專利名稱：誘導細胞死亡的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及誘導細胞死亡的方法，更確切地說，但不僅僅局限于使用從乳頭狀瘤病毒中得到的E2和/或E7蛋白殺死細胞的方法。
乳頭狀瘤病毒(PV)，屬于乳多空病毒家族的病毒，是具有雙鏈環(huán)狀DNA的DNA病毒，該雙鏈環(huán)狀DNA有許多基因包括E2、E6和E7基因。它們感染上皮細胞并通常誘導良性高增殖病變的形成。無數男人和女人患有由一種人體乳頭狀瘤病毒(HPV)所引起的生殖器道感染，該導致外陰部疣的病毒至少有95種類型。然而，一些類型的乳頭狀瘤病毒與更嚴重的情況如癌有關。例如，HPV16型和18型與女性的子宮頸癌(zur Hausen，H(1991)Virology，184，9-13)有關，牛乳頭狀瘤病毒(BPV)2型和4型分別與牛的膀胱癌和上消化道癌有關(Campo，M.S.，等(1992)Cancer Res.52，6898-6904，CampoM.S.，等(1994)Carcinogenesis，15，1597-1601)。人體子宮頸癌細胞表達病毒E6和E7癌基因，這些基因的產物增加了細胞的增殖并促進了細胞的無限增殖化(Crook，T.，andVousden，K.H.(1996)Papillomavirus ReviewsCurrent Research onPapillomaviruses(Lacey，C.，ed)55-60頁，Leeds University Press，Leeds)。人體乳頭狀瘤病毒E2基因或缺少人體乳頭狀瘤病毒E2基因都被認為與感染PV的細胞一起在子宮頸癌的形成中起著主要作用。大多數子宮頸癌包含經染色體整合的HPV基因組的拷貝，其中病毒E2基因由于病毒環(huán)狀DNA的開環(huán)而導致分離(Baker，C.C.，等(1987)J.Virol.，61，962-971)。進一步，E2基因的突變增加了HPV16的無限增殖能力(Romanczuk，H.，and Howley，P.M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，3159-3163)。
乳頭狀瘤病毒E2基因編碼序列特異性DNA結合蛋白，該序列特異性DNA結合蛋白調控病毒基因表達，在病毒DNA復制中也需要該蛋白(Thierry，F.(1996)Papillomavims ReviewsCurrent Researchon Papillomaviruses(Lacey，C.，ed)21-29頁，Leeds UniversityPress，Leeds)。E2蛋白與在病毒長調控區(qū)(LCR)內發(fā)現的一個反向重復序列的多個拷貝相結合為二聚體。依靠特定的PV病毒和被研究的特定E2蛋白，E2與這些位點的結合能激活或阻遏E6和E7癌基因的轉錄。例如，HPV16 E2蛋白激活從位于HPV16 LCR的3’末端的P97啟動子的轉錄，它引起E6和E7癌基因的轉錄增加，而在幾乎相同的條件下，BPV1 E2蛋白阻遏P97啟動子的活性(Boulvard，V.等(1994)EMBO J.，13，5451-5459，Kovelman，R等(1996)Virol，70，7549-7560)。E2二聚體的每個亞單位包含兩個被柔性絞鏈區(qū)分開的結構域每個亞單位的N末端結構域介導病毒轉錄的調控，而C末端結構域介導DNA的結合(Giri，I.，和Yaniv，M(1998)EMBOJ.，7，2823-2329)。在BPV中，缺少N末端轉錄結構域的截短的E2蛋白也被表達。這些截短的E2蛋白(E2-TR)能阻遏病毒轉錄，并也能與具有全長的E2形成轉錄失活的異源二聚體(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.，66，3941-3945)。
從HPV16、HPV18和BPV1得到的E2蛋白都對子宮頸癌細胞系的增殖和生存具有顯著作用。我們已說明了HPV16 E2蛋白在經修飾的SiHa細胞中的表達。SiHa細胞是一個包含E2基因片段的單拷貝的HPV16轉化細胞系。我們在重金屬誘導的金屬硫蛋白啟動子的控制下，制造了表達HPV16 E2蛋白的SiHa-E2穩(wěn)定細胞系。使用重金屬誘導E2在這些細胞中的表達導致了經由細胞凋亡的細胞死亡(Sanchez-Perez，A.等(1997)J.Gen.Virol.，78，3009-3018)。E2誘導的細胞死亡表現出細胞凋亡的幾個典型特征，包括細胞膜出現氣泡、染色質凝聚和出現帶有亞-G0 DNA成分的細胞片段。類似地，HPV18 E2蛋白誘導HeLa細胞的細胞凋亡，HeLa細胞也是一個包含E2基因片段的拷貝的HPV18轉化細胞系(Desaintes，C.，等，(1997)EMBO J.16.504-514)。BPV1 E2蛋白在SiHa或HeLa細胞中的表達表明它是，至少部分是，通過阻斷細胞從G1期到S期的堿基轉換來阻遏增殖(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Dowhanick，J.J.，等(1995)J.Virol.，69，7791-7799，Hwang，E.S.，等(1996)Oncogene，12，795-803)。由于在這些實驗中使用的增殖測定，幾天后培養(yǎng)物上得到了菌落形成，BPV1 E2可能也在這些細胞系中誘導細胞凋亡。
還有證據表明E2蛋白可能對非HPV轉化細胞有影響。HPV31 E2蛋白使用重組腺病毒在HPV陰性正常人體包皮角質形成細胞(NHKcells)中的表達，導致在細胞周期的S期抑制，及帶有亞-G0 DNA成分的細胞的出現是一個細胞凋亡的典型特征(Frattini，M.G.，等(1997)EMBO J.，16，318-331)。然而，BPV1 E2對C33a細胞或SAOS細胞的增殖沒有作用，C33a細胞是一種HPV陰性子宮頸癌細胞系，SAOS細胞是一種HPV陰性骨肉瘤細胞系(Dowhanick，J.J.等(1995)J.Virol.69.7791-7799)。進一步，HPV18 E2蛋白對C33a細胞、SAOS細胞或HACat細胞的細胞凋亡的數量沒有作用，HACat細胞是一種自動無限增殖的HPV陰性人體角質形成細胞系(Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。
目前，沒有模型能滿意地解釋E2蛋白對細胞增殖的影響。

圖1是從HPV16 E2蛋白到誘導細胞凋亡的幾個可能途徑的示意圖。底線代表整合HPV基因組，彎箭頭表示P97啟動子。E2蛋白調控HPV16E6和E7基因(開放框)的轉錄。E6與p53結合并減少了細胞內p53的半衰期。E7與Rb結合并導致E2F的釋放。p53和E2F都能產生細胞凋亡。注意到即使不依賴于E2對E6和E7轉錄的影響，E2也能誘導細胞凋亡。在包含整合的HPV DNA的細胞系中，已表明BPV1E2和HPV18 E2能阻遏HPV18 E6和E7癌基因的轉錄(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Desaintes，C.，等(1997)EMBOJ.，16.504-514)。
