一種锝-99m標記DNA三角雙錐納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物學領(lǐng)域，具體是一種锝-99m標記DNA三角雙錐納米顆粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA作為一種天然的生物大分子，在納米尺度構(gòu)建功能結(jié)構(gòu)方面具有得天獨厚的優(yōu)勢:首先，Watson-Crick堿基配對原則使得DNA鏈之間的雜交可以進行專門的設計；第二，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特性明確，其直徑和螺旋重復單位分別為大約2nm和3.4nm(約10.5個堿基對)，這使得針對復雜DNA結(jié)構(gòu)的模型構(gòu)建得到簡化；第三，現(xiàn)代有機化學和分子生物學的發(fā)展允許我們對DNA序列進行合成和修飾；最后，DNA是一種生物相容性很好的材料，可以用于與其它材料一起構(gòu)建多組分復合結(jié)構(gòu)。
[0003]基于寡核苷酸鏈的上述優(yōu)勢，DNA單鏈構(gòu)建成為多面體結(jié)構(gòu)后，其潛力不可忽視。這是由于DNA多面體結(jié)構(gòu)具有其他結(jié)構(gòu)無法替代的特性:分子尺度小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而靈活、易于操作、生物相容性好，同時可以進行精確的定位和修飾。目前DNA多面體結(jié)構(gòu)已經(jīng)在生物探針，腫瘤靶向和藥物運輸?shù)确矫嬲宫F(xiàn)出理想的效果。熒光基團標記的DNA四面體納米顆粒(DNA Tetrahedron Nanostructure)結(jié)構(gòu)能夠在沒有轉(zhuǎn)染試劑的情況下單獨進入人類胚胎腎細胞，并維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定長達48小時。2011年中科院上海應用物理研宄所樊春海課題組成功使用DNA四面體結(jié)構(gòu)載帶CpG進入細胞，并產(chǎn)生刺激效應。
[0004]2012年Daniel G.Anderson課題組以葉酸作為革El向基團修飾DNA四面體結(jié)構(gòu)并載帶siRNA實現(xiàn)細胞水平和小動物水平的基因沉默，同時通過FMT-CT(fluorescencemolecular tomography fused with computed tomography)實現(xiàn)了小鼠體內(nèi)的腫瘤顯像(Nature Nanotechnology,2012，7，389-393.)。
[0005]與此同時，越來越多的實驗室致力于開發(fā)結(jié)構(gòu)簡單對稱，同時微觀尺度更大的DNA多面體結(jié)構(gòu)。Andrew J.Turberfield課題組先后合成出DNA三角雙錐納米顆粒(J.Am.Chem.Soc.，2007，129，6992)。因此，考慮到DNA多面體結(jié)構(gòu)在藥物載帶、腫瘤靶向、分子影像等方面的巨大潛力，本發(fā)明將利用锝-99m放射性核素對DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)進行放射性標記，探索這種DNA多面體結(jié)構(gòu)在小動物體內(nèi)的分布規(guī)律和代謝情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備99mTc標記的DNA三角雙錐納米顆粒的方法，主要克服了現(xiàn)有技術(shù)中難以在動物水平上應用DNA三角雙錐納米顆粒進行分析或檢測的缺陷，制備方法中，反應選擇性相對較高，條件較為溫和，操作較為簡單，同時標記過程較為簡潔，標記率較高，標記時間較短，并且能夠制備得到較為穩(wěn)定的基于DNA三角雙錐納米顆粒的SPECT分子影像探針，可以為后續(xù)的生物學應用提供更多的基礎信息。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種锝-99m標記DNA三角雙錐納米顆粒的制備方法，其中包括下述步驟:
[0009](I)使用配體化合物與氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈進行反應，對產(chǎn)物進行純化，得到反應物A ;其中，所述的配體化合物為放射性金屬配體分子；
