專利名稱：抗血管生成蛋白及其應(yīng)用的制作方法
涉及的申請本申請要求美國臨時申請60/089,689,(1998年6月17日)，及美國臨時申請60/126,175(1999年3月25日)的所有權(quán)利，它們?nèi)康募夹g(shù)內(nèi)容通過在此處引述而合并于本文。
背景技術(shù)：
血管基底膜由膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、纖連蛋白和觸覺蛋白等大分子物質(zhì)組成(Timpl,R.,1996，現(xiàn)代細胞生物學觀點8:618-24)。功能上膠原蛋白可以促進細胞粘連、轉(zhuǎn)移、異化、生長(Paulsson,M.,1992,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.27:93-127)，并且通過這些功能在血管生成過程中的內(nèi)皮細胞繁殖和行為發(fā)面起重要作用，血管生成作用是指新血管組織在原有血管組織上形成的過程(Madri,J.A.et al.,1986,J.Histochem.Cytochem.34:85-91；Folkman.J.,1972,Ann.Surg.175:409-16)。血管生成作用是一個復(fù)雜的過程,它指內(nèi)皮細胞的生長、轉(zhuǎn)移、繁殖，及生長的內(nèi)皮細胞異化成為管狀結(jié)構(gòu)，并且在正在生長的血管組織周圍形成膜狀基體的過程。此外血管生成作用還可在一些正常生理現(xiàn)象，如損傷修復(fù)、子宮內(nèi)膜重建過程重要作用(Folkman,J.et al.,1995,J.Biol.Chem.267:10931-34)?，F(xiàn)在已明確證明血管生成在大于幾個立方毫米的固體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的過程中起作用(Folkman,J.,1972,Ann.Surg.175:409-16；Folkman,J.,1995,Nat.Med.1:27-31)。一些研究顯示，膠原蛋白代謝的抑制劑有抗血管生成的特性，證實了膜的膠原蛋白合成、及沉積對血管組織的生成和生長是很關(guān)鍵的理論(Maragoudakis,M.E.et al.,1994,Kidney Int 43:147-50；Haralabopoulos,G.C.et al.,1994,Lab.Invest.71:575-82)。但是膠原蛋白在基質(zhì)膜的組成和血管形成中的準確地位仍不清楚。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及有抗血管生成功能的Ⅳ型膠原蛋白α鏈的NCⅠ區(qū)的蛋白。本發(fā)明尤其涉及Arresten,Canstatin,Tumstatin等新發(fā)現(xiàn)的蛋白，及它們的有生物活性(如抗血管生成作用)的片段、突變體、類似物、同系物及它們的衍生物、多聚體(如二聚體)和融合蛋白。這些蛋白都包含了Ⅳ型膠原蛋白NC1區(qū)的C末端片段。更確切的說，Arrestem,Canstatin和Tumstatin分別是Ⅳ型膠原蛋白的α1、α2、α3鏈各自的NC1區(qū)的C末端片段。這三種蛋白都是單體蛋白，它們在體內(nèi)實驗中抑制腫瘤生長，在體外包括內(nèi)皮管狀生長實驗在內(nèi)的幾種實驗中也抑制毛細血管的增生。
本發(fā)明包括了經(jīng)分離和重組生成的Arresten(一般也稱為Arrestin)。Arresten包含Ⅳ膠原蛋白的α1鏈的NC1區(qū)，有抗血管生成(增生)的活性，還包括分離Arresten中得到的有抗血管生成功能的它的片段，片段多聚體，及編碼抗血管生成蛋白的多聚核苷酸(核酸)。此外本發(fā)明也包括含有以分離的Arresten，其抗血管生成的片段，或二者同時作為生物活性成分的組合物。從另一方面講，本發(fā)明提供了一治療哺乳動物中繁殖型病如癌癥的方法，而癌癥的特點之一是血管生成活性，該方法包括向哺乳動物給予包含抗血管生成性的Arresten或其片段?？寡苌尚缘腁rresten及其片段也可以用于防止細胞擴散(轉(zhuǎn)移)或內(nèi)皮細胞的繁殖。本發(fā)明也包括了分離的抗血管生成活性的Arresten及其片段的抗體。
本發(fā)明包括了經(jīng)分離和重組生成的Canstatin。Canstatin包含Ⅳ膠原蛋白的α2鏈的NC1區(qū)，有抗血管生成(增生)的活性，還包括分離的Canstatin的有抗血管生成功能的片段，分離的Canstatin和抗血管生成的片段的多聚體，及編碼抗血管生成蛋白的多聚核苷酸。此外本發(fā)明也包括含有分離的Canstatin，其抗血管生成的片段，或二者同時作為生物活性成分的組合物。從另一方面講，本發(fā)明提供了一治療哺乳動物中繁殖型病如癌癥的方法，而癌癥的特點之一是血管生成活性，該方法包括向哺乳動物給予包含抗血管生成的Canstatin或其片段的組合物?？寡苌傻腃anstatin及其片段也可以用于防止細胞擴散(轉(zhuǎn)移)或內(nèi)皮細胞的繁殖。本發(fā)明也包括了分離的抗血管生成的Canstatin及其片段的抗體。
本發(fā)明還包括了經(jīng)分離和重組生成的Tumstatin。Tumstatin包含Ⅳ膠原蛋白的α3鏈的NC1區(qū)，有抗血管生成(增生)的活性，還包括分離Tumstatin的有抗血管生成功能的片段，分離Tumstatin和抗血管生成片段的多聚體，及編碼抗血管生成蛋白的多聚核苷酸。此外本發(fā)明也包括含有以Tumstatin，其抗血管生成的片段，或二者同時作為生物活性成分的組合物。從另一方面講，本發(fā)明提供了一治療哺乳動物中繁殖型病如癌癥的方法，而癌癥的特點之一血管生成活性，該方法包括向哺乳動物給予含有抗血管生成的Tumstatin或其片段的組合物?？寡苌傻腡umstatin及其片段也可以用于防止細胞擴散(轉(zhuǎn)移)或內(nèi)皮細胞的繁殖。本發(fā)明也包括分離的抗血管生成的Tumstatin及其片段的抗體。
附圖的簡要說明

圖1A,1B分別是人的Ⅳ型膠原蛋白α1鏈核苷酸序列圖(圖1A,SEQ ID NO:1)及氨基酸(圖1B,SEQ ID NO:2)。圖中標出了正向和反向引物的位置(SEQ ID NO:3),(SEQ ID NO:4)。
圖2是Arresten克隆載體pET22b(+)結(jié)構(gòu)圖示。正向引物(SEQID NO:3)，反向引物(SEQ ID NO:4)和Arresten基因的插入位點也標出。
圖3A,3B分別是Arresten和Endostatin在含有用3H標記的胸腺嘧啶的內(nèi)皮細胞繁殖的曲線圖。橫坐標分別是Arresten(0～10微克/毫升),Endostatin(0～10微克/毫升)；縱坐標為內(nèi)皮細胞(CPAE)的數(shù)量。
圖4A,4B,4C,4D是Arresten和Endostatin對含用3H標記胸腺嘧啶的內(nèi)皮細胞繁殖的影響的柱狀圖。圖4A,4B,4C分別是Arresten為0～50微克/毫升(4A,4B),0～10微克/毫升(4C)對786-0,PC-3,HPEC三種細胞的作用圖。圖4D為0.1～10微克/毫升的Endostatin對A-498細胞的作用圖。
圖5A,5B,5C是一套顯微照相圖。顯示了Arresten(2微克/毫升，5B),Endostatin(20微克/毫升，5C)對經(jīng)過FBS誘導(dǎo)趨化的內(nèi)皮細胞在人的臍部內(nèi)皮細胞間轉(zhuǎn)移影響的作用圖。5A是沒處理的對照圖。
圖6是圖5結(jié)果的柱狀圖。圖6分別顯示Arresten(2微克/毫升，20微克/毫升)和Endostatin(2.5微克/毫升，20微克/毫升)對ECV-304內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移的作用。
圖7是Arresten對內(nèi)皮管狀物形成影響的作用。管狀組織形成的百分比如y軸所示，抑制物的濃度如x軸顯示。幾組實驗分別為什么也不加(對照◆)，加BSA(對照△)，加7S區(qū)(對照X)，Arresten(■)。
圖8A,8B分別顯示Arresten對內(nèi)皮管狀物形成的作用。8B中Arresten的濃度為0.8微克/毫升；8A為對照。
圖9A,9B,9C,9D是Arresten和Endostatin對體內(nèi)腫瘤生長的影響的曲線圖。9A所示為分別用Arresten(10毫克/千克，□)和BSA(+)處理及對照(●)的小鼠體內(nèi)腫瘤從700立方毫米生長的情況；9B所示為分別用10毫克/千克Arresten(□),BSA(+)處理后的腫瘤從100立方毫米增長情況；9C所示是使用10毫克/千克Arresten(□),Endostatin(▲)處理和對照(●)中腫瘤從100立方毫米增長的情況；9D所示為用Arresten(□)處理后腫瘤從200立方毫米增長的情況，(●)為對照。
圖10A,10B分別是人的Ⅳ型膠原蛋白α2鏈核苷酸(Fig.10A,SEQ ID NO:5)與氨基酸的序列圖(Fig.10B,SEQ ID NO:6)。其中正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:8)的位置也已注明。
圖11所示為Canstatin的克隆載體pET22b(+)的圖譜，其中正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:8)及Canstatin基因的插入位點也已注明。
圖12A,12B,12C,12D分別為不同濃度的Canstatin(x軸)對內(nèi)皮細胞(C-PAE)(圖12A，圖12C)和非內(nèi)皮細胞(786-0,PC-3,HEK293)(圖12B,12D)繁殖的影響圖。細胞繁殖的探測用胸腺嘧啶(H3)作為標記(圖12A,12C)和亞甲藍染色(12B,12D)進行觀察。
圖13為柱狀圖，表示為每單位面積(y軸)中分別用不加VEGF(沒有VEGF或血清)，加VEGF(1％FCS+10納克/毫升)處理的細胞，用0.01 Canstatin(1％FCS+10納克/毫升VEGF,0.01微克/毫升Canstatin)，及用1.0微克/毫升Canstatin(1％FCS+10納克/毫升VEGF和1微克/毫升Canstatin)處理過的轉(zhuǎn)移的內(nèi)皮細胞的數(shù)量。
圖14為分別用BSA(□),Canstatin(■)和α5NC1(○)處理的內(nèi)皮管組織形成數(shù)量與對照(y軸)形成的百分比。縱軸表示平均值的均方差。
圖15A,15B,15C,15D分別為Canstatin(■),Endostatin(○)和對照(□)對PC-3細胞(圖15A,15B)和786-0細胞(圖15C,15D)的腫瘤體積分數(shù)(y軸，15A,15B)和腫瘤體積(立方毫米，y軸，15C,15D)的影響的線狀圖，X軸所示為處理后的天數(shù)。
圖16A,16B分別為人的Ⅳ型膠原蛋白α3鏈核苷酸(圖16A,SEQ ID NO:9)與氨基酸(圖16B,SEQ ID NO:10)的序列圖。圖中還注明了正向引物(SEQ ID NO:11)和反向引物(SEQ ID NO:12)的位置及Tumstatin333,Tumstatin334基因片段的起始點和終止點。
圖17為Tumstatin的克隆載體pET22b(+)圖譜。途中正向引物(SEQ ID NO:11)和反向引物(SEQ ID NO:12)位置及Tumstatin的基因插入位點也已注明。
圖18所示為Tumstatin的突變體Tumstatin N-53中α3(Ⅳ)NC1單體的鈍端氨基酸位置。實心環(huán)是產(chǎn)生該突變體時從Tumstatin上的N端切下的53個氨基酸殘基。用短線代表的二硫健是按照其在α1(Ⅳ)NC1和α2(Ⅳ)NC1中存在的情況表示的。
圖19A,19B,19C分別為用不同濃度Tumstatin處理的含H3標記胸腺嘧啶的C-PAE細胞(圖19A),PC-3細胞(圖19B),786-0細胞(圖19C)的情況。每組值均含三個重復(fù)。
圖20為不同濃度的(x軸)Tumstatin(●),BSA(對照□)，7S區(qū)(對照○)對內(nèi)皮管狀物形成的影響。
圖21A,21B為用Tumstatin(●),Endostatin(○)處理相對于對照在處理不同天(x軸)后對腫瘤體積的影響(y軸，立方毫米)的線狀圖。用星號標記的數(shù)據(jù)點具有顯著性，其P＜0.05。
圖22為對照小鼠(□)和用Tumstatin突變體(●)處理后腫瘤的增長情況(y軸)，x軸為處理后的天數(shù)。用星號標記的數(shù)據(jù)具有顯著性，其P＜0.05。
圖23分別為不同濃度的Arresten(●),Canstatin(○),12 kDaArresten片段(■),8 kDa Arresten片段(□),10 kDa Canstatin片段(▲)對內(nèi)皮管狀物形成的抑制作用。
圖24分別為不同濃度的Tumstatin333(●),Tumstatin 334(○)，BSA(■對照)，α6(□對照)，Tumstatin(▲)(x軸)對內(nèi)皮管狀物形成的抑制作用(y軸)。
本發(fā)明的詳述不需要的血管生成往往導(dǎo)致許多疾病，換句話說，如果有可能在特定的條件、特定的時間、或組織制止毛細血管的生長或膨脹，許多疾病或不良狀況可以被預(yù)防或減輕?；|(zhì)膜的組織依賴于Ⅳ型膠原蛋白網(wǎng)的形成，而這種膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可能通過Ⅳ膠原蛋白碳端(NC1區(qū))的非膠原小球體形成(Timpl.R.,1996,Curr Opin CellBiol 8:618-24；Timpl.R.et al.,1981,Eur.J.Biochem.120:203-211)。Ⅳ型膠原蛋白由六個不同的基因產(chǎn)物組成，命名為α1,α2,α3,α4,α5,α6(Prockop,D.J.et al.,1995,Annu.Rev.Biochem.64:403-34)。α1,α2的同功體普便存在于人的基質(zhì)膜中，而其它四種表現(xiàn)為有限制的分布(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。
由已存在組織上形成的新的毛細血管即生血管作用，對腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移是必要的(Folkman,R.,et al.,1992,J.Biol.Chem.267:10931-4；Folkman,J.1995,Nat.Med.1:27-31；Hanahan,D.et al.,1996,Cell 86:353-64)。人和動物的腫瘤開始時是不發(fā)生血管化作用的，然而當腫瘤的體積大于幾個立方毫米時，便發(fā)生血管化作用(Folkman,J.1995.Nat.Med.1:27-31；Hanahan,D.et al.,1996,Cell86:353-64)。轉(zhuǎn)變?yōu)檠苌杀硇托枰獙ρ馨l(fā)生激活子的上調(diào)節(jié)與血管生成作用抑制子的下調(diào)節(jié)(Folkman,J.1995,Nat.Med.1:27-31)。管狀內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基本纖維生長因子(bFGF)是腫瘤中最普遍表達的血管發(fā)生因子。血管生成的腫瘤可能過量表達一種或幾種血管發(fā)生因子，這樣可協(xié)同促進腫瘤的生長。用受體拮抗物來抑制一種血管發(fā)生因子(如VEGF)是不足以阻止腫瘤的生長的。最近，一些血管生成抑制子被發(fā)現(xiàn)，且一些如IFN-a，血小板因子-4(Maione,T.E.et al.,1990,Science 247:77-9)，和PEX(Brooks,P.C.et al.,1998,Cell 92:391-400)與腫瘤細胞并無內(nèi)源性的聯(lián)系，Angiostatin(O’Reilly,M.S.et al.,1994,Cell 19:315-28)和endostatin(O’Reilly,M.S.et al.,1997,Cell 88:277-85)確是由腫瘤組織本身產(chǎn)生的與腫瘤相關(guān)的血管生成的抑制子。盡管用這些內(nèi)源的血管生成抑制子治療腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移是相當有效的，并且是吸引人的，但一些與抗血管生成作用療法相關(guān)的潛在問題必須考慮到。尤其必須慎重考慮的是慢性的血管生成治療引起的滯后毒性和在治療過程中引起的不正常損傷修復(fù)和血管再增生。
本發(fā)明描述了具有抗血管生成作用特性的蛋白、片段、類似物、衍生物、同系物、和突變體，也描述了用這些蛋白、片段、類似物、衍生物、同系物、和突變體抑制血管生成引起的增生性疾病的治療方法。這些蛋白包括有Ⅳ型膠原蛋白的α鏈的NC1區(qū)或其一部分，更具體地，包括有Ⅳ型膠原蛋白的α1,α2,α3鏈的NC1區(qū)的單體。這些蛋白，尤其是單體狀態(tài)，在體內(nèi)可阻止腫瘤的生長，在體外一些模型的實驗中也組織毛細血管的形成，這些實驗包括了皮下管狀物生成實驗。
這些蛋白也可能還包括NC1區(qū)的連接部分。α1,α2,α3鏈是優(yōu)選的，正如實驗表明，α4,α5,α6鏈沒有或只有很低的抗血管生成作用的活性。一般而言，優(yōu)選單體形式存在的蛋白，正如有證據(jù)表明，六聚體形式的蛋白幾乎沒有活性或者是活性很低。
更具體地講，本發(fā)明描述了一命名為Arresten的蛋白，它是約230個氨基酸的蛋白，與人類Ⅳ型膠原蛋白NC1區(qū)α1鏈的氮端氨基酸是相同的(Hostikka,S.L.et al.,1998,J.Biol.Chem 263:19488-93)。
本文還描述了的是，人的Arresten能通過如pET22b這樣的細菌表達質(zhì)粒在E.coli中表達，這些表達質(zhì)粒可穿過周質(zhì)形成可溶解的蛋白。該蛋白表達后為碳端有6個組氨酸的29 kDa的融合蛋白。超過26 kDa以外的3 kDa產(chǎn)生于多接頭和組氨酸標記。當用真核載體pcDNA3.1時，Arresten表達為在293腎細胞中的分泌蛋白，用293腎細胞產(chǎn)生的蛋白目前還沒有純化也沒有觀測標記。
E.coli產(chǎn)生的Arresren可以劑量依賴型方式抑制bFGF刺激的內(nèi)皮細胞的繁殖，其ED50為0.25微克/毫升，而對于腎癌細胞(786-0)，前列腺癌細胞(PC-3)，人前列腺內(nèi)皮細胞(HPEC)的繁殖沒有明顯的作用。Endostatin抑制C-PAE細胞繁殖，其ED50為0.75微克/毫升，是Arresten的3倍，對A-498癌細胞沒有抑制作用。
如前面描述的那樣，Arresten對內(nèi)皮細胞繁殖和轉(zhuǎn)移的特異性抑制表明，Arresten可能是通過細胞表面的蛋白或受體來發(fā)揮其功能的。對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制說明Arresten在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中有直接作用，類似于batimastat(BB-94)和marimastat(BB-2516)。
在本發(fā)明中，Canstatin是Ⅳ型膠原蛋白α2鏈的NC1區(qū)，被用來抑制血管生成作用，在試驗中可抑制內(nèi)皮細胞的繁殖與轉(zhuǎn)移，及內(nèi)皮管狀物的生成。對內(nèi)皮細胞繁殖與轉(zhuǎn)移的特異性抑制證明Canstatin有抗血管生成的功能，它可能通過細胞表面的受體或蛋白起作用。整合蛋白因它們在細胞外基質(zhì)的結(jié)合能力，及有調(diào)節(jié)細胞繁殖和轉(zhuǎn)移的能力而被認為可能是細胞表面Canstatin的受體。尤其，avb3整合蛋白很可能就是Canstatin受體，因為它在血管生成過程中受誘導(dǎo)，并且有多種結(jié)合的能力。
在本發(fā)明中，Tumstatin，即Ⅳ型膠原蛋白α3鏈的NC1區(qū)(Timpl,R.et al.,1981,Eur.J.Biochem.120:203-11；Turner,N.et al.,1992,J.Clin.Invest 89:592-601)，被用于在體內(nèi)和體外的血管生成和腫瘤生長的模型中調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞繁殖和血管組織的形成。α3(Ⅳ)鏈的分布僅限于一些特定基質(zhì)膜中，象GBM，耳窩的基質(zhì)膜，眼基質(zhì)膜如前晶狀體膜，Descemet膜，卵巢和睪丸基質(zhì)膜(Frojdman,K.et al.,1998,Differentiation 83:125-30)，肺泡毛細血管基質(zhì)膜(Kashtan,C.E.,1998,J.Am.Soc.Nephrol.9:1736-50)。然而，在腎血管系統(tǒng)中，維管基質(zhì)膜和皮下組織基質(zhì)膜，肝的維管基質(zhì)膜中卻沒有該α3鏈的分布(Kashtan,C.E.,1998,J.Am.Soc.Nephrol.9:1736-50)。在愈傷過程中，是Ⅳ型膠原蛋白的α鏈(不包括α3,α4鏈)會集結(jié)形成新的毛細血管，因為α3,α4鏈不是原有基質(zhì)膜即預(yù)先存在的血管系統(tǒng)的成分。因為α3(Ⅳ)鏈不是正常人的皮膚的原有組成部分，所以用Tumstatin處理后，愈傷組織修復(fù)過程中膠原蛋白的凝集和血管生成不會發(fā)生變化。
α3(Ⅳ)鏈既可在人的腎血管基質(zhì)膜中表達也可以在GBM中表達(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。這些原有血管系統(tǒng)可能參與了前期腎腫瘤的形成如腎細胞癌。Tumstatin通過α3鏈與其它α鏈的結(jié)合以干擾新的血管形成的方式，有效治療原發(fā)腎腫瘤。1996年在美國大約有3萬人被診斷為腎細胞癌(Mulders,P.et al.,1997,Cancer Res.57:5189-95)，并且對該病擴散的預(yù)測情況很不樂觀。盡管放射性療法和化療有了進步，但病人在接受治療后并沒有明顯增長壽命(Mulders,P.et al.,1997,Cancer Res.57:5189-95)。缺少治療腎細胞癌的有效方法突出體現(xiàn)了發(fā)展新的治療方法的重要性?？紤]到這個現(xiàn)實，最近在幾個動物模型實驗上將控制新的血管化作用作為目標取得了較為理想的效果(Baillie,C.T.et al.,1995,Br.J.Cancer 72:257-67；Burrows,F.J.et al.,1994,Pharmacol.Ther.64:1 55-74；Thorpe,P.E.et al.,1995,Breast CancerRes.Treat 36:237-51)。Tumstatin對抑制體內(nèi)腎細胞癌的生長顯示它對這類腫瘤血管生成的治療(抑制)有很大的潛能。