腫瘤抑制蛋白p53被很好地表征。有許多p53的突變體以及p53相關基因，例如p73和p63(White，E.和Prives.C.，Nature，399.61999)。E6蛋白與腫瘤抑制蛋白p53相結合，這種作用導致細胞內p53的半衰期減少(Werness，B.A.等(1990)Science.248，76-79，Scheffner，M.，等(1990)Cell.63，1129-1136，Lechner，M.S.等(1992)EMBOJ.，11，3045-3052，Hubbert，N.L.等(1992)J.Virol.，66.6237-6241)。山于p53能阻斷細胞周期進程和/或誘導細胞凋亡(Gottlieb，T.M.和Oren，M.(1998)Seminars in Cancer Biol.，8.359-368)，E6的降低可能期望導致p53的增加和細胞周期抑制的增加和/或細胞死亡(如圖1中圖解)。與此觀點相一致，BPV1 E2在HeLa細胞中的表達顯示出可以穩(wěn)定p53(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。然而，E2-TR也阻遏E6和E7在這些細胞中的轉錄，但這截短的E2蛋白既不能穩(wěn)定p53，也不能誘導細胞凋亡(Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。這表明N末端轉錄調控結構域對這些作用負責，E2對E6轉錄的阻遏不是誘導細胞凋亡的關鍵因素。另外，HPV31 E2在NHK細胞中的表達顯示出使p53不穩(wěn)定(Frattini.M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。
E7蛋白與Rb腫瘤抑制蛋白、Rb相關蛋白p107和p130相結合(Dyson，N.，等(1989)Science，243，934-937，Hu，T.，等(1995)Int.J.Oncology.6.167-174)。E7與Rb的結合導致從Rb-E2F復合物中釋放出E2F蛋白，也被認為是為依賴于泛蛋白的蛋白酶解作用而進攻Rb(Boyer.S.N.等(1996)Cancer Res.56.4620-3624，Jones，D.L.和Munger，K.(1997)J.Virol.，71，2905-2919，Virology，239，97-107)。當從Rb中釋放后，轉錄因子E2F家族的成員激活S期所需的基因轉錄，E2F-1的過量表達可誘導血清饑餓細胞的細胞凋亡(Wu X.，和Levine，A.J.(1994)Proc.Natl.Acad.USA 91.3602-3606，Qin.X.Q.，等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91.10918-10922)。所以，E2對E7轉錄的阻遏可能被期望降低游離E2F的數量，并導致細胞周期的抑制(見所附圖1)。
BPV1 E2蛋白在HeLa細胞中的表達伴隨著E2F-1 mRNA和蛋白的降低以及E2F依賴性基因的表達減少(Hwang，E.S.等(1996)Oncogene，12，795-803)。而HPV16 E2蛋白在SiHa細胞中的表達伴隨著E2F活性增加(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.78.3009-3018)。進一步，HPV31 E2蛋白在NHK細胞中的過量表達伴隨著E2F-1 mRNA的增加(Frattini.M.G.等(1997)EMBOJ.16.318-331)。另一復雜之處在于不象BPV1 E2阻遏轉錄，HPV16和HPV18 E2蛋白都顯示出能激活HPV16 E6和E7癌基因的轉錄(Bouvard，V.，等(1994)EMBO J.13.5451-5459，Kovelman，R.，等(1996)Virol，70.7549-7560)。E7數量的任何增加都可能導致游離E2F的增加，這反過來又會導致細胞死亡(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.78.3009-3018)。
試圖通過E6和E7基因的轉錄阻遏或激活來解釋E2蛋白對細胞增殖影響的模型，顯然都局限于HPV陽性細胞。然而，HPV31 E2蛋白顯示出可誘導HPV陰性NHK細胞內的細胞凋亡(Frattini.M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。此外，HPV16 LCR內的突變阻斷E2與啟動子近側的E2位點結合，而且阻止E2介導的對E6和E7轉錄的阻遏，并不能完全減少E2對轉化效率的負面影響。(Romanczuk，H.，and Howley.P.M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89.，3159-3163)。這些報告表明E2可能獨自影響細胞增殖，而與它對E6和E7轉錄的影響無關。為處理這個問題，我們在多種被瞬時轉染的細胞系中表達了HPV16 E2蛋白。我們已說明這個E2蛋白能意外地在HPV轉化和非HPV轉化細胞系內誘導細胞凋亡。另外，我們已說明HPV16 E2誘導的細胞凋亡是p53依賴性的，以及誘導細胞死亡不需要E2蛋白的DNA結合活性。
WO98/01148(Harvard)公開了干擾被PV感染和/或轉化的細胞的增殖的方法和成分。但沒有披露使用E2來殺死PV陰性細胞、細胞的p53狀態(tài)、被處理細胞內細胞凋亡的誘導或對PV免疫應答的產生。
WO94/04686(Biogen)說明了蛋白包括HPV E2多肽傳遞到基于HIV TAT蛋白的細胞的方法。但沒有披露使用E2來殺死HPV陰性細胞、細胞的p53狀態(tài)、被處理細胞內細胞凋亡的誘導或對PV免疫應答的產生。
WO92/12728(Biogen)公開了非功能性E2衍生多肽，特別是E2轉激活阻遏蛋白，它與正常E2二聚并阻斷它在HPV感染的細胞內的功能。但沒有披露使用E2來殺死PV陰性細胞、細胞的p53狀態(tài)、被處理細胞內細胞凋亡的誘導或對PV免疫應答的產生。
WO98/32861(Pasteur)公開了干擾被PV感染和/或轉化的細胞的增殖的方法和成分。但沒有披露使用E2來殺死PV陰性細胞或對PV免疫應答的產生，沒有披露使用E7來殺死細胞，以及在DNA結合中使用任何缺陷型E2蛋白。
WO98/05248(Bristol-Myers Squibb公司)公開了使用多肽來應答PV感染，該多肽對應于在哺乳動物細胞內表達的肽，該肽對應于部分E6和E7蛋白。但沒有披露使用E2肽或E2 DNA序列來預防PV感染或子宮頸癌。
一方面，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性p53野生型、p53突變型或p53相關基因陽性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種殺死PV陽性細胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
進一步，本發(fā)明提供了一種殺死感染非HPV致癌病毒的細胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
進一步，本發(fā)明提供了一種殺死致癌細胞或致癌前體的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
