一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化應(yīng)激是指細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，R0S)生成和防止ROS損 傷的抗氧化能力之間失去平衡的狀態(tài)，傾向于氧化，自由基的產(chǎn)生超過(guò)了抗氧化劑的防御 能力，而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（Gupta-Elera Gaytri et al·，2012)。ROS與多種疾病有息息相 關(guān)，在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病、皮膚病、呼吸道疾病等疾病中，ROS都起著重要作用， 尤其是在癌癥和心血管疾病等發(fā)病率日益增高的疾病中的作用，引起當(dāng)今各國(guó)學(xué)者的廣泛 關(guān)注。ROS的產(chǎn)生和代謝失衡可引起多種器官功能異?；蚪M織病變，因此尋找有效的抗氧化 劑就顯得十分重要。
[0003] 目前，由于合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯（BHT)、丁基羥基茵香醚（BHA)等多數(shù) 技術(shù)復(fù)雜，成本較高，且有較大的毒性甚至致癌作用，使人們對(duì)合成抗氧化劑產(chǎn)生疑慮和排 斥心理，臨床應(yīng)用有較大的局限性，而天然抗氧化劑安全、低毒，符合新世紀(jì)人們對(duì)健康的 需求，因此，從資源豐富的天然藥物中尋找高效、低毒、價(jià)廉的抗氧化劑已成為該領(lǐng)域研宄 的一個(gè)重要方向，其抗氧化作用機(jī)制的研宄，對(duì)進(jìn)一步天然抗氧化藥物的研宄開(kāi)發(fā)具有重 要意義。
[0004] 黑果枸杞沿/iAeflica? Murr.)藏藥稱(chēng)為"旁瑪"，為前科（Solanceae)、前 族（Solanceae Reihb)、枸杞亞族wettst)、枸杞屬L.)多年生灌木，具 棘刺，漿果球形，成熟后為紫黑色，有很高的光合效率和較強(qiáng)抗逆性，是我國(guó)西北特有的抗 鹽抗旱野生植物種，主要分布于青海、甘肅、新疆等地(郭本兆等，1987)。黑果枸杞果實(shí)味甜 多汁，含豐富的維生素、有機(jī)酸及糖類(lèi)，民間常生食或榨汁做飲料。黑果枸杞果實(shí)也具有一 定的醫(yī)療保健功能，其味甘、性平、清心熱，藏醫(yī)用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等 病癥，并且藥效顯著，被收載于《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》等藏醫(yī)藥經(jīng)典著作中；《維吾爾藥 志》記載，維吾爾族醫(yī)生常用黑果枸杞果實(shí)及根皮治療尿道結(jié)石、月經(jīng)不調(diào)、癬疥、齒齦出血 等病癥；民間用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯、明目及降壓藥。
[0005] 近年研宄表明，黑果枸杞的成熟果實(shí)富含原花青素、花色苷等黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)活 性成分，且被證明是其發(fā)揮耐缺氧、抗疲勞、抗氧化、抗衰老等藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ) (Zheng et al.，2007)。為了更有效地發(fā)揮黑果枸杞的藥用保健功效，研宄人員以黑果枸 杞果實(shí)為材料對(duì)其活性成分進(jìn)行了提取工藝研宄。張?jiān)碌龋?010)對(duì)黑果枸杞花色苷色 素微波輔助提取參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研宄，結(jié)果表明在提取溶劑75%乙醇、輻射功率70 W、提取 時(shí)間20 min、料液比1 :50、浸泡時(shí)間20 h的條件下，花色苷色素提取率為15. 32%，提取物 中總花色苷含量為936. 27 mg/100 g。馬玉婷等（2011)以黑果枸杞發(fā)酵后的皮渣為材料， 采用酶解法，研宄了其花色苷的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，黑果枸杞酒渣中花色苷的最 佳提取條件為以pH= I. 0的蒸餾水為浸提劑，按料水比I :40 (g :mL)、果膠酶加酶量0. 8%， 在50°C下酶解提取60 min條件下，色價(jià)為7. 903,但并未測(cè)定產(chǎn)物花色苷含量。授權(quán)專(zhuān)利 CN 103340983 B "黑果枸杞原花青素產(chǎn)品及其制備方法"公開(kāi)了一種以黑果枸杞果實(shí)為原 料，經(jīng)酸性水溶液提取、聚苯乙烯一二乙烯苯大孔樹(shù)脂層析純化，制備治療人體白細(xì)胞降低 的藥用提取物。由于黑果枸杞果實(shí)味甜多汁，目前市場(chǎng)上多榨汁做為保健功效飲料銷(xiāo)售。專(zhuān) 利CN 101912480 B "一種黑果枸杞原花青素提取物的制備方法"公開(kāi)了一種以黑果枸杞果 汁或黑果枸杞濃縮液為原料，經(jīng)非極性大孔吸附樹(shù)脂分離、真空減壓濃縮或納濾膜濃縮，制 備黑果枸杞原花青素提取物的方法。授權(quán)專(zhuān)利CN 101982192 B"黑果枸杞原花青素產(chǎn)品及 其制備方法"公開(kāi)了一種黑果枸杞鮮果榨汁，果汁經(jīng)陶瓷膜除雜、大孔樹(shù)脂分離、超濾膜純 化，制備種原花青素提取物的方法。
