一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，尤其涉及一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型忠的一些毒株引起的急性呼吸道傳染病。 動(dòng)物禽流感的大規(guī)模爆發(fā)，不僅給養(yǎng)殖戶帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，也危害到人類的身體健康，同時(shí)帶 來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] -般采用動(dòng)物禽流感疫苗來(lái)預(yù)防與治療動(dòng)物禽流感。
[0004] -方面，現(xiàn)有的技術(shù)中，一般選取滅活的毒株來(lái)制備疫苗。一般用雞胚生產(chǎn)，病毒 適應(yīng)雞胚后在雞胚中的生長(zhǎng)，疫苗生產(chǎn)周期長(zhǎng)。另外病毒在雞胚的傳代的過(guò)程中很容易發(fā) 生變異，導(dǎo)致疫苗的免疫效果不好。很難達(dá)到有效預(yù)防的目的。
[0005] 另一方面，現(xiàn)有的疫苗多采用注射的形式接種，接種復(fù)雜，易產(chǎn)生疼痛感，因此，研 宄一款能夠口服的疫苗具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，提供一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法， 具有免疫效果好、服用方便等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)構(gòu)建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到表達(dá)細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)、表達(dá)；
[0010] 2)將步驟1)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒；
[0011] 3)將步驟2)得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干；
[0012] 4)將步驟3)得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均 勻，得到混合液；
[0013] 5)將步驟4)得到的混合液，包裝，制劑、福射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫 苗。
[0014] 進(jìn)一步，所述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。所述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶 液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 2 %，所述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 03 %。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法， 通過(guò)將凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，制成禽流感亞單位口服疫 苗。不需要注射，緊緊通過(guò)口服就可以達(dá)到很好的免疫效果。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為本發(fā)明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗對(duì)小鼠的免疫效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0018] 本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法若無(wú)特別說(shuō)明均采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，可參見說(shuō)明 書或者分子生物學(xué)克隆指南第三版。本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)試劑若無(wú)特別說(shuō)明均為本領(lǐng)域的 常規(guī)實(shí)際，市場(chǎng)上可以購(gòu)買到。
[0019] 實(shí)施例1培養(yǎng)病毒株A/Anhui/1/2013 (H7N9)，提取病毒株中的RNA
[0020] 所述 A/Anhui/1/2013 (H7N9)來(lái)自中國(guó)疾控中心（CDC)。
[0021] 將禽流感病毒株A/Anhui/1/2013 (H7N9)取0. 2mL接種于15日齡雞胚，37攝氏度 培養(yǎng)40h，置于4攝氏度冰箱過(guò)夜，無(wú)菌收集尿囊液。取病毒尿囊液500mL4攝氏度條件下 6000rpm離心20min收集上清，25000rpm離心2h超速離心，沉淀用5mLTEN重懸，用質(zhì)量分 數(shù)10 % -40 %的蔗糖梯度離心，35000rpm離心2h，收集質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 % -35 %的病毒帶，透析 脫糖，用無(wú) RNA酶的TE緩沖液懸浮，分裝，凍存。
[0022] 利用QIANGEN Rneasy Mini Kit試劑盒提取RNA，具體操作步驟參見說(shuō)明書。
[0023] 實(shí)施例2利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA
[0024] 取RNA菌懸液10微升，加入20pmol引物1 (如SEQ ID NO :3所示核酸序列）混 勻后置于70攝氏度水浴中反應(yīng)lOmin，再加入5*反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0. lmol/LDTT2微升、 2. 5mmol/LdNTP 4微升、RNA酶抑制劑1微升、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶10U，37攝氏度水浴lh，97攝 氏度作用l〇min。獲得cDNA。
[0025] 實(shí)施例3以獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增HA基因
[0026] 按照如下反應(yīng)體系配置反應(yīng)液：
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 構(gòu)建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到表達(dá)細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)、表達(dá)； 2) 將步驟1)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒； 3) 將步驟2)得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干； 4) 將步驟3)得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均勻， 得到混合液； 5) 將步驟4)得到的混合液，包裝，制劑、輻射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 03%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：構(gòu)建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到表達(dá)細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)、表達(dá)；將表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒；將得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干；將得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均勻，得到混合液；將得到的混合液，包裝，制劑、輻射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫苗。所述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。所述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％，所述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03％。本發(fā)明制成禽流感亞單位口服疫苗,不需要注射，僅僅通過(guò)口服就可以達(dá)到很好的免疫效果。
【IPC分類】A61K39-145, C12N15-85, A61P31-16
【公開號(hào)】CN104645325
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510085590
【發(fā)明人】王華瑞, 李永亮
【申請(qǐng)人】武漢思齊源生物科技有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日