本發(fā)明中，Tumstatin特異性地抑制內(nèi)皮細胞的繁殖，并且在體外對PC-3,786-0腫瘤細胞的繁殖沒有效果。盡管Tumstatin不抑制內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)移，它在體外卻明顯抑制內(nèi)皮管狀物的形成。這些結(jié)果表明，tumstatin通過抑制血管生成過程中的不同步驟而抑制了新血管的形成。
在體內(nèi)研究中，Tumstatin在matrigel試驗中抑制血管增長，在小鼠異種移植中抑制PC-3,786-0腫瘤的生長。用Tumstatin抑制腫瘤的生長，是樂觀的，特別是考慮到臨床治療腫瘤。
因為Tumstatin有Goodpasture病的病原抗原決定部位，而Goodpasture病是一種表現(xiàn)為肺出血和急性腎小球性腎炎的自主免疫病癥(Butkowski,R.J.et al.,1987,J.Biol.Chem.262:7874-77；Saus,J.et al.,1988,J.Biol.Chem.263:13374-80；Kalluri,R.et al.,1991,J.Biol.Chem.266:24018-24)，因此短期或長期用Tumstatin治療血管生成會誘發(fā)這種疾病。幾個科研組已經(jīng)嘗試了對Goodpasture病自主抗原決定部位在α3(Ⅳ)NC1區(qū)上的位置進行定位，并且報道了氮端部分、中間部分、碳端部分都具有該抗原決定部位(Kalluri,R.et al.,1995,J.Am.Soc.Nephrol.6:1178-85；Kalluri,R.et al.,1996,J.Biol.Chem.271:9062-8；Levy,J.B.et al.,1997,J.Am.Soc.Nephrol.8:1698-1705；Quinones,S.et al.,1992,J.Biol.Chem.267:19780-4；Kefalides,N.A.et al.,1993,Kidney Int.43-94-100；Netzer,K.O.et al.,1999,J.Biol.Chem.274:11267-74)。最近報道了自主抗體僅與α3(Ⅳ)NC1區(qū)氮端的反應(yīng)現(xiàn)象與利用重組嵌和體的腎存活率相關(guān)聯(lián)(Hellmark,T.et al.,1994,Kidney Int,55:936-44)。該病的抗原決定位位于氮端末的40氨基酸處也已得到證實。鈍端的Tumstatin已合成，它因切去抗原決定位而缺少了氮端53個氨基酸殘基，且該分子對小鼠異種移植中786-0腫瘤的增長有明顯的抑制作用。此外，該分子不和從幾個Goodpasture病人中提取的抗體相結(jié)合。這些結(jié)果說明缺少了氮端53個氨基酸的Tumstatin仍含有抗血管生成的片段。
Tumstatin對內(nèi)皮細胞繁殖的特異性抑制說明它可能通過細胞表面的蛋白或受體起作用。血管生成還依賴于由整合蛋白avb3介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞膠連(Brooks,P.C.et al.,1994,Cell 79:1157-64)。Tumstain可能通過干擾繁衍的內(nèi)皮細胞與基質(zhì)成分之間的相互作用而將內(nèi)皮細胞排擠到細胞程序性死亡的正常代謝中(Re,F.et al.,1994,J.Cell.Biol.127:537-46)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP’s)已經(jīng)被認為是作為調(diào)節(jié)在腫瘤中新血管生成的主要酶(Ray,J.M.et al.,1994,Eur.Respir.J.7:2062-72)。最近證明的是，MMP-2(PEX)的抑制子可以通過抑制血管生成來阻礙腫瘤的生長(Brooks,P.C.et al.,Cell 92:391-400)。Tumstatin可能通過抑制MMP的活性起作用。
不論在體內(nèi)或在體外，Tumstatin抑制血管生成的結(jié)果是阻止腫瘤的生長。為將Tumstatin引入臨床醫(yī)療，必須考慮到它在系統(tǒng)治療中的毒性和副作用。而Tumstatin的分布是有局限的，尤其在皮下基質(zhì)膜中一般不含Tumstatin的事實表明，用Tumstatin治療血管生成副作用很小。此外，在特定器官(如腎)中的血管基質(zhì)膜中存在Tumstatin說明用它來有效治療少數(shù)器官中的腫瘤是有相當潛能的。當然，最終理想的是利用基因轉(zhuǎn)移手段實現(xiàn)tuimstatin基因在腫瘤血管組織中體內(nèi)表達(Kashihara,N.et al.,1997,Exp.Nephrol.5:126-31；Maeshima,Y.et al.,1996,J.Am.Soc.Nephrol.7:2219-29；Maeshima,T.et al.,1998,J.Clin.Invest.101:2589-97)。
α3(Ⅳ)鏈的分布限定于特定器官的基質(zhì)膜，考慮到它可能抑制α鏈的凝集，Tumstatin的可能毒性很小。此外α3(Ⅳ)鏈在腎的血管基質(zhì)膜中也觀察到(Kalluri,R.et al.,1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)，并且這些血管可能參與原發(fā)腎瘤(如腎細胞癌)的生成。因此Tumstatin可能通過擾亂α3(Ⅳ)鏈和其它α鏈間的結(jié)合來有效抑制這類腫瘤。
在本文中，術(shù)語“血管發(fā)生作用”(血管生成)指在組織和器官中形成新的血管，并且涉及內(nèi)皮細胞的繁殖。在正常生理條件下，人或動物只有在很特定的時期才有血管生成。例如在損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育、原體luteum、子宮內(nèi)膜和胎盤中均可觀察到有血管生成現(xiàn)象。術(shù)語“內(nèi)皮”是指排列組成血清腔、淋巴管、血管的一層扁平內(nèi)皮細胞。因此，“抗血管生成活性”是指一物質(zhì)所具有的抑制血管生長的能力。血管的生長是一個復(fù)雜的過程，包括位于內(nèi)皮細胞下的基質(zhì)膜定位裂解，相對應(yīng)表皮細胞的繁殖，并且轉(zhuǎn)移至將形成血管的部位，把這些細胞組成新血管膜，內(nèi)皮細胞繁殖的終止，和外膜細胞及其它支持新生血管壁的細胞的插入?！翱寡苌苫钚浴痹诒疚闹兄父蓴_其中的一步、幾步或全部步驟，最終使新血管形成被抑制。
抗血管生成活性還可能包括內(nèi)皮抑制活性，皮下抑制活性通常指一物質(zhì)具有抑制血管生成的能力，如在培養(yǎng)基中存在成纖維細胞因子、血管發(fā)生因子、或其它生長因子時抑制牛的毛細血管內(nèi)皮細胞的生長或轉(zhuǎn)移?！吧L因子”是一類促進細胞生長、繁殖或合成能力的物質(zhì)?！把苌上嚓P(guān)因子”指或是抑制或是促進血管生成的因子。血管發(fā)生相關(guān)因子的一例就是血管發(fā)生生長因子，象基本的成纖維細胞生長因子一樣，它是血管生成的促使因子。血管發(fā)生相關(guān)因子的另一例子是血管生成作用抑制子，例如:制管張素(參見U.S.Pat.No.5,801,012；U.S.Pat.No.5,837,682；U.S.Pat.No.5,733,876；U.S.Pat.No.5,776,704；U.S.Pat.No.5,639,725；U.S.Pat.No.5,792,845；WO 96/35774；WO 95/29242；WO 97/23500)或endostatin(WO 97/15666)。
“大體相同的生物活性”是指一物質(zhì)在抗血管生成方面，在標準實驗中與Arresten、Canstatin、Tumstatin有相似的生物活性?！皹藴蕦嶒灐卑ǖ幌抻?，在分子生物學中用于檢測測算抗血管生成活性，細胞循環(huán)停滯，和細胞程序性死亡的方法。這些實驗包括但不限于內(nèi)皮細胞繁殖，內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移，細胞循環(huán)分析，內(nèi)皮管狀物形成，細胞程序性死亡的檢測，也就是程序性細胞檢測或AnnexinV-FITC實驗，尿囊絨膜(CAM)實驗，及小鼠內(nèi)腎癌腫瘤生長的抑制實驗。這些方法詳見下面的舉例。
在本文中，Arresten在也寫作Arrestin，包括Arresten的片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種，還有從其它動物來的Arresten，及其片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種。
在本文中，Canstatin包括Canstatin的片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種，還有從其它動物來的Canstatin，及其片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種。
在本文中，Tumstatin包括Tumstatin的片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種，還有從其它動物來的Tumstatin，及其片段、突變體、同系物、類似物、氨基酸序列的等位變種。
應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的意圖是要包括內(nèi)皮組織抑制活性的的Arresten、Canstatin、Tumstatin一切衍生物。也就是說通常有抑制血管生成活性的任意物質(zhì)，例如在培養(yǎng)基中有成纖維細胞生長因子、血管生長相關(guān)因子、或其它已知生長因子存在條件下抑制牛的毛細血管生長或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明包括完整的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白，及這些蛋白的衍生物和有生物活性的蛋白片段。這些具有Arresten、Canstatin、Tumstatin活性的蛋白有的有氨基酸替代，有的是糖基或其它分子附加連接在氨基酸集團上。
本發(fā)明也描述了Arresten、Canstatin、Tumstatin的片段、突變體、同系物、類似物。Arresten、Canstatin、Tumstatin的片段是指組成上小于完整的Arresten、Canstatin、、Tumstatin而又包括至少25個連續(xù)Arresten、Canstatin、Tumstatin氨基酸的多肽。這些分子可能也包括或不包括克隆過程中附加的氨基酸序列，例如，氨基酸殘基的序列與完整或部分的克隆連接物序列一致。本發(fā)明包括的突變體，無論有或沒有附加的氨基酸殘基，必須與天然的或原先的多肽等長的蛋白有相同的生物學活性。
其中一片段，命名為Tumstatin N-53，在標準實驗中被發(fā)現(xiàn)與完整的Tumstatin有相同的抗血管生成活性。Tumstatin N-53包括了原有完整的Tumstatin蛋白去掉氮端53個氨基酸殘基的部分。本發(fā)明中記載的其它突變體在此處記錄的實驗中也有很高水平的抗血管生成活性。這些片段如Tumstatin 333,Tumstatin 334,12 kDaArresten片段、8 kDa Arresten片段、10 kDa Canstatin片段，它們的ED50值分別為75、20、50、50、80納克/毫升。而完整的Arresten、Canstatin、Tumstatin分別為400、400、550納克/毫升。Tumstatin333包括SEQ ID NO:10的第2到125個氨基酸，Tumstatin 334包括SEQ ID NO:10的第126到245個氨基酸。
Arresten、Canstatin、Tumstatin的突變體是指在原有氨基酸酸序列上有任何變化的多肽。這些改變可能在自然條件下形成，也可能由人工得到，如化學能量(X射線)或其它形式的化學突變、遺傳工程、雜交或其它形式遺傳物質(zhì)交換而來。這些突變體包括堿基的改變、缺失、插入、倒位、移位、復(fù)制等。Arresten、Canstatin、Tumstatin的突變體形式與原來的Arresten、Canstatin、Tumstatin多肽相比，其抗血管生成活性可表現(xiàn)為增加或降低，這些突變體也可能包括或不包括在克隆過程中附加的氨基酸殘基，例如，與連接物序列的部分或全部相同的氨基酸殘基或序列。
本發(fā)明中抗血管生成蛋白的突變體/片段可以通過PCR克隆產(chǎn)生。命名為Tumstatin 333和Tumstatin 334的片段就是用該方法生成的，并且其抗血管生成的活性比原全長Tumstatin蛋白還要高，如下邊的例18，圖23、24所示。為得到這種片段，PCR引物必須從已知序列上設(shè)計以便每對引物都可從整個蛋白基因上擴下已知片段。擴增后的片段進一步克隆在合適的表達載體上，如載體pET22b，所表達的蛋白的抗血管生成的活性以如后面實驗所述進行檢測。
本發(fā)明中抗血管生成蛋白的突變體(片段)還可以通過假單胞菌(Pseudomonas)的彈性蛋白酶消化得到，象Mariyama,M.et al.(1992,J.Biol.Chem.267:1253-8)和后面的例24所講的那樣。用這種方法得到了12 kDa,8 kDa和10 kDa的Canstatin突變體，所有這三種突變體在抗血管生成活性上比原先完整的蛋白還要高。
Arresten、Canstatin或Tumstatin的類似物是指與完整的分子或其片段，等位變種結(jié)構(gòu)上相當類似的非自然分子，并且與原Arresten,Canstatin,Tumstatin有相同或更高的生物活性。這些類似物包括有生物活性的Arresten、Canstatin、Tumstatin的衍生物(例如上面定義的化學衍生物)及它們的片段、突變體、同系物、等位變種的衍生物，這些衍生物是與沒經(jīng)過修飾的Arresten、Canstatin、Tumstatin多肽、片段、突變體、同系物、等位變種有相同激活或拮抗的效果。
Arresten、Canstatin或Tumstatin的等位變種是指相對于Arresten、Canstatin或Tumstatin標準多肽氨基酸序列自發(fā)產(chǎn)生了變異的多肽。編碼Arresten、Canstatin或Tumstatin等多肽的多聚核苷酸的等位變種是指含有與編碼相應(yīng)的Arresten、Canstatin或Tumstatin的多肽的多聚核苷酸而言發(fā)生了序列變化的多聚核苷酸，因此，編碼Arresten、Canstatin或Tumstatin多肽的多聚核苷酸的等位突變也編碼Arresten、Canstatin或Tumstatin多肽的等位突變蛋白。
還可能的是，某一給定多肽可能是單一的Arresten、Canstatin、Tumstatin片段、突變體、類似物、等位變種，也可能是它們中的兩個或多個，例如，某一多肽可能既有Arresten、Canstatin、Tumstatin的類似物又有其突變體。如一比原先短的Arresten、Canstatin、Tumstatin分子完全可在實驗室中合成。若該片段在經(jīng)過已知的方法發(fā)生突變，那該分子既是的Arresten、Canstatin、Tumstatin片段又是它的突變體。又如產(chǎn)生一突變體后，后又證明它是某些哺乳動物中Arresten、Canstatin、Tumstatin的等位形式，那這種突變體同時也是等位變種。本發(fā)明中也將包括這些片段、突變體、等位變種、類似物的組合。
試舉一例，例18中提到的用大腸桿菌克隆表達產(chǎn)生的Tumstatin是一單體。它還是一融合蛋白或嵌合蛋白，因為用大腸桿菌克隆表達的過程中，可在表達的蛋白上加入外源多連接頭序列及組氨酸標記。同樣在例18中描述的Tumstatin片段Tumstatin N-53是完整蛋白Tumstatin的缺失突變體，用大腸桿菌克隆表達的過程中也會加上一附加序列，因此它也是完整Tumstatin的融合或嵌合蛋白。把Tumstatin N-53的亞單體連接(即二聚體、三聚體)將產(chǎn)生一Tumstatin蛋白的多聚融合或嵌和突變體片段。
本發(fā)明中包括了和Arresten、Canstatin、Tumstatin有相似氨基酸序列的蛋白，或和編碼Arresten、Canstatin、Tumstatin的核酸有相似序列的多聚核苷酸?！皫缀跻粯拥男蛄小敝负怂峄蚨嚯呐c標準序列相比致少有70％的相同；“特別相似”至少為80％相同；“更為相似”為90％；“極為相似”為95％，“最為相似”至少為97％。比較序列的長度一般最短為75核苷酸或25個氨基酸；較理想的至少為150個核苷酸，50個氨基酸；最理想的為243-264個核苷酸，81-88個氨基酸。此處多肽是指氨基酸的分子鏈，并非專指產(chǎn)物的具體長度。因此，肽、寡肽、蛋白均包括在多肽范圍內(nèi)。多肽還包括經(jīng)表達后修飾的多肽，例如糖基化、乙?；⒘姿峄鹊?。
“序列相同”在此處指2個多聚體分子間亞單位序列的相似性比較，如2條核酸或2個多肽。當分子中某一亞基位置上為相同單體亞基時(如2條多肽鏈某一位置均為絲氨酸)，那么它們在該位置上就相同。兩序列的相似性是相配對或相同位置的數(shù)量的直接體現(xiàn)，若2肽鏈或化合物序列有一半是相同的，那么兩序列就有50％的相似性；若90％的位置上都相同則有90％的序列相似性。例如，序列R2R5R7R10R6R3和R9R8R1R10R6R3,6個位置中3個相同，因此二者之間相似性為50％；而R2R5R7R10R6R3和R8R1R10R6R3,5個位置中3個相同，二者之間的相似性為60％。而序列之間的相似性是位置上相同或匹配的一種直接體現(xiàn)。因此，如果相關(guān)序列某一位置或部分在某一特定氨基酸缺失，那缺失的部分就不計入序列相似性中。如R2R5R7R10R6R3和R2R5R7R10R3,6個位置中5個相同，二者相似性為83.3％。
相似性經(jīng)常用序列分析軟件來測量，如BLASTN或BLASTP(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。用BLASTN對核苷酸分析時(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)二序列間匹配參數(shù)如下匹配為1，不匹配為-2，有開口5，有大的裂口2。用BLASTP對蛋白序列分析時，匹配為0，不匹配為0，有開口為11，有大的兩序列的“序列同源性”是指二者之間僅發(fā)生了保守替代，其它均相同。對多肽序列來說，保守替代包括一特定位置上的氨基酸被同類其它氨基酸取代(例如氨基酸之間有共同的一些特性疏水性、電荷、其它構(gòu)象或化學特性，如纈氨酸取代亮安酸，天門冬酰氨取代賴氨酸)；或在不改變影響多肽生物活性的構(gòu)象或折疊的位置上發(fā)生一個或多個非保守氨基酸取代、缺失或插入?！氨Ｊ匦匀〈钡睦影ㄒ环菢O性殘基(疏水性)如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸間相互取代；極性殘(親水性)基間相互取代亮氨酸和賴氨酸間、谷氨酰氨和天門冬酰氨之間、蘇氨酸和絲氨酸之間；一堿性殘基如賴氨酸、精氨酸、組氨酸間相互替代；酸性殘基如天門冬氨酸和谷氨酸間相互替代；或是化學作用修飾后的氨基酸替代原來氨基酸；前提是多肽必須有強的生物學活性。兩有同源性的序列叫作“序列同系物”。
對多肽來說，同源性用序列分析軟件(如美國威斯康星大學生物工程中心遺傳電腦組的序列分析軟件包，大學路1710號，Madison,WI 53705)來測量。蛋白分析軟件分析相似性序列是通過給替代、缺失或其它修飾指定其程度并比較相似的序列來完成的。保守性替代一般指以下各組的替代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天門冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰氨、谷氨酰氨；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明中也包括了Arresten、Canstatin、Tumstatin的化學衍生物?！盎瘜W衍生物”指一多肽，其有一個或多個殘基與功能側(cè)基反應(yīng)后生成的化學修飾殘基衍生物。這些衍生物殘基包括，其自由氨基經(jīng)過衍生而形成胺的分子鹽酸基、對甲苯磺酰基、芐氧羧基、丁氧羧基、氯乙?；?、甲?；?。自由羧基經(jīng)衍生后生成鹽，甲基或乙基酯或其它形式的酯或肼類。自由羥基可形成O-酰或O-烷基衍生物。組氨酸的氮咪唑基可生成N-對苯甲基組氨酸?；瘜W衍生物也包括含有一個或多個20個常規(guī)氨基酸的自然衍生物的肽，如4-羥基脯氨酸替代脯氨酸；5-羥基賴氨酸替代賴氨酸；3-甲基組氨酸取代組氨酸；高絲氨酸代絲氨酸；鳥氨酸代替賴氨酸。
本發(fā)明也包括含有抗血管生成蛋白、它們的片段、突變體、同系物、類似物、等位變種的融合蛋白和嵌合蛋白。融合蛋白或嵌合蛋白可在重組表達和克隆過程中產(chǎn)生，該蛋白可能含有附加氨基酸或與連接物部分或全部相同的氨基酸序列。例如本發(fā)明中的Arresten，在大腸桿菌中表達時(見例2)，含有加在該蛋白上的載體序列，其中包括組氨酸標記。在本文中，術(shù)語“融合蛋白或嵌和蛋白”包括在原有氨基酸序列基礎(chǔ)上的這種改變。Canstatin和Tumstatin中也有這種改變(分別見例11和18)。某一融合蛋白或嵌和蛋白可以是一單一蛋白的多聚體，例如抗血管生成蛋白的重復(fù)；融合蛋白或嵌和蛋白也可由幾種蛋白組成(例如，幾種抗血管生成蛋白)。融合或嵌和蛋白可以由2個或多個已知的抗血管生成蛋白的連接體組成(如制管張素和endostatin，或有生物活性的制管張素和endostatin)；它也可以是抗血管生成蛋白和靶因子組成的結(jié)合體(endostatin和表皮生長因子EGF或RGD肽鏈組成的結(jié)合體)；或抗血管生成蛋白與免疫球蛋白組成的結(jié)合體(如endostatin和IgG特別是去掉Fc部分后的IgG組成的結(jié)合體)。融合蛋白和嵌和蛋白還可包括抗血管生成蛋白、它們的片段、突變體、同系物、類似物、等位變種和其它抗血管生成蛋白組成的結(jié)合體，如endostatin或制管張素。其它抗血管生成蛋白可能還包括restin和apomigren；(PCT/US98/26058，其教導(dǎo)通過在此引述而合并于本文)和endostatin的片段(PCT/US98/26057，其教導(dǎo)通過在此引述而合并于本文)。此處，術(shù)語“融合蛋白”和“嵌和蛋白”也包括附加成分，如用于遞送化療劑的附加成分，也就是編碼化療劑的核酸與編碼抗血管生成蛋白的基因相連。融合蛋白或嵌和蛋白也包括一種抗血管生成蛋白的多聚體，例如二聚體或三聚體。這些融合蛋白或嵌和蛋白可以通過翻譯后的修飾連在一起，也可是完全由重組產(chǎn)生。
