)。
[0003] 當細胞處在饑餓狀態(tài)時，細胞自噬的目的在于回收細胞內營養(yǎng)物質來維持細胞代 謝，而當細胞處于壓力時，細胞自噬也能將累積的損壞胞器和蛋白質清除。
[0004] 細胞自噬的缺陷是多種疾病的主要成因，這些疾病可以是，但不限于：神經 退行性疾病、肝臟疾病和癌癥。許多人類神經退行性疾病與異常突變和/或泛素蛋白 (polyubiquitinatedprotein)的累積以及過度的神經細胞死亡有關。
[0005] 神經生長因子（Nervegrowthfactor,NGF)于1951年被分離出來，且其為是 第一個被分離出來的神經滋養(yǎng)因子。在發(fā)育過程及成熟動物個體中，NGF是由星狀細胞 (astrocytes)分泌，且對于神經突觸可塑性以及建立有功能的神經回路亦扮演重要的角 色。內生性的NGF對于前腦負責學習記憶的膽堿神經元的存活及功能的重要性亦被證實， 此種神經滋養(yǎng)因子的部分去除與可量測的學習和記憶缺陷相關。
[0006] 在許多動物模式中，NGF已顯示具有潛在的神經保護效果。此外，在大鼠中，NGF 能保護對抗諸如3-NP和MPTP的線粒體毒素所引起的神經元死亡。因此，在神經退行性 疾病的治療的藥理應用中，NGF被認為扮演關鍵的角色。然而，NGF的獲取受到血腦障壁 (blood-brainbarrier)的限制，且當經由周邊投藥時又易被代謝掉；因此，使用時它只能 被直接注入至腦部。當NGF經由腦室注射時，其與許多的副作用相關聯(lián)，因而使該傳遞途徑 不實用。因此，對于神經退行性疾病，調控內生性NGF表達可能是一種嶄新的治療策略。
[0007] 神經退行泛指神經元的功能或結構漸進式的喪失。許多神經退行性疾病，包括帕 金森氏癥（Parkinson'sdisease,F*D)、阿茲海默癥（Alzheimer'sdisease,AD)、亨丁頓氏 舞蹈癥（Huntington'sdisease,HD)和肌萎縮性脊髓側索硬化癥（amyotrophiclateral sclerosis，ALS)都是因神經退行的過程所造成。最近，許多神經退行性疾病的類似疾病被 發(fā)現(xiàn)，這些疾病彼此之間都有些關聯(lián)。舉例來說，有些神經退行性疾病與錯誤折疊的蛋白質 的不正常堆積有關，其亦被稱為非典型的蛋白質集結（atypicalproteinassemblies)。
[0008] 亨丁頓氏舞蹈癥（HD)是一種常染色體顯性的神經退行性疾病，其由亨丁頓 (huntingtin,Htt)基因的外顯子l(exon1)上CAG三核苷酸重復序列的異常擴張所導 致。HD的主要特征是HD實驗動物及病患腦中受影響的紋狀體神經元的突變亨丁頓蛋白 Htt(mHtt)聚集體的形成。Htt基因的多谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ)延伸大于37個 谷氨酰胺的擴張或編碼該polyQ延伸的短N-端片段就足以造成小鼠或該疾病的細胞模型 中的聚集體形成。
[0009] 靈芝（Ganodermalucidum)是亞洲地區(qū)使用廣泛且歷史悠久的藥用植物（真 菌）之一。已有許多研究探討靈芝在疾病治療上的應用。靈芝的最重要藥理活性小 分子成分是三萜類（triterpenoids)，其被報導具有肝臟保護、抗高血壓、降膽固醇 (hypocholesterolemic)、抗組織胺（anti-histaminic)、抗癌以及抗血管新生活性。然而， 其增進智能的特性尚未被充分研究。

【發(fā)明內容】

[0010] 在一方面，本發(fā)明提供一種在患有細胞自噬缺陷的個體中誘導細胞自噬的方法。 根據(jù)本發(fā)明，該方法包含對該個體投予治療有效量的靈芝萃取物，其中，該細胞自噬增進該 個體中的蛋白質聚集體的清除。
[0011] 在本發(fā)明的一具體實施例中，該細胞自噬缺陷是在該個體的細胞，其表達蛋白質 聚集體，且其中該細胞是神經細胞或神經膠質細胞。在本發(fā)明的一具體實施例中，該蛋白質 聚集體是選自下列所組成的群組的聚集體：亨丁頓蛋白、淀粉樣蛋白0、a-突觸核蛋白、 T蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式以及其組合。
[0012] 在本發(fā)明的一具體實施例中，該細胞自噬缺陷為選自于由神經退行性疾病、克隆 氏癥（Crohn'sdisease)、老化、心臟疾病和肝臟疾病所組成的群組的疾病。在本發(fā)明的一 具體實施例中，該神經退行性疾病選自于由亨丁頓氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥、肌 萎縮性脊髓側索硬化癥和致死性家族性失眠癥所組成的群組。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，該靈芝萃取物是經由口服投予至該個體。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于在患有細胞自噬缺陷的個體中活化神經生長因子 (NGF)的方法，其中，該神經生長因子可活化個體的細胞自噬，且其中該細胞自噬可增進個 體的蛋白質聚集體的清除。根據(jù)本發(fā)明，該方法包含對該個體投予治療有效量的靈芝萃取 物。
[0015] 在本發(fā)明的一具體實施例中，該細胞自噬缺陷是在該個體的細胞，其表達蛋白質 聚集體。