[0010](2)于溶劑A中將反應物A、氯化亞錫的鹽酸溶液與高锝酸根離子混合均勻，調(diào)節(jié)混合液的pH值至6.0?7.5，進行還原配位反應后得到反應物B ；
[0011 ] (3)于溶劑B中將反應物B與DNA三角雙錐納米顆粒的水溶液混合均勻，經(jīng)高效液相色譜純化后即得锝_99m標記的DNA三角雙錐納米顆粒。
[0012]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(I)中，所述的反應物A采用氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈與配體化合物等為原料進行制備；所述的配體化合物為DTPA(CAS號:67-43-6)、MAG3 (CAS 號:66516-09-4) ,HYNIC(Hydrazinonicotinic acid)或 DOTA (CAS 號:60239-18-1)中的一種或多種。
[0013]作為本發(fā)明進一步的方案:反應物A，由下述制備方法制得:
[0014]①將配體化合物于溶劑C中攪拌溶解，加入氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈，室溫反應0.5?2.5小時；其中，氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈為溶解于無菌水中的5 ‘端修飾氨基的DNA單鏈，其濃度范圍為5?20 μ g/ μ L，溶解于無菌水后添加同體積的碳酸氫鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH至8?8.5 ;所述的配體化合物與氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈的摩爾比為5?20:1 ；
[0015]②反應結(jié)束后，使用NAP-10脫鹽柱進行樣品的純化與回收，使用紫外分光光度計進行樣品的定量后，即得反應物A。
[0016]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟①中，所述的配體化合物反應原料為二亞乙基三胺五乙酸二酐，所述的溶劑C為有機溶劑，
[0017]作為本發(fā)明進一步的方案:有機溶劑為DMF。
[0018]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟②中，所述NAP-10脫鹽柱的洗脫劑為醋酸銨水溶液，其濃度為0.25?0.5mol/L，樣品通過NAP-10脫鹽柱回收后使用紫外檢測方法測定樣品的濃度，其中檢測波長為260nm。
[0019]步驟(2)中，所述的反應物B可以按照本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)方法，采用二氯亞錫對高锝酸根進行還原后實現(xiàn)對反應物A進行放射性標記的目的。
[0020]步驟(2)中，所述反應物A、所述氯化亞錫的鹽酸溶液和所述高锝酸根離子的用量可按照此類反應的常規(guī)反應量進行選擇，一般以所述高锝酸根離子完全反應為準。
[0021]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟⑵中，所述的溶劑A為0.25?0.5mol/L的醋酸銨溶液；反應物A溶解于0.25?0.5mol/L的醋酸銨溶液中，其中反應物A的質(zhì)量為5?20 yg ;所述氯化亞錫的鹽酸溶液中，所述鹽酸的濃度為10?50mmol/L，所述氯化亞錫的濃度為I?5mmol/L ;所述調(diào)節(jié)混合液的pH值是采用氨水調(diào)節(jié)混合液的pH值；所述氨水的濃度為 0.1 ?0.5mol/Lo
[0022]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(2)中，所述還原配位反應的時間為20?30min ；所述還原配位反應的溫度為室溫；所述還原配位反應在密閉反應容器內(nèi)振蕩進行；所述振蕩的速度為300?600rpm。
[0023]步驟(3)中，通過DNA三角雙錐與反應物B的DNA互補配對過程，制備得到锝_99m標記的DNA三角雙錐納米顆粒。
[0024]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(3)中，所述溶劑B為水溶液，其中包含5mmol/L的氯化鎂離子與1mM Tris Base，并使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5?8.0。
