大血藤提取物的應用及其提取方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取及應用領域，特別涉及抑制骨吸收并促進骨形成的大血藤提 取物。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥是危害人類健康的主要疾病之一，尋找切實有效的抗骨質(zhì)疏松藥物已 成為當今醫(yī)藥領域的重大課題。中藥以其資源豐富、價格便宜、毒副作用小等諸多優(yōu)勢在防 治骨質(zhì)疏松癥方面具有較大的潛力與優(yōu)勢。隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥治療骨質(zhì)疏松可 望深入到細胞分子水平并從中篩選出高效、穩(wěn)定、低毒的中藥單體或復方組分，充分發(fā)揮中 藥防治骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢。
[0003] 破骨細胞負責骨吸收，成骨細胞負責骨形成，當這兩種功能細胞作用失衡就會導 致骨質(zhì)疏松。根據(jù)破骨細胞、成骨細胞在骨組織中的作用，研宄藥物對其分化成熟及功能的 影響，找到抑制骨吸收、促進骨形成的化合物是開發(fā)治療骨質(zhì)疏松藥物的重要手段之一。
[0004] 大血藤為木通科植物大血藤 Sargeflioi/iara Ctoeaia (Oliv. )Rehd. et Wils.的 干燥藤莖。味苦，性平，歸大腸、肝經(jīng)。具有清熱解毒，活血，祛風止痛的作用。用于跌打腫 痛，風濕痹痛等。中藥防治骨質(zhì)疏松癥多從補益肝腎、強筋壯骨、益氣養(yǎng)血、活血化瘀入手。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供具有抑制骨吸收并促進骨形成作用的大血藤提取物。本發(fā)明 提供的大血藤提取物為大血藤醇提物和水煎物。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的： 大血藤提取物用于抑制骨吸收和促進骨形成的應用。
[0007] 所述的大血藤提取物的提取方法，包括以下步驟：（1)取干燥的大血藤，粉碎備 用；（2)將粉碎的大血藤用乙醇回流提取，過濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得 醇提物；或?qū)⒎鬯榈拇笱儆盟澹^濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得水煎物。
[0008] 所述的乙醇為60-80%的乙醇溶液。
[0009] 所述的回流提取次數(shù)為2-4次，時間為l_4h。
[0010] 所述的水煎次數(shù)為2-4次，時間為l-3h。
[0011] 以大血藤為天然藥物資源，通過多種溶劑提取法和分離方法，并在提取、分離過程 中緊密結(jié)合得到的提取物對骨吸收和骨形成的作用的活性實驗，最終得到具有顯著抑制骨 吸收和促進骨形成作用的大血藤提取物。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：大血藤主產(chǎn)中國湖北、四川、江西、河南、江蘇等地，資源豐富。 大血藤含有鞣質(zhì)類、糖苷類、環(huán)多酚類、三萜皂苷類、木質(zhì)素類、黃酮類等多種成分，具有抗 輻射、耐缺氧、抗菌、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗病毒、抗癌等藥理作用。中藥防治骨質(zhì)疏松癥多從補益肝 腎、強筋壯骨、益氣養(yǎng)血、活血化瘀入手，作為一種強壯補血藥，大血藤常與其它中藥配伍使 用治療風濕筋骨疼痛、跌打損傷等。目前尚沒有明確大血藤中具有抗骨質(zhì)疏松癥的有效成 分及作用機理。
[0013] 抑制骨吸收和促進骨形成是治療骨質(zhì)疏松癥的有效途徑，本發(fā)明通過醇提和水 煎，得到抑制骨吸收并促進骨形成的大血藤提取物，提取方法簡單，并且作用顯著，易于開 發(fā)。
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例3的大血藤提取物對TRAP酶活力的影響，與空白組比，*K0. 05， 01 ; 圖2為實施例3的大血藤提取物對TRAP染色陽性細胞數(shù)量的影響，與空白組比， 木戶〈0. 05, 01 ; 圖3為實施例3的各組破骨細胞TRAP染色（100 X ); 圖4為實施例3的大血藤提取物對破骨細胞骨吸收陷窩數(shù)量積的影響，與空白組比， 05, 01 ; 圖5為實施例3的大血藤提取物對破骨細胞骨吸收陷窩面積的影響，與空白組比， 木戶〈0. 05, 01 ; 圖6為實施例3的各組破骨細胞骨吸收陷窩甲苯胺藍染色（100Χ )。
【具體實施方式】
[0015] 1材料及儀器 1. 1材料 大血藤，購自四平市百草堂中藥飲片有限公司，批號：20130401。