進一步，本發(fā)明提供了一種治療子宮頸癌的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與被治療者的子宮頸細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。這種方法除了對引起癌細胞死亡有利外，還對由E2衍生物產生的對HPV的免疫應答有利。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物與這些細胞接觸。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陽性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物與這些細胞接觸。這種方法對可能由E2衍生物產生的對HPV的免疫應答有利。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV致癌細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物與這些細胞接觸。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV子宮頸癌細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物與這些細胞接觸。這種方法對可能由E2衍生物產生的對HPV的免疫應答有利。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白與這些細胞接觸。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白和/或以包含p53突變型的細胞誘導p53野生型或p53野生型功能的藥物與這些細胞接觸。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型與這些細胞接觸。
進一步，本發(fā)明提供了一種誘導PV陰性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白以及能激活p53功能的任何誘導劑，例如DNA損害藥物或UV、X射線或其它形式的輻射，來與這些細胞接觸。
E2或E7或衍生物可由病毒手段提供如腺病毒、腺病毒相關病毒和痘病病毒，或由非病毒手段提供如VP22、穿透蛋白(penetratin)和脂質體。
在本發(fā)明中，盡管考慮使用E7蛋白和它的功能衍生物或其部分，但優(yōu)選使用E2蛋白和它的功能衍生物或其部分。
按照本發(fā)明的方法，特別優(yōu)選使用DNA結合缺陷型E2衍生物，因為它們不允許或不參與病毒復制，但仍殺死細胞并誘導免疫應答。
從HPV16、HPV18和BPV1中得到的E2蛋白都影響子宮頸癌細胞系的增殖和/或存活(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.，78.3009-3018，Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514，Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.67.3720-3729)。前面我們提出HPV16 E2蛋白通過激活病毒E7基因的轉錄，誘導HPV16轉化SiHa細胞的細胞凋亡(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.，78.3009-3018)。相反，其他人提出了HPV18 E2蛋白通過阻遏病毒E6和E7基因的轉錄，誘導HPV18轉化HeLa細胞的細胞凋亡(Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514)。這里，我們說明了HPV16 E2蛋白誘導幾個非HPV轉化HeLa細胞系內的細胞凋亡，支持了HPV31 E2蛋白顯示出能誘導HPV陰性NHK細胞系內細胞凋亡的論證(Frattini，M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。這些資料表明上述任一機理都不完全正確。E2蛋白或是不依賴于HPV基因組誘導細胞凋亡，或是這些蛋白通過兩個途徑來誘導細胞凋亡一個需要其它HPV蛋白，另一個不依賴于其它HPV蛋白。
E7主要作為癌蛋白被廣泛研究，但也作為細胞凋亡的誘導物。例如，E7被發(fā)現能致敏角質形成細胞，使其進行自發(fā)的細胞凋亡和對腫瘤壞死因子α應答的細胞凋亡(Stoppler，H.等(1998)Oncogene.17.1207-1214)。有證據提出E7誘導的細胞凋亡可通過依賴于p53和不依賴于p53兩種途徑發(fā)生(Howes，K.A.等(1994)Genesand Dev.8，1300-1310，Pan.H.，和Griep.A.E.(1994)Genes andDev.8，1285-1299，Stoppler，H.等(1998)Oncogene.17.1207-1214)。這里我們說明了在HeLa細胞系內，HPV16 E7蛋白的過量表達誘導細胞凋亡。E7誘導的細胞凋亡可被HPV16 E6的過量表達抵消，或被反式內源性失活(trans-dominant negative)p53突變體的表達抵消。這些結果強有力地提出HPV16 E7蛋白誘導這些細胞中的p53依賴性細胞凋亡。我們已說明，類似E7，HPV16 E2蛋白誘導HeLa細胞的細胞凋亡，且此細胞凋亡是p53依賴性的。E7和E2都能誘導包含HPV16 E6基因的細胞的細胞凋亡。鑒于E6與p53結合且這種作用導致p53半衰期的減少，這些活動也許看起來十分顯著。然而，p53活性已在幾個HPV陽性細胞系內得到證明(Butz，K.，等(1995)Oncogene，10，927-936，Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514)。
我們說明了誘導HeLa細胞的細胞凋亡不需要HPV16 E2蛋白的序列特異性DNA的結合活性。相反，N末端結構域，包括轉錄激活結構域和絞鏈區(qū)域，對促進細胞死亡是必需的。BPV1 E2引起的生長抑制需要一個功能性DNA結合結構域和一個功能性轉錄激活結構域(Goodwin，E.C.等(1998)J.Virol.72.3925-3934)。這些資料表明HPV16 E2蛋白誘導的細胞凋亡和BPV1 E2蛋白誘導的生長抑制，都可由兩個分別的途徑得到。BPV1 E2蛋白產生的生長抑制被認為需要整合HPV癌基因的轉錄調控。所以，BPV1 E2蛋白誘導的生長抑制是整合E6和E7基因轉錄阻遏的結果(Goodwin，E.C.等(1998)J.Virol.72.3925-3934)。BPV E2對E6轉錄的阻遏可能導致p53的數量增加，這又導致p53依賴性的細胞凋亡(Hwang，E.S.，等(1996)Oncogene 12.795-803，Desaintes，C.等(1997)EMBOJ.16.504-514)。相反，HPV16 E2誘導的細胞凋亡的發(fā)生與DNA的結合活性無關，也與整合HPV序列的存在無關。
