一種脂肪干細(xì)胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種脂肪干細(xì)胞制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎（OA)是機(jī)械和生物性因素相互作用，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)發(fā) 生病變的慢性致殘性疾??；多發(fā)生在中老年人，隨著年齡的增加患病率明顯升高。目前的 治療方法包括手術(shù)和藥物干預(yù)，但患者正常的軟骨功能仍難以恢復(fù)。因此，軟骨損傷修復(fù)一 直是臨床研宄中的棘手問題。近年來，人們把骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨關(guān)節(jié)炎的修復(fù)細(xì)胞。 但要想獲取骨髓干細(xì)胞，就必須經(jīng)過穿刺抽取骨髓，進(jìn)而進(jìn)行分離純化提取。此外，骨髓干 細(xì)胞含量低、致瘤性高，在臨床上應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)不言而喻。脂肪干細(xì)胞來源豐富、易獲取、致瘤性 低，且具有強(qiáng)大的增殖和分化潛力，已成為極具吸引力的軟骨替代治療研宄熱點(diǎn)。脂肪干細(xì) 胞（Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多 向分化潛能的干細(xì)胞；具有可迅速擴(kuò)增、不易衰老等特點(diǎn)。研宄發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞除了分化 形成新的軟骨組織，還能分泌多種活性因子，如：轉(zhuǎn)化生長因子M、角質(zhì)細(xì)胞生長素等。近 年來的研宄結(jié)果表明，脂肪干細(xì)胞能夠用于治療關(guān)節(jié)疾病。
[0003] 然而，脂肪干細(xì)胞十分脆弱，將其制成制劑很難保證存活率，而如果制劑中脂肪干 細(xì)胞的存活率不足則不能發(fā)揮很好的藥效。因此，進(jìn)一步提高脂肪干細(xì)胞在制劑中的存活 率和活性，保證移植的干細(xì)胞在體內(nèi)存活十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種干細(xì)胞存活率高的脂肪干細(xì)胞 制劑及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑，包括：脂肪干細(xì)胞、透明質(zhì)酸、白蛋白和生理鹽水。
[0006] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %~
[0007] 作為優(yōu)選，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。
[0008] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~10%。
[0009] 作為優(yōu)選，白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。
[0010] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，脂肪干細(xì)胞的密度為2X107個(gè)/ mL~5XIO7個(gè) /mL。
[0011] 作為優(yōu)選，脂肪干細(xì)胞的密度為3XIO7個(gè)/mL。
[0012] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、白蛋白的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為10 %，脂肪干細(xì)胞的密度為3XIO7個(gè)/mL。
[0013] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、白蛋白的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為5 %，脂肪干細(xì)胞的密度為2XIO7個(gè)/mL。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、白蛋白的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為10 %，脂肪干細(xì)胞的密度為5XIO7個(gè)/mL。
[0015] 制劑中，干細(xì)胞密度過大則存活率會因營養(yǎng)不足而大幅降低，而干細(xì)胞密度過小 也不利于存活率的保持，且過小的干細(xì)胞密度會導(dǎo)致用所需制劑量的增大。本發(fā)明通過實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，干細(xì)胞密度為2XIO7個(gè)/mL~5X10 7個(gè)/mL時(shí)，干細(xì)胞存活率最高。
[0016] 生理鹽水是指生理學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床上常用的滲透壓與動(dòng)物或人體血漿的滲透壓相 等的氯化鈉溶液。本發(fā)明采用的生理鹽水是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 9%的氯化鈉溶液，其與人體組 織的滲透壓一致，以其作為溶劑，不會對脂肪干細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
[0017] 白蛋白（又稱清蛋白，albumin，Alb)是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白 的40%~60%。能夠維持血漿膠體滲透壓的恒定且承擔(dān)一定的運(yùn)輸功能。以往的研宄中 表明，白蛋白可能會誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。但本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在脂肪干細(xì)胞制劑中添加 白蛋白可以為脂肪干細(xì)胞提供營養(yǎng)，提高脂肪干細(xì)胞在制劑中的存活率，且脂肪干細(xì)胞制 劑在低溫保藏一個(gè)月后仍未見分化的跡象。在一定范圍內(nèi)，白蛋白的添加量與脂肪干細(xì)胞 的存活率成正相關(guān)。但過高的白蛋白濃度會導(dǎo)致細(xì)胞因滲透壓失衡而失水變形，反而降低 脂肪干細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)表明，制劑中添加白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~10%最有利于提 高細(xì)胞存活率。
