養(yǎng)24 h。然后加入阿霉素達(dá)到10 μ g/mL，培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。
[0027] ⑵UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞HS68光毒性氧化損傷保護(hù)能力評(píng)價(jià)： UVB被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的環(huán)境致癌物質(zhì)，通過產(chǎn)生大量的活性氧（ROS)危害對(duì)人體健康。 近期，本課題組研宄發(fā)現(xiàn)UVB的光毒性主要是由細(xì)胞脂質(zhì)過氧化造成的（Song et al. The photocytotoxicity of different lights on mammalian cells in interior lighting system. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 117 (2012) 13 -18)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞HS68光毒性氧化損傷細(xì)胞模型來評(píng)價(jià)黑果枸杞 果渣天然復(fù)合抗氧化劑對(duì)于光毒性的保護(hù)作用。
[0028] 具體操作：人皮膚成纖維細(xì)胞HS68采用DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清、2mM谷氨 酸鹽、1%鏈霉素/青霉素）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37°C、5% CO2的無菌環(huán)境。培養(yǎng)基每2~3 天更換一次，細(xì)胞培養(yǎng)24h并達(dá)到80%聚集程度時(shí)，向培養(yǎng)基中加入黑果枸杞果渣天然復(fù)合 抗氧化劑，使其終濃度達(dá)到〇，10，20 or 40 μ g/mL培養(yǎng)24h。然后暴露在120 mj/cm2劑 量的UVB光線下（（Philips TL 20W/12RS熒光燈管，發(fā)射光譜285~350 nm，峰值310~315 nm)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。
[0029] ⑶結(jié)論如表2所示。細(xì)胞暴露于阿霉素或UVB后，細(xì)胞活力顯著下降。給予黑果 枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑或葡萄籽提取物（GSE)后，細(xì)胞活力顯著增高，表明黑果枸杞果 渣天然復(fù)合抗氧化劑或葡萄籽提取物（GSE)能夠顯著保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞心臟毒性 損傷和UVB誘導(dǎo)的人表皮成纖維細(xì)胞光毒性損傷。而且，在心臟毒性細(xì)胞損傷保護(hù)方面，黑 果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑的保護(hù)能力優(yōu)于同劑量陽性對(duì)照藥物GSE但無顯著差別；在 光毒性細(xì)胞損傷保護(hù)方面，黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑的保護(hù)能力接近陽性對(duì)照藥物 GSE。因此，可以看出本發(fā)明制備得到黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑具有良好的抗氧化活 性和細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用。
[0030] 表2黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑細(xì)胞氧化損傷保護(hù)能力評(píng)價(jià)結(jié)果
注：與空白對(duì)照組相比，#產(chǎn)< 0. 01 ;與損傷模型組相比，*產(chǎn)< 0. 05、**產(chǎn)< 0. 01、M產(chǎn) < 0.0 Olo
[0031] 4、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、安全性好。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1 一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，包括以下步驟： ⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液按1 :6的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后，在溫度為40°C 的條件下靜置60 min，得到混合溶液。
[0033] 其中：黑果枸杞果渣是指茄科枸杞屬多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果實(shí)榨汁后的固體廢棄物。
[0034] 復(fù)合酶溶液是指將纖維素酶與果膠酶等質(zhì)量混合后溶解于水中，所得到的pH為 4~5的溶液。
[0035] ⑵將混合溶液與體積濃度為95%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到75%， 然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0036] 其中：超聲波-微波反應(yīng)器的反應(yīng)條件是指超聲波功率為800 W、微波功率為300 W、反應(yīng)時(shí)間為35 min、反應(yīng)溫度為70°C。
[0037] ⑶將黑果枸杞果渣提取物與水按I :10的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后離心，得到上 清液，該上清液上弱極性大孔樹脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用2倍柱體積的水和體積濃度 為70~90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮至原洗脫液體積 的30%后得到濃縮產(chǎn)物；濃縮產(chǎn)物于-70°C預(yù)凍4 h后經(jīng)冷凍干燥，即得到黑果枸杞果渣天 然復(fù)合抗氧化劑。
[0038] 其中：離心的條件是指轉(zhuǎn)速為4000 rpm，時(shí)間為20min。
[0039] 減壓濃縮的條件是指真空度0. 05 MPa，溫度50°C。
[0040] 冷凍干燥的條件是指真空度為10 Pa、溫度為-55°C、干燥時(shí)間為72 h。
[0041] 實(shí)施例2 -種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，包括以下步驟： ⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液按I :7. 5的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后，在溫度為 50°C的條件下靜置40 min，得到混合溶液。
[0042] 其中：黑果枸杞果渣是指茄科枸杞屬多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果實(shí)榨汁后的固體廢棄物。
[0043] 復(fù)合酶溶液是指將纖維素酶與果膠酶等質(zhì)量混合后溶解于水中，所得到的pH為 4~5的溶液。
[0044] ⑵將混合溶液與體積濃度為100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到 75%，然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0045] 其中：超聲波-微波反應(yīng)器的反應(yīng)條件是指超聲波功率為1000 W、微波功率為330 W、反應(yīng)時(shí)間為32 min、反應(yīng)溫度為60°C。
