一種新型血小板凍干處理液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及血小板凍干干燥保存領(lǐng)域，具體涉及一種血小板凍干處理液。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板的冷凍干燥研宄開始于20世紀(jì)50年代，然而當(dāng)時研宄結(jié)果并沒有像人們 預(yù)期的那樣成功。直到2001年，WolkersWF等再次對血小板進(jìn)行了凍干保存的研宄，首次 使用海藻糖對血小板進(jìn)行凍干前預(yù)處理，成功的凍干了血小板。前人對血小板凍干保存的 嘗試預(yù)示著血小板凍干保存的可能性，凍干保存血小板成了研宄熱點(diǎn)，國內(nèi)亦有多家單位 對血小板進(jìn)行了凍干研宄，但是目前已報道的凍干配方存在一些不足，如配方中蛋白質(zhì)類 保護(hù)劑用人血清白蛋白，價格昂貴，且不易獲?。灰灿杏枚谆鶃嗧浚╠imethylsulfoxide， DMS0)預(yù)處理的，它有一定的毒性，且處理步驟繁瑣等。目前依然沒有一個公認(rèn)的、穩(wěn)定可靠 且經(jīng)濟(jì)的血小板凍干保存方法。
[0003] 還應(yīng)該注意血小板凍干緩沖液滲透壓和濃度問題，目前凍干血小板的研宄都很少 提到這一點(diǎn)。凍干緩沖液滲透壓過高或過低都對血小板不利。凍干緩沖液濃度是決定凍干 成敗及凍干產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要因素。凍干工藝要求凍干緩沖液重量濃度（w/v)在4%~ 25%之間為宜，最佳濃度在10%~15%。如果緩沖液濃度太高，干燥時藥液表面首先干燥， 形成結(jié)構(gòu)致密的表層，該表層孔隙細(xì)小，透氣性差，因此下面的水氣難以穿過干燥層，因而 沿瓶壁上升，導(dǎo)致制品離壁、萎縮；或使水氣在干燥層停留時間過長，干燥的表層制品重新 吸潮，導(dǎo)致制品塌陷，體積縮小；另外，濃度太高時，藥液在干燥過程中容易結(jié)塊，所得制品 外觀不均勻；緩沖液濃度過低時，所得制品結(jié)構(gòu)比較疏松、機(jī)械強(qiáng)度低，在包裝及運(yùn)輸過程 中受到振動易萎縮或變成粉末，影響制品的外觀，甚至?xí)?dǎo)致溶質(zhì)隨水汽一起飛走，導(dǎo)致凍 干失敗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種血小板凍干處理液； 本發(fā)明的另一目的在于提供一種血小板凍干處理方法。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種血小板凍干處理液，由以下兩部分組成： 1) 血小板凍干預(yù)處理液：由基礎(chǔ)緩沖液加40~60mmol/L海藻糖和可逆性血小板激活 抑制劑，調(diào)節(jié)PH為6. 6~6. 8,過濾后制備得到； 2) 血小板凍干緩沖液：由基礎(chǔ)緩沖液加40~60mmol/L海藻糖、可逆性血小板激活抑 制劑以及蛋白質(zhì)類保護(hù)劑，調(diào)PH為6. 6~6. 8,過濾后制備得到。
[0006] 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，基礎(chǔ)緩沖液的組成成分為：55mm〇l/ LNaCl, 2.lmmol/LKC1,0. 7mmol/LCaCl2,1.lmmol/LMgS04,31mmol/LNaHC03,3. 4mmol/L梓 檬酸，6. 7mmol/L梓檬酸鈉，15mmol/L乙酸鈉，10. 7mmol/L葡萄糖。
[0007] 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，海藻糖的濃度為50mmol/L。
[0008] 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，可逆性血小板激活抑制劑為0. 8~ L2ug/mLPGEl或 5mmol/LL-Arg0
[0009] 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，可逆性血小板激活抑制劑為lug/ mLPGElo 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，蛋白質(zhì)類保護(hù)劑為2%v/v的BSA或30%v/v~40% v/v的血衆(zhòng)。
[0010] 作為上述血小板凍干處理液的進(jìn)一步改進(jìn)，蛋白質(zhì)類保護(hù)劑為30%v/v的血衆(zhòng)。