[0018] 透明質(zhì)酸又稱玻尿酸，是一種高分子的聚合物。是由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙 酰葡糖胺組成的高級多糖。透明質(zhì)酸是構(gòu)成人體細(xì)胞間質(zhì)、眼玻璃體、關(guān)節(jié)滑液等結(jié)締組織 的主要成分，在體內(nèi)發(fā)揮保水、維持細(xì)胞外空間、調(diào)節(jié)滲透壓、潤滑、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的重要生 理功能。按照分子量的大小，透明質(zhì)酸可分為：大分子量透明質(zhì)酸、中分子量透明質(zhì)酸、小分 子量透明質(zhì)酸三類。其中：大分子量透明質(zhì)酸的分子量為1800000~2200000,主要用于防 止脫水，組織細(xì)胞再生，緊致肌膚；中分子量透明質(zhì)酸的分子量為1000000~1800000,主要 用于緊致肌膚，長久保濕；小分子量透明質(zhì)酸的分子量為400000~1000000,主要用于快 速與細(xì)胞發(fā)生水合作用，保持細(xì)胞的水分。在脂肪干細(xì)胞制劑中添加透明質(zhì)酸可以為脂肪 干細(xì)胞提供合適的基質(zhì)環(huán)境，維持脂肪干細(xì)胞的存活率，且利于脂肪干細(xì)胞在治療關(guān)節(jié)疾 病的過程中，分化為軟骨組織。
[0019] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸的分子量為400000~ 1000000。
[0020] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑中，脂肪干細(xì)胞為第三代~第五代的 脂肪干細(xì)胞。
[0021] 第三代~第五代的脂肪干細(xì)胞能夠保持干細(xì)胞固有的分化潛能，不會出細(xì)胞凋亡 或衰退的現(xiàn)象，其狀態(tài)最佳，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以迅速增長并分化。
[0022] 作為優(yōu)選，第三代~第五代的脂肪干細(xì)胞經(jīng)胰酶酶解后，以生理鹽水清洗。
[0023] 將第三代~第五代的脂肪干細(xì)胞經(jīng)胰酶酶解后，以生理鹽水清洗再用于本發(fā)明提 供的脂肪干細(xì)胞制劑能夠進(jìn)一步保證干細(xì)胞的存活率。
[0024] 其中，胰酶酶解具體為：取第三代~第五代（P3-P5)的脂肪干細(xì)胞，用PBS清洗兩 遍后，加入2~3mL0. 25%胰酶-0. 02%EDTA;80%脂肪干細(xì)胞皺縮變圓時(shí)，加入5~8mL 含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止酶解，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部脫落。
[0025] 其中，清洗具體為：把經(jīng)胰酶酶解的脂肪干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，500~ 800g離心3~5min。離心結(jié)束后倒棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入20~40mL的生理鹽水重 懸細(xì)胞，500~800g離心3~5min，棄上清液。
[0026] 優(yōu)選的，清洗的次數(shù)為2次。
[0027] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑的制備方法，包括：將白蛋白、透明質(zhì)酸與生理鹽水 混合后，重懸脂肪干細(xì)胞，獲得脂肪干細(xì)胞制劑。
[0028] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑的制備方法簡單溫和，不會損傷干細(xì)胞的活性，從 而提高脂肪干細(xì)胞制劑中干細(xì)胞的存活率。
[0029] 具體的，本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑的制備方法包括：將透明質(zhì)酸與生理鹽水 混合至透明質(zhì)酸的終濃度為3%~5%后，重懸脂肪干細(xì)胞至脂肪干細(xì)胞的密度為2XIO7 個(gè)/mL~5XIO7個(gè) /mL。
[0030] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑能夠很好的維持脂肪干細(xì)胞的活性和存活率，在保 存期間不會發(fā)生分化，因此，本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑可以用于制備治療關(guān)節(jié)疾病的 藥物。
[0031] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑在制備治療關(guān)節(jié)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0032] 作為優(yōu)選，關(guān)節(jié)疾病為骨性關(guān)節(jié)炎。
[0033] 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑，包括：脂肪干細(xì)胞、透明質(zhì)酸、白蛋白和生理鹽水。 本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑中，脂肪干細(xì)胞在透明質(zhì)酸和白蛋白及生理鹽水的保護(hù)下， 能夠維持良好的存活率和活性，且不會啟動(dòng)分化。且本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞制劑的制備 方法，能夠避免損傷脂肪干細(xì)胞，提高了制劑中脂肪干細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提 供的脂肪干細(xì)胞制劑能夠?qū)⒅靖杉?xì)胞的存活率維持在99%以上，細(xì)胞大小均勻、形態(tài)均 為梭型。0°C~4°C保存72h后，細(xì)胞仍保持著良好的形態(tài)，沒有出現(xiàn)體積變大等異?，F(xiàn)象， 存活率仍保持在95 %以上，且經(jīng)表面抗原檢測，脂肪干細(xì)胞仍保持干細(xì)胞的特點(diǎn)，沒有發(fā)生 分化，具有良好的活性。
【附圖說明】
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