我們說明了HPV16 E2誘導的細胞凋亡需要兩個功能性轉錄激活結構域。類似的用BPV1 E2和BPV1 E2-TR做的異源二聚體實驗表明，有效的轉錄激活需要兩個功能性轉錄激活結構域(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66，3941-3945)。目前還不清楚為什么每個E2二聚體的兩個激活結構域對轉錄激活或誘導細胞凋亡是必需的。
簡而言之，我們說明了在沒有其它HPV基因產物的情況下，HPV16 E2蛋白導致了細胞凋亡，還說明了這種E2誘導的細胞凋亡是p53依賴性的。HPV基因組整合進入宿主染色體和隨之發(fā)生的E2基因斷裂除去了這一原細胞凋亡的信號。由于整合HPV序列繼續(xù)產生E6和E7蛋白，這些細胞繼續(xù)增殖并可能形成子宮頸癌腫瘤。
在本說明書中，下列表達式為解釋所給出的、非限制性的下列含義1)“PV陽性”意為一個被PV感染或轉化的細胞，而“PV陰性”則具有相反含義。
2)“蛋白”和“多肽”可以互換使用，盡管“蛋白”可能通常被認為是自然產生的多肽。
E2或E7的功能性衍生物是具有E2或E7的某些生物功能的蛋白質或多肽，例如，E2蛋白的N末端轉錄/復制結構域(氨基酸1-200)或E2蛋白的C末端結合結構域(氨基酸279-365)。E2或E7的功能性部分分別是具有至少部分天然的E2或E7序列的多肽。
按照本發(fā)明，誘導細胞死亡的方法和產物將通過例子并參照附圖進行說明，圖2至圖14為圖2說明HPV 16 E2對HeLa細胞的影響；圖3說明使用E2和E7誘導HeLa細胞的細胞凋亡的實驗結果；圖4說明證明E2-誘導和E7-誘導的細胞凋亡為p53依賴性的實驗結果；圖5說明在N296，K299和R304突變的截短E2蛋白E2Ct折疊和二聚，但未能結合DNA的實驗結果；圖6說明誘導細胞凋亡不需要DNA結合，但需要N末端轉錄調控結構域的實驗結果；圖7說明證明E2-E2Ct異源二聚體不誘導細胞凋亡的實驗結果；以及圖8圖解說明了用于下列實驗的蛋白質；圖9說明HPV 16 E2的DNA和氨基酸序列；圖10說明HPVE2DBM的DNA和氨基酸序列；圖11說明E2Ct的DNA和氨基酸序列；圖12說明E2CtDBm的DNA和氨基酸序列；圖13說明VP22-E2融合蛋白誘導HeLa細胞內的細胞凋亡；圖14說明HPV 16 E2特異T細胞的應答。
1.試驗程序-概要a.質粒質粒pCB6+p53和pCB6+p53173L分別代表p53野生型和p53突變體，由Dr Moshe Oren和Dr Andy Phillips提供。質粒pCMX-GFP3代表綠熒光蛋白，由Dr Jeremy Tavare提供。從pUHD 15-1中除去攜帶CMV啟動子的XhoI-EcoRI片段，用此片段取代pUHD 10-3中的誘導性四環(huán)素啟動子，從而制得pWEB質粒。將從HPV16基因組DNA得到的適當HPV序列克隆至pWEB的唯一Eco RI位點，緊靠著CMV啟動子的下游，從而得到HPV16 E2(圖9)、E6和E7表達質粒。使 用 寡 核 苷 酸 引 物 E25’5’CTACGAATTCATGGAGACTCTTTGCCAACG 3’ 和E23’5’GATAGAATTCTCATATAGACATAAATCCAG 3’，從HPV 16 DNA模板中通過PCR(94℃1分鐘，53℃3分鐘，72℃1分鐘，如此循環(huán)30次)將E2基因擴增。這些引物取代位于E2編碼序列的5’和3’末端的Eco RI限制位點(全部以粗體強調)。PCR產物被克隆到pWEB的Eco RI位點，并用一組E2特異性測序引物測序以檢查任何點突變的發(fā)生。使 用 具 有 Eco RI 位 點 的 引 物 E65’ 5’TGAGAATTCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG 3’和E63’5’ATCGAATTCTTACAGCTGGGTTTCTCTAGG 3’，從HPV16模板中通過PCR(95℃1分鐘，52℃1分鐘，68℃2分鐘，如此循環(huán)30次)將E6基因擴增。PCR產物被克隆到pWEB的Eco RI位點，并用一組E6特異性測序引物測序。使 用 具 有 Eco RI 位 點 的 引 物 E75’ 5’TCGGAATTCATGCATGGAGATACACCTAC 3’和E73’5’AGCGAATTCTTATGGTTTCTGAGAACAGATGG 3’，從HPV 16模板中通過PCR(94℃1分鐘，54℃2分鐘，72℃1分鐘，如此循環(huán)30次)將E7基因擴增。PCR產物被克隆到pWEB，并用一組E7 PCR引物測序。
突變的E2結構由使用PCR所產生。質粒pWEB-E2DBDm表達一突變的E2蛋白，其中E2 DNA結合結構域內的三個氨基酸(N296，K299和R304)被丙氨酸取代。通過PCR(94℃1分鐘，55℃1分鐘，68℃1分鐘，如此循環(huán)30次)，同時使用引物pWEB 5’5’ACCTCCATAGAAGACACCGGG 3’和E2m5’CGACACTGCAGTATACAATGTACAATGCTTTTTAAATGCATATCTTAAACATGCTAAAGTAGCAGCATCACC 3’，并以pWEB-E2為模板，從而誘導突變。斜體的堿基與E2基因錯配而誘導突變。PCR產物在3’末端包含一個PstI位點(以粗體強調)。這個位點和位于CMV啟動子內的SstI位點被用來取代帶有突變的E2DBDm序列的pWEB-E2內的野生型E2序列。整個PCR產物用一組E2特異性測序引物測序，以檢查任何不想要的突變的發(fā)生。
質粒pWEB-E2Ct表達一截短E2蛋白，它缺少E2蛋白從1到279的N末端氨基酸，但能正常地二聚和結合DNA(Lewis，H.，和Gaston，K.(1999)J.Mol.biol.294885-896)。為產生這一突變，通過PCR(94℃1分鐘，55℃1分鐘，68℃1分鐘，如此循環(huán)30次)，同時使用引物E2Ct5’5’GAAACAGAATTCATGAACTGTAATAGTAACACTACACCC 3’和E23’，并以pWEB-E2為模板，使堿基對3592和3852之間的HPV 16序列擴增。這些引物取代產物兩端的EcoRI限制位點(粗體)，并誘導一ATG翻譯起始密碼子(斜體)。PCR產物被克隆到pWEB內的EcoRI位點，并用E2特異性引物測序。質粒pWEB-E2CtDBDm表達一DNA結合缺陷型E2Ct。除了在PCR反應中使用pWEB-E2DBDm(它包括了具有N296A K299A和R304A突變的完全長度的E2)作為模板外，該質粒的生產與pWEB-E2Ct完全相同。
86氨基酸E2Ct(圖11)和E2Ct DBDm(圖12)蛋白在Escherichiacoli XL1-blue細胞中用表達載體pKK223-3(Pharmacia Biotech)被表達。序列編碼E2Ct和2CtDBDm分別從pWEB-E2Ct和pWEB-E2Ct DBDm中作為EcoRI片段被切除，并克隆至pKK223-3內Ptac啟動子下游的唯一EcoRI位點。該插入可用E2和pKK233-3特異性引物測序。