本發(fā)明還包括含有Arresten、Canstatin、Tumstatin、它們的片段、突變體、同系物、類似物、等位變種的多聚體蛋白?！岸嗑垠w”指包含了一個蛋白亞基的2個或多個復(fù)制體。蛋白的亞基可以是本發(fā)明中的蛋白(如Arresten二聚或多聚體)，或一個片段、突變體、同系物、類似物、等位變種(例如Tumstatin突變體或片段，如Tumstatin 333)重復(fù)2次或更多次。一個多聚體也可以是一融合蛋白或嵌和蛋白(如一重復(fù)的Tumstatin突變體可能和多連接序列相結(jié)合)和/或一條或多條抗血管生成蛋白的肽鏈，該肽鏈以單體形式存在或以重復(fù)的形式存在(如一蛋白可由2或多個多聚體組成)。
本發(fā)明還包括了含有分離的一條或多條編碼Arresten、Canstatin、Tumstatin的多聚核苷酸的組合物，及載體和含該多聚核苷酸的宿主細胞，以及產(chǎn)生Arresten、Canstatin、Tumstatin，它們的片段、突變體、同系物、類似物、等位變種的方法。在本文中，術(shù)語“載體”指的是能在其中插入或克隆一些核酸的物質(zhì)，其功能是將插入的這段核酸轉(zhuǎn)移至宿主細胞中。這樣的還可以帶來被轉(zhuǎn)移的核酸的復(fù)制和/或表達。一些這樣的載體包括有從質(zhì)粒、噬菌體、動植物來源或插入的病毒的核酸；有的載體為非病毒性的載體，如配體-核酸結(jié)合物，脂質(zhì)體，或脂-核酸復(fù)合體?？赡転槔硐氲氖牵瑢⑥D(zhuǎn)移的核酸分子可工作地連接到一表達控制序列上，生成一種能夠表達該外源核酸的表達載體。核酸的這種轉(zhuǎn)移方式稱為“轉(zhuǎn)化”，指的是以外源核酸序列插入到一宿主細胞中，而不論插入方式。例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)或雜交等。外源核酸能以不整合的形式存在，如一個質(zhì)?；蚱渌问剑灰部梢哉系剿拗骰蚪M中?！翱晒ぷ鞯剡B接”指給定組分間按能行使其預(yù)定功能的方式連接。例如將一控制序列“可工作地連接”到一編碼序列上，指的是它們的連接方式能夠在與控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達?！熬幋a序列”指一段核酸序列能在合適調(diào)控序列調(diào)控下先轉(zhuǎn)錄成mRNA，之后翻譯成多肽。編碼序列的范圍由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子決定。這種序列長度可以是自然的，也可以用已知方式導(dǎo)入或加上核酸片段。一編碼序列可能包括但不限定于mRNA、cDNA、重組的核酸序列。
對其中克隆有核酸的載體可以進行挑選，即根據(jù)其在真核或原核生物中表達來挑選。有兩個可對arresten、canstatin、tumstatin基因進行克隆并表達的載體，他們是pET22b和pET28(a)載體(來自于美國威斯康星州麥迪遜市的Novagen公司)；和一修飾后的pPICZαA載體(來自于美國加利弗尼亞州圣地亞哥市的InVitrogen公司)。這兩種載體分別可使蛋白在細菌和酵母中表達(參見PCT/US98/25892，其教導(dǎo)通過在此引述而全部合并于本文)。
當一核酸片段被克隆到一合適載體上之后，就可以轉(zhuǎn)化進一合適的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”指可以接受由載體攜帶的含有外源核酸片段的受體細胞。宿主細胞可是原核細胞也可是真核細胞，如哺乳動物、植物或昆蟲；它可以是單細胞，也可以是多細胞的結(jié)合體(如在培養(yǎng)基、或組織培養(yǎng)基、或一組織、器官)。宿主細胞可由正常的多細胞器官提取，也可有多細胞器官的病理組織中提取(如哺乳動物)。在本文中，宿主細胞不僅指轉(zhuǎn)化了外源核酸的原始細胞，也指該細胞的含有外源核酸的后代細胞。
在一實施方案中，分離到的編碼抗血管生成蛋白的基因上附帶連接一編碼肽鏈的核酸連接子。這樣的連接子都是本領(lǐng)域熟知的，例如，連接子包括至少一個編碼至少一個附加氨基酸的密碼子。一般連接子的長度為1到20或30個氨基酸。核酸的連接子也與編碼抗血管生成蛋白的基因一起翻譯，結(jié)果產(chǎn)生一在氨基或羧基末端至少附帶一個氨基酸殘基的抗血管生成蛋白。重要的一點是附加的氨基酸沒有抗血管生成的活性。
將目的核酸插入到載體中后，將載體轉(zhuǎn)化到合適的原核菌株中，并在適合有抗血管增生生物活性的蛋白表達的合適條件下，產(chǎn)生有生物活性的抗血管生成蛋白、突變體、衍生物、片段或融合蛋白。在一實施方案中，本發(fā)明包括將編碼抗血管生成蛋白的多聚核苷酸克隆進載體pET22b、pET17b或pET28a，然后轉(zhuǎn)化入細菌中。然后細菌宿主菌株產(chǎn)生抗血管生成蛋白。一般每升培養(yǎng)液中抗血管生成蛋白產(chǎn)生的量是10～20mg或更多。
本發(fā)明中的另一實施方案中，真核載體包括一修飾后的酵母載體。一種方法中用到的pPICZα質(zhì)粒中含一多克隆位點。多克隆位點中插入一組氨酸標記片段。此外，載體也能插入一NdeⅠ位點或其它適合的酶切位點。這些位點是本領(lǐng)域中所熟知的。這個實施方案中產(chǎn)生的含有組氨酸標記的抗血管生成蛋白含1個或更多，典型的是5-20個組氨酸。標記必須不影響蛋白的抗血管生成活性。
產(chǎn)生Arresten,Canstatin或Tumstatin的一種方法是分別對SEQID NO:1,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的多聚核苷酸進行擴增，分別克隆進表達載體，如pET22b、pET 28(a)、pPICZαA或其它的表達載體，然后將含有的外源多聚核苷酸的載體轉(zhuǎn)化進能使編碼多肽的基因表達的宿主細胞中去，在適合蛋白表達的適條件下培養(yǎng)宿主細胞，然后從培養(yǎng)物中提取和純化。產(chǎn)生抗血管生成蛋白的一般方法，特別是產(chǎn)生Arresten、Canstatin、Tumstatin的方法在后面的例子中給予介紹。Arresten、Canstatin、Tumstatin也可在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生表達產(chǎn)物，例如，作為轉(zhuǎn)基因奶牛，羊或豬的奶水的一個組分)，或在轉(zhuǎn)基因植物中表達產(chǎn)物，例如在玉米中與淀粉分子相結(jié)合。
Arresten、Canstatin、Tumstatin也可能由傳統(tǒng)如化學合成的方法產(chǎn)生。用于構(gòu)建本發(fā)明的蛋白的合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合成的Arresten、Canstatin、Tumstatin蛋白序列如果與重組產(chǎn)生的Arresten、Canstatin、Tumstatin有同樣的一、二、三級結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象的話，則它們可以具有同樣的生物活性，包括抗血管生成的生物活性。因此，合成的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白序列可作為重組產(chǎn)生的經(jīng)分離的Arresten、Canstatin或Tumstatin蛋白的替代品，用于對治療化合物的篩選，以及用于發(fā)展抗體的免疫學方法中。
Arresten、Canstatin和Tumstatin蛋白在阻抑血管生成方面是有效的，這一點在標準實驗中已確證，并在下面的例子中給出。Arresten、Canstatin、Tumstatin不抑制其它類型細胞的生長，如非內(nèi)皮細胞。
編碼Arresten、Canstatin或Tumstatin的核酸可由分離的DNA或cDNA文庫中克隆出。在本文中，核酸和多肽如果被稱為“分離的”，則指核酸或多肽相對于從它們的生物來源上自由分離出來(生物來源指核酸混合物或在細胞中)，它們可以經(jīng)過進一步的加工?！胺蛛x”的核酸或多肽包括用此處描述的方法、相似方法或其它適用方法得到的多肽或核酸，也包括充分純化后的核酸或多肽，用化學合成的核酸或多肽，結(jié)合化學和生物方法產(chǎn)生的核酸和多肽，及分離到的重組產(chǎn)生的核酸和多肽。因此，“分離”的多肽指不與其它蛋白，糖基、脂或細胞結(jié)合物相結(jié)合的蛋白?！胺蛛x的核酸”指不會立即與其來源生物基因組共價結(jié)合的核酸，而在自然狀態(tài)下，它們會立即共價結(jié)合。因此，分離的核酸指一般與結(jié)合到載體內(nèi)的核酸(自主復(fù)制的病毒或質(zhì)粒)，或一獨立于其它核酸的核酸，例如，以傳統(tǒng)化學方法或限制酶切后產(chǎn)生的獨立于其它核酸的核酸片段。
本發(fā)明中的多聚核苷酸和蛋白可用于設(shè)計分離其它抗血管生成蛋白的探針。美國專利第5,837,490號(授權(quán)給Jacobs等人)中提供了一些好的方法，該文獻的所有教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文。寡核苷酸探針的設(shè)計應(yīng)遵循以下參數(shù)(a)要包括未知基數(shù)量(N)盡量少；(b)其Tm值在80℃左右(假設(shè)對每個A或T為2℃，對每個G或C為4℃)。
寡核苷酸最好用g-32p-ATP(特異活性為6000 Ci/mmol)和T4多聚核苷酸激酶，并采用通常用于標記寡核苷酸的技術(shù)來標記。也可以使用其它標記方法。對未結(jié)合的探針最好用凝膠過濾層析或其它已經(jīng)建立的方法除去。放射性物質(zhì)插入到探針中的數(shù)量用閃爍計數(shù)器計算。標記后的探針活性最好為4×106dpm/pmol。含有全長克隆群體的細菌培養(yǎng)物，優(yōu)選在融化后，以100μl接種到無菌的含25ml加100mg/ml LB(肉湯)培養(yǎng)液的搖瓶中。培養(yǎng)物最好在37℃培養(yǎng)至飽和，之后在無菌的LB培養(yǎng)液中稀釋。稀釋液的等分實驗最好在平板上確定其稀釋度和數(shù)量，使其最終37℃過夜培養(yǎng)后，在含氨芐青霉素100微克/毫升、瓊脂1.5％、LB固體的150毫米petri平板上生成5000個單菌落。也可以采用其它已知的產(chǎn)生單菌落的方法。
然后用標準的菌落雜交用將菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，裂解，變性，烘干。高度嚴謹條件為至少1×SSC在65℃，或1×SSC和50％甲酰胺在42℃，中度嚴謹條件應(yīng)至少為4×SSC在65℃，或4×SSC和50％甲酰胺在42℃，低度嚴謹條件應(yīng)至少為4×SSC在50℃，或6×SSC和50％甲酰胺在40℃。
然后，膜在含6×SSC,(20×的貯存液為175.3gNaCl/L,88.5g檸檬酸三鈉用NaOH調(diào)pH為7),0.5％SDS,100微克/毫升酵母DNA,10mM EDTA(大約10ml/150mm濾膜)的緩沖液中，65℃，輕微振蕩，雜交1小時。最好隨后以濃度大于或等于1×106dpm/ml將探針加入雜交體系中，然后雜交膜在65℃，輕微振蕩下雜交過夜。然后用500ml 2×SSC+0.5％SDS的緩沖液在室溫下洗滌膜，不搖動，最好隨后用500ml 2×SSC+0.5％SDS的緩沖液在室溫下輕搖15分鐘?？梢圆捎没虿徊捎?.1×SSC+0.5％SDS緩沖液65℃洗30分鐘到1小時的第三次洗滌。然后優(yōu)選將膜干燥，在X射線下自由顯色足夠時間以便觀測其陽性結(jié)果。也可以用其它已知的雜交方法。然后將陽性菌落挑出，培養(yǎng)，用常規(guī)方法提質(zhì)粒DNA。然后，克隆可再用限制性酶切，雜交或DNA測序來確定。
本發(fā)明包括了在哺乳動物組織中用Arresten、Canstatin和Tumstatin或它們的有生物學活性的片段、類似物、同系物、衍生物或突變體抑制血管生成的方法。具體而言，本發(fā)明包括用有效劑量的1種或多種抗一血管生成蛋白或其生物活性的片段、生物活性的片段結(jié)合體、激活劑、拮抗體來治療血管生成介導(dǎo)的病癥。有效劑量的抗血管生成蛋白是指足以抑制導(dǎo)致疾病的血管生成，并從而疾病全部或部分減除的劑量。對血管生成介導(dǎo)的病癥的減除可通過觀察癥狀減弱來確定，如腫瘤體積上的減少或抑制用腫瘤的生長。在本文中，術(shù)語“有效劑量”還指組合物中每一種有生物活性組分的總量，該量足可以顯示對病人有利的效果，即治療、治愈、防止或相關(guān)醫(yī)療條件減緩、增加治療效率、治愈、對疾病的防治或減輕，以及產(chǎn)生上述效果的方法劑量。當結(jié)合使用時，該術(shù)語指的是產(chǎn)生療效的各活性成分量的總和，而不論是結(jié)合給藥、依次給藥或同時給藥。血管生成介導(dǎo)的病包括(但不限定于)癌，固體瘤，血生腫癌瘤(白血病)，腫瘤擴散(轉(zhuǎn)移)，良性腫瘤(如血管瘤，聲覺神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤，沙眼、化膿的肉牙瘤)，類風濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬，視覺血管生成病(如糖尿病的視力減退，視網(wǎng)膜病，早熟視網(wǎng)膜病，斑點降解，角膜移植排斥，新血管青光眼，retrolental fibroplasia豆狀纖維組織，rubeosis),Oslerwebber綜合癥，心肌梗塞(血管生成)，斑點新血管化(血管生成)，毛細血量擴張(hemophiltac joints)。血發(fā)病、血管纖維瘤，創(chuàng)傷肉芽。抗血管生成蛋白對治療內(nèi)皮細胞過多或非正常刺激的疾病是有用的。這些病包括(但不限于)腸的粘連，Crohn’s病，動脈粥樣硬化，硬皮病，肥大瘢(如病瘢痕疙瘩)?？寡苌傻鞍自谂咛ヒ浦矔r可以用作防止血管化的出生控制劑?？寡苌傻鞍讓χ委煂⒀苌勺鳛樯斫Y(jié)果的病如貓劃痕病(Rochele ininalin quintosa)和潰瘍(Heliobacter pylori)有作用?？寡苌傻鞍滓部捎糜诜乐雇肝鲆浦惭塥M窄和過胖(如阻止肥胖組織中毛細血管形成來防止它擴張)?？寡苌傻鞍滓部捎糜谥委熃M織性(即非轉(zhuǎn)移的)疾病?！鞍敝噶龅纳L，畸形生長或增生生長或細胞發(fā)育不正常的狀態(tài)，也包括固體瘤，非固體瘤，不正常的細胞繁殖，就象白血病那樣。在本文中，“癌”也指依賴于血管生成的瘤和腫瘤，即腫瘤因其生長(體積和/或質(zhì)量增生)需要增加血管的數(shù)量和密度來供血。“消退”指用本領(lǐng)域熟知的方法方法測量出腫瘤體積和質(zhì)量的減少。
然而，有的時候血管生成的增加是需要的，如傷口愈合，或在心臟梗塞后組織中，抗血管生成蛋白的抗體或抗血清能用于阻止固定的，原有抗血管蛋白及其過程，因此增加新血管組織的生成并抑制組織萎縮。
抗血管生成蛋白可以和其它物質(zhì)、方法結(jié)合起來治療疾病。例如，腫瘤可以用傳統(tǒng)的外科手術(shù)、射線、化療免疫法并結(jié)合抗血管生成蛋白來治療，然后，繼續(xù)將抗血管生成蛋白給藥于病人，來延長微轉(zhuǎn)移的休眠期和穩(wěn)定，抑制殘存原發(fā)腫瘤的生長。抗血管生成蛋白或其片段、抗血清、受體激動劑，受體拮抗劑，或它們的結(jié)合物，也可與其它抗血管生成化合物、抗血管生成蛋白(如制管張束，endostatin)、片段、抗血清、受體激動劑，受體抗生物結(jié)合。此外，抗血管生成蛋白或它們的片段，抗血清、受體激動劑、受體拮抗劑、或它們的結(jié)合物，可與藥劑上可接受的賦形劑結(jié)合，還可選擇性地結(jié)合維持釋放基質(zhì)(如生物降解性的聚合物)，從而形成藥用組合物。本發(fā)明的組合物還可以包含其它抗血管生成蛋白或化合物，如endostatin或制管張素，它們的突變體、片段和類似物。這些組合物還可以進一步包含其它的試劑，這些其它的試劑可能增進蛋白活性或輔助其治療活性，或用于治療目的，例如化療或放射性試劑。這些附加因子和/或試劑可以包括在組合物中，與本發(fā)明的蛋白質(zhì)產(chǎn)生抑制哺乳動物組織中血管生成的綜合效應(yīng)，或使副作用降到最低。此外，其中用含有本發(fā)明中蛋白的組合物的給藥方式可以是與其它的治療法一同采用，例如，與化療或放療一同采用。
本發(fā)明包括用含有本發(fā)明的蛋白的組合物接觸組織而抑制哺乳動物中的血管生成?！敖佑|”不僅指體表應(yīng)用，也指將組合物引入組織或組織中的細胞中去的送達方式。
本發(fā)明還包括使用定時釋放或維持釋放傳遞系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在手術(shù)不可能或很困難時是很理想的，例如病人因年齡大或病期長而身體虛弱，或在利弊分析表明需要對治療進行控制時。
在本文中，維持釋放基體指由某種材料組成的基質(zhì)，一般是多聚體，它可以被酶降解，或被酸、堿水解或被溶解。當基質(zhì)體插入到體內(nèi)時，它和酶及體液發(fā)生作用。維持型釋放基體最好選自生物相容性物質(zhì)，如脂質(zhì)體，多聚乳酸鹽，多聚glycolide(glycolic acid的聚合物)，聚乳酸共glycolide(乳酸和glycolic acid的共聚體)，多聚酐，多聚酯(鄰)，多聚蛋白，透明質(zhì)酶，膠原蛋白，硫酸軟骨素，羧酸、脂肪酸、磷脂、多聚糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸，如丙苯氨酸，酪氨酸、異亮氨酸、多聚核苷、多聚乙烯丙烯、聚乙烯吡呤烷酮和硅土。較好的生物可降解基質(zhì)是聚乳酸，多聚glyco1ide或多聚乳酸共-glycolide。
本發(fā)明中的血管生成調(diào)節(jié)組合物可以是固體，液體或氣溶膠，也可用已知的任意途徑給藥。固體組合物的例子有藥丸，霜劑，和可植入的藥劑單位。藥丸可口服，霜劑可以在體表局部給藥?？芍踩氲乃巹﹩挝豢梢栽诓≡罱o藥(例如在腫瘤的位置)，或可以對血管生成調(diào)節(jié)物進行系統(tǒng)釋放，如皮下植入。液態(tài)組合物的例子包括適于皮下注射的配方，靜脈注射的配方，動脈注射的配方，及體表和眼內(nèi)治療的配方。氣溶膠的例子有對肺給藥的吸入配方。
以上描述的有抗血管生成活性的蛋白和蛋白片段，可以用本領(lǐng)域熟知的配制方法制出，將分離的或基本純凈的蛋白或蛋白片段在藥理學上可接受配方中給藥。這些配方可以用常規(guī)途徑給藥。一般來說，結(jié)合物可通過體表，腦經(jīng)皮，皮下、腹腔、顱內(nèi)的(頭蓋內(nèi)的)、腦內(nèi)室、腦內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)，口腔、直腸或腸胃外的途徑(如靜脈內(nèi)的、背柱的、皮下或肌肉)給藥。此外，抗血管生成蛋白可與生物可降解多聚體結(jié)合，使化合物維持釋放，多聚體移可以植入在需要釋放藥的位置附近，例如，在腫瘤位點，或在可以實現(xiàn)緩慢系統(tǒng)釋放的位點植入。微型滲透泵也可用來控制通過小管輸送至目標地的高濃度抗血管生成蛋白的運送，目的地指轉(zhuǎn)移生長的腫瘤或其它支持血管。生物可降解多聚體和它們的應(yīng)用也有描述，如在Brem et al(1991年)的文章中有詳述(J.Neurosurg.74:441-446)，該文獻通過在此引述而合并于本文。
含有本發(fā)明的多肽的組合物可以靜脈給藥，如可按單位劑量注射。在本文中，術(shù)語“單位劑量”在指本發(fā)明的治療組合物時，指適宜于對象的物理形態(tài)離散的單位劑量，每單位含有與稀釋劑如載體結(jié)合后產(chǎn)生所需治療效果的活性物質(zhì)的預(yù)定量。
本發(fā)明的組合物的給藥包括靜脈注射，肌肉內(nèi)，腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)，皮下和關(guān)節(jié)注射和輸入。用于腸胃外的注射的組合物包括藥理學上可接受的無菌水溶液或非水溶液，分散體，懸浮液，和乳劑，以及加入無菌的注射液或分散物中的無菌粉劑。適合的水或非水載體，稀釋劑、溶劑，或載體包括水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，羧甲基纖維素，以及它們相應(yīng)的混合物，植物油(如橄欖油)和注射性的有機酯如乙基油酸等。應(yīng)該保持適合的流體性，例如，用卵磷酯等進行包被，用表面活性物質(zhì)在分散劑中保持所需的顆粒大小。這些植物中還可以包括佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和擴散劑。為防止微生物的作用，可以在組合物中包含多種抗細菌或真菌的藥劑，如對羧基苯甲酸酯，氨化醇，酚山梨酸等。在需要時，也可加入一些等滲物質(zhì)，如糖、NaCl等。為使注射的藥劑長期吸收，可加入單硬酯酸的鋁鹽和明膠，從而可以延緩吸收?？勺⑸涞馁A存形式是用多聚乳酸共-glycolide，多聚鄰酯和多聚酸酐等生物降解性多聚體將藥制成微膠囊基粒。通過控制藥物和多聚體的比率和所用多聚體的類型可以控制藥物釋放。貯存的注射物也可用脂質(zhì)體或微乳膠將藥物包裹，而脂質(zhì)體與微乳膠可與人體組織相容。注射的藥方(劑)可以滅菌，如用細菌過濾膜過濾，或用無菌的固體組合物混合，這些固體組合物在使用前能溶解或分散于其它無菌的注射介質(zhì)中。