[0006] 果實(shí)榨汁后產(chǎn)生的果渣一直是食品工業(yè)果汁生產(chǎn)中亟待解決的難題。由于缺少合 理高效的再利用技術(shù)，絕大多數(shù)果渣中的活性成分得不到有效利用，往往被當(dāng)做廢棄物處 理，造成了極大的資源浪費(fèi)。日益增長(zhǎng)的黑果枸杞加工產(chǎn)業(yè)也是如此，目前所有的制備加工 技術(shù)均以黑果枸杞果實(shí)或果汁為原料，還沒(méi)有果渣高效綜合再利用技術(shù)的報(bào)道。
[0007] 因此，為了合理高效利用黑果枸杞資源，亟需提供一種操作簡(jiǎn)單、提取率高、安全 的利用黑果枸杞果渣高效利用的方法，并明確其應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、提取率高的黑果枸杞天然復(fù)合 抗氧化劑的制備方法。
[0009] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種黑果枸杞天然復(fù)合抗氧化劑的制備方法，包 括以下步驟： ⑴將黑果枸杞果渣與復(fù)合酶溶液按I :6~7. 5的質(zhì)量體積比混勻后，在溫度為40~50°C 的條件下靜置40~60 min，得到混合溶液； ⑵將所述混合溶液與體積濃度為95~100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到 75%，然后在超聲波-微波反應(yīng)器中反應(yīng)，得到黑果枸杞果渣提取物； ⑶將所述黑果枸杞果渣提取物與水按1 :1〇~15的質(zhì)量體積比混勻后離心，得到上清 液，該上清液上弱極性大孔樹(shù)脂色譜柱進(jìn)行純化，并依次用2~3倍柱體積的水和體積濃度 為70~90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮至原洗脫液體積 的30%后得到濃縮產(chǎn)物；所述濃縮產(chǎn)物于-70°C ~ -85°C預(yù)凍4~6 h后經(jīng)冷凍干燥，即得到 黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑。
[0010] 所述步驟⑴中的黑果枸杞果渣是指茄科枸杞屬多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果實(shí)榨汁后的固體廢棄物。
[0011] 所述步驟⑴中的復(fù)合酶溶液是指將纖維素酶與果膠酶等質(zhì)量混合后溶解于水中， 所得到的pH為4~5的溶液。
[0012] 所述步驟⑵中超聲波-微波反應(yīng)器的反應(yīng)條件是指超聲波功率為800~1000 W、微 波功率為300~330 W、反應(yīng)時(shí)間為32~35 min、反應(yīng)溫度為60~70°C。
[0013] 所述步驟⑶中離心的條件是指轉(zhuǎn)速為4000~5000 rpm，時(shí)間為15~20min。
[0014] 所述步驟⑶中減壓濃縮的條件是指真空度0. 05~0. 08 MPa，溫度50~70°C。
[0015] 所述步驟⑶中冷凍干燥的條件是指真空度為10~100 Pa、溫度為-55°C ~ -70°C、 干燥時(shí)間為24~72 h。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明利用黑果枸杞果汁生產(chǎn)中的副產(chǎn)物果渣，首先采用復(fù)合酶酶解技術(shù)破壞植物 細(xì)胞壁纖維素和果膠骨架，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性成分的充分釋放，隨后同時(shí)利用低功率 微波穿透式內(nèi)外加熱和超聲波空化作用，進(jìn)一步提高活性成分的提取效率，并節(jié)省提取時(shí) 間；而且在提高提取效率的同時(shí)降低了能耗和污染物排放，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際意義。
[0017] 2、采用本發(fā)明得到的天然復(fù)合抗氧化劑最終產(chǎn)品為紫紅色粉末，極易溶于水，經(jīng) 測(cè)試其總抗氧化能力TEAC為182. 2~196· 3 mg TE/g，總酚含量為130. 78~145· 62 mg GAE/ g，總黃酮含量為 214·92~238·41 mg QE/g，總花色苷含量為 99·83~109·65 mg CGE/g。
[0018] ⑴總酚含量測(cè)定： 米用 Singleton and Rossi (1965)的 Folin-Ciocalteau 試劑比色法，在 96 孔板中 測(cè)定。具體操作：5 μ L待測(cè)樣品溶液與60 μ L NaCO3 (7.5% w/v)溶液、15 μ L Folin-Ciocalteau試劑混合。然后，加入200 μ L水，60°C靜置5 min。待反應(yīng)液冷卻至室溫，700 rim波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。沒(méi)食子酸（GAE)作為標(biāo)準(zhǔn)化合物，待測(cè)樣品的總酚含量表示為每 克樣品中沒(méi)食子酸的毫克當(dāng)量(mg GAE/g)。