質粒pVP22-E2是由將整個HPV16 E2開放閱讀框架克隆至具有VP22開放閱讀框架的質粒pVP22/Myc-His(Invitrogen)的多克隆位點而產生。該插入可用pVP22/Myc-His-特異性引物測序。b.蛋白質純化和圓二色性光譜學包含pKK-E2Ct或pKK-E2CtDBDm的E.coli XL1-blue細胞(Stratagene公司)生長為在600nm下OD值是0.5。然后用1mMIPTG誘導蛋白質表達，且細胞在37℃下培育過夜。通過離心分離收集細胞，在含1mM MgCl2和1％2-巰基乙醇的50mM三乙酸鹽-EDTA緩沖溶液(PH7.5)中再懸浮，然后在4℃下經超聲處理裂解。細胞裂解物經離心分離(15,000g在4℃下進行30分鐘)澄清，然后在20℃下用0.1％DNase I培育30分鐘。細胞抽提液用含1％2-巰基乙醇的50mM磷酸鹽緩沖溶液(PH5.7)透析3小時，然后再次離心。上清液裝入一S-瓊脂糖凝膠陽離子交換培養(yǎng)基柱內，并用含10mM DTT的50mM磷酸鹽緩沖溶液(PH5.7)使之平衡，在用50柱體積的磷酸鹽緩沖溶液沖洗后，使用一線性濃度梯度為0.2～1MNaCl的同一緩沖溶液超過500ml(速度為1ml/分)時，E2蛋白被洗脫。用SDS-PAGE和凝膠阻滯測定(數據未列出)來收集和分析蛋白峰(用A280nm檢測)。收集的E2片段用10體積的含10mM DTT的50mM磷酸鹽緩沖溶液(PH5.7)透析3小時，然后放入MonoS HR16/10陽離子交換柱內，并以相同緩沖溶液使之平衡。E2用線性濃度梯度為0.1～1M NaCl洗脫，在急速冷卻和-70℃下保藏前，用含1mMDTT的25mM磷酸鈉緩沖溶液(PH7.9)透析3小時。用Expasy Tools從E2野生型(pI 9.7；Mr 10016.6)和E2突變體(pI 9.4；Mr 9831.4)中的氨基酸序列測定等電點(pI)和分子量。分子量在一臺VG Quattro三節(jié)四極質譜儀上通過電霧化電離作用得到證實。結構完整性在一臺Jobin Yvon CD6旋光分光儀用遠紫外和近紫外圓二色性光譜學得到證實，該旋光分光儀在1nm/分下采用0.05cm光程長度和0.5nm分離度。c.凝膠阻滯測定與 HPV 16 E2 位 點 1 的 從 核 苷 酸 4 6 到 65(5’TTGAACCGAAACCGGTTAGT 3’)的序列相符的雙鏈寡核苷酸(100ng)，端部用T4多核苷酸激酶(Stratagene公司)以[γ-32P]ATP標記。未包含的標記用一Sephadex G-50柱(Stratagene公司)除去。標記寡核苷酸(10000cpm)與純化蛋白在結合緩沖溶液(20mMHEPES(pH7.9)，25mMKCl，1mMDTT，0.1％NP-40，10％甘油酰，0.5μg/μl牛血清清蛋白，80ng/μl poly[d(I·C)])中培育。在20℃下經過20分鐘后，游離并被標記的DNA在0.5x TBE的6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上解析，并用放射自顯影術顯示。在3M尿素(20℃下1小時)中將蛋白質混合和變性，然后在結合緩沖液中用0.1M尿素稀釋使蛋白質再折疊，從而形成E2Ct野生型和E2CtDBDm的異源二聚體。異源二聚體的DNA結合活性的測定如上所述。d.細胞培養(yǎng)基和轉染SiHa、C33a、Saos-2、MCF-7和COS-7細胞在Dulbecco改進的Eagles培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium，DMEMSigma)中保存，并補充10％胎牛血清(Foetal Bovine Serum，FBSSigma)、青霉素(1000000單位/升)和鏈霉素(100mg/升)。NIH 3T3細胞在DMEM中保存，并補充10％小牛血清(CSSigma)和青霉素/鏈霉素。HeLa細胞在極限必需培養(yǎng)基(Minimal Essensial Medium，MEMSigma)中保存，并補充10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。866、873、877、915和808F細胞在DMEM中保存，并補充5％FBS、青霉素/鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、5μg/ml胰島素、0.01μg/ml上皮生長因子(EGF)、0.01μg/ml霍亂毒素和0.4μg/ml氫化可的松。所有細胞均在37℃下的5％CO2中保存。
在瞬時轉染前，將細胞涂布在6個凹穴平皿內的蓋玻片上，每個凹穴上有3×105個細胞，然后培育過夜，得到傳代鋪滿培養(yǎng)物。根據制造商的操作指南，用于SiHa、NIH 3T3細胞的脂質體試劑Tfx-50和用于所有其它細胞的脂質體試劑Tfx-20(Promega)在每一轉染中，按1ml血清游離培養(yǎng)基內脂質體DNA的比例為3∶1來使用。用于每個轉染的DNA在本文中均有描述。在18小時(E7實驗)或30小時(E2實驗)后，蓋玻片在PBS中沖洗，細胞在22℃下用4％低聚甲醛/PBS固定30分鐘。在進一步用PBS沖洗后，細胞用二苯并酰亞胺(bisbenzimide，Hoechst No.33258Sigma)染色30分鐘，然后用PBS沖洗，再用10μl MOWIOL(Calbiochem)將細胞固定在顯微鏡載片上。e.熒光顯微術和成象用Leica DM IRBE倒置落射熒光顯微鏡來進行熒光顯微術，該顯微鏡配有FITC、DAPI過濾組和20x物鏡(Leica)。成象用LeicaDM IRBE倒置共焦顯微鏡來觀察，該顯微鏡配有63x油鏡(Leica)和TCS-NT4軟件(Leica)。2.HPV 16 E2和E7蛋白在HeLa細胞中誘導細胞凋亡質粒pWEB-E2、pWEB-E6和pWEB-E7分別表達HPV 16 E2、E6和E7蛋白。每個質粒被瞬時轉染用脂質體以提高其進入生長在蓋玻片上的HeLa細胞的數量。圖2顯示了一組有代表性的HeLa細胞，可用裝配有40x油鏡的落射熒光顯微鏡觀察到(a)Bright field顯微術(b)GFP熒光(c)DAPI熒光。在每個實驗中，GFP表達質粒pCMX-GFP3被共轉染入細胞內；pCMX-GFP3表達綠熒光蛋白(GFP)并允許通過其熒光經FITC過濾組的激發(fā)作用鑒別轉染細胞。由于GFP均勻分布轉染細胞內表達，它也允許細胞形態(tài)學的測定(圖2b)。細胞用能進入所有細胞的細胞核的二苯并酰亞胺(Hoechststain)染色，且無論它們的轉染狀態(tài)如何，都允許比較未轉染細胞與轉染細胞的染色質凝聚情況(圖2c)。單個細胞用GFP標記為未轉染或轉染，并分別用Hoechst染料和GFP測定染色質凝聚和細胞膜鼓泡。圖2中顯示了一個典型的正在經歷細胞凋亡的轉染細胞。細胞膜鼓泡在(a)和(b)中可見。正在經歷細胞凋亡的未轉染細胞和轉染細胞的百分比可通過計數確定。
在與E2和E7表達質粒瞬時轉染后，所見的細胞凋亡的HeLa細胞比例由圖2示出。在每個實驗中，大約有5％的未轉染細胞和5％的帶有空pWEB載體的轉染細胞為細胞凋亡。E2和E7表達質粒都顯著增加了轉染細胞群(population)中細胞凋亡的數量(分別如圖3a和圖3b所示)。如圖2所示，在未轉染和轉染細胞群中的細胞凋亡的細胞被鑒別。轉染完全相同地重復進行三次。這些數據表明HPV16 E2和E7蛋白都在HeLa細胞中誘導了細胞凋亡。接下來我們開始確定這些蛋白在其它細胞系中是否誘導細胞凋亡。3.E2和E7在HPV轉化和非HPV轉化細胞系中誘導細胞凋亡我們測定了HPV 16 E2和E7蛋白在六個HPV轉化細胞系和4個非HPV轉化細胞系中誘導細胞凋亡的能力。比較結果如表1所示。表1 E2和E7在多種細胞系中誘導細胞凋亡