本發(fā)明中的治療組合物可以包括藥理學上可接受的鹽，例如有機或無機酸鹽。此處“藥理學上可接受的鹽”，指在醫(yī)學標準范圍內(nèi)的，用于人或動物組織中無毒性，無過敏，無變態(tài)反應(yīng)并且有一合理的危害比率的鹽類。藥理學上可按受的鹽是本領(lǐng)域所熟知的，如S.M.Berge et al.在J.Pharmaceutrcal Sciences(藥物科學雜志)(1977)661 et seq中詳盡描述了的藥理學上可接受的鹽類，該文獻的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。藥理學上可接受的鹽類包括酸的加成鹽(以多肽的自由氨基形成)，即與無機酸形成的鹽，例如，如鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。與自由羧基形成的鹽也可以由無機堿生成，例如，鈉、鉀、氨、鈣、鐵的氫氧化物，或有機堿如異丙氨，2-乙醇氨、組氨酸、普魯卡因等。鹽也可能在本發(fā)明的化合物的最后分離與純化時產(chǎn)生，或另外以自由堿與合適有機酸反應(yīng)生成。代表性的酸加成鹽包括(但不限于)乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，檸檬酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦胺酸鹽、二葡糖酸鹽，甘油磷酸鹽、半硫酸鹽，庚糖酸鹽，己糖酸鹽，延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽，α-羥基甲硫酸鹽(isethionate)，乳酸鹽、馬來酸鹽、甲硫酸鹽、煙酸鹽，2-萘硫酸鹽、草酸鹽，pamoate，果膠酸鹽，pesulfate,3-苯丙酮酸鹽，苦味酸鹽，pivalate，丙酮酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽，對甲苯硫酸鹽和十一烷酸鹽。含堿性氮的基團可與一些基團形成四級物，這些基因有低級烷鹵化物如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化鹽、溴化鹽、碘化鹽；二烷基硫酸鹽如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸鹽；長鏈鹵化物如癸基、月桂基、豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物、碘化物；芳烷基囪化物如苯甲基、苯乙基。從而可以獲得水溶液或酯溶液或懸浮液。能形成藥理學可接受的酸加成鹽類的無機酸的例子有氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸；有機酸有草酸、馬來酸、琥珀酸、檸檬酸。
在本文中，術(shù)語“藥理學上可接受的”、“生理上可耐受的”的和其它不同的術(shù)語在用于組合物、載體、稀釋劑和賦形劑等時，是可以互相替換使用的，其指的是這樣的物質(zhì)，即這些物質(zhì)在對哺乳動物給藥時出現(xiàn)最輕微的負生理反應(yīng)，如惡心、眩暈、翻胃等。制備含有溶解和分散的活性成分的藥用組合物是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，并且不限制于配方。一般而言，這樣的組合物被制備成可注射的劑型，如溶液或懸液，然而，也可以制備成在使用前溶于液體而形成溶液或懸浮液的固體。制劑也可被乳化。
活性成分可混于賦形劑，賦形劑必須是藥理上可接受的并且與活性成分相容，其使用量要適合于本文所描述的各種治療方法。適宜的賦形劑包括水、鹽水、右旋葡萄糖，甘油、乙醇或它們的混合物。此外，如果需要，組合物中可含少量輔助成分(佐劑)如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑等，以提高活性成分的效果。
本發(fā)明中的抗血管生成蛋白也可以與藥物前體一起含在組合物之中。在本文中，術(shù)語“前體藥物”指在體內(nèi)能迅速轉(zhuǎn)化生成親代化和物的物質(zhì)，比如，在血液中通過酶的水解作用而生成。T.Higuchi和V.Stella在“以前體藥物作為新的傳遞系統(tǒng)”(Prodrugs as NovelDelivery Systems,Vol 14 of the ACS Symposium Series)和Edward B.Roche ed.,在“藥物設(shè)計中的生物可逆性載體”(Bioreversible Cariersin Drug Design，美國藥物協(xié)會和Permeagon出版社，1987)兩文中有詳細描述和介紹，這兩篇文獻的教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文。在本文中，術(shù)語“藥理學上接受的前體藥物”指的是，(1)本發(fā)明的化合物的前體藥物，它們在正常醫(yī)學判斷標準范圍之內(nèi)，適于用于人或動物組織而又無毒性，過敏、應(yīng)激性等反應(yīng)，有一合適的利益危險性比率并且能起到預(yù)定效果；(2)親代化合物的兼性離子形式，如果可能的話。
本發(fā)明的抗血管生成蛋白的劑量依病的狀態(tài)或治療條件、或臨床的其它因素如人或動物的體重和條件及給藥途徑等而定。對于治療人或功物而言，蛋白劑量一般為10到20 mg/kg體重。在復(fù)合治療中，如用本發(fā)明中的蛋白與放射療法、化療或免疫療法聯(lián)合使用時，可以適當減少劑量，例如，0.1～0.2 mg/kg體重。依據(jù)抗血管生成蛋白在受治動物或人體內(nèi)的半衰期，抗血管生成蛋白可在一定時間內(nèi)每天幾次至每周一次給藥之間變化。有一點必須清楚，本發(fā)明中的蛋白對于人和獸醫(yī)同樣適用。本發(fā)明中的方法包括一次給藥和多次給藥，包括同時和在一定時間內(nèi)給藥。此外，抗血管生成蛋白可與其它形式的治療結(jié)合使用，如化療，放射療法，免疫療法。
抗血管生成蛋白的藥物包括適于口服，直腸，眼睛(包括玻璃體內(nèi))，鼻內(nèi)，體表(包括舌下)，子宮內(nèi)，陰道，或腸胃外的(包括皮下，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈，皮內(nèi)，顱內(nèi)、氣管內(nèi)，硬膜)給藥。抗血管生成蛋白的藥劑可方便以單位劑量形式也可用傳統(tǒng)藥物學方法配制。這些方法包括將活性成分和藥物載體或賦形劑配合在一起的步驟。一般來說，藥劑的制備包括均勻地和緊密地將活性成分與液體載體或細的固體載體或它們兩者結(jié)合起來，然后，如果需要，使產(chǎn)品塑形。
適于腸胃外給藥的藥劑包括水性的或非水性的無菌注射溶液，它們可以包含抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑，與目標受體血液達到等滲的溶解質(zhì)，以及包含懸浮劑和加厚劑的水性或非水性的無菌懸浮液。藥劑可以裝入單位劑量的或多劑量的容器內(nèi)，例如，封密的安瓿或小管，可以貯存于凍干條件下，在使用前，僅需加入無菌液態(tài)載體，如加入水來用于注射。臨時注射溶液和懸浮物可用前面所描述的無菌的藥粉，顆粒和藥片來制成。
當有效量的本發(fā)明的蛋白采用口服時，本發(fā)明的抗血管生成蛋白應(yīng)為藥片、膠囊、藥粉、溶液或藥丸形式。用藥片時，藥用組合物中可以另外含有固體載體，如明膠或佐劑。藥片，膠囊和藥粉含有本發(fā)明蛋白的量為5～95％，最好含25～90％。當以液體形式給藥時，可以加入液相載體，如水、凡士林、動物油或植物油(如花生油、無機油、大豆油或芝麻油)或合成油。液體形式的藥用組合物可以進一步含有生理鹽水溶液，葡萄糖或其它糖類溶液，或醇(如乙二醇、丙二醇，或聚乙二醇)。當用液劑給藥時，藥用組合物含有月0.5～90％重量的本發(fā)明的蛋白，最好含1～50％本發(fā)明的蛋白。
當有效量的本發(fā)明的蛋白用于靜脈、皮膚或皮下注射時，本發(fā)明的蛋白應(yīng)為非致熱原、腸胃外可吸收的液體形式。具有合適的pH、等滲、穩(wěn)定性等的腸胃外可接受的蛋白溶液的制備，是本領(lǐng)域所熟知的。優(yōu)選的適于靜脈、皮膚或皮下注射的藥用組合物應(yīng)該在本發(fā)明的蛋白之外，還包含等滲載體如氯化鈉注射物，Ringer注射物，Dextrose注射劑，Dextrose和NaCl注射劑，乳酸Ringer注射劑，或其它本領(lǐng)域所熟知的載體。本發(fā)明中的藥用組合物還可含有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的穩(wěn)定劑，防腐劑，緩沖液，抗氧化劑或其它添加劑。
在本發(fā)明的藥用組合物中，本發(fā)明的蛋白的含量將依所需治療的疾病的程度和性質(zhì)、及病人曾經(jīng)接受過的治療的性質(zhì)等而定。最終由醫(yī)生來決定每位病人的蛋白用量。初用時，醫(yī)生應(yīng)用少劑量的本發(fā)明蛋白治療病人，并觀察其反應(yīng)。然后可適量加大藥量，直到當該藥物在病人身上達到最好的療效時，用藥量不再增加。
根據(jù)疾病的程度和性質(zhì)以及病人的特異反應(yīng)的不同，本發(fā)明的藥用組合物的靜脈注射治療時間將不同。本發(fā)明的每種蛋白每次連續(xù)靜脈給藥的持續(xù)時間應(yīng)在12-24小時范圍內(nèi)。最終由醫(yī)生來判定所用本發(fā)明的藥用組合物的合適持續(xù)靜脈注射時間。
優(yōu)選的單位劑量的藥劑是每日劑量或單位劑量，每日亞劑量，或治療劑量的一部分。應(yīng)該理解的是，除以上提到的成分外，本發(fā)明的藥劑也可包含該具體藥劑的常用的其它的成份。另外，還可以將細胞毒素物質(zhì)加入到抗血管生成蛋白或其生物活性片段中，或以其它的方式與它們結(jié)合使用，從而可對病人起到雙層療效。
本發(fā)明的藥物配方也適用于獸醫(yī)領(lǐng)域。特別是家養(yǎng)動物和純種的馬，是除人之外的本發(fā)明中蛋白治療的理想對象。
細胞毒素劑如蓖麻蛋白可連到抗血管生成蛋白或其片段上，可作為對抗血管生成蛋白發(fā)生連接的細胞的摧毀工具。這些細胞可在很多部位發(fā)現(xiàn)，包括但不限于微轉(zhuǎn)移酶和原發(fā)腫瘤。連到細胞毒素上的蛋白以一種更高效的方式被運輸至目的部位。例如，蓖麻蛋白連到一高親合的片段上能通過小管轉(zhuǎn)運到支持目標位點的組織中或直接運至目的位點。這些物質(zhì)通過滲透泵以能控制的方式通過輸入小管。抗血管生成蛋白與拮抗物結(jié)合后可以協(xié)同作為抗血管生成作用的激活子增加組織與血管生成。這種治療方式提供了一種破壞轉(zhuǎn)移性癌癥的有效途徑。
其它治療方法包括將抗血管生成蛋白、片段、類似物、抗血清、或它們的受體激活物、受體拮抗物連到細胞毒素蛋白上。應(yīng)該理解的是，抗血管生成蛋白可來源于人也可來源于動物。抗血管生成蛋白可由化學反應(yīng)合成或用重組技術(shù)和表達系統(tǒng)生成。抗血管生成蛋白也可用酶切Ⅳ型膠原蛋白產(chǎn)生有抗血管生成活性的蛋白質(zhì)。它也可由類似細胞內(nèi)切酶活性的化合物切Ⅳ型膠原蛋白而成?？寡苌傻鞍椎漠a(chǎn)生還可以通過影響切割酶活性的化合物來修飾。
本發(fā)明也包括基因療法，即將編碼抗血管生成蛋白、片段、突變體，或它們的融合蛋白的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，并進行調(diào)節(jié)。將DNA轉(zhuǎn)入細胞中并進行基因產(chǎn)物蛋白的表達的眾多方法，也稱為基因治療的方法，在“動物體細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)入”[Gene Transfes intoMammalian Somatic Cells in vivo,N.Yang(1992),Crit.Rev.Biotechn.12(4):335-336]中有詳細描述，該文獻的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文?；虔煼ò▽NA序列導(dǎo)入體細胞或胚系細胞中來進行體內(nèi)或者體外的治療方法?；虔煼ㄍㄟ^替換基因調(diào)節(jié)正常或者不正常的基因的功能，從而抵抗感染性病毒或者其他病原。
用基因療法治療這些疾病的策略包括治療性策略包括如確定有缺陷的基因，然后插入一個具有功能的基因，或者取代有缺陷的基因的功能，或者增強基因的功能；也包括預(yù)防性策略，如增加一個基因，其表達的蛋白質(zhì)對這種疾病具有療效，或者它能使得組織或器官對一種療法更加敏感。作為預(yù)防性策略的一個實施例，將一種編碼一個或者多個抗血管生成蛋白的基因置于患者體內(nèi)，就可以防止血管生成的發(fā)生；或者將一種能使腫瘤細胞對輻射更加敏感的基因置于體內(nèi)，使得針對腫瘤的輻射可以殺死更多的腫瘤細胞。
本發(fā)明考慮了許多轉(zhuǎn)移DNA或者抗血管生成蛋白的調(diào)控序列的方案。轉(zhuǎn)染啟動子序列，或者一種與抗血管生成蛋白特異地相關(guān)的基因，或者那些可以增加抗血管生成蛋白的表達量的序列也作為基因治療的方法予以考慮。這種技術(shù)的實施例在馬薩諸塞州劍橋的轉(zhuǎn)染色質(zhì)療法公司(Transkaryotic Therapies,Inc.,Cambridge，Mass)實施過，他們使用同源重組技術(shù)插入一個基因開關(guān)，可以在細胞里開啟促紅細胞生成素基因的表達。參見1994年4月15日的“遺傳工程新聞”(Genetic Engineering News)。在那些抗血管生成蛋白(或者它們的受體)沒有正常表達的細胞中，這種基因開關(guān)可以用來激活它們的表達。
基因治療的基因轉(zhuǎn)移方法可以歸為三大類物理學方法(如電穿孔法，直接基因轉(zhuǎn)入法和顆粒轟擊法)；化學方法(如脂質(zhì)載體法，或者其它非病毒載體法)；和生物學方法(如病毒衍生載體和受體吸收法)。例如，可以使用非病毒載體，其中的DNA用脂質(zhì)體包裹。這種脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體可以通過靜脈注射法直接注射到病人體內(nèi)。據(jù)信這種脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體會在肝臟聚集，在那里DNA被轉(zhuǎn)移到巨噬細胞和Kupffer細胞中。這些細胞是長壽的，因此可以使被轉(zhuǎn)移的基因得到長期的表達。另外，載體或裸DNA可以直接注射到需要的器官，組織或腫瘤中，使治療性的DNA被送到靶標處。
基因治療方法也可按基因送達的部位來分類。送達基因的基本方法包括離體(ex vivo)基因轉(zhuǎn)移法，體內(nèi)(in vivo)基因轉(zhuǎn)移法和體外(in vitro)基因轉(zhuǎn)移法。離體基因轉(zhuǎn)移法是從病人身上提取出細胞，進行細胞培養(yǎng)。然后將DNA轉(zhuǎn)染到細胞中，在擴大被轉(zhuǎn)染細胞的數(shù)目，重新將細胞移植回體內(nèi)。體外基因轉(zhuǎn)移法是，被轉(zhuǎn)染的細胞是細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，譬如組織培養(yǎng)細胞，它不是取自特異的病人身上的特異的細胞。這些“實驗室細胞”被轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過篩選，擴大培養(yǎng)，作為給病人移植用或其它用途。
體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移法需要將DNA導(dǎo)入到病人體內(nèi)的細胞中。這樣的方法包括用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，利用非感染性的病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到病人體內(nèi)，或者直接將裸DNA注射到病人體內(nèi)的某一部位，這些DNA被一定數(shù)量的細胞吸收，并在其中使基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)得到表達。另外，這里描述的其他方法，如基因槍法，也可以用來在體內(nèi)插入DNA或者調(diào)節(jié)性序列，以控制抗血管生成蛋白的表達。
基因治療的化學方法需要以脂質(zhì)類物質(zhì)，不一定是脂質(zhì)體，來幫助DNA通過細胞膜。以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的帶正離子的Lipofectin或cytofectin可以與帶負電荷的DNA結(jié)合，形成一種復(fù)合物，可以通過細胞膜，使DNA得以進入細胞內(nèi)。另外一種化學方法是利用基于受體的胞吞作用，這需要特異地結(jié)合到能與細胞表面受體結(jié)合的配體上，將其包裹起來，轉(zhuǎn)運通過細胞膜。配體與DNA結(jié)合，整個復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細胞里面。配體/基因復(fù)合物被注射到血流中，然后具有這種受體的細胞會特異性的結(jié)合配體，并將配體/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞里。
許多基因療法利用病毒載體將基因?qū)氲郊毎?。例如，?jīng)改造的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)在離體方法中得到利用，將基因?qū)氲酵庵芰馨图毎湍[瘤滲透淋巴細胞，肝臟細胞，上皮細胞，肌細胞，或其他體細胞中，然后，將這些被改造的細胞輸回病人體內(nèi)，提供被插入基因的表達產(chǎn)物。
在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方案中，也已經(jīng)利用病毒載體來實現(xiàn)將基因轉(zhuǎn)移到細胞里。為實現(xiàn)外源基因的組織特異性表達，可以利用具有組織特異性的順式調(diào)控元件或啟動子。另外，也可利用原位DNA轉(zhuǎn)移或者具有組織特異性的病毒載體來實現(xiàn)這一目標。例如，為了將基因轉(zhuǎn)移到活體血管細胞里，可以將體外轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細胞植入動脈血管壁上挑選的位置。病毒也感染了周圍細胞，而且這些細胞也表達出了基因產(chǎn)物。使用導(dǎo)管可以將病毒載體直接導(dǎo)入到活體的某一部位，這樣使得病毒只能感染特定的范圍，達到長期的、位點特異性的基因表達。在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中，在哺乳動物組織和肝臟組織上，也有利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過將改造過的病毒注射進血管內(nèi)，從而將基因?qū)氲狡鞴俚摹?br> 用作基因治療的病毒載體包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒，其它RNA病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)，或新比斯(Sindbis)病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(adeno-associated virus)，皰疹病毒，SV40病毒，牛痘，以及其它DNA病毒。復(fù)制缺陷型的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒是最為常用的基因轉(zhuǎn)移載體。鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒的組成包括單鏈RNA組成，復(fù)合有核心蛋白以及聚合酶，外有一種gag蛋白包裝，外被糖蛋白env包裹，它決定宿主范圍。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組包括gag,pol,env基因以及5’和3’的長末端重復(fù)序列LTR。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)是以如下事實為基礎(chǔ)如果有輔助的包裝細胞系提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白，那么僅含有5’和3’LTR序列和包裝信號的最小病毒足以實現(xiàn)病毒的包裝、感染及整合到目標細胞中的過程。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的基本的優(yōu)點是，在大部分類型的細胞中都能有效地感染，基因可以得到有效地表達，僅有一個拷貝的基因被整合到目的細胞染色質(zhì)DNA上，而且對逆轉(zhuǎn)錄基因組的操作比較容易進行。
腺病毒包括一線性雙鏈DNA，核心蛋白，外被外殼蛋白包裹。分子病毒學的進步使得可以利用這些微生物來發(fā)展載體，以便在體內(nèi)將新的遺傳序列轉(zhuǎn)移到目的細胞中。以腺病毒為基礎(chǔ)的載體可以使基因得到高水平的表達。腺病毒載體具有很高的感染性，即便用滴度很低的病毒也如此。而且，作為無細胞病毒顆粒，腺病毒是具有完全感染性的，因此沒有必要注射生產(chǎn)細胞系。另一個有力的優(yōu)點是腺病毒載體能夠使外源基因在體內(nèi)得到長期的表達。
基因轉(zhuǎn)移的機械方法包括融合脂質(zhì)囊泡如脂質(zhì)體或其它用于膜融合的囊泡，含有帶正電脂質(zhì)的DNA的脂質(zhì)顆粒如lipofectin，多聚賴氨酸介導(dǎo)的(polylysine-mediated)的DNA轉(zhuǎn)移，DNA的直接注射，如通過顯微注射將DNA注入精子或體細胞中，由氣動作用轉(zhuǎn)移包裹的DNA顆粒，如基因槍法中使用的金顆粒，無機化合物法如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移最先在植物組織轉(zhuǎn)化中被使用。采用顆粒轟擊裝置，或基因槍法，產(chǎn)生一個動力將密度很大的DNA顆粒(如金顆?；蜴u顆粒)加速到很大的速度，使其能穿透器官，組織或細胞。顆粒轟擊法可以在體外系統(tǒng)中使用，也可在離體或體內(nèi)技術(shù)中使用，將DNA導(dǎo)入細胞、組織或器官。另一種方法是配體介導(dǎo)的基因治療，它需要將DNA與特定的配體相連，形成配體-DNA復(fù)合物，從而通過配體將DNA導(dǎo)入到特定的細胞或組織中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將質(zhì)粒DNA注射到肌肉細胞中，會有很高百分比的肌肉細胞被轉(zhuǎn)化，并且維持標記基因的表達。質(zhì)粒DNA也許會，也許不會整合到細胞的染色體基因組上去。非整合型的DNA轉(zhuǎn)化使得可以在最終分化的、非增殖性的組織中保持較長時間的表達，而不必擔心會導(dǎo)致在細胞或線粒體基因組中產(chǎn)生插入、刪除或變異突變。長期的，但不一定是永久的，治療基因的轉(zhuǎn)移至特異細胞中，可以對某些遺傳疾病有療效或預(yù)防作用。DNA可以反復(fù)地定期注射，以維持基因表達產(chǎn)物具有一定的水平，但又不會在受體細胞的基因組中產(chǎn)生突變。不將外源基因整合到細胞基因組中，可以允許同時有幾個不同的外源DNA存在，同時表達幾種不同的基因產(chǎn)物。