[0046] ⑶將黑果枸杞果渣提取物與水按I :15的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后離心，得到上 清液，該上清液上弱極性大孔樹脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用3倍柱體積的水和體積濃度 為70~90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮至原洗脫液體積 的30%后得到濃縮產(chǎn)物；濃縮產(chǎn)物于-85°C預(yù)凍6 h后經(jīng)冷凍干燥，即得到黑果枸杞果渣天 然復(fù)合抗氧化劑。
[0047] 其中：離心的條件是指轉(zhuǎn)速為5000 rpm，時(shí)間為15min。
[0048] 減壓濃縮的條件是指真空度0. 08 MPa，溫度70°C。
[0049] 冷凍干燥的條件是指真空度為100 Pa、溫度為-70°C、干燥時(shí)間為24h。
[0050] 實(shí)施例3 -種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，包括以下步驟： ⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液按1 :7的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后，在溫度為45°C 的條件下靜置50 min，得到混合溶液。
[0051 ] 其中：黑果枸杞果澄是指前科枸杞屬多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果實(shí)榨汁后的固體廢棄物。
[0052] 復(fù)合酶溶液是指將纖維素酶與果膠酶等質(zhì)量混合后溶解于水中，所得到的pH為 4~5的溶液。
[0053] ⑵將混合溶液與體積濃度為98%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到75%， 然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0054] 其中：超聲波-微波反應(yīng)器的反應(yīng)條件是指超聲波功率為900 W、微波功率為320 W、反應(yīng)時(shí)間為33 min、反應(yīng)溫度為65°C。
[0055] ⑶將黑果枸杞果渣提取物與水按I :12的質(zhì)量體積比（g :mL)混勻后離心，得到上 清液，該上清液上弱極性大孔樹脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用2. 5倍柱體積的水和體積濃 度為70~90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮至原洗脫液體 積的30%后得到濃縮產(chǎn)物；濃縮產(chǎn)物于-75°C預(yù)凍5h后經(jīng)冷凍干燥，即得到黑果枸杞果渣 天然復(fù)合抗氧化劑。
[0056] 其中：離心的條件是指轉(zhuǎn)速為4500 rpm，時(shí)間為18min。
[0057] 減壓濃縮的條件是指真空度0· 06 MPa，溫度60°C。
[0058] 冷凍干燥的條件是指真空度為50 Pa、溫度為_60°C、干燥時(shí)間為48 h。
[0059] 上述實(shí)施例1~3中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060] 上述實(shí)施例1~3中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061] 微波提取裝置為XH-300B微波超聲波合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公 司），冷凍干燥機(jī)為FD-2型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，包括以下步驟： ⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液按I :6~7. 5的質(zhì)量體積比混勻后，在溫度為40~50°C 的條件下靜置40~60 min，得到混合溶液； ⑵將所述混合溶液與體積濃度為95~100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到 75%，然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物； ⑶將所述黑果枸杞果渣提取物與水按1 :1〇~15的質(zhì)量體積比混勻后離心，得到上清 液，該上清液上弱極性大孔樹脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用2~3倍柱體積的水和體積濃度 為70~90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮至原洗脫液體積 的30%后得到濃縮產(chǎn)物；所述濃縮產(chǎn)物于-70°C ~ -85°C預(yù)凍4~6 h后經(jīng)冷凍干燥，即得到 黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑。2. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑴中的黑果枸杞果渣是指茄科枸杞屬多年生灌木植物黑果枸杞成熟果實(shí)榨汁后的 固體廢棄物。3. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑴中的復(fù)合酶溶液是指將纖維素酶與果膠酶等質(zhì)量混合后溶解于水中，所得到的PH 為4~5的溶液。4. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑵中超聲波-微波反應(yīng)器的反應(yīng)條件是指超聲波功率為800~1000 W、微波功率為 300~330 W、反應(yīng)時(shí)間為32~35 min、反應(yīng)溫度為60~70°C。5. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑶中離心的條件是指轉(zhuǎn)速為4000~5000 rpm，時(shí)間為15~20min。6. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑶中減壓濃縮的條件是指真空度0. 05~0. 08 MPa，溫度50~70°C。7. 如權(quán)利要求1所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，其特征在于：所 述步驟⑶中冷凍干燥的條件是指真空度為10~100 Pa、溫度為-55°C ~ -70°C、干燥時(shí)間為 24-72 h〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，該方法包括以下步驟：⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液混勻后靜置，得到混合溶液；⑵將混合溶液與乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到75%，然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物；⑶將黑果枸杞果渣提取物與水混勻后離心，得到上清液，該上清液上弱極性大孔樹脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用水和乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮得到濃縮產(chǎn)物；所述濃縮產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥，即得到黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、提取率高。
【IPC分類】A61P39/06, A61K36/815
【公開號(hào)】CN104983915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510433968
【發(fā)明人】高婷婷, 畢宏濤, 陶燕鐸, 邵赟
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月23日