*凋亡細胞百分比測定如文中所述。*細胞凋亡的背景水平(background level)指未轉染細胞群和經空pWEB質粒轉染的細胞群。除了MCF-7細胞外，這些數據都是相周的，括號內給出了MCF-7細胞內經pWEB轉染后的細胞凋亡的百分比。
pWEB轉染的MCF-7細胞表現出較高的細胞凋亡的背景水平。
E2和E7在HeLa細胞和SiHa細胞中誘導細胞凋亡，HeLa細胞和SiHa細胞分別為一種HPV18轉化和一種HPV16轉化子宮頸癌細胞系。E2和E7都能在人體866、873、877和915角質形成細胞中誘導細胞凋亡866細胞和915細胞包含HPV 16，873細胞包含HPV18，877細胞同時包含HPV 18和HPV 45(Bartholomew，J.等(1997)Cancer Res.57，937-942和P.Stern，unpublished observations)。有趣的是，E2和E7都不能在C33a細胞、COS-7細胞或Saos-2細胞中誘導細胞凋亡，C33a細胞、COS-7細胞和Saos-2細胞分別為一種非HPV轉化子宮頸癌細胞系、一種SV40轉化猴成纖維細胞系和一種人體骨肉瘤細胞系。然而，E2和E7在三種其它HPV陰性細胞系中卻能誘導高數量的細胞凋亡即808F細胞、NIH3T3細胞和MCF-7細胞，它們分別是一種人體成纖維細胞系、一種鼠成纖維細胞系和一種人體乳腺癌細胞系。所以，E2能在HPV陰性細胞系中誘導細胞凋亡。這些結果的另一個引人注意的特征是所有能被E2誘導發(fā)生細胞凋亡的細胞系也都能被E7誘導發(fā)生細胞凋亡。類似地，對E2表達不敏感的細胞系也都對E7表達不敏感。因此，E2和E7是經過相同的途徑，或經過能匯合于同一點的途徑來誘導細胞凋亡。
所有對E2或E7表達的應答產生細胞凋亡的細胞系，都被認為包含p53野生型。例如，NIH3T3細胞包含p53野生型，并發(fā)生p53依賴性的細胞凋亡(Chirillo，P.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94.8162-8167)。與此對比，C33a細胞包含突變的p53(Crook.T.，等(1991)Oncogene.6 873-875)，Saos-2不包含p53，這兩個細胞系都不能發(fā)生細胞凋亡以應答E2或E7。為確定p53是否在E2和/或E7誘導細胞死亡中發(fā)揮作用，接下去我們來看，反式內源性失活p53突變體和HPV 16 E6蛋白表達對表達這些蛋白的細胞中的細胞凋亡數量的影響。4.E2和E7經p53依賴性途徑誘導細胞凋亡
HeLa細胞被這些質粒瞬時轉染GFP-表達質粒pCMX-GFP3和pWEB(或pWEB-E2或pWEB-E7)以及表達p53野生型(wt)的pCB6+p53(或表達p53突變體(mt)的pCB6+p53173L)。凋亡細胞如圖2所示被鑒別。
p53野生型的共表達將E2和E7誘導的細胞凋亡數量增加了幾乎50％(比較圖4a中的4、5、7和8列)。相反，反式內源性失活p53173L突變體的共表達卻將E2和E7誘導的細胞凋亡數量減少至接近基礎水平(分別為圖4a中的6列和9列)。這些數據表明，在這些條件下，HPV16 E2和E7蛋白誘導的細胞凋亡是通過p53依賴性途徑發(fā)生的。為確認這一結論，HeLa細胞被pWEB-E2(或pWEB-E7)和pWEB-E6(或空pWEB)載體瞬時共轉染。HPV16 E6蛋白與E3泛蛋白連接酶E6-AP一起結合p53，這導致p53通過泛蛋白依賴性蛋白酶降解(Scheffner，M.等(1990)Cell.63.1129-1136，Huibregtse，J.M.等(1991)EMBO J.，10.4129-4135)。pWEB-E6質粒的增加數量導致E2誘導的細胞凋亡數量逐漸降低(圖4b)。類似地，E7蛋白誘導的細胞凋亡數量也由于E6的共表達而顯著降低(圖4c)。在pWEB-E6大量存在的情況下，E2和E7蛋白誘導的細胞凋亡降低到基礎水平附近。綜上所述，這些結果證實了HPV16 E6蛋白和HPV16E7蛋白誘導的細胞凋亡都需要功能性p53。5.誘導細胞凋亡不需要E2的DNA結合活性雖然已有幾個似乎可信的機理用以解釋E7過量表達導致細胞凋亡，但從E2的過量表達到細胞凋亡的途徑還不清楚。我們起初提出在SiHa細胞內，E2可能增加整合E7癌基因的轉錄，并提出這可能會導致E7誘導的細胞死亡。但是，這里我們闡述了E2可誘導幾個非HPV轉化細胞系的細胞凋亡(表1)。這些數據表明E2不能簡單地通過激活E7轉錄殺死細胞。為證實這一假設，我們在E2 DNA結合結構域(DBD)內，在已知對蛋白質-DNA的相互作用重要的位置上放置三個點突變。HPV16 E2 DBD和BPV1 E2 DBD-DNA復合物的晶體結構表明，HPV16 E2 DBD內的氨基酸N296、K299和R304對特異性E2結合位點的識別很關鍵(Hegde，R.S.和Androphy.E.J.(1998)J.Mol.Biol.284.1479-1489，Hegde，R.S.等(1992)Nature 359.505-512)。使用定點誘變，我們以丙氨酸取代了所有這三個氨基酸。在E2蛋白的全部長度內和僅僅在E2 DNA結合結構域內，突變被誘導。
為確定這些突變不需要DNA結合活性，且不擾亂E2 DBD的整個折疊，我們在細菌內表達了DBD野生型和突變的DBD。質粒pKK-E2Ct表達一種能正常二聚和結合DNA的截短E2蛋白(氨基酸280到365)(Lewis H.和Gaston.K(1999)J.Mol.Biol.294885-896)。質粒pKK-E2CtDBDm表達含N296A、K299A和R304A突變的相當的E2片段。E2Ct和E2CtDBDm蛋白從攜帶各自質粒的細菌中純化得到(圖5a)。具體地，在圖5(a)實驗中，純化后的E2Ct和E2CtDBDm樣品用SDS-PAGE分析。標記的尺寸如圖中所示。在圖5(b)和圖5(c)實驗中，用圓二色性表明N296、K299和R304突變的存在不影響E2CtDBDm的折疊或二聚作用。(d)將數量逐漸增加(分別為10、50和250nM)的E2Ct(2-4道)或E2CtDBDm(5-7道)加入到被標記的寡核苷酸中，該標記寡核苷酸攜帶有來自HPV16基因組的E2結合位點1E2(1)。游離的和被結合的DNA在6％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并可用放射自顯影術顯示。E2Ct-E2(1)復合物如箭頭所示。然后，用圓二色性(CD)檢測突變的存在是否改變了E2 DBD的折疊或二聚作用。E2Ct和E2CtDBDm蛋白的CD光譜非常相似。這意味著突變對這些性能影響很小或沒有影響。圖5d顯示了凝膠阻滯測定結果，其中數量逐漸增加的E2Ct蛋白(2-4道)或E2CtDBDm蛋白(5-7道)被加入到攜帶有一個E2結合位點的標記的寡核苷酸中。由圖可見，E2Ct與標記DNA結合緊密，而E2CtDBDm對此位點沒有任何可檢測出的結合。
