改善血小板聚集的藥物組合物及其以ptafr為靶點(diǎn)的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以PTAFR為靶點(diǎn)篩選的具血小板聚集的 組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板活化因子（platelet activating factor，PAF)是體內(nèi)一種重要的多功能 磷脂遞質(zhì)，PAF主要由中性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，有廣泛 的生物活性，PAF通過與PAF受體（PTAFR)結(jié)合可引起很多生理、病理反應(yīng)，如血栓形成、低 血壓、支氣管痙攣、內(nèi)臟器官損傷、神經(jīng)損傷、急性胰腺炎、哮喘等。PTAFR拮抗劑能阻斷這些 效應(yīng)的發(fā)生，有很大的應(yīng)用價值，能促進(jìn)血小板活化，抑制血栓形成；能抑制哮喘病人接觸 抗原后的早期支氣管收縮；抑制特異質(zhì)個體接觸抗原后的遲發(fā)性皮膚過敏；對腦缺血及腦 炎性損傷有保護(hù)作用，對PAF誘導(dǎo)的心血管疾病具有很好的治療和預(yù)防作用。故尋找與發(fā) 展新型、高效、安全、低毒、方便的藥物組合具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種以PTAFR為靶點(diǎn)的改善血小板聚集的中藥 組合物。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供一種通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計分子對接，以PTAFR為靶 點(diǎn)篩選該中藥組合物的方法，或者再和實(shí)體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種改善血小板聚集的組合物，該組合物包含以下組分：丹參內(nèi)酯、木犀草 素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內(nèi)酯。
[0007] 優(yōu)選該組合物丹參內(nèi)酯1-3重量份、木犀草素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷0. 6-1. 8 重量份、三七皂苷P 1. 5-4. 5重量份，新蛇床內(nèi)酯0. 8-2. 4重量份。
[0008] 最優(yōu)選丹參內(nèi)酯1重量份、木犀草素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷0. 6重量份、三七 皂苷P 1. 5重量份，新蛇床內(nèi)酯0. 8重量份。
[0009] 以PTAFR為靶點(diǎn)篩選上述改善血小板聚集的組合物的方法，包含以下步驟：
[0010] DPTAFR蛋白三維結(jié)構(gòu)的獲??；
[0011] 2)采用分子對接軟件，以銀杏內(nèi)酯B為中心確定PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)區(qū) 域；
[0012] 3)對三七、紅花、丹參、川考四種中藥材的小分子配體與PTAFR蛋白進(jìn)行計算機(jī)虛 擬篩選，根據(jù)設(shè)定的活性區(qū)域，利用分子對接軟件，將每個小分子配體與PTAFR活性位點(diǎn)區(qū) 域進(jìn)行分子對接，記錄對接得分?jǐn)?shù)據(jù)；
[0013] 4)根據(jù)步驟3)的對接得分結(jié)果進(jìn)行排序，確定具血小板聚集的藥物組合物：丹參 內(nèi)酯、木犀草素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內(nèi)酯。
[0014] 上述方法中，在PTAFR蛋白三維結(jié)構(gòu)的獲取之前，從數(shù)據(jù)庫搜尋中藥三七、紅花、 丹參、川芎四種中藥材的有效化學(xué)成分，共得到240個化學(xué)成分信息，其中三七42個，紅花 88個，丹參53個，川芎57個，對每個化合物應(yīng)用MacroModel小分子配體前處理優(yōu)化模塊進(jìn) 行前處理優(yōu)化。
[0015] 上述方法中，對每個化合物應(yīng)用MacroModel小分子配體前處理優(yōu)化模塊進(jìn)行前 處理優(yōu)化，能量閾值設(shè)定為〇· 5kJ · ηπΓ1 · mor1。
[0016] 上述方法步驟1)中，PTAFR蛋白三維結(jié)構(gòu)的獲取具體是通過以下方式：通過 Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列，該蛋白共有342個氨基酸殘基，具體以人 源P2Y12受體（PDB ID 4NTJ的A鏈）為模板，在Swiss-Prot和美國國立生物技術(shù)信息中 心NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中檢索目標(biāo)序列基礎(chǔ)上，選用Prime模塊，應(yīng)用同源模建方式，在 NCBI BLAST序列比對基礎(chǔ)上建立蛋白三維結(jié)構(gòu)。
[0017] 上述方法步驟1)中，PTAFR蛋白三維結(jié)構(gòu)的獲取后，對構(gòu)建的蛋白進(jìn)行模型驗(yàn)證 和分子動力學(xué)方式評價結(jié)構(gòu)合理性。