[0016] 在本發(fā)明的一具體實施例中，該蛋白質聚集體是亨丁頓蛋白、淀粉樣蛋白3、 a-突觸核蛋白、t蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式以及其組合中的一種或 多種。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于預防個體記憶喪失的方法。根據(jù)本發(fā)明，該方法包 含對該個體投予治療有效量的靈芝萃取物，其中，該靈芝萃取物可活化該個體的細胞自噬。
[0018] 在本發(fā)明的一具體實施例中，該靈芝萃取物誘導神經生長因子（NGF)以活化該個 體的細胞自噬。在本發(fā)明的一具體實施例中，該細胞自噬可增進個體的蛋白質聚集體的清 除。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，該個體患有細胞自噬缺陷。在本發(fā)明的一具體實施例中，該細胞自噬 缺陷為選自于由亨丁頓氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥和致 死性家族性失眠癥所組成的群組神經退行性疾病
[0020]另一方面，本發(fā)明提供一種在患有細胞自噬缺陷的個體中誘導細胞自噬的組合 物，其中，該方法包含靈芝酸和醫(yī)藥上可接受的載劑。在本發(fā)明的一具體實施例中，該靈芝 酸是一種或多種選自于由靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝酸D和12-乙酰 氧基靈芝酸F所組成的群組的靈芝酸。
【附圖說明】
[0021] 靈芝（Ganodermalucidum)在說明書及附圖中縮寫為GaLu。圖1A至1E顯示神 經生長因子（NGF)對表達mHtt-74Q的PC12細胞模型的影響。（A)經NGF處里后的細胞的 熒光平均強度（FMI)比。直方圖表示在兩次獨立實驗中測得的FMI的量化（n= 6)。（B) 在表達mHtt-74Q并經50ng/ml的NGF處理的細胞中，熒光分布向左移，代表聚集體減少。X 軸代表測得的綠色熒光幅度，而呈熒光程度繪制的Y軸代表細胞數(shù)。數(shù)值以平均標準偏差 (mean土SD)方式表示（#P〈0. 01 為與未經Dox處理（NoDox)相比；而 #P〈0. 05、##P〈0. 01 為與經Dox處理（Dox)相比）。（C)NGF促進自嗤小體（autophagosome)的形成，并可促進 mHtt的降解。利用MDC染色以檢視細胞內表達自體吞噬泡。在經NGF處理的細胞中可見 MDC染色后的熒光強度增加。白色箭頭代表在經NGF處理的細胞中的MDC與EGFP的影像重 迭（co-localization)，而黃色箭頭代表在經Dox處理的細胞中的EGFP聚集體和經MDC染 色的點狀熒光影像。在Dox細胞中有稀少的EGFP與MDC的影像重迭。（比例尺為10微米 (ym))。（D)MDC染色的量化結果。與控制組（noDox)相比，結果為每細胞中所含的點狀 熒光影像。（E)以西方墨點法檢視在不同條件下LC3-I與LC3-II的蛋白質濃度（以200nM 的雷帕霉素（Rapamycin)誘導細胞自噬作為正控制組）（n= 3) /P〈0. 05, #P〈0. 01為與No Dox相比，而#P〈0. 05廣P〈0. 01為與Dox相比。
[0022] 圖2A至2G顯示靈芝（GaLu)(為星狀細胞NGF誘導物）在PC12細胞中調節(jié)粒腺 體的生體合成（biogenesis)與在HD細胞模型中減緩mHtt所誘導的損害。分析初級星狀 細胞經GaLu處理六小時的mRNA表達量（A)或二十四小時的蛋白質表達量（B)。（C)顯示 NGF于星狀細胞經GaLu(GaLu-ACM)處理二十四小時所收集的二十倍濃縮細胞培養(yǎng)液的西 方墨點圖示。（D)利用流式細胞儀分析以GaLu-ACM抑制mHtt-74Q聚集體。直方圖表示在 兩次獨立實驗中測得的FMI的量化（n= 6)。（E)在表達mHtt-74Q并經100iig/ml的GaLu 處理的細胞中，熒光分布向左移，代表聚集體數(shù)目減少。（F)GaLu增加MDC強度。白色箭頭 所指為經GaLu處理的細胞有MDC和EGFP的影像重迭。（比例尺為10微米）。與未經處 理的控制組（noDox)相比，將每細胞的點狀熒光影像區(qū)進行MDC的量化。（G)顯示利用西 方墨點法觀察LC3-I和LC3-II在每個條件下的蛋白質表達濃度。（使用200nM的雷帕霉 素處理作為誘導細胞自噬的正控制組）（n= 3)。乍〈0. 05，，〈0. 01為與NoDox相比，而 #P〈0. 05, ##P〈0. 01 為與Dox相比。
[0023] 圖3顯示靈芝萃取物在初級星狀細胞中專一性的增加NGFmRNA的表達量。星狀細 胞經靈芝萃取物處理6小時后進行RT-PCR，分析神經滋養(yǎng)因子（NGF,IGF-1，bFGF和BDNF) 的表達。
[0024] 圖4A至4C顯示星狀細胞NGF誘導物（靈芝萃取物）在PC12細胞中誘導神經突 觸的生長。所使用的培養(yǎng)液為經靈芝（GaLu-ACM)處理或未經靈芝處理24小時后的初級星 狀細胞培養(yǎng)液。將PC12細胞以GaLu-ACM或NGF處理后收集。
[0025] 圖5A至5J顯示區(qū)分來自靈芝粗萃物的