[0019] ⑵總黃酮含量測(cè)定： 采用Chang et al. (2002)的比色法，在96孔板中測(cè)定。具體操作：5 yL待測(cè)樣品溶 液加入到90yL甲醇中。隨后，混合溶液中依次加入6 ULAlCl3(K) % w/v)溶液、6 yLl mol/L醋酸鉀溶液和170 μ L水。靜置反應(yīng)30 min后，415 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。懈皮 素（QE)作為標(biāo)準(zhǔn)化合物，待測(cè)樣品的總黃酮含量表示為每克樣品中槲皮素的毫克當(dāng)量(mg QE/g)〇
[0020] ⑶總花色苷含量測(cè)定： 按照Nic〇u6 et al. (2007)所述的方法進(jìn)行測(cè)定，具體操作：分別取1.5 mL待測(cè)樣品 溶液，加入到10 mL容量瓶中，然后分別用0. lmol/L的磷酸緩沖液定容至10 mL。反應(yīng)溶液 靜置15 min后，分別于520 nm和700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。矢車(chē)菊素-3-0-葡萄糖 苷（CGE)作為標(biāo)準(zhǔn)化合物，待測(cè)樣品的總花色苷含量按照下列公式計(jì)算，總花色苷含量表示 為每克樣品中矢車(chē)菊素-3-0-葡萄糖苷的毫克當(dāng)量(mg CGE/g)。
公式中，Jiiji為總的溶液吸收值，為2(hJ%pH=l、520 nm波長(zhǎng)下光吸收值， 700 nm波長(zhǎng)下光吸收值，#為矢車(chē)菊素-3-0-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol)，f 為矢車(chē)菊素-3-0-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)，/為光程（10 mm)。
[0022] ⑷分析結(jié)果參見(jiàn)表1。從表1可以看出，本發(fā)明所得的黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧 化劑含有大量的酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、花色苷類(lèi)等活性化合物。
[0023] 表1黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑組成分析結(jié)果（n=3)
3、本發(fā)明所得的天然復(fù)合抗氧化劑經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)能力檢測(cè)顯示，具有顯著 的成纖維細(xì)胞UVB氧化損傷光毒性和心肌細(xì)胞阿霉素氧化損傷心臟毒性的防護(hù)作用，其細(xì) 胞氧化損傷保護(hù)能力顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物一一葡萄籽提取物（GSE，多酚含量99. 04%)。
[0024] 實(shí)驗(yàn)采用"阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2心臟毒性氧化損傷細(xì)胞模型"和"UVB誘 導(dǎo)成纖維細(xì)胞HS68光毒性氧化損傷細(xì)胞模型"測(cè)定黑果枸杞果渣天然復(fù)合抗氧化劑的細(xì)胞 氧化應(yīng)激損傷保護(hù)能力。葡萄籽提取物（GSE，多酚含量99. 04%，購(gòu)自天津市尖峰天然產(chǎn)物 研宄開(kāi)發(fā)有限公司）作為陽(yáng)性對(duì)照物。
[0025] ⑴阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2心臟毒性氧化損傷保護(hù)能力評(píng)價(jià)： 目前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是心肌細(xì)胞凋亡或壞死的主要原因，特別是由抗腫瘤藥物-阿 霉素（DOX)引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是其心臟毒性的主要產(chǎn)生原因。因此，本實(shí)驗(yàn)采 用阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2心臟毒性氧化損傷細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)黑果枸杞果渣天然復(fù) 合抗氧化劑對(duì)于心臟毒性的保護(hù)作用。
[0026] 具體操作：大鼠心肌細(xì)胞H9c2采用DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清、2 mM谷氨酸 鹽、1%鏈霉素/青霉素）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37°C、5% CO2的無(wú)菌環(huán)境。培養(yǎng)基每2~3天 更換一次，細(xì)胞培養(yǎng)24h并達(dá)到80%聚集程度時(shí)，向培養(yǎng)基中加入黑果枸杞果渣天然復(fù)合 抗氧化劑，使其終濃度達(dá)到〇，10，20 or 40 μ g/mL培