[0025]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(3)中，所述的DNA三角雙錐納米顆粒制備時，首先向步驟(3)中的溶劑B中加入6條DNA寡核苷酸鏈，迅速升溫至95°C維持10分鐘后，迅速降溫至4°C，即可得到帶有雜交能力的DNA三角雙錐納米顆粒；其中6條DNA寡核苷酸鏈在溶劑B中的濃度為I?2 ymol/L ;所述的高效液相色譜純化方法中，色譜柱使用300mm*7.5mm的B1Sep_S4000色譜柱；流動相為氯化鈉水溶液，流動相濃度為300?750mM ;液相色譜沖洗方法為等度洗脫；流動相流速為0.3?lmL/min。
[0026]按本領(lǐng)域常識，本發(fā)明中，所述的室溫一般為20?30°C。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的制備方法反應選擇性高，條件溫和，操作簡單，標記產(chǎn)率較高，后處理步驟簡便。本發(fā)明的锝_99m標記的DNA三角雙錐納米顆粒水溶性好，生物適應性優(yōu)良，可以很好的滿足探索和研宄DNA納米顆粒在小動物體內(nèi)分布的相關(guān)實驗需求，為后續(xù)DNA納米顆粒應用于生物體提供更多的基礎信息。
【附圖說明】
[0028]圖1為得-99m標記DNA 二角雙維納米顆粒的制備流程不意圖；
[0029]圖2為锝-99m標記的DNA三角雙錐納米顆粒的色譜圖，其中a為放射性檢測器的出峰數(shù)據(jù)，b為紫外檢測器的出峰數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0030]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0031]本發(fā)明實施例中，所使用的DNA寡核苷酸鏈可為現(xiàn)有的各種DNA單鏈，可通過市售獲得。
[0032]下述實施例中，DNA三角雙錐納米顆粒可通過現(xiàn)有文獻方法制備，可參考文獻:Christoph Μ.Erben，Russell P.Goodman，Andrew J.Turberfield.A Self-Assembled DNABipyramid.J.Am.Chem.Soc.2007，129，6992-6993.
[0033]實施例1
[0034]本實施例中，偶聯(lián)有DTPA配體的DNA寡核苷酸鏈由下述制備方法制得:
[0035]①將氨基修飾的DNA寡核苷酸鏈溶解于無菌水中(濃度為10yg/yL);隨后加入等體積的碳酸氫鈉溶液(濃度為0.5mol/L，pH 8.5)。DTPA( 二亞乙基三胺五乙酸二酐，Cyclic DTPA anhydride)溶解于DMF中(濃度為10mg/mL)后，以20:1的摩爾比加入到DNA溶液中，室溫振蕩(300rpm)反應約I小時。
[0036]②反應結(jié)束后將反應液投入NAP-10脫鹽柱(美國GE公司)中，使用0.25M醋酸銨作為洗脫溶液進行脫鹽處理，針對洗脫的每一管樣品，均使用紫外分光光度計進行檢測，合并含有DNA樣品的各組分并定量至10 μ g/ μ L，即可得到偶聯(lián)有DTPA配體的DNA寡核苷酸鏈，記為反應物A。
[0037]本實施例中，隨后對偶聯(lián)有DTPA配體的DNA寡核苷酸鏈進行锝_99m的放射性標記以制備反應物B:
[0038]取1yg修飾有DTPA的DNA鏈溶解于60 μ L醋酸銨(濃度為0.25M)中，加入12yL碳酸氫鈉水溶液(濃度為0.5M)，隨后加入氨水溶液(濃度為0.175M)將混合溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.6。向混合液中加入37MBq高锝酸鈉水溶液，后加入3 μ L 二氯亞錫-鹽酸溶液(二氯亞錫濃度為lmg/mL，鹽酸濃度為1mM)。反應液室溫孵育30分鐘，即可得到锝_99m標記的DNA寡核苷酸鏈。
[0039]本實施例中，隨后將锝-99m標記的DNA寡核苷酸鏈與帶有手臂鏈的DNA三角雙錐進行雜交以制備锝-99m標記的DNA三角雙錐納米顆粒:
[0040]配置含有氯化鎂(5mM)和Tris Base(1mM)(三輕甲基氨基甲燒)的水溶液，使用鹽酸將溶液PH調(diào)節(jié)至8.0，向該溶液中加入6條DNA寡核苷酸單鏈，使得各條DNA寡核苷酸單鏈的濃度均為I μΜ。隨后溶液升溫至95°C保持10分鐘，后迅速降溫至4°C，即可得到帶有手臂鏈的DNA三角雙錐納米顆粒。將上一步制備的锝-99m標記的DNA寡核苷酸鏈與帶有手臂鏈的DNA三