[0011] 一種血小板凍干處理液，由以下兩部分組成： (1) 血小板凍干預(yù)處理液：包括 55mmol/LNaCl，2.1mmol/LKCl，0.7mmol/LCaCl2， I.lmmol/LMgS04, 31mmol/LNaHC03, 3. 4mmol/L朽1 樣酸，6. 7mmol/L梓樣酸納，15mmol/L乙 酸鈉，10. 7mmol/L葡萄糖，50mmol/L海藻糖，lug/mLPGEl;調(diào)節(jié)pH為6. 6~6. 8,過濾后制 備得到； (2) 血小板凍干緩沖液：包括 55mmol/LNaCl，2.lmmol/LKCl，0.7mmol/LCaCl2， I.lmmol/LMgS04, 31mmol/LNaHC03, 3. 4mmol/L朽1 樣酸，6. 7mmol/L梓樣酸納，15mmol/L乙 酸鈉，10. 7mmol/L葡萄糖，50mmol/L海藻糖，lug/mLPGE1，30%血衆(zhòng)；調(diào)節(jié)pH為 6. 6 ~6. 8， 過濾后制備得到。
[0012] 一種血小板凍干處理方法，包括下列步驟： 1) 取血小板樣品，離心棄上清液留沉淀，用與棄去上清同體積的血小板凍干預(yù)處理液 重懸血小板，37°C振蕩水浴3h~6h，使血小板保持懸浮狀態(tài)； 2) 水浴后，將血小板懸液再離心，棄上清液留沉淀，用與棄去上清同體積的血小板凍干 緩沖液重懸血小板； 3) 將預(yù)處理后的血小板懸液轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，于_80°C超低溫預(yù)凍過夜，次日轉(zhuǎn)入已 預(yù)冷的凍干機(jī)進(jìn)行真空干燥，冷阱溫度為_45±5°C，真空度為< 133mbar，真空干燥24h后 取出，將其密封后置于室溫下保存； 其中所述血小板凍干預(yù)處理液及血小板凍干緩沖液如上所述。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明公開了 一種血小板凍干處理液及凍干處理方法，即用基礎(chǔ)緩沖液加50mmol/L海藻糖和IUg/mlPGEl對血小板凍干前水浴負(fù)載海藻糖，再用基礎(chǔ)緩沖液加50mmol/L海 藻糖、Iyg/mlPGEl和30%v/v~40%v/v血衆(zhòng)重懸血小板后凍干，制備得到了可在室溫 下穩(wěn)定保存的凍干血小板。
[0014] 本發(fā)明采用PGEl為可逆性血小板激活抑制劑，PGEl可有效抑制血小板聚集，降低 血栓素A2水平，還可抑制血小板活化，促進(jìn)血栓周圍已活化的血小板逆轉(zhuǎn)；通過研宄發(fā)現(xiàn)PGEl對凍干后血小板回收率效果佳。
[0015] 白蛋白是一種常用的蛋白質(zhì)類凍干保護(hù)劑，由于人血清白蛋白比較昂貴，而且很 難得，本發(fā)明優(yōu)選2%v/v的BSA來代替人血清白蛋白制備得到凍干血小板，可滿足各種外 部的使用需求。如果是在手術(shù)輸液中的使用，考慮到BSA是牛血清蛋白，在人體中使用可能 會存在排異或者過敏反應(yīng)的風(fēng)險，本發(fā)明優(yōu)選30%v/v~40%v/v血衆(zhòng)來代替人血清白蛋 白，并取得了很好的效果。血漿是很常見且較廉價的原料，而且含有白蛋白等蛋白質(zhì)，用它 來代替昂貴的白蛋白作為血小板蛋白質(zhì)類保護(hù)劑，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。
[0016] 本發(fā)明的血小板凍干處理液包括凍干預(yù)處理液和凍干緩沖液，其滲透壓均為 311.6mOsm，與血漿滲透壓（290~310m0sm)相近，不會對血小板產(chǎn)生不良影響。此外凍干 緩沖液重量濃度（w/v)約為29%;得到的凍干血小板外觀尚可。
[0017] 將本發(fā)明的凍干血小板分別置于_20°C、4°C和室溫下保存Od~180d，發(fā)現(xiàn)保存時 間相同的情況下，凍干血小板復(fù)水化后血小板回收率、MPV、血小板相對聚集率以及血小板 激活后釋放的生長因子TOGF-BB、TGF- 0和VEGF差異均無顯著性，即凍干血小板在三種溫 度下保存效果相當(dāng)。
[0018] 本發(fā)明的凍干血小板可以在室溫下穩(wěn)定保存至少6個月，為下一步制備血小板止 血藥以及在手術(shù)中使用的血小板制品提供了便利和可能。
【附圖說明】
[0019] 圖1為透射電鏡下血小板形態(tài)（40000X); 其中：a為凍干前血小板；b為復(fù)水化的凍干血小板。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 英文縮略詞如下： PGEl為前列腺素El，L-Arg為左旋