為確定誘導細胞死亡是否需要E2的DNA結合活性，我們用質粒pCMX-GFP3瞬時轉染HeLa細胞，該質粒表達野生型全部長度的E2蛋白(pWEB-E2)，或帶有N296A、K299A和R304A突變的全部長度的E2(pWEB-E2DBDm)。圖2中顯示了被鑒別的凋亡細胞。轉染完全相同地重復進行三次。令人驚訝的是，pWEB-E2和pWEB-E2DBDm質粒誘導細胞死亡的數量幾乎相同(圖6)。相反，僅僅表達E2 DBD因而缺少N末端轉錄激活結構域的質粒pWEB-E2Ct，不能誘導細胞死亡(圖6)。所以，盡管誘導HeLa細胞的細胞凋亡不需要E2的序列特異性DNA結合活性，但N末端轉錄激活結構域是必不可少的。為確認和擴展這些結論，我們接下去看E2異源二聚體誘導細胞死亡的能力。6)E2誘導細胞死亡所需要的兩個功能性N末端結構域以前已經說明了BPV1 E2和E2-TR蛋白能形成異源二聚體(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66.3941-3945)。盡管據報道這些異源二聚體在體外結合DNA，但他們不能在完整細胞內激活轉錄(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66.3941-3945)?？紤]到這個情況，我們想確定HPV16 E2和E2Ct蛋白是否能形成異源二聚體，這些異源二聚體是否能誘導細胞死亡。為確定異源二聚體能否在體外形成，我們將一固定數量的E2Ct野生型與數量逐漸增加的DNA結合缺陷型E2Ct DBDm蛋白相混合。圖7a中所示數量的E2Ct和E2CtDBDm相混合后，然后在3M尿素中變性，以方便亞基的交換。稀釋進入0.1M尿素中，經過再折疊后，蛋白被加到標記的寡核苷酸中，該標記寡核苷酸攜帶有HPV16 E2結合位點1E2(1)。游離的和被結合的DNA在6％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并可用放射自顯影術顯示。E2Ct-E2(1)復合物如箭頭所示。再折疊的E2Ct與攜帶一個E2結合位點的標記寡核苷酸結合，而再折疊的E2CtDBDm顯示出無DNA結合活性(圖7a，分別為3和4道)。向固定數量的E2Ct中加入數量逐漸增加的E2CtDBDm，導致DNA結合活性逐漸降低(圖7a，5-8道)。這些數據表明，至少在這個體外測定中，這些蛋白能形成異源二聚體。
為詳細研究異源二聚體在完整細胞內的形成，用pWEB-E2和數量逐漸增加的空pWEB質粒(空心方框)，或pWEB-E2Ct和數量逐漸增加的pWEB(實心圓)，或pWEB-E2和數量逐漸增加的pWEB-E2Ct(實心方框)瞬時轉染HeLa細胞，圖2中顯示了被鑒別的凋亡細胞，轉染完全相同地重復進行三次。pWEB-E2質粒在轉染細胞群中誘導了高數量的細胞死亡，而pWEB-E2Ct質粒沒有影響(圖7b)。然而，隨著數量逐漸增加的pWEB-E2Ct質粒被加入到含pWEB-E2的轉染混合物中，轉染細胞群中細胞凋亡的百分比下降，最終達到背景水平(圖7b)。數量逐漸增加的pWEB-E2CtDBDm質粒也降低了pWEB-E2誘導的細胞死亡的數量，而數量逐漸增加的pWEB沒有影響(沒有示出)。這些數據表明，在完整細胞內形成了含有E2和E2Ct的異源二聚體，這些異源二聚體不能誘導細胞凋亡。所以，看來為誘導細胞死亡，E2二聚體需要兩個功能性N末端結構域。7.VP22-E2融合蛋白能誘導細胞凋亡單純皰疹病毒1型(HSV-1)蛋白VP22是在病毒衣殼和包膜之間病毒顆粒的外被區(qū)域內發(fā)現的一種38kDa蛋白。當在瞬時轉染細胞中表達時，VP22被轉運入細胞質，接著以一個非典型分泌機理從合成細胞輸出。然后蛋白高效率地進入周圍細胞，并基于一依賴于細胞骨架肌動蛋白的作用機制，定位于細胞核。一旦位于細胞核內，VP22與染色質結合，并被分離到子代細胞中。細胞間的VP22轉運是如此高效，以至蛋白能進入一個轉染單分子層中的每一個細胞(Elliott，G和O’Hare，P(1997)Cell 88223-233)。
為了將E2 ORF克隆到正確閱讀框架的VP22載體(Invitrogen)內，先將它從pWEBE2質粒中除去，再作為EcoR1片段插入pBluesciptII KS(Stratagene公司)的多克隆位點。然后這個結構與EcoRV和BamHI一起被酶切消化，得到的E2片段插入到pVP22的多克隆位點。用pVP22和E2的特異性引物進行DNA序列分析。
質粒pVP22-E2、pVP22和pWEB-E2與pCMX-GFP3共轉染入HeLa細胞，轉染和未轉染細胞群內凋亡細胞的百分比測定如前面所述。在與pVP22-E2瞬時轉染后，凋亡細胞的百分比增加至30％左右(圖13)。相反，pVP22質粒對細胞凋亡數量沒有影響。這些數據表明VP22-E2融合蛋白能誘導HeLa細胞的細胞凋亡。8.E2和免疫應答E2和對HPV的免疫應答在子宮頸癌和惡性前的HPV相關疾病中控制HPV感染方面，已有的資料顯示出E2免疫性可能起作用(Rocha-Zavaleta等，(1997)Brit.J.Cancer 75，1144-1150)。針對E2而誘導出來的免疫可能是保護性的，原則上，可能把子宮頸上皮的基底/副基底細胞中病毒表達的最早階段作為靶子攻擊。在消滅帶有游離型DNA的細胞方面，刺激局部長壽粘膜免疫比基于衣殼蛋白的疫苗更好。帶有游離型HPVDNA的細胞可能形成庫(潛伏狀態(tài))，其中整合作用(反應進行的一個主要危險因素)可能會隨之發(fā)生。婦女中PV陽性在15～25歲性活躍的女性中大約占39％。它隨著年齡顯著下降，證明這樣的觀點，即存在對感染的獲得性免疫。
致免疫E2蛋白或經修飾E2蛋白的局部傳遞可激活一種細胞凋亡途徑的預兆將代表一種與治療性和預防性組成一起、對任一種子宮頸病變的補充進攻。這與高危險和低危險病毒感染包括外陰疣或其它疣有關。一個有趣的可能性在于，E2蛋白的免疫原性可由于與靶DNA結合而得到提高。此復合物可能傳遞單一抗原表位，此抗原表位可被自然清除的免疫應答所識別。
我們已說明T輔助細胞對HPV16 E2的應答顯示出與病毒感染的清除相關，強調的是該蛋白作為預防性和治療性的免疫目標的潛力(Bontkes，H.J等(1999).Gen Virol 802453-2459)。為檢測HPV 16E2特異性T細胞應答，我們已經使用γ干擾素ELISPOT做了測定。圖14顯示了T細胞對HPV 16 E2的記憶是在供體1內而不是在供體2內的證據。然而，從外周血液單核細胞中制備的自體樹狀細胞長期暴露于HPV 16 E2 C末端片段，能產生特異T細胞的初次激活。我們用GM-CSF和IL-4從血清游離培養(yǎng)基內的粘附外周血液單核細胞中制備了樹狀細胞(DCs)。該細胞的主體是CD1a+、HLA-DR+、CD80+和CD14-。去除CD4細胞后的外周血液淋巴細胞用自體Dcs和10μg/ml E2Ct(制備如1b部分所述)、或在無抗原的情況下，培育4或11天(在第9天洗滌應答細胞，并加入新鮮的DCs和E2或無抗原加入)。在再次平皿接種(replating)和培育過夜后，用ELISPOT測定。對三份不同的細胞濃度計算斑點，并歸一數據，計算平均和標準誤差。這些數據證明了具有抗HPV病變活性的E2 T細胞在人體內產生和/或增加的可能性。
權利要求
1.一種誘導PV陰性p53野生型、p53突變型或p53相關基因陽性細胞的細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PVE2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
2.一種殺死PV陽性細胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