電穿孔基因轉(zhuǎn)移法使用一個電流使得組織或細胞對電穿孔介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移敏感。一個給定強度的短電脈沖可以增加細胞膜的通透性，以至于DNA分子可以穿透并進入細胞。這種技術(shù)可以在體外系統(tǒng)中使用，或用離體或體內(nèi)技術(shù)將DNA導(dǎo)入到細胞、組織或器官中。
載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移可以用來將外源DNA轉(zhuǎn)入到細胞中。載體-DNA復(fù)合體可以很方便的被導(dǎo)入到體液或血流，然后組織特異性的進入目標器官或組織。脂質(zhì)體和多聚陽離子，如多聚賴氨酸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)化體(lipofectin)或細胞轉(zhuǎn)化體(cytofectin)，都可以使用。脂質(zhì)體可以作成對細胞或組織具有特異性的，這樣脂質(zhì)體攜帶的外源DNA就可以直接被靶細胞吸收。注射對某些細胞表面特定的受體有特異性的免疫脂質(zhì)體是一種將外源DNA插入到含有這種受體的靶細胞的捷徑。另外一種已經(jīng)使用的載體系統(tǒng)是5脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)/多聚賴氨酸偶聯(lián)系統(tǒng)，它應(yīng)用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中，將DNA導(dǎo)入到肝臟細胞。
被轉(zhuǎn)化的DNA也可以與其它類型的載體相連，以便將它們導(dǎo)入到受體細胞中，并使其能駐留在細胞質(zhì)或細胞核質(zhì)中。DNA可以與載體核蛋白相連，這種核蛋白是特殊的工程顆粒復(fù)合體，直接將DNA導(dǎo)入至細胞核里。
抗血管生成蛋白的基因調(diào)控可以通過增加能與編碼抗血管生成蛋白的基因結(jié)合的化合物，或者控制與基因相關(guān)的區(qū)域，或控制其相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯的速度來實現(xiàn)。而且被編碼抗血管生成蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的細胞可以輸回患者體內(nèi)，以提供這種蛋白的體內(nèi)來源。例如，用攜帶有抗血管生成基因的載體轉(zhuǎn)化細胞，被轉(zhuǎn)化的細胞可以是來自患者身上的正常組織的細胞，患者的病變區(qū)細胞，也可以是非患者本人的細胞。
例如，來自患者身上的腫瘤細胞可以用能夠表達本發(fā)明蛋白的載體轉(zhuǎn)染，然后重新輸回患者體內(nèi)。被轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞在患者體內(nèi)產(chǎn)生一定水平的蛋白表達，可以抑制腫瘤的生長。患者可以是人，也可以是動物。細胞也可以被非載體轉(zhuǎn)染，或用本領(lǐng)域所熟知的物理、化學的方法如電穿孔法、離子孔道法，或基因槍法。而且，DNA可以不必通過載體的輔助，而直接注射到患者體內(nèi)。特別是注射到皮下，肌肉或血液中。
通過轉(zhuǎn)染抗血管生成蛋白基因至患者體內(nèi)的基因治療方案可以是通過整合將抗血管生成蛋白基因整合到患者的細胞基因組或線粒體基因組中，也可以讓其以獨立的可復(fù)制或不可復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)形式存在于細胞質(zhì)或細胞核質(zhì)里。對抗血管生成蛋白的表達可以維持一個很長的時間，也可以通過不斷的反復(fù)注射基因，使蛋白質(zhì)在細胞、組織、器官或血液中的水平被維持在所需要的水平。
另外，本發(fā)明還涉及抗體及抗血清，它們可以用于檢測新的抗血管生成蛋白，也可用于以相關(guān)的抗血管生成活性的出現(xiàn)或相應(yīng)的活性缺乏為特征的疾病的診斷、預(yù)測及治療。這樣的抗體和抗血清也可在需要的時候被用于上調(diào)需要調(diào)節(jié)的血管生成，例如在心肌梗塞后的心肌組織中，本發(fā)明蛋白的抗體或抗血清可以用來阻斷局部的、天然的抗血管生成蛋白和生成過程，增加新的血管的形成，抑制心肌組織萎縮。
這些抗體和抗血清可以與藥理學上可接受的組合物和載體結(jié)合起來，形成診斷、預(yù)測或治療用藥物。這里的“抗體”和“抗體分子”是指一群免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白的具有免疫活性的部分，也就是含有抗體結(jié)合位點或抗原互補位的分子。
使用能夠特異性地結(jié)合抗血管生成蛋白的抗體進行的消極的抗體療法可以調(diào)節(jié)依賴于血管生成的生理過程，如生殖、發(fā)育、傷口愈合、組織修復(fù)。而且，加入能與抗血管生成蛋白的抗體Fab區(qū)結(jié)合的抗血清還可以阻斷內(nèi)源性的針對該蛋白的抗血清與該蛋白的結(jié)合。
本發(fā)明的抗血管生成蛋白還可以用于制備對這些抑制因子和受體具有特異性的抗體。抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。這些特異地與抗血管生成蛋白結(jié)合的抗體或者它們的受體可以被用于診斷和試劑盒，它們都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的用于檢測或定量體液或組織中抗血管生成蛋白或其受體的技術(shù)。這些檢測的結(jié)果可以用來診斷或預(yù)測腫瘤和其它血管生成介導(dǎo)的疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)。
本發(fā)明也包括抗血管生成蛋白、其抗體以及由這些蛋白和/或它們的抗體組成的組合物在以血管生成為特征的疾病的診斷或預(yù)診斷中的使用。在本文中，術(shù)語“預(yù)診斷方法”一詞是指能夠?qū)θ嘶騽游锏囊环N疾病的發(fā)展作出預(yù)測的方法，這種疾病尤其是依賴于血管生成的。術(shù)語“診斷方法”一詞是指能夠明確確定人或動物的依賴于血管生成類疾病的存在或其種類的方法。
抗血管生成蛋白可以用于檢測和定量能結(jié)合改蛋白抗體的診斷方法與試劑盒。這些試劑盒可以檢測血液循環(huán)中抗血管生成蛋白的抗體，這些蛋白存在表明由原位腫瘤分泌的抗血管生成蛋白存在下的擴散。這種學血液中有抗血管生成蛋白的患者更有可能發(fā)展成多腫瘤或癌癥，在治療或短期的恢復(fù)后也更有可能發(fā)生復(fù)發(fā)。這些抗蛋白的抗體的Fab片斷可以作為抗原用于制備抗-蛋白Fab片斷抗血清，它們可以用來中和抗血管生成蛋白的抗體。這種方法可以減少由抗-蛋白抗體引起的對循環(huán)的蛋白的清除。從而有效地提高血液循環(huán)中抗血管生成蛋白的水平。
本發(fā)明亦包括對抗血管生成蛋白特異的受體的分離提取。對組織具有高的結(jié)合親和性的蛋白片斷可以用親和柱來分離提取抗血管生成蛋白的受體。分離純化這些受體是朝向闡明抗血管生成蛋白作用機理的基本步驟。分離受體與鑒定其激動劑和拮抗劑將有助于發(fā)展調(diào)節(jié)這些受體活性－生物活性的最后的途徑－的藥物。分離這些受體使能夠設(shè)計核酸探針，用原位雜交或溶液雜交技術(shù)來確定受體的位置和合成情況。進一步地，可以分離受體的基因，將其插入到一個表達載體，轉(zhuǎn)化細胞，譬如病人的腫瘤細胞，以增強細胞、組織或腫瘤結(jié)合抗血管生成蛋白與抑制局部血管生成的能力。
抗血管生成蛋白用于發(fā)展親和柱，以分離腫瘤細胞培養(yǎng)物中的抗血管生成蛋白的受體。分離純化得到的受體進行氨基酸序列分析。利用序列信息，可以鑒定、分離得到編碼受體的基因。然后，將克隆的基因插入到表達載體中。這些技術(shù)都是本領(lǐng)域中非常熟知的技術(shù)。將編碼受體的核算序列轉(zhuǎn)化到腫瘤細胞中，通過轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞表達出受體，可以提高這些細胞對于內(nèi)源性的或外源性的抗血管生成蛋白的反應(yīng)能力，從而減少轉(zhuǎn)移瘤的生長速度。
本發(fā)明的血管生成抑制蛋白可以用標準的微量化學設(shè)備合成，其純度用FPLC和質(zhì)譜法檢驗。蛋白質(zhì)合成、FPLC和質(zhì)譜的方法都是本領(lǐng)域中很普通熟知的技術(shù)?？寡苌傻鞍缀退鼈兊氖荏w蛋白在重組大腸桿菌或酵母表達系統(tǒng)中表達，用柱層析方法純化。
可以合成抗血管生成蛋白的不同片斷，用于各種用途，例如(但不限于)用于制備特異性抗血清的抗原，用作抗血管生成蛋白結(jié)合部位的激活劑或抑制劑，或結(jié)合細胞毒素劑，用于殺死結(jié)合了抗血管生成蛋白的細胞。
合成的抗血管生成蛋白片斷可以用于各種用途。用放射性標記對抗血管生成蛋白受體具有高親和性的蛋白片斷，用于放射性自顯影和膜結(jié)合技術(shù)的顯示與定量分析。這一應(yīng)用為診斷與研究提供了一個重要的工具。關(guān)于受體結(jié)合特性的知識有助于探究受體的信號傳導(dǎo)機理。
可以使用標準方法將抗血管生成蛋白及由它們衍生的蛋白與其它分子偶聯(lián)起來。抗血管生成蛋白的氨基端和羧基端都含有酪氨酸與賴氨酸殘基，用放射性或非放射性技術(shù)標記。譬如用傳統(tǒng)技術(shù)進行放射性標記(酪氨酸-氯胺T，放射性碘iodogen，乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶聯(lián)技術(shù)在本領(lǐng)域中都是很熟知的常規(guī)技術(shù)?；蛘撸瑢⒗野彼峄蛸嚢彼峒尤氲?jīng)]有這種殘基的蛋白質(zhì)中，以幫助在這些蛋白的氨基端和羧基端進行放射性標記。偶聯(lián)技術(shù)是基于一些氨基酸殘基上的可利用的功能基團如(但不限于)氨基、巰基、羧基、苯基、咪唑基。各種影響這些偶聯(lián)反應(yīng)的試劑包括戊二醛，重氮對二氨基聯(lián)苯(diazotized benzidine)，碳二亞胺(carbodiimide)和鄰苯醌(p-benzoquinone)。
在各種應(yīng)用中，用化學法將抗血管生成蛋白與同位素、酶、載體蛋白、細胞毒素試劑、熒光分子、化學發(fā)光試劑、生物發(fā)光試劑和各種其他化合物相偶聯(lián)。對于特定的反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)的效率用各種不同技術(shù)來確定。譬如本發(fā)明的蛋白的放射性標記使用具有高特異性的氯胺T(Chloramine T)和NaI125，反應(yīng)用偏亞硫酸氫鈉(Sodium metabisulfite)終止，反應(yīng)混合物用一次性柱子脫鹽。被標記的蛋白被洗脫出來，收集組分。從組分中移出等份試樣，用伽馬計數(shù)器測定放射性強度。用這種方法，沒有反應(yīng)的NaI125被從蛋白中分離出來。具有最高特異性放射性的蛋白組分儲存?zhèn)溆?，如用于分析抗血管生成蛋白結(jié)合抗血清的能力。
另外，用半衰期短的同位素標記抗血管生成蛋白，使用X射線斷層攝影技術(shù)或其它現(xiàn)代的放射性成像技術(shù)觀察在體內(nèi)受體的結(jié)合部位，以此確定腫瘤的位置。
在這些合成的蛋白質(zhì)內(nèi)進行系統(tǒng)的氨基酸取代，得到對抗血管生成蛋白受體具有高親和性的蛋白激動劑或抑制劑，它們可以提高或減少對受體的結(jié)合。這些激動劑用來抑制微小轉(zhuǎn)移瘤的生長，從而限制癌癥的擴散。抗血管生成蛋白的抑制劑在血管生成不足的情況下使用，以阻斷抗血管生成蛋白的抑制作用，提高血管生成。例如，該療法對糖尿病患者提高傷口愈合有療效。
本發(fā)明進一步用以下實施例予以闡明，但這些實施例并不意味著會限制本發(fā)明的范圍。相反，還應(yīng)該清楚地理解的是，為還可以有各種其它實施方案，或修正方案和任何等同的其它實施方案，只要這些方案在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了本文所述的內(nèi)容后變?yōu)榱巳唬也⒉槐畴x本發(fā)明的實質(zhì)和/或附錄的權(quán)利要求的范圍。實施例實施例1天然Arresten的分離從人胎盤和羊膜組織可以得到毫克級的Arresten。分離Arresten或其它類似的蛋白的方法已經(jīng)有報道(如，Langeveld,J.P.等，1988,J.Biol.Chem.263:10481-10488；Saus,J.等,1988,J.Biol.Chem.263:13374-13380；Gungwar S.等，1990,J.Biol.Chem.265:5466-5469；Gungwar S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-15324；Kahsai,T.Z.等,1997,J.Biol.Chem.272:17023-17032)。Neilson等對重組Arresten的生產(chǎn)也有報道(1993,J.Biol.Chem.268:8402-8406)。該蛋白也可以在293腎臟細胞中表達(譬如，用Hohenester E.等描述的方法，1998,EMBO J.17:1656-1664)。Arresten也可以按Pihlajaniemi T.等的方法分離得到(1985,J.Biol.Chem 260:7681-7687)。
圖1顯示了Ⅳ型膠原蛋白NC1結(jié)構(gòu)域α鏈的核酸序列(SEQ IDNO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。上面標記了Arresten蛋白的大概起始與結(jié)束位置。Arresten基本上包括了Ⅳ型膠原蛋白α鏈的NC1結(jié)構(gòu)域，可能還有連接區(qū)，它剛好是NC1結(jié)構(gòu)域前的12氨基酸序列。
用細菌膠原蛋白酶從人胎盤分離天然Arresten，使用陰離子交換層析，凝膠過慮層析，HPLC和親和層析法進行分離純化(GunwarS.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24；weber S.等，1984,Eur.J.Biochem.139:401-410)。來自人胎盤的Ⅳ型膠原蛋白是HPLC純化的，用C-18疏水柱(Pharmacia，美國新澤西州Piscataway)。蛋白用乙晴梯度(32％-39％)洗脫。有一個主峰，一個小的雙峰。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)第一個峰有兩條帶，第二個峰沒有蛋白條帶。免疫印跡也發(fā)現(xiàn)在第二個峰沒有檢測到蛋白，第一個峰證明是Arresten。
實施例2用大腸桿菌生產(chǎn)重組的Arresten從α1 NC1(Ⅳ)pDS載體上用PCR擴增Arresten基因(NeilsonE.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-8405)，使用正向引物5’CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物5’-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC-3’(SEQ ID NO:4)。得到的cDNA片斷用BamHⅠ和HindⅢ酶切，連接到已酶預(yù)切好的pET22b(+)載體上(Novagen公司，美國威斯康星Madison)。圖2表示質(zhì)粒的構(gòu)建過程。Arresten處于pelB前導(dǎo)序列的下游，且與其處于同一閱讀框內(nèi)，這樣可以使表達的Arresten分泌到周質(zhì)腔中，以可溶性蛋白形式表達。蛋白另外加上一段載體序列，編碼一段氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO:13)。序列3’端與多聚組氨酸標簽(His Tag)相連。在cDNA的3’與His-Tag之間的額外載體序列編碼氨基酸序列KLAAALE(SEQ ID NO:14)。對這兩條鏈的陽性克隆進行序列測定加以鑒定。
將含有編碼Arresten基因的質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)化E.Coli.HMS174(Novagen公司，美國威斯康星州Madison)，然后轉(zhuǎn)化BL21細胞(Novagen公司，美國威斯康星州Madison)進行表達。用過夜培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)液接種到500 ml LB培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)約4小時，使培養(yǎng)液OD600達到0.6。然后加入IPTG(終濃度為1-2mM)，誘導(dǎo)蛋白表達。誘導(dǎo)兩個小時后，5000g離心收集細胞，用6M胍，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的緩沖液懸浮細胞，裂解。懸浮的細胞用超聲波破碎，12,000g離心30分鐘。上清過一5ml的Ni-NTA瓊脂糖柱子(Qiagen公司，德國Hilden)4-6次，流速為2ml/min。非特異性結(jié)合的蛋白用含有10mM和25mM咪唑的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗脫除去。然后用增加咪唑濃度(50mM,125mM,250mM)的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗脫Arresten蛋白。洗脫得到的蛋白于4℃對PBS透析兩次，有少部分蛋白在透析過程中會沉淀下來。收集透析過的蛋白，以約3500g離心，分離沉淀與上清部分。每一組分的蛋白濃度用BCA分析法(PierceChenical有限公司，美國，伊利諾斯州Rockford)和定量SDS-PAGE分析法確定。沉淀部分蛋白約占22％,78％在溶液中回收。所得總蛋白產(chǎn)量約為10mg/l。
大腸桿菌表達的蛋白主要以溶解性蛋白的形式分離，SDS-PAGE電泳表明在29 kDa處有一單體條帶。額外的3 kDa來自多聚連接子和組氨酸標簽(His-Tag)序列，用Arresten與6His-Tag抗體進行免疫檢測。
實施例3在293胚胎腎臟細胞表達Arresten用含有α1(Ⅳ)NC1基因的pDS質(zhì)粒為模板擴增Arresten,并在同一閱讀框架中將信號肽序列加到真核表達載體pcDNA3.1上(Invitrogen公司，美國加州San Diego)。將α1(Ⅳ)鏈5’端的信號肽克隆到NCⅠ域的5’端是為了可以讓蛋白分泌到培養(yǎng)基中。含有Arresten基因的重組質(zhì)粒用側(cè)翼引物測序。沒有錯誤的cDNA進一步純化，用于體外翻譯研究以確認蛋白表達。以CaCl法，用含有Arresten的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293細胞，用遺傳霉素(geneticin)篩選被轉(zhuǎn)化的陽性克隆(Life Technologies/Gibco BRL,美國馬里蘭州Gaithersburg)。在抗生素存在下，將細胞經(jīng)過3周的處理，直至沒有明顯的細胞死亡為止。然后將克隆鋪展到T225培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。收集上清，用Amicon濃縮儀進行濃縮(Amicon)處理。濃縮過的上清用SDS-PAGE電泳，免疫印跡及ELISA分析Arresten的表達。用ELISA檢測到上清中有很強的結(jié)合。SDS-PAGE分析表明主要條帶是30 kDa處的一條單一的條帶。含有Arresten的上清用對Arresten特異的抗體親和層析柱分離純化(Gunwar等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。得到一個主峰，含有分子量約為30 kDa的單體，對Arresten抗體具有免疫反應(yīng)性。每升培養(yǎng)液約可得到蛋白1-2mg重組Arresten蛋白。
實施例4Arresten抑制內(nèi)皮細胞的增殖C-PAE細胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞匯合，保持接觸抑制48小時。對照細胞是786-0(腎癌)細胞，PC-3細胞，HPEC細胞和A-498(腎癌)細胞。細胞用胰蛋白酶在37℃保溫5分鐘消化，收集(Life Technologies/Gibco BRL,美國馬里蘭州Gaithersburg)。將含有12500個細胞的、1％FCS的DMEM的細胞懸浮液加到用10μg/ml的纖連蛋白包裹過的24孔的板上。在含5％CO2，濕度95％的條件下37℃保溫24小時。去培養(yǎng)基，代之以含0.5％FCS和3ng/ml的bFGF(R&D系統(tǒng)公司，美國明尼蘇達州Minnesota)的DMEM。沒有刺激的對照細胞不加bFGF。細胞用各種濃度(0.01μg/ml至50μg/ml)的Arresten或endostatin處理。所有的孔都在處理的時候加入1微居里的3H-胸腺嘧啶。24小時候后，去培養(yǎng)基，小孔用PBS洗。用1N NaOH將細胞洗下來，加到一個有4ml的Scinti Verse溶液(Fisher Scientific公司，美國賓夕法尼亞州Pittsburgh)的閃爍小管里。吸收的胸腺嘧啶用閃爍計數(shù)器測定。結(jié)果如圖3A與3B所示，它們表示用不同濃度的Arresten或endostatin處理的C-PAE細胞吸收3H-胸腺嘧啶的情況。圖4A,4B,4C和4D表示用Arresten或endostatin處理的對照組細胞情況，Arrestaten對786-0細胞(圖4A),PC-3細胞(圖4B),或HPEC細胞(圖4C)具有的效應(yīng)較小。Endotstin對A-498細胞的效應(yīng)(圖4D)較小。圖3與圖4的所有組都代表三個樣本的數(shù)據(jù)。