[0018] 上述方法步驟2)中所述的以銀杏內(nèi)酯B為中心確定PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位 點(diǎn)區(qū)域的具體方法是：PTAFR蛋白和銀杏內(nèi)酯B分別加入到分子對接Mae s tr〇系統(tǒng)中， 進(jìn)行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理，采用glide對接模塊下receptor grid generation面板，以銀杏內(nèi)醋B為中心確定PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)區(qū)域。
[0019] 上述以PTAFR為靶點(diǎn)篩選改善血小板聚集的組合物的方法具體包括以下步驟：
[0020] 1)從數(shù)據(jù)庫搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的有效化學(xué)成分，共得到 240個化學(xué)成分信息，其中三七42個，紅花88個，丹參53個，川芎57個，對每個化合物應(yīng)用 MacroModel小分子配體前處理優(yōu)化模塊進(jìn)行前處理優(yōu)化；
[0021] 2)通過Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列，該蛋白共有342個氨基酸 殘基，以人源P2Y12受體（PDB ID 4NTJ的A鏈）為模板，在Swiss-Prot和NCBI蛋白質(zhì)序 列數(shù)據(jù)庫中檢索目標(biāo)序列基礎(chǔ)上，選用Prime模塊，應(yīng)用同源模建方式，在NCBI BLAST序列 比對基礎(chǔ)上建立PTAFR蛋白三維結(jié)構(gòu)；
[0022] 3)將2)步驟得到的PTAFR蛋白和銀杏內(nèi)酯B分別加入到分子對接Maestro系統(tǒng) 中，進(jìn)行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理，采用glide對接模塊下receptor grid generation面板，以銀杏內(nèi)醋B為中心確定PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)區(qū)域；將1)步驟得 到的四味中藥的240個化合物分子導(dǎo)入分子對接Maestro系統(tǒng)中，PTAFR蛋白和小分子物 質(zhì)間距離設(shè)定為1. 〇/〇. 8 ;精度方面選擇標(biāo)準(zhǔn)精度，將進(jìn)行三七、紅花、丹參、川芎四味中藥 材的240個化合物小分子分別引入到PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)區(qū)域，與PTAFR蛋白進(jìn)行 虛擬篩選工作，每個化合物與PTAFR活性位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行分子對接，記錄對接得分?jǐn)?shù)據(jù)；根據(jù) 對接得分進(jìn)行排序，確定具血小板聚集的藥物組合物：丹參內(nèi)酯、木犀草素-7-0-β -D-吡 喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內(nèi)酯。
[0023] 4)通過實(shí)體藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物活性驗(yàn)證。
[0024] 本發(fā)明對上述以PTAFR為靶點(diǎn)篩選改善血小板聚集的組合物的方法進(jìn)行如下具 體實(shí)體藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：
[0025] 1)取體重18_22g的ICR小鼠，分別給予相對應(yīng)的藥物，尾靜脈注射給藥，連續(xù)給藥 7天，末次給藥結(jié)束后1. 5-2. 5小時內(nèi)摘取小鼠眼球取血，肝素鈉抗凝，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心 取上清液得到含藥血漿；
[0026] 2)選用小鼠血小板活化因子（PAF)酶聯(lián)免疫分析（ELISA)試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾 心法測定標(biāo)本中小鼠血小板活化因子（PAF)水平，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（0D 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠血小板活化因子（PAF)濃度分別對上述的含藥血漿進(jìn) 行檢測；
[0027] 3)將每個測得值與空白對照組的差值除以空白對照組的測得值，即得PTAFR抑制 率評價四個化合物丹參內(nèi)酯，木犀草素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷，三七皂苷P和新蛇床內(nèi) 酯組合抑制PTAFR藥效特征。