3.一種殺死感染致癌病毒細胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
4.一種殺死PV陰性和PV陽性致癌細胞或致癌前體的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物與這些細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物的DNA序列。
5.一種誘導PV陰性和PV陽性細胞細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物與這些細胞接觸。
6.一種誘導致癌細胞細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物與這些細胞接觸。
7.一種誘導PV陽性子宮頸癌細胞細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它們的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物與這些細胞接觸。
8.如權利要求1～7中任一項所述的一種誘導細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白和p53野生型蛋白和/或以包含突變體p53的細胞誘導p53野生型或p53野生型功能的藥物或藥物組成與這些細胞接觸。
9.如權利要求1～7中任一項所述的一種誘導細胞凋亡的方法，包括用編碼PVE2和/或E7的DNA和編碼p53野生型蛋白的DNA和/或以包含突變體p53的細胞誘導p53野生型或p53野生型功能的化合物與這些細胞接觸。
10.如權利要求1～7中任一項所述的一種誘導細胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白和至少一種激活p53功能的作用劑與這些細胞接觸。
11.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中被處理細胞群中的大部分細胞被殺死。
12.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中細胞被HPV感染。
13.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中細胞被HPV轉化。
14.如權利要求12或13所述的方法，其中HPV被整合入細胞基因組。
15.如權利要求12、13或14所述的方法，其中HPV為16型和/或18型。
16.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中細胞為哺乳動物細胞。
17.如權利要求16所述的方法，其中細胞為例如子宮頸、乳房、肺、腦、結腸、食道、黑素瘤、骨肉瘤、皮膚、肝、頭、癌或白血病細胞。
18.如權利要求17所述的方法，其中細胞在哺乳動物體內。
19.如權利要求17或18所述的方法，其中細胞為人體細胞。
20.如權利要求1、2或11～19中任一項所述的方法，其中細胞為致癌細胞或其前體。
21.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中細胞被病毒感染。
22.如權利要求19所述的方法，其中細胞被致癌病毒或反轉錄病毒感染。
23.如權利要求22所述的方法，其中致癌病毒為HPV、Hepatitis B、Herpesvirus B、Epstein-Barr病毒或人體T細胞親淋巴病毒1型或2型。
24.如權利要求20所述的方法，其中細胞被HIV或HIV相關病毒感染。
25.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中在細胞內或被治療者體內誘導了免疫應答，特別是粘膜應答。
26.如權利要求25所述的方法，其中免疫應答為粘膜應答。
27.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中細胞過度表達p53或相關基因或其突變體。
28.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中E2衍生物或功能部分與DNA的結合不如E2野生型與DNA的結合。
29.一種治療子宮頸癌的方法，包括用E2和/或E7或它們的功能部分與被治療者的子宮頸細胞接觸，或向這些細胞提供一個編碼PVE2和/或E7蛋白或它們的功能部分的DNA序列。
30.如權利要求29所述的方法，其中被治療者為人。
31.如權利要求29或30所述的方法，包括在被治療者體內誘導對PV的免疫的應答。
32.如權利要求25、26、29、30或31所述的方法，其中E2與另一蛋白質或其功能部分融合，該蛋白質或其功能部分引發(fā)免疫應答。
33.如權利要求32所述的方法，其中蛋白質為破傷風類毒素片段C。
34.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中使用編碼E2部分或E2衍生物的DNA序列，與E2野生型相比，該部分或衍生物在DNA結合中為缺陷型。
35.如上述中任一項權利要求所述的方法，其中E2蛋白或其部分或其衍生物與DNA復合。
36.一種PV疫苗，至少包含E2的一部分或E2的衍生物。
37.如權利要求28所述的PV疫苗，其中E2是從HPV衍生得到。
38.一種DNA結合缺陷型變體，包括一個缺少天然E2序列C末端部分的E2氨基酸序列。
39.如權利要求38所述的一種DNA結合缺陷型變體，包括一個缺少天然E2蛋白的最后86個氨基酸的E2序列。
40.如權利要求38或39所述的一種DNA結合缺陷型變體，包括一個E2序列，該E2序列缺少天然E2蛋白的氨基酸296、299和304。
41.包括如權利要求38、39或40所述的E2變體的同源二聚體。
42.包括如權利要求38、39或40所述的E2變體的異源二聚體。
43.一種載體，包括經修飾的E2或E7 DNA序列，或至少E2或E7 DNA序列的一部分。
44.如權利要求43所述的載體，其中E2或E7 DNA序列編碼能殺死p53陽性細胞、PV陽性細胞、感染致癌病毒的細胞或癌細胞的E2或E7衍生物。
45.如權利要求43或44所述的載體，它編碼多肽，該多肽在哺乳動物細胞內產生免疫應答，特別是粘膜應答。
46.如權利要求44所述的載體，其中產生粘膜應答。
47.如權利要求43、44或45所述的載體，其中E2或E7 DNA序列編碼能抑制病毒復制的E2或E7衍生物。
48.如權利要求47所述的載體，其中衍生物能抑制HPV的復制。
49.如權利要求43、44、45、46或47所述的載體，其中E2或E7 DNA序列編碼E2衍生物，與E2野生型或E7相比，該E2衍生物在DNA結合中為缺陷型。
50.如權利要求36所述的一種編碼E2衍生物的核苷酸序列。
51.如權利要求38所述的核苷酸序列，其中該序列為DNA或RNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導細胞死亡的方法。
文檔編號A61K48/00GK1372598SQ0081242
公開日2002年10月2日 申請日期2000年7月13日 優(yōu)先權日1999年7月13日
發(fā)明者凱文·利昂·加斯湯, 彼得·萊斯萊·斯特恩, 安東尼·拉塞爾·克拉克 申請人:布里斯托爾大學