實施例5Arresten抑制內(nèi)皮細胞遷移Arresten和endostatin對FBS誘導(dǎo)的化學趨向性的抑制效應(yīng)是以人臍帶內(nèi)皮細胞(ECV-304細胞，ATCC1998-CRL,ATCC(American Type Culture Collection，美國VA州Manassas市大學街10801號，20110-2209)使用Boyden分析法(美國馬里蘭州Jhon Cabin的Neuro-Probe有限公司)測定的。ECV304細胞在含有10％的FBS和5 ng/ml DilC18(3)活體熒光染色劑(美國俄勒岡州EugeneMolecular Probes有限公司)的M199培養(yǎng)基中生長過夜。胰蛋白酶消化后，用含有0.5％FBS的M199培養(yǎng)基洗，稀釋細胞，將60000個細胞接種到每個孔的上層室中，同時加入(或不加)Arresten或endostatin(2-40μg/ml)。下層室加入含有2％的FBS的M199作為化學趨向劑，含有細胞的室與化學趨向劑之間用孔徑為8μm多聚碳酸酯濾膜(Poretics公司，美國加州Livermore)隔開。37℃在5％CO2，濕度95％的條件下保溫4.5小時。去掉沒有遷移的細胞，用PBS緩沖液洗上層小室，過濾膜用塑料刀片刮，浸泡于含4％福爾馬林的PBS中，置于玻璃幻燈片上。用一強功率的熒光源，使用數(shù)字式的SenSysTM相機，利用PMIS軟件處理(RoperScientific/Photometerics，美國亞利桑那州Tue\cson)可以記錄到多張獨立相似的圖片。圖5A,5B,5C顯示2μg/ml的Arresten與20μg/ml一樣的有效。細胞計數(shù)用軟件OPTIMAS 6.0(MediaCybemetics公司，紐約Rochester)進行，結(jié)果如圖6所示，顯示用圖解的形式表示在顯微照片中所看到的結(jié)果。
實施例6Arresten抑制內(nèi)皮血管的形成為了測試對內(nèi)皮血管形成的抑制，在24孔板的每孔中加入320μl matrigel(Collaborative Biomedical Products公司，美國馬薩諸塞州Bedford)，讓其聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。將約25,000個小鼠大動脈內(nèi)皮細胞用EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics Corporation，美國加州San Diego)懸浮，不加抗生素，加到每個孔中。細胞用逐漸增加濃度的Arresten或者BSA，無菌PBS或7S結(jié)構(gòu)域處理。所有分析都做三個平行。細胞在37℃保溫24-48小時，用CK2奧林巴斯顯微鏡(CK2 Olympus microscope)(目鏡3.3倍，物鏡10倍)觀察。然后用400DK涂覆的TMAX膠卷(Kodak)拍照。將細胞用定影液染色(Sigma Chemical Company，美國密蘇里州圣路易斯)，拍照。拍十次，計數(shù)所有的血管數(shù)，計算平均值。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，與對照比較起來，Arresten抑制了血管形成。由圖8A可見具有代表性的血管生成較好者。圖8B表示用0.8μg/ml的Arresten處理，MAE細胞很少或沒有血管生成者(100X顯示)。
也用C57/BL6小鼠進行體內(nèi)的Matrigel分析。Matrigel在4℃解凍過夜。然后將其與20 U/ml的肝素(Pierce Chemical公司，美國伊利諾斯州Rockford),150 ng/ml的bFGF(R&D System公司，美國明尼蘇達州州Minneapolis)，和1μg/ml的Arresten或10μg/ml的endostatin混合。將混合物用21g的針皮下注射。對照組為同樣的混合物，只是不加血管生成抑制劑。14天后，殺死小鼠，取出matrigel塞子，matrigel塞子用多聚福爾馬林PBS室溫固定4個小時，然后轉(zhuǎn)到PBS中放置24小時。Matrigel塞子用石蠟包埋，切片，用H&E染色。切片用光學顯微鏡檢查，計數(shù)形成的血管數(shù)，計算平均值。
當Matrigel在有bFGF存在下，有或沒有增加濃度的Arresten時，在1μg/ml Arresten和10μg/ml endostatin下觀察到血管數(shù)減少了50％。這些結(jié)果表明，Arresten通過抑制血管形成過程的不同步驟而影響新的血管形成。結(jié)果也表明在1μg/ml濃度下Arresten與10μg/ml的endostatin在抑制體內(nèi)新血管形成作用上的效果是一樣的。
實施例7:Arresten抑制體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移對C57/BL6小鼠靜脈注射1,000,000個MC38/MUC1細胞(GongJ.等，1997,Nat.Med.3:558-61)。26天內(nèi)，每隔一天，對五只對照小鼠注射無菌10 mM的PBS，對六只實驗小鼠注射4mg/ml的Arresten。26天后，計數(shù)每只小鼠的肺癌結(jié)個數(shù)，對每組取平均值。每組觀察到有兩只死亡。發(fā)現(xiàn)Arresten明顯的減少了原發(fā)腫瘤結(jié)的形成，從對照組的300個減少到200個。
實施例8Arresten抑制體內(nèi)腫瘤的生長將2,000,000個786-0細胞通過皮下注射到7至9周齡的雄性無胸腺裸鼠體內(nèi)。第一組六只小鼠，讓腫瘤長至700mm3大小。第二組小鼠六只，腫瘤讓其長至100mm3大小。每天注射無菌的ArrestenPBS溶液，連續(xù)注射十天，700mm3的小鼠注射劑量為20mg/kg。100 mm3的小鼠注射劑量為10 mg/kg。對照小鼠注射BSA或者PBS溶液。結(jié)果如圖9A,9B所示。圖9A的曲線表示處理后腫瘤體積的從700mm3的增加，10mg/kg Arresten處理(□)，BSA處理(+)，對照(●)。用Arresten處理的腫瘤大小從700mm3縮小到500mm3，BSA處理的腫瘤大小及對照組的10天內(nèi)增大至12000mm3。圖9B表示腫瘤最初大小為100mm3小鼠，用Arresten處理(□)的結(jié)果也是導(dǎo)致腫瘤縮小至80mm3，而BSA處理(+)的10天內(nèi)腫瘤大小增長至500mm3。
收集大約5,000,000個PC-3(前列腺腺癌細胞)，靜脈注射到7至9周齡的雄性無胸腺裸鼠體內(nèi)。讓腫瘤生長10天。然后用Vernier測徑器測量腫瘤大小，用標準公式(寬2X長×0.52)計算腫瘤體積大小(O’Reilly M.S.等，1997,Cell,88:277-85；O’Reilly M.S.等，1994,Cell 79:315-28)。動物按每組5-6只分組。實驗鼠每天注射Arresten(10mg/kg/day)或endostatin(10m/kg/day)。對照鼠每天注射PBS溶液。結(jié)果如圖9C所示。表明Arresten(□)對腫瘤生長抑制效應(yīng)與endostatin(▲)一樣好甚至稍微更好。重復(fù)實驗，不過Arresen劑量只用4mg/kg/day。結(jié)果如圖9D所示。8天后停止處理(箭頭)，但是不另外施加Arresten時，12天內(nèi)仍然有明顯的抑制效應(yīng)。12天后，Arresten的抑制效應(yīng)開始消失。
實施例9循環(huán)系統(tǒng)中Arresten的半衰期從人胎盤提取天然的Arresten蛋白，通過靜脈注射到體重200g的大鼠中，每只大鼠的劑量為5mg。直接通過ELISA法用抗Arresten抗體分析不同時間血清中Arresten的存在。作為對照，亦分析每個時間點的血清蛋白，須確保使用相同量的血清。發(fā)現(xiàn)血清中循環(huán)的Arresten半衰期大約為36小時。
另一組通過和/或皮下注射方式注射人Arresten I.P.,觀察肺，腎，肝，胰臟，脾臟，腦，睪丸，卵巢等器官的病理標志。進行ELISA分析，在這些大鼠血清中檢測到Arresten抗體存在，在腎小球基底膜上發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性的IgG沉積物存在，這在以前也曾觀察到(Kalluri,R.等，1994,PNAS USA 91:6201-5)。腎中的抗體沉積物并沒有伴隨著任何發(fā)炎跡象或腎臟功能損壞。這暗示Arresten是沒有病原性的。
實施例10Arresten對酶MMP-2的結(jié)合及抑制MMP-2,MMP-9及這些酶的抗體從Oncogene公司購買得到。如前人所述(Kalluri R.等，1994,PNAS USA,91:6201-5)用直接從人胎盤分離得到的天然Arresten做ELISA分析，MMP-2和MMP-9都對Arresten有特異性結(jié)合。它們不結(jié)合7S結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合不依賴于TIMP-2和TIMP-1的結(jié)合。
為了評估Arresten對降解基底膜的作用，將Matrigel與MMP-2和MMP-9一起37℃保溫6小時，同時輕微震蕩。用SDS-PAGE電泳分析上清，用Ⅳ型膠原蛋白α2鏈的抗體作免疫印跡實驗。在降解分實驗的開始，逐漸增加濃度加入Arresten，觀察到MMP2活性被抑制。SDS-PAGE膠中的NC1結(jié)構(gòu)域以單體、二聚體形式存在，可以用Ⅳ型膠原蛋白的抗體作western印記實驗觀察到。逐漸增加濃度的Arresten抑制MMP-2對基底膜的降解作用。表明Arresten可以結(jié)合MMP-2，阻止其對基底膜膠原蛋白降解作用。對于MMP-9也得到了類似的結(jié)果。
實施例11在大腸桿菌中生產(chǎn)重組Canstatin圖10表示Ⅳ型膠原蛋白NC1結(jié)構(gòu)域α2鏈的核酸序列(SEQ IDNO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。編碼Canstatin的序列用PCR擴增，以α2 NC1(Ⅳ)/pDS載體為模板(Neilson E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)，正向引物為5’-CGG GAT CCT GTC AGC ATCGGC TAC CTC-3’(SEQ ID NO:7)，反向引物為5’CCC AAG CTTCAG GTT CTT CAT GCA CAC-3’(SEQ ID NO:8)。得到的cDNA片斷用BamhⅠ和HindⅢ酶切，連接到預(yù)切好的pET22b(+)載體上(Novagen公司，美國威斯康星州Madison)。質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖11所示。這樣將Canstatin基因插入pelB前導(dǎo)肽的下游且與其為同一讀碼框，這樣可以使蛋白以可溶性蛋白的形式表達分泌到周質(zhì)腔中。另有一段額外的載體序列MDIGINSD(SEQ ID NO:13)加到蛋白上。序列3’端與一段多聚His-Tag序列相連。在cDNA與His-Tag序列之間有一段載體序列編碼氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO:14)。陽性克隆經(jīng)雙鏈測序確認。
帶有Canstatin的質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞HMS174(Novagen公司，美國威斯康星州Madison)。然后轉(zhuǎn)化到BL21細胞中進行表達(Novagen公司，美國威斯康星州Madison)。將過夜培養(yǎng)的菌液接種到500ml LB培養(yǎng)基中。然后培養(yǎng)約4小時，時OD600達到0.6。加入終濃度5mM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。誘導(dǎo)兩個小時后，5000g離心收集細胞，用含6 M胍，0.1M NaH2PO4,0.01MTris.HCl,pH 8.0的緩沖液懸浮細胞。懸浮的細胞用超聲波破碎，12,000g離心30分鐘，上清過一5ml的Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen,德國Hilden)4-6次，流速2ml/min。非特異性結(jié)合的蛋白分別用15ml的含10mM,25mM,50mM咪唑的8M尿素，0.1MNaH2PO4,0.01MTris-HCl,pH 8.0的緩沖液洗去。Canstatin蛋白用分別用含125mM和250mM)咪唑的8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0緩沖液洗脫。洗脫的蛋白對PBS在4℃透析兩次。透析時其中一部分蛋白會沉淀，收集透析過蛋白，3,500g離心，將沉淀與上清分離。每一部分的蛋白量用BCA分析(PierceChemical公司，美國伊利諾斯州Rockford)確定，用SDS-PAGE電泳分析定量。SDS-PAGE分析表明在29 kDa處有一單體條帶，額外的3 kDa是來自多聚Linker和His-Tag序列。收集含有Canstatin蛋白的洗脫組分，對PBS透析，以備下面的分析用。SDS-PAGE和wester印跡分析過的Canstatin用抗-His-Tag抗體進行檢測。用Ⅳ膠原蛋白NC1抗體也檢測到細菌表達的重組Canstatin蛋白。
大腸桿菌表達的蛋白主要以可溶性蛋白的形式分離。總蛋白中沉淀部分約占40％，其余的溶液部分占60％。蛋白質(zhì)的總產(chǎn)量大約為15m/l。
實施例12Canstatin在胚腎細胞293中的表達。
含有α2(Ⅳ)NC1的pDS質(zhì)粒(Neilson,E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)被用于PCR擴增Canstatin，在此過程中，一段信號肽序列可以按設(shè)計插入真核表達載體pcDNA3.1上(InⅣitrogen公司，San Diego,California,USA)。將全長α2(Ⅳ)鏈的5’端的前導(dǎo)肽序列克隆導(dǎo)NC1區(qū)域的5’端以使蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。使用側(cè)邊引物對含有Canstatin的重組載體進行測序。進一步純化無錯的cDNA克隆，并用于體外翻譯研究以驗證蛋白質(zhì)的表達。用氯化鈣法用含有Canstatin的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293細胞(Kingstaon.R.E.,1996，“磷酸鈣轉(zhuǎn)染”pp.9.1.4-9.1.7,見“最新分子生物學方法”，Ausubel,F.M.,等編，wiley和Sons公司，紐約市，NY,USA)。轉(zhuǎn)化的克隆用慶大霉素(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)抗生素篩選。在抗生素存在的情況下培養(yǎng)細胞三周，直至沒有細胞死亡。細胞群落在T-225搖瓶中擴大培養(yǎng)生長直至匯合。然后收集上清并用amicon離心機(Amicon公司)離心濃縮。濃縮的上清用SDS-PAGE，免疫雜交和ELISA方法分析Canstatin的表達。通過ELISA方法可以探測到上清的強烈結(jié)合。含有Canstatin的上清用Canstatin專一性的抗體進行親和層析(Gunwar,S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。分離到一個主要的峰含有大約24 kDa的純化的單體，該單體具有對于Canstatin抗體的免疫活性(抗-α2 NC1抗體，1∶200稀釋)。
實施例13Canstatin抑制內(nèi)皮細胞的增殖。
在含有10％的胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)小牛大動脈內(nèi)皮(CAPE)細胞并保持接觸抑制48小時。在37℃用胰蛋白酶(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)消化5分鐘來收集細胞。將懸浮在含有0.5％的胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中的12,500個細胞加到用10ug/mlfibronectin包被的24孔板的每一個孔中。在37℃,5％CO2和95％的濕度下培養(yǎng)細胞24小時。移去培養(yǎng)基并用含有0.5％的FCS(未激活的)或者10％的FCS(激活并處理過的細胞)的DMEM培養(yǎng)基更換。780-0,PC-3和HEK 293細胞作為對照并生長至匯合，胰蛋白酶消化并用同樣的方法鋪在平板上。細胞用三倍體積0.025到40mg/ml濃度的Canstatin或者endostatin處理。在胸腺嘧啶結(jié)合試驗中，所有孔在處理時都加入1毫居的3H-胸腺嘧啶。24小時后，移去培養(yǎng)基并用PBS洗孔三次。用1N的NaOH抽提細胞并加入到含有4ml ScintiVerse Ⅱ溶液(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)閃爍小瓶中。用閃爍計數(shù)器測量胸腺嘧啶的結(jié)合。
結(jié)果顯示如圖12A和12B。圖12A是一個柱狀圖，顯示了不同量的Canstatin對于CAPE細胞增殖的影響。每分鐘胸腺嘧啶結(jié)合的計數(shù)顯示在y-軸上。在x-軸上0.5％是0.5％的FCS(未激活的)對照，10％是10％的FCS(激活)對照。用增加量的Canstatin濃度處理可以穩(wěn)定地減少胸腺嘧啶地結(jié)合。圖12A是一個柱狀圖，顯示了在非內(nèi)皮細胞786-0,PC-3和HEK 293細胞中增加量的Canstatin對于胸腺嘧啶結(jié)合地影響。每分鐘胸腺嘧啶結(jié)合的計數(shù)顯示在y-軸上，x-軸顯示的是用增加量的Canstatin濃度處理的三個細胞系，0.5％的FCS(未激活的)和10％的FCS(激活)對照。各組代表三次的樣，柱代表每分鐘的平均數(shù)加上平均標準方差。
還進行了溴酚蘭染色試驗。3,100個細胞加到每個孔中并處理如上，然后使用Oliver等的方法(Oliver等，1989,J.Cell.Science92:513-80)對細胞進行計數(shù)。各孔用100ml的1×PBS清洗一次，然后各孔加入在中性緩沖溶液中的10％甲醛(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)室溫固定30分鐘。除去甲醛，細胞用在0.01M硼酸鹽緩沖液(pH 8.5)中的1％溴酚蘭(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)室溫染色30分鐘。用100ml的0.1N的HCl/乙醇(1∶1混合物)室溫抽提溴酚蘭一小時。溴酚蘭染色的量在小平板讀數(shù)計(BioRad公司,Hercules,Califomia,USA)上用655nm波長的光吸收進行測量。
結(jié)果顯示如圖12C.和12D。圖12C是一個柱狀圖，顯示了不同量的Canstatin對于CAPE細胞染色劑吸收的影響。OD655吸收值顯示在v-軸上。“0.1％”代表的是0.1％的FCS處理的對照(未激活的)，“10％”是10％FCS處理的對照(激活)。小條表示的是用增加量濃度的Canstatin處理。在CAPE細胞中，可以在用大約0.625-1.25μg/ml水平的Canstatin處理的未激活的細胞中看到染料吸收減少。圖12D是一個柱狀圖，顯示了不同濃度的Canstatin對于非內(nèi)皮細胞HEK 293(白色柱)和PC-3(斜線柱)的作用結(jié)果。OD655吸收值顯示在y-軸上?！?.1％”代表的是0.1％的FCS處理的對照(未激活的)，“10％”是10％FCS處理的對照(激活)。柱代表655nm相對吸收單位平均值加上每一處理濃度下8個孔的平均標準方差。
檢測到Canstatin對于10％血清激活的內(nèi)皮細胞劑量依賴型抑制的ED50值為大約0.5μg/ml(如圖12A和12C)。在Canstatin劑量上升到0.5mg/ml時，沒有觀察到對于腎腫瘤細胞(786-0)，前列腺腫瘤細胞(PC-3)，或者人胚胎腎細胞(HEK293)有明顯的作用效果(如圖12B和12D)。這些內(nèi)皮細胞特異性顯示了Canstatin可能是一種非常有效的抗血管生成試劑。
實施例14Canstatin抑制內(nèi)皮細胞遷移。
在血管生成過程中，內(nèi)皮細胞不僅增殖而且遷移。因此，可以估計Canstatin會作用于內(nèi)皮細胞的遷移。使用Boyden小室試驗(Nero-Pro公司，Cabin John,Maryland,USA)檢測到了Canstatin和endostatin對于人臍帶內(nèi)皮細胞(HUVECs)的FBS誘導(dǎo)的趨化性有抑制作用。HUVECs細胞生長在含有10％PBS和5ng/mlDiIC18(3)(Molecular Probes公司，Eugene,Oregon,USA)的M199培養(yǎng)基(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)中進行活性熒光染色過夜。胰蛋白酶消化后，用含有0.5％PBS的M199培養(yǎng)基清洗和稀釋細胞，將60,000個細胞加入到上層小室的孔中同時加入或者不加入Canstatin(0.01或者1.0mg/ml)。含有2％PBS的M199培養(yǎng)基放入下層作為趨化劑。含有細胞的小室和趨化劑用8μm孔徑的聚碳酸酯膜(Poretics公司，Livermore,California,USA)分開。小室在37℃,5％CO2和95％的濕度下溫育4.5小時。棄去未遷移細胞，用清洗上層細胞，用塑料鏟刮下濾膜，用含4％甲醛的PBS溶液固定并放在玻璃片上。使用高熒光視野用SenSysTM數(shù)碼相機記錄下一些獨立的同源圖像，運用PMIS(RoperScientific/Photometrics公司，Tucson,Arizona,USA)圖像處理軟件進行操作。使用OPTIMIZE6.0軟件程序(Media Cybernetics,Rochester,NY)對于細胞進行計數(shù)(Klemke,R.L.等，1994,J.Cell.Biol.127:859-66)。