[0028] 本發(fā)明方法篩選得到的組合物混合后可與藥學(xué)可接受的輔料制備成制劑，劑型可 以為片劑、膠囊、糖漿、口服液、注射液等。本發(fā)明中藥組合物具有無毒副作用、療效顯著、無 禁忌癥及不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可以長期使用。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明篩選以丹參內(nèi)酯、木犀草素-7-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和 新蛇床內(nèi)酯為組合物的血小板聚集抑制劑，化合物來源于中藥材，無明顯毒副作用、療效顯 著、無禁忌癥及不良反應(yīng)，可以長期使用。
[0031] (2)本發(fā)明提供了以PTAFR為靶點(diǎn)，通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計分子對接方法和實(shí) 體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式，篩選該具有抗血小板聚集作用的中藥組合物，精度高，結(jié)果準(zhǔn)確 可靠。
[0032] (3)本發(fā)明首先采用分子對接技術(shù)從三七、紅花、丹參、川芎中藥材中篩選了對以 PTAFR靶點(diǎn)最優(yōu)異的化合物單體，然后將篩選的四種單體進(jìn)行組合配比，具有明顯的抗血小 板聚集作用，且協(xié)同增效。本發(fā)明組合物采用的藥物配比是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出來的，任何 藥物的用量過低或過高均會影響抗血小板聚集功效。
【附圖說明】
[0033] 圖I PTAFR蛋白與模板蛋白Ρ2Υ12序列比對結(jié)果圖
[0034] 圖2優(yōu)化后的PTAFR蛋白
[0035] 圖3應(yīng)用PR0CHECK工具對優(yōu)化后的PTAFR評價結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說明：
[0037] 實(shí)施例1 :
[0038] (1)從數(shù)據(jù)庫（中國中科院中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫）搜尋中藥三七、紅花、丹參、 川芎四種中藥材的有效化學(xué)成分，共得到240個化學(xué)成分信息，其中丹參53個（所包括的 化合物名稱詳見表1)，紅花88個（所包括的化合物名稱詳見表2)，三七42個（所包括 的化合物名稱詳見表3)，川芎57個（所包括的化合物名稱詳見表4)，對每個化合物應(yīng)用 MacroModel小分子配體前處理優(yōu)化模塊對活性組分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行前處理優(yōu)化，能量閾值設(shè)定 為 0· 5kJ · nm 1 · mol、
[0039] (2)通過歐洲生物信息學(xué)研宄所蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白 的一級氨基酸序列（P25105)，該蛋白共有342個氨基酸殘基，以人源P2Y12受體（即TOB ID4NTJ的A鏈）為模板，在Swiss-Prot和美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù) 據(jù)庫中檢索目標(biāo)序列基礎(chǔ)上，選用Prime模塊，應(yīng)用同源模建方式，在NCBI BLAST序列比對 基礎(chǔ)上建立蛋白三維結(jié)構(gòu)，見圖1。再進(jìn)行常規(guī)的分子動力學(xué)方式優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)，優(yōu)化后的 蛋白結(jié)構(gòu)詳見圖2。選用Procheck工具對優(yōu)化后蛋白結(jié)構(gòu)合理性進(jìn)行評價，結(jié)果詳見圖3， 結(jié)果表明構(gòu)建的蛋白結(jié)構(gòu)僅有3. 2%處于不合理區(qū)（要求90%以上處于合理區(qū)即可）。
[0040] (3)將步驟⑵同源模建得到的PTAFR蛋白和銀杏內(nèi)酯B分別導(dǎo)入到分子對接 Maestro系統(tǒng)中，進(jìn)行加氫原子、刪除水分子、處理重原子相關(guān)前處理，采用glide對接模塊 下receptor grid generation面板，以銀杏內(nèi)醋B為中心確定PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位 點(diǎn)區(qū)域；(PTAFR蛋白和小分子物質(zhì)間距離設(shè)定為1. 0/0. 8,精度方面選擇"標(biāo)準(zhǔn)精度"，將銀 杏內(nèi)酯B與PTAFR活性位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行分子對接，記錄總對接得分，結(jié)果得到銀杏內(nèi)酯B與 PTAFR對接得分為-7. 9402,以該得分為閾值判斷四味中藥材與PTAFR的作用效應(yīng)），將步 驟⑴得到的240個化合物小分子分別引入到PTAFR蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)區(qū)域，與PTAFR 蛋白進(jìn)行虛擬篩選工作，記錄對接得分?jǐn)?shù)據(jù)（對接得分?jǐn)?shù)據(jù)主要由小分子化合物與PTAFR 蛋白之間的親脂性、氫鍵、金屬配位體、不合適的鍵的旋轉(zhuǎn)和原子的