[0016] I·2 儀器 RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；LGJ-12型冷凍干燥機，購自北京松 源華興科技發(fā)展有限公司。
[0017] 2醇提物的制備 取大血藤，粉碎，用乙醇回流提取，過濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得醇提 物。
[0018] 3水煎物的制備 取大血藤，粉碎，用水煎，過濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得水煎物。
[0019] 優(yōu)選的，步驟2中所述的乙醇為60-80%的乙醇溶液。
[0020] 優(yōu)選的，步驟2中所述的回流提取次數(shù)為2-4次，時間為l_4h。
[0021] 優(yōu)選的，步驟3中所述的水煎次數(shù)為2-4次，時間為l_3h。
[0022] 本發(fā)明的實施例1 :取大血藤100 g，用75%乙醇1000 mL回流提取3次，時間分 別為3 h、2 h、l h，過濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得到醇提物。取醇提物200 mg溶到ImL DMSO中，制成200 mg · ml/1的儲備液，梯度稀釋到20 mg · mL 4和2 mg · mL - 備用。
[0023] 本發(fā)明的實施例2 :取大血藤100 g，用水1000 mL煎3次，時間分別為2. 5 h、2 h、 I. 5 h，過濾，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得到水煎物。取水煎物200 mg溶到ImL DMSO中，制成200 mg · ml/1的儲備液，梯度稀釋到20 mg · mL -和2 mg · mL -備用。
[0024] 本發(fā)明的實施例3 :大血藤提取物對破骨細胞分化及骨吸收功能的影響。
[0025] (1)骨髓細胞的分離和誘導培養(yǎng)：將出生48 h內(nèi)的乳兔斷頸處死，75%酒精浸泡 消毒，在無菌操作臺中剝離后肢股骨和脛骨，置于冷的PBS中，用無菌紗布剝除軟組織后， 將骨干置于含a -MEM全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 mg/mL) 無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用滅菌的手術(shù)剪刀將骨干縱向剪開，輕刮出骨內(nèi)的細胞直至骨內(nèi)表面 變白，剪碎骨干合并含細胞培養(yǎng)基于具塞玻璃管中經(jīng)漩渦震蕩I min左右，過200目細胞 篩后配成所需細胞懸液，按照1~2 X IO6個/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板（0. 5 mL/孔）內(nèi)， 置于5% C02、37°C、飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h左右用PBS洗掉未貼壁細胞，加入含10_8 mol·!/1的la，25-(0H)2VitD3的培養(yǎng)基進行誘導，并計為第一天，然后每3天更換一次含 10_ 8 mol · L-1的 I a，25-(0H) 2VitD3的全培養(yǎng)基。
[0026] (2)大血藤提取物對骨髓細胞向破骨細胞分化的影響： ① TRAP活力測定：按照上述方法分離培養(yǎng)細胞，24 h左右更換含KT8 mol · Γ1的 la，25_(0H)2VitD3和各劑量藥物的全培養(yǎng)基，然后每3天更換一次上述的培養(yǎng)基。分為 空白對照組（DMS0，1 yL.mL-1)、醇提物低劑量組（EL，2 mg.L-1)、醇提物中劑量組（EM，20 mg · Γ1)、醇提物高劑量組（EH，200 mg · Γ1)、水提物低劑量組（WL，2 mg · Γ1)、水提物中劑 量組（麗，20 mg· L-1)、水提物高劑量組（WH，200 mg· L-1)給藥，每組設4個復孔，藥物干預 到第8天進行TRAP酶活力測定，先用0. 2% TritonX-IOO裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸 酶（StrACP)測試盒(南京建成）說明書進行，于酶標儀上檢測530 nm處吸光值（^)，記錄數(shù) 據(jù)，根據(jù)說明書上的計算公式換算成金氏單位（U/L)。
[0027] 結(jié)果如圖1所示，各組TRAP酶活力值都小于空白組，且與空白組相比，大血藤醇提 物和水提物中劑量組（20 mg · Γ1)具有顯著性差異（K0. 05);大血藤醇提物和水提物高劑 量組（200 mg噸―1)組具有極顯著性差異（K0. 01)，表明20~200 mg噸―1的大血藤提取物能 顯著性抑制破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶活力。
[0028] ②TR