結(jié)果顯示如圖13，該柱狀圖顯示了每個視野中的遷移的內(nèi)皮細胞的數(shù)目(y-軸)，這些細胞分別未用VEGF(沒有VEGF或沒有血清)，使用處理VEGF(含1％FCS和10ng/ml VEGF)，以及使用0.01μg/ml的Canstatin(含1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml的Canstatin)和1μg/ml的Canstatin(含1％FCS和10ng/mlVEGF和1μg/ml的Canstatin)的進行處理過。
觀察到在10ng/ml時Canstatin對于HUVECs細胞的增殖具有明顯的抑制作用。Canstatin抑制內(nèi)皮細胞增殖和遷移的能力暗示它在血管生成的不僅一個步驟中起作用?？蛇x地，Canstatin可能作為受激地內(nèi)皮細胞地細胞凋亡的信號從而能夠同時作用于細胞地增殖和遷移。據(jù)報道凋亡可以被agiostatin，另外一種抗血管生成的分子誘導(dǎo)(O’Reilly,M.S.等，1994,Cell 79:315-28；Lucas,R.等，1998,Blood 92:4730-41)。
實施例15Canstatin抑制內(nèi)皮管的生成作為第一個Canstatin抑制血管生成能力的試驗，推斷出他可以阻止內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠，即一種鼠基質(zhì)膜的固體膠中形成管。當鼠大動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在基質(zhì)膠中時，它們很快排列并形成空的管狀結(jié)構(gòu)。
將基質(zhì)膠(C ollaborative Biomedical Products公司，Bedford,Massachusetts,USA)(320ml)加到24孔板的每個孔中并使之聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。將在不含抗生素的EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)培養(yǎng)基中的25,000個鼠大動脈內(nèi)皮細胞(MAE)懸浮物加到鋪有基質(zhì)膠的每個孔中。這些細胞用Canstatin,BSA，無菌PBS或者α5-NC1區(qū)以增加的濃度進行處理。所有的試驗都做三次。細胞在37℃溫育24-28小時并用CK2 Olympus顯微鏡觀察(3.3×目鏡，10×物鏡)。使用400涂有DK的TMAX膠卷照相(Kodak公司)。然后細胞用diff-quik固定劑(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)約4周后，將這些鼠分成4鼠一組。對于試驗組(4只鼠)每天皮內(nèi)注射總體積為0.2ml的3mg/kg劑量的Canstatin。對照組(4只鼠)每天給予相同體積的PBS。使用Vernier卡尺測量腫瘤的長和寬，并用標準的公式長度×寬度2×0.52來計算腫瘤的體積。腫瘤的體積從26mm3到73mm3，在給定日期計算的腫瘤體積除以處理的笫一天的體積以此獲得微分腫瘤體積(V/V)，如上所述。每一組中包括5只小鼠。結(jié)果顯示在圖15B中，該圖顯示的是微分的腫瘤體積(y軸)±標準方差，對處理的天數(shù)(x軸)作圖。相對于對照(□)來說，Canstatin(■)處理的腫瘤體積只有微小的增加，這一結(jié)果與以endostatin(○)處理獲得的結(jié)果有明顯的差別。
對于腎臟細胞瘤來說，將在2百萬個786-0細胞皮下注射到7到9周大的無胸腺裸鼠體內(nèi)。使腫瘤生長到大約100mm3到大約700mm3。每一組中有6只鼠。每天皮內(nèi)注射10mg/kg劑量的Canstatin,注射10天。對照組每天給予相同體積的PBS。結(jié)果顯示在圖15C(100mm3的腫瘤)和31D(700mm3的腫瘤)中。在兩個組中，處理的腫瘤(■)相比較對照(□)有明顯的萎縮。
大腸桿菌中產(chǎn)生的Canstatin抑制小的(100mm3的腫瘤，圖15C)和大的(700mm3的腫瘤，圖15D)腎臟細胞瘤的生長。對于嚴重綜合性免疫缺陷小鼠(SCID)中的人前列腺腫瘤(PC-3)來說，10mg/kg劑量的Canstatin使得腫瘤的相對體積為只注射載體的小鼠的55％。在無胸腺裸鼠中，使用了相對低劑量的Canstatin和endostatin,3mg/kg劑量的Canstatin具有與8mg/kg劑量的endostatin一樣的效果。在所有的體內(nèi)研究中，小鼠表現(xiàn)為健康，沒有出現(xiàn)衰老的跡象，試驗中沒有老鼠死亡。
實施例17Canstatin處理小鼠的CD31免疫組織化學體內(nèi)試驗中腫瘤體積的減少顯示了對這些腫瘤中血管形成的抑制作用。為檢測腫瘤管，進行了石蠟包埋腫瘤切片的CD31抗體堿性磷酸酶免疫組織化學。切下的腫瘤組織用剃刀切成幾塊大約3-4mm厚的小塊然后用4％的甲醛固定24小時。在脫水和石蠟包埋前組織轉(zhuǎn)入PBS中。在石蠟包埋后，將組織切成3mm厚的切片并固定起來。對切片脫臘，重新水化，并用300mg/ml的蛋白酶ⅩⅩⅣ(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)在37℃預(yù)處理5分鐘。用100％的乙醇終止反應(yīng)。切片風干，在水化并用10％的兔血清封閉。然后玻片用1∶50稀釋的鼠抗鼠CD31單克隆抗體(PharMingen公司，San Diego,California,USA)在4℃溫育過夜，然后在37℃，30分鐘溫育兩次，分別用1∶50稀釋的兔抗鼠免疫球蛋白(DAKO)和鼠APAAP(DAKO)。用新品紅進行顏色反應(yīng)。切片用蘇木精復(fù)染。
可以觀察到Canstatin處理的腫瘤比對照腫瘤的血管的數(shù)目減少。實施例18在大腸桿菌中Tumstatin和Tumstatin突變體的重組生產(chǎn)Ⅳ型膠原的α3鏈的NC1區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:9)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)的顯示于圖16。Tumstatin編碼序列是從α3 NC1(Ⅳ)/pDS載體(Neilson,E,G.等，1993,J.Boil.Chem.268:8402-5)經(jīng)過PCR擴增而來的，使用的前端引物為5’-CGG GATCCG GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3’(SEQ ID NO:11)，后端引物為5’-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT-3’(SEQ IDNO:12)。獲得的片段用BamHⅠ和HindⅢ酶消化，連接到預(yù)消化的pET22b(+)(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)上。構(gòu)建如圖17所示。Tumstatin連接并融合到pelB前導(dǎo)肽的下游，從而使得它可以定位到周質(zhì)空間和表達可溶性蛋白質(zhì)。添加到蛋白質(zhì)上的附加的序列編碼氨基酸序列MDIGINSD(SEQ ID NO:13)。序列的3’末端連接著多組氨酸結(jié)合序列。在cDNA的3’末端和組氨酸結(jié)合序列之間的添加的載體序列編碼氨基酸序列KLAAALE(SEQ IDNO:12)。陽性克隆在兩條鏈上測序。編碼Tumstatin的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)先是轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HMS174(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)中，然后轉(zhuǎn)化到BL21(Novagen公司，Madison,Wisconsin,USA)中進行表達。在500ml LB培養(yǎng)基(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)中過夜培養(yǎng)細菌培養(yǎng)物。培養(yǎng)物生長4小時直到達到OD600值為0.6然后加入IPTG至終濃度為1mM以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。在誘導(dǎo)2小時后，用5,000×g離心收集菌體并用6M胍，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0重懸菌體。重懸的菌體用超聲波破碎，用12,000×g離心30分鐘。上清部分以每分鐘2ml的速度通過5ml的Ni-HTA瓊脂糖柱(Qiagen公司，Hilden,Germany)4-6次。用含10mM和25mM的咪唑，8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01M Tris-HCl,pH 8.0的溶液清洗柱子除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。在8M尿素，0.1M NaH2PO4,0.01MTris-HCl,pH 8.0的緩沖液中增加咪唑的濃度(50mM,125mM,和250mM)來將蛋白質(zhì)從柱子上清洗下來。洗脫的蛋白質(zhì)在4℃對PBS透析兩次。在透析過程中總蛋白中的一部分沉淀下來。收集透析的蛋白質(zhì)，在大約3,500×g離心將其分為不溶的部分(沉淀)和可溶的部分(上清)。
大腸桿菌表達的Tumstatin主要以可溶的蛋白質(zhì)來分離，SDS-PAGE分析顯示為一條31 kDa的條帶。增加的3 kDa來自接頭和組氨酸結(jié)合序列。含有這條大的部分被用于下一步的試驗。通過BCA試驗(Pierce化學公司，Rockforrd,Illinois,USA)檢測每一部分中蛋白質(zhì)的濃度，使用掃描濃度測量儀進行定量SDS-PAGE分析。在非還原條件下可以看到有一條代表Tumstatin二聚體的60 kDa的帶，在還原條件下這條帶被還原為31 kDa的單體。蛋白質(zhì)的總的收獲量為每升5mg。
重組的被刪節(jié)的Tumstatin(Tumstatin-N53)缺少53個N端的氨基酸，在大腸桿菌中表達和純化如另外一種突變體(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。該突變體如圖18所示，該組成圖顯示了在α3(Ⅳ)NC1單體中被刪節(jié)的氨基酸的位置。實心圓表示了從Tumstatin刪去N-端的53個氨基酸殘基以產(chǎn)生“Tumstatin-N53”(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。二硫鍵用短線標示，他們的存在位置在α1(Ⅳ)NC1和α2(Ⅳ)NC1中是不同的(Siebold，等1988,J.Biochem.176:617-24)。為清楚起見，圖中只了標示兩個可能存在的二硫鍵結(jié)構(gòu)。
抗人α3(Ⅳ)NC1的兔抗體的制備方法如前所述(Kalluri,R.等，1997,J.Clin.Invest.99:2470-8)。單克隆鼠抗鼠CD31單克隆抗體購自PharMingen公司(PharMingen公司，San Diego,California,USA)。FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG抗體，F(xiàn)ITC結(jié)合的羊抗兔IgG抗體，以及結(jié)合辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG抗體購自Sigma化學試劑公司(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)。
用SDS-PAGE和免疫雜交分析獲得的濃縮的上清中Tumstatin的表達，方法如前所述(Kalluri,R.等，1996,J.Biol. Chem.271:9062-8)。在12％的分離膠的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行一向SDS-PAGE。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用2％的BSA室溫封閉30分鐘。在封閉了殘余的結(jié)合位點后，用清洗緩沖液清洗膜，在含有1％BSA,1∶1000稀釋的一抗的PBS中溫育。室溫在搖床上溫育過夜。然后用清洗緩沖液清洗膜，用結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗室溫搖床溫育3小時。然后再次清洗雜交膜，加入底物(在0.05M的磷酸鹽緩沖液中含有0.01％的氯化鈷和鎳銨，和對二氨基連苯)并在室溫溫育10分鐘。然后倒出底物溶液，加入含有過氧化氫的底物緩沖液。當顯示出帶之后，用蒸餾水終止反應(yīng)并干燥膜?？梢钥吹揭粭l31 kDa的條帶。
實施例19Tumstatin在293胚胎腎細胞中的表達使用真核載體pcDNA3.1，人Tumstatin可以作為一種分泌的可溶性蛋白質(zhì)在293胚胎腎細胞中表達。這種重組蛋白質(zhì)(不含任何的純化和檢測位點)可以用親和層析進行純化，并用SDS-PAGE和免疫雜交分析從主峰中檢測到一種純的單體形式。
含有α3(Ⅳ)NC1(Neilson,E.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:8402-5)的pDS質(zhì)粒被用于PCR擴增Tumstatin，在此過程中可以加入一段前導(dǎo)肽序列同讀碼框融合到真核表達載體pcDNA3.1(Invitrogen公司，San Diego,California,USA)上。全長α3(Ⅳ)鏈的5’端的前導(dǎo)肽被克隆到NC1區(qū)的5’端以便使蛋白質(zhì)能夠分泌到培養(yǎng)基中。使用側(cè)邊引物對含有Tumstatin的重組載體在兩條鏈上進行測序。進一步純化無錯的cDNA克隆，并用于體外翻譯研究以驗證蛋白質(zhì)的表達。通過氯化鈣法用含有Tumstatin的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293細胞(Sambrook,J.等，1989，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室，Cold Spring Habour,New York,USA,pps.16.32-16.40)。轉(zhuǎn)化的克隆用慶大霉素(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)抗生素篩選。在抗生素存在的情況下培養(yǎng)細胞三周，直至沒有細胞死亡。細胞群落在T-225搖瓶中擴大培養(yǎng)生長直至匯合。然后收集上清并用amicon離心機(Amicon公司)離心濃縮。濃縮的上清用SDS-PAGE，免疫雜交和ELISA方法分析Tumstatin的表達。通過ELISA方法可以探測到上清的強烈結(jié)合。
含有Tumstatin的上清用Tumstatin專一性的抗體進行親和層析(Gunwar,S.等，1991,J.Biol.Chem.266:15318-24)。分離到一個主要的峰含有大約31 kDa的純化的單體，該單體具有對于Tumstatin抗體的免疫活性(抗-α2 NC1抗體，1∶200稀釋)。
實施例20Tumstatin抑制內(nèi)皮細胞增殖使用大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)通過5H-胸腺嘧啶結(jié)合試驗檢測Tumstatin對C-PAE細胞的抗增殖活性。
細胞系和培養(yǎng)物786-0(腎腫瘤細胞系)，PC-3(人前列腺腫瘤細胞系)，C-PAE(牛肺動脈內(nèi)皮細胞系)，MAE(鼠大動脈內(nèi)皮細胞系)獲自美國標準培養(yǎng)物保藏中心。786-0和C-PAE細胞系保藏在DMEM(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)中，ECV-304細胞系在M199中，MAE細胞系在EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)中，培養(yǎng)基中補充有10％的胎牛血清(FCS),100單位/ml的慶大霉素，和100mg/ml的鏈霉素。
增殖試驗.C-PAE細胞生長在含有10％的胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中并保持接觸抑制48小時。C-PAE細胞被用于第二和第四階段。786-0和PC-3細胞在本實驗中被用作非內(nèi)皮細胞的對照。用胰蛋白酶(Life Technologies/Gibco BRL公司，Gaithersberg,Maryland,USA)在37℃消化5分鐘來收集細胞。將在含有0.5％的胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中的12,500個細胞加到用10μg/mlfibronectin包被的24孔板的每一個孔中。在37℃,5％CO2和95％的濕度下培養(yǎng)細胞24小時。移去培養(yǎng)基并用含有0.5％的FCS的DMEM培養(yǎng)基更換。未激活的對照細胞用0.5％的FCS培養(yǎng)。細胞用0.01到10mg/ml濃度的Tumstatin處理。所有孔在開始處理12小時后都加入1毫居的3H-胸腺嘧啶。24小時后，移去培養(yǎng)基并用染色并再次照相(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。觀察十個視野，對管進行計數(shù)并取平均值。
結(jié)果顯示如圖14，該圖顯示了在分別用BSA(□)，Canstatin(■)和α5NC1(○)處理的內(nèi)皮管組織形成數(shù)量與對照(PBS處理)形成的百分比(y軸)?？v軸表示平均值的均方差。結(jié)果顯示相對于對照地Canstatin極大地減少了內(nèi)皮管形成。
Canstatin劑量依賴型地選擇性抑制內(nèi)皮管地形成，在1mg的Canstatin蛋白質(zhì)濃度下能夠接近完全抑制管的形成(圖14)。而對照蛋白質(zhì)，牛血清白蛋白(BSA)，Ⅳ型膠原的α5鏈的NC1區(qū)都對于內(nèi)皮管的形成沒有影響，顯示出在這個試驗中，對于的抑制作用是專一性的，而不是加入蛋白質(zhì)的緣故。這一結(jié)果顯示出Canstatin是一種抗血管生成試劑。
實施例16Canstatin抑制腫瘤的體內(nèi)生長。
從培養(yǎng)物中收集人前列腺癌細胞(PC-3細胞)并將在無菌PBS中的2百萬個細胞皮下注射到7到9周大的SCID雄性鼠體內(nèi)。腫瘤生長4周后，將這些鼠分成4鼠一組。對于試驗組每天皮內(nèi)注射總體積為0.1ml的10mg/kg劑量的Canstatin。對照組每天給予相同體積的PBS。在試驗開始時(0天)，對照小鼠的腫瘤的體積為88-135mm3，而處理的小鼠為108-149mm3。每一組中包括5只小鼠。在給定日期計算的腫瘤體積除以處理的第一天的體積以此獲得微分腫瘤體積(V/V)。結(jié)果顯示在圖15A,該圖顯示的是微分的腫瘤體積(v軸)±標準方差，對處理的天數(shù)(x軸)作圖。相對于對照(□)來說，Canstatin(■)處理的腫瘤體積只有微小的增加。
在另外一個PC-3試驗中，從培養(yǎng)物中收集PC-3細胞并將在3百萬個細胞皮下注射到6到7周大的無胸腺裸鼠體內(nèi)。腫瘤生長大PBS洗孔三次。用1N的NaOH抽提放細胞并加入到含有4mlScirtiVerse Ⅱ溶液(Fisher Scientific公司，Pittsburgh,Pennsylvania,USA)閃爍小瓶中。用閃爍計數(shù)器測量胸腺嘧啶的結(jié)合。
結(jié)果顯示如圖19A和19B。圖19A是一個柱狀圖，顯示了當用不同量的Tumstatin(x軸)處理時，3H-胸腺嘧啶(y軸)與C-PAE細胞(圖19A)，786-0細胞(圖19B)，和PC-3細胞(圖19C)的結(jié)合。各組代表三次的樣。Tumstatin對于20％FCS激活的內(nèi)皮細胞明顯具有劑量依賴型抑制，ED50值為大約0.01mg/ml(如圖19A.)。甚至當劑量上升到20mg/ml時，沒有觀察到對于腎腫瘤細胞(786-0)，或者前列腺腫瘤細胞(PC-3)有明顯的抗增殖作用(如圖19B和19C)。這些內(nèi)皮細胞特異性顯示了Tumstatin可能是一種非常有效的抗血管生成試劑。在Tumstatin(0.1-1.0mg)處理的細胞中和對照細胞中，3H-胸腺嘧啶結(jié)合的平均值的差異時明顯的(P＜0.5)。當用Tumstatin處理PC-3細胞或者786-0細胞時沒有觀察到抑制作用(如圖19B.和19C)。帶有星號標記的數(shù)據(jù)是顯著的，用OneTailed Student’s檢測確認其P＜0.05。
實施例21Tumstatin抑制內(nèi)皮管的生成將基質(zhì)膠(Collaborative Biomedical Products公司，Bedford,Massachusetts,USA)(320ml)加到24孔板的每個孔中并使之聚合(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。將在不含抗生素的EGM-2(Clonetics公司，San Diego,California,USA)培養(yǎng)基中的25,000個鼠大動脈內(nèi)皮細胞(MAE)懸浮物加到鋪有基質(zhì)膠的每個孔中。這些細胞用Tumstatin,BSA或者7S區(qū)以增加的濃度進行處理。對照細胞用無菌的PBS處理。所有的試驗都做三次。細胞在37℃溫育24-28小時并用CK2 Olympus顯微鏡觀察(3.3×目鏡，10×物鏡)。使用400涂有DK的TMAX膠卷照相(Kodak公司)。然后細胞用diff-quik固定劑(Sigma化學試劑公司，St.Louis,Missouri,USA)染色并再次照相(Grant,D.S.等，1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63)。由兩個對于該試驗步驟不了解的觀察者觀察十個視野，對管進行計數(shù)并取平均值。
結(jié)果顯示如圖20。當鼠大動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在基質(zhì)膠，一種鼠基質(zhì)膜的固體膠中時，它們很快排列并形成空的管狀結(jié)構(gòu)(Haralabopoulos,G.C等，1994,Lab.Invest.71:575-82)。由293細胞中產(chǎn)生的Tumstatin，與BSA對照相比，明顯地劑量依賴型抑制MAE細胞中內(nèi)皮管的形成(圖20)。在用1mg/ml的蛋白質(zhì)處理后，內(nèi)皮管形成的百分率BSA為98.0±4.0,Tumstatin為14.0±4.0。使用大腸桿菌產(chǎn)生的Tumstatin也能獲得相同的結(jié)果。Ⅳ型膠原的7S區(qū)(N-末端非膠原區(qū))對于內(nèi)皮管的形成沒有作用。當濃度為800-1000ng/ml時，Tumstatin能夠獲得最大的抑制作用。用Tumstatin(●,0.1到10g/ml)處理的和對照[BSA(□)]，7S區(qū)(○)的平均百分值的差別是明顯的(P＜0.5)。每一點代表平均值±三孔的SE。這個試驗重復(fù)三次。帶有星號標記的小柱是對P＜0.5的結(jié)果所做的后續(xù)試驗。在7S區(qū)處理的試驗中可以觀察到良好形成的管。用0.8mg/ml Tumstatin處理MAE細胞顯示出減少的管的形成。
為評價Tumstatin在體內(nèi)對于新的毛細管形成的作用，進行了基質(zhì)膠植入試驗(Passaniti,A.等，1992，Lab Invest.67:519-29)。自Jackson實驗室(Jackson實驗室，Bar Harbor,Marine,USA)獲得5到6周齡的C57/BL6鼠。將基質(zhì)膠(Collaborative BiomedicalProducts公司，Bedford,Massachusetts,USA)在4℃浸泡過夜。在給C57/BL6鼠注射之前，與20U/ml肝素(Pierce化學公司，Rockdord,Illinois,USA),150ng/ml的bFGF(R&D System公司，Minneapolis,Minnesota,USA)，和1mg/ml的Tumstatin混合。對照組中沒有血管生成抑制劑。用21號的針頭皮下注射基質(zhì)膠混合物。14天后，處死小鼠并取出基質(zhì)膠植入物。用4％的甲醛(PBS中)室溫固定基質(zhì)膠植入物，然后轉(zhuǎn)入中放置24小時。對植入物進行石蠟包埋，切片和H&E染色。在光學顯微鏡下檢查切片并在10個高倍視野中對血管數(shù)進行計數(shù)。所有的切片都是由一個不知道該研究過程的病理學家編號和觀察的。
當植入的基質(zhì)膠含有和肝素時，無論使用的是否是大腸桿菌產(chǎn)生的Tumstatin，用1m/ml的Tumstatin處理都能夠觀察到血管形成的數(shù)目減少了70％。在每個高倍視野下的血管數(shù)目為，Tumstatin,2.25±1.32,和對照，7.50±2.17。每一個柱子代表了每組5-6個小鼠的平均值±SE。Tumstatin(1mg/ml)與用PBS處理的對照比較明顯抑制體內(nèi)的新血管的形成。Tumstatin處理的動物和對照動物的平均百分值的差別是明顯的(P＜0.05)。Tumstatin的處理是明顯的，其P＜0.05是由One Tailed Student’s檢測所確定的。實施例22Tumstatin和Tumstatin突變體抑制體內(nèi)的腫瘤生長收集5百萬個PC-3細胞并皮下注射到7到9周齡的雄性無胸腺裸鼠的背部。使用Vernier卡尺測量腫瘤的長和寬，并用標準的公式長度×寬度2×0.52來計算腫瘤的體積。使腫瘤生長到100mm3，將這些鼠分成5或6鼠一組。給每一試驗組分別用無菌PBS中的Tumstatin或者鼠endostatin每日腹腔注射(20mg/kg)，共注射10天。對照組給予載體注射(BSA或者PBS)。10天后每2或3天計算一次腫瘤的體積。結(jié)果顯示如圖21A，該圖顯示了腫瘤體積(mm3)(y軸)對于用PBS對照(□)，20mg/kg Tumstatin(●)，和20mg/kg endostatin(○)處理天數(shù)(x軸)所作的圖。大腸桿菌中產(chǎn)生的Tumstatin能夠明顯抑制PC-3人前列腺腫瘤細胞的生長(如圖21A)。20mg/kg的Tumstatin和20mg/kg的endostatin能夠同樣抑制腫瘤的生長。在第十天可以明顯地觀察到對于腫瘤生長的抑制作用(對照202.8±50.0mm3，Tumstatin82.9±25.2mm3,endostatin68.9±16.7mm3)。與對照比較，每日注射Tumstatin或者endostatin能夠抑制人前列腺腫瘤細胞(PC-3)的生長。該試驗是當腫瘤體積小于100mm3時開始的。
同時在小鼠中研究了Tumstatin對于另外一種原發(fā)腫瘤的作用。收集2百萬個786-0細胞并皮下注射到7到9周齡的雄性無胸腺裸鼠的背部。使腫瘤生長到大約600mm3到大約700mm3，將這些鼠分成6鼠一組。用在無菌PBS中的Tumstatin每日腹腔注射(6mg/kg)，共注射10天。對照組給予PBS注射。結(jié)果顯示如圖21B，該圖顯示了腫瘤體積(mm3)(y軸)對于用PBS對照(□)，和6mg/kg Tumstatin(●)處理后的天數(shù)(x軸)所作的圖。大腸桿菌中產(chǎn)生的Tumstatin在6mg/kg時能夠明顯抑制PC-3人腎臟腫瘤細胞的生長(如圖21B)。在第十天可以明顯地觀察到對于腫瘤生長的抑制作用(對照1906±179.7mm3,Tumstatin 619±120.7mm3)。與對照比較，每日注射Tumstatin能夠抑制人腎臟腫瘤細胞(786-O)的生長。該試驗是當腫瘤體積為600-700mm3時開始的。每一點代表各組中5-6小鼠的平均值±SE。帶有星號標記的小柱是對P＜0.5的結(jié)果所做的后續(xù)試驗。
Ⅳ型膠原的α3鏈的NC1區(qū)[α3(Ⅳ)NC1]的一部分是Goodpasture綜合癥的病原的抗原決定簇(Butkowski,R.J.等，1987,J.Biol.Chem.262:7874-7；Saus,J.等1988,J.Biol.Chem.263:13374-80；Kalluri,R.等，1991,J.Biol.Chem.266:2401 8-24)。Goodpasture綜合癥是一種自身免疫疾病，表現(xiàn)為肺部出和/或血管球性腎炎(Wilson,C.&F.Dixon,1986,The Kidney,W.B.Sanders公司，Philadelphia,Pennsylvania,USA,pps.880-89；Hudson,B.G.等，1993,J.Biol.Chem.268:16033-6)。這些癥狀是由于抗α3(Ⅳ)NC1的自身抗原的結(jié)合致使腎小球和肺泡的基底膜受到干擾(Wilson,1996,supra；Histon 1993,supra)。有幾個研究小組試圖預(yù)測Goodpasture綜合癥自身抗原在α3(Ⅳ)上的位置[Kalluri.R.等，1995,J.Am.Soc.Nephrol.6:1178-85；Kalluri.R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8；Lery,J.B.等，1997,J.Am.Soc.Nephrol.8:1698-1705；Kefalides,N.A.等，1993,Kidney Int.43:94-100；Quingones,S.等，1992,J.Biol.Chem.267:19780-4(勘誤在269:17358)；Netzer，K.O等，1999,J.Biol.Chem.274:11267-74]，在N端，C端和中間位置的殘基都被報道過是抗原決定簇底位置。最近，更可能的疾病相關(guān)的在N端的病原決定簇被鑒定出來(Hellmark,T.等，1999,Kidney Int.55:936-44)，進一步確定是N端的40個氨基酸。設(shè)計了一種截短了的缺少N端的53個氨基酸的tumstatin(Tumstatin-N53)，與Goodpasture的自身抗原決定簇的病原發(fā)生有關(guān)。該突變蛋白用于如下試驗。
將2百萬個786-0細胞皮下注射到7到9周齡的雄性無胸腺裸鼠的背部。使腫瘤生長到大約大小為100-150mm3，將這些鼠分成5鼠一組。用大腸桿菌中表達的缺少53個N端氨基酸殘基的Tumstatin每日腹腔注射(20mg/kg)，共注射10天。對照小鼠給予PBS注射。結(jié)果顯示如圖22，該圖顯示了腫瘤體積(mm3)的增加(y軸)對于用對照鼠(□)，20mg/kg Tumstatin突變體(●)處理后的天數(shù)(x軸)所作的圖。大腸桿菌中產(chǎn)生的Tumstatin-53在20mg/kg時能夠明顯抑制786-0人腎臟腫瘤細胞的生長(如圖22)。與對照比較，每日注射Tumstatin能夠明顯抑制人腎臟腫瘤細胞(786-O)的生長(第十天對照110.0±29.0mm3,Tumstatin345.0±24.0mm3)。該試驗是當腫瘤體積為600-700mm3時開始的。每一點代表各組中5-6小鼠的平均值±SE。帶有星號標記的數(shù)據(jù)是顯著的，用One Tailed Student’s檢測確定其P＜0.05。
實施例23α3(Ⅳ)NC1和CD31的免疫組化染色分析取7-9周齡的雄性C57/BL6小鼠腎臟與皮膚組織，經(jīng)過處理用于免疫熒光顯微鏡分析。組織樣品用液氮冷凍處理，切成4mm厚的切片備用。組織用如前人所述的間接免疫熒光技術(shù)處理(Kalluri,R.等，1996,J.Biol.Chem.271:9062-8)。冷凍的切片用一抗體，即多克隆抗CD31抗體(1∶100稀釋)或多克隆抗α3(Ⅳ)NC1抗體(1∶50稀釋)染色。然后加二抗，F(xiàn)ITC連接的抗大鼠IgG抗體或FITC連接的抗人IgG抗體。用奧林巴斯熒光顯微鏡(Tokyo，日本)檢查免疫熒光。在陰性對照中，用一不相關(guān)的前免疫血清代替一抗。
小鼠腎臟中，在GBM和血管基底膜中觀察到α3(Ⅳ)NC1的表達。在腎小球內(nèi)皮細胞和血管內(nèi)皮細胞中可觀察到CD31,PECAM-1的表達。在小鼠皮膚中，在上皮基底膜和血管基底膜中沒有α3(Ⅳ)NC1。在皮膚內(nèi)皮細胞中觀察到CD331的表達。在小鼠腎臟腎小球內(nèi)皮細胞和小血管中觀察到CD31的表達。在腎小球基底膜和腎小球外血管基底膜中觀察到α3(Ⅳ)NC1的表達。在小鼠皮膚中，內(nèi)皮小血管中觀察到CD31的表達。在上皮基底膜中沒有α3(Ⅳ)NC1的表達，上皮小血管基底膜中幾乎沒有觀察到α3(Ⅳ)NC1的表達。這些結(jié)果表明canstatin限制分布的實施例。
實施例24抗血管生成蛋白的突變體及片斷Arresten和canstatin蛋白的突變體和片斷用假單胞菌彈性蛋白酶消化(Mariyama等，1992,J.Biol.Chem.267:1253-8)得到。消化產(chǎn)物用凝膠過濾HPLC處理，所得到的片斷用SDS-PAGE電泳分析，用上面描述的內(nèi)皮血管分析法分析評估。這些片斷包括Arresten的12 kDa片斷，Arresten的8 kDa的片斷，canstatin的一個10 kDa的片斷。另外，通過PCR克隆得到兩個canstatin的片斷(“333”和“334”)。
如圖23所示的，如前所述的內(nèi)皮血管分析，兩個Arresten片斷[12 kDa(□)和8 kDa(■)]和canstatin的片斷[19 kDa(▲)]抑制內(nèi)皮血管形成，其效果甚至比Arresten(●)或canstatin(○)還強。圖24表示canstastin片斷333(●)和334(○)的效果一樣比作為對照的canstatin(▲)強，以BSA(■)和α6鏈(□)作為對照。
所有引述的文獻，專利，及專利申請都通過在此引述而全部合并于本文。雖然本發(fā)明在此用實施方案做了特別的說明和描述，但對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在沒有離開權(quán)利要求中的本發(fā)明的實質(zhì)與范圍的條件下，還可以有常規(guī)技術(shù)的各種形式上的及細節(jié)的改變。
權(quán)利要求
1．一種分離的蛋白質(zhì)，選自如下之一Ⅳ型膠原的α1鏈的NC1區(qū)，Ⅳ型膠原的α2鏈的NC1區(qū)，或者Ⅳ型膠原的α3鏈的NC1區(qū)，或者它們的片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體，其中，蛋白質(zhì)、片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體都具有抗血管生成特性。
2．權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)是一種單體。
3．權(quán)利要求2的分離的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)是捕獲肽(Arresten)。
4．權(quán)利要求2的分離的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)是Canstain。
5．權(quán)利要求2的分離的蛋白質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)是Tumstatin。
6．一種權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的多聚體，或者它們的片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體，其中的多聚體具有抗血管生成的特性。
7．一種嵌合蛋白質(zhì)，其包括一種或者多種權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，或者它們的片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體，其中的嵌合蛋白質(zhì)具有抗血管生成的特性。
8．權(quán)利要求7的嵌合蛋白質(zhì)，進一步含有選自至少下列之一的一種蛋白分子endostatin或其片段，angiostatin或其片段，restin或其片段，apomigren或其片段，或者其它的抗血管生成蛋白質(zhì)或其片段。
9． 一種組合物，作為一種生物活性成分，含有一種或者多種權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)。
10．權(quán)利要求9的組合物，以及藥理學上相容的填料。
11．一種組合物，作為一種生物活性成分，含有一種或者多種權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，還含有選自下列的至少一種蛋白質(zhì)分子endostatin或其片段，angiostatin或其片段，restin或其片段，apomigren或其片段，或者其它的抗血管生成蛋白質(zhì)或其片段。
12．一種組合物，作為一種生物活性成分，含有權(quán)利要求6的多聚體。
13．一種組合物，作為一種生物活性成分，含有權(quán)利要求7的嵌合蛋白質(zhì)。
14．一種分離的多聚核苷酸，編碼權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，或者它們的片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體，其中的嵌合蛋白質(zhì)具有抗血管生成的特性。
15．權(quán)利要求14的一種分離的的多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸可操作連接到表達控制序列上。
16．用權(quán)利要求15的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
17．權(quán)利要求16的宿主細胞，其中的宿主細胞選自細菌，酵母，哺乳類，昆蟲或者植物細胞。
18．一種分離的多聚核苷酸，編碼權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)。
19．一種分離的多聚核苷酸，編碼權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)。
20．一種分離的多聚核苷酸，編碼權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)。
21．一種生產(chǎn)權(quán)利要求14的多聚核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞，核甘酸的宿主細胞選自細菌，酵母，哺乳類，昆蟲或者植物細胞；(b)從培養(yǎng)物中純化蛋白質(zhì)；由此生產(chǎn)出權(quán)利要求14的多聚核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
22．一種分離的多聚核苷酸，根據(jù)如下工藝獲得(a)制備一種或者更多的多聚核苷酸探針，該探針在一定條件和適宜的嚴謹度下可與權(quán)利要求14的多聚核苷酸雜交；(b)用該探針與哺乳動物DNA雜交；(c)分離用探針檢測到的DNA多聚核苷酸；核甘酸分離的多聚核苷酸的核苷酸序列與權(quán)利要求14的多聚核苷酸的核苷酸序列一致。
23．給予哺乳動物抗血管生成蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將哺乳動物細胞導(dǎo)入哺乳動物體內(nèi)，所述的哺乳動物細胞已在體外處理以插入權(quán)利要求14的多聚核苷酸，并在該哺乳動物的體內(nèi)表達出有效治療劑量的抗血管生成蛋白質(zhì)，該劑量足以抑制哺乳動物中的血管生成活性。
24．權(quán)利要求23的方法，對抗血管生成蛋白質(zhì)的表達是瞬時表達。
25．權(quán)利要求23的方法，核甘酸的細胞選自血液細胞，TIL細胞，骨髓細胞，血管細胞，腫瘤細胞，肝細胞，肌肉細胞，纖維原細胞。
26．權(quán)利要求25的方法，核甘酸的多聚核苷酸通過病毒載體插入細胞中。
27．特異性結(jié)合權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)、類似物、衍生的同源物、或者它們的突變體的抗體。
28．一種在哺乳動物組織中抑制血管生成活性的方法，該方法包括用一種組合物來處理組織，該組合物含有下列的一種或者幾種權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)、或者它們的片段、類似物、衍生物、或者它們的突變體，權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的多聚體，權(quán)利要求1的片段的多聚體，一種包括一種或者幾種權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的嵌合蛋白質(zhì)，或者一種含有權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)片段的嵌合蛋白質(zhì)。
29．權(quán)利要求28的方法，核甘酸的疾病包括血管生成依賴性腫瘤，良性瘤，風濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病視網(wǎng)膜病，銀屑癬，視覺血管生成疾病，Osler-Webber綜合癥，心肌性血管生成，片狀血管生成，毛細血管擴張，血友病生節(jié)，血管纖維瘤，傷口肉芽，腸粘連，動脈硬化癥，硬皮病，高尿酸血，貓抓熱病，幽門螺旋菌潰瘍，透析移植所致血管狹窄，避孕和肥胖癥。
30．權(quán)利要求29的方法，核甘酸的疾病是腫瘤。
31．使用權(quán)利要求28的組合物抑制有血管增生活性癥狀的疾病，該方法包括對于該疾病的病人給藥，該組合物結(jié)合放射治療、化學治療、和免疫治療。
32．一種多肽，其包含SEQ ID NO:10的第2位到第125位氨基酸，該多肽具有抗血管生成活性。
33．一種編碼權(quán)利要求32的多肽的多聚核苷酸。
34．一種多肽，其包含SEQ ID NO:10的笫125位到第245位氨基酸，該多肽具有抗血管生成活性。
35．一種編碼權(quán)利要求34的多肽的多聚核苷酸。
36．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α1鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過PCR克隆方法而獲得。
37．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α2鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過PCR克隆方法而獲得。
38．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α3鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過PCR克隆方法而獲得。
39．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α1鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過假單胞菌(Pseudomonas)彈性蛋白酶消化方法而獲得。
40．權(quán)利要求39的抗血管生成片段，該片段的大小為12 KDa。
41．權(quán)利要求39的抗血管生成片段，該片段的大小為8 KDa。
42．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α2鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過假單胞菌(Pseudomonas)彈性蛋白酶消化方法而獲得。
43．權(quán)利要求42的抗血管生成片段，該片段的大小為10 KDa。
44．一種具有抗血管生成活性的Ⅳ型膠原的α3鏈的NC1區(qū)片段，該片段通過假單胞菌(Pseudomonas)彈性蛋白酶消化方法而獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗血管生成特性的蛋白,以及使用這些蛋白來抑制血管生成作用。
文檔編號A61K38/00GK1309663SQ99808686
公開日2001年8月22日 申請日期1999年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月17日
發(fā)明者拉格赫阿姆·凱盧里 申請人:貝斯以色列護理醫(yī)療中心