專利名稱：：含Enopeptin的復合制劑及其抑制皮膚色素沉著的醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含Enopeptin和其鹽的復合制劑及其皮膚黑色素沉著抑制劑的醫(yī)藥和美容用途領域。皮膚的顏色主要受表皮色素量的影響。黑色素由黑素細胞產生并釋放給周圍的角質細胞，然后在角化的過程中脫落，從而得以保持表皮內固定的濃度。因此，皮膚的顏色變得均勻，一年之間的膚色變化甚微。但是，黑色素的產生受紫外線和黑素細胞刺激激素(MSH)或老化的刺激，臨床上可以看出皮膚的黑化。若黑化發(fā)生在局部，就會出現(xiàn)與周圍正常皮膚的明顯差別，并可形成色素點，例如雀斑或黃褐斑。這些色素點、雀斑、黃褐斑將隨老齡化而加重或變得很難消退，因而需要有一種藥物或美容護膚品能夠有效預防色斑的形成或使色素點恢復到周圍正常皮膚的顏色。為此目的，一些藥物被推薦，其中的一些已被應用。例如過氧化物被認為有清除黑色素的功能。被應用的類似藥物有氫醌及其衍生物、氯化氨基汞、抗壞血酸、巰基胺類、4-異丙基兒茶酚以及過氧化物(過氧化氫，過氧苯酰)等。但是，這些化合物多不穩(wěn)定且多為化學試劑，并非由生物體產生，對人體存在一定毒性和對肌膚的刺激性，而且防止色素沉積的實際效果不佳。近年來，含具有還原作用的維生素C(L-抗壞血酸)的化妝品已被應用，但維生素C是不穩(wěn)定的而且看來很少明顯效果。在歐洲和美國，應用對苯二酚及其衍生物以及各種兒茶酚治療色素點或作為有色人種皮膚的增白劑。但這些化合物有時可引起刺激和過敏，因此從安全方面考慮是很不令人滿意的。而且，在一些情況下，他們引起白斑，所以很難用作黑色素生成抑制劑(或增白化妝品)，雖被推出但存在安全性問題，且減輕黑色素沉著的實際效果不明顯。Enopeptin為日本HiroyukiOsada在1991年進行抗病毒藥物篩選時發(fā)現(xiàn)的一種新結構縮肽類化合物，其抗菌譜窄，對鼠的急性毒性低(LD50為200mg／kg)，Enopeptin-A對鏈霉菌X59的黑色素合成有強的抑制活性，對黑素瘤B16細胞的黑色素合成也有一定抑制作用且穩(wěn)定性好，對色素沉著有極好的預防和改善活性作用。日本專利JP0565297公開了用鏈霉菌制備生理活性化合物Enopeptin-A，包括水溶劑型產物和該化合物抗菌素藥劑的生產方法。日本專利JP05117298公開了Enopeptin-A和B的制備方法，主要為從鏈霉菌RK-1051發(fā)酵代謝產物中分離出Enopeptin-A和B的技術。日本專利JP064003196和JP064003194公開了與Enopeptin有關的有機物的專利文獻；但上述專利文獻中未見有抑制黑色素生成的報道。本發(fā)明的目的是提供一種能抑制人體黑色素沉著的復方制劑用于預防和治療人體黑色素沉著。本發(fā)明的另一目的是作為美容產品提供人們美容護膚。本發(fā)明所涉及的黑色素抑制劑包含Enopeptin-A或Enopeptin-B。含Enopeptin的黑色素抑制劑可采用各種劑型例如搽劑、乳劑、霜劑、軟膏、貼劑或在有機溶劑中的溶液等。本發(fā)明的黑色素抑制劑還可包含用于各種化妝品的其它任意的輔料。例如油劑、濕潤劑、增稠劑、防腐劑、乳化劑、香料、乳膠穩(wěn)定劑等。由此獲得的本發(fā)明黑色素抑制劑由于其對黑色素生成和引起黑色素的色素沉著有極好的抑制活性可局部應用于患部，例如雀斑、炎癥遺斑、妊娠黑斑，以及防止日曬后肌膚黑色素色斑形成，可用作為外用皮膚增白劑。本發(fā)明的目的是通過下述方式實現(xiàn)的細胞和組織的變性是由于物質代謝障礙，在部分細胞內或間質中發(fā)生形態(tài)結構變化，出現(xiàn)各種異常物質或原有某些物質的堆積過多。過多色素存在組織內稱為色素沉著。黑色素為內生色素，皮膚中黑色素正是由分布于人的表皮基底層細胞間的黑色素細胞所產生，體內從蛋白質分解出來的酪氨酸，進入皮膚的基底層后，經黑色素細胞所含的氧化酶的作用，氧化成顆粒狀的黑色素。人體局部黑色素沉著不僅影響人的美觀，甚至危害人的身心健康。黑色素合成抑制劑可預防和治療人體局部性過量黑色素沉積，如黑痔，雀斑，炎癥遺斑，妊娠黑斑等。人體組織中黑色素形成的生物合成途徑如下由此可見，酪氨酸酶是動物、植物和微生物黑色素生物合成過程中唯一的關鍵酶。近年來，通過用蘑菇酪氨酸酶篩選方法，B16黑素瘤細胞篩選方法，比基尼鏈霉菌篩選方法以及用幼蠶液篩選方法已從天然產物中獲得了一些具有黑色素合成抑制的化合物；如Feldamycin，Melanostatin，OH-3984，Melanoxazal，MR304A等，但到目前為止，未見有將上述化合物制備成黑色素合成抑制劑。發(fā)明人經過實驗發(fā)現(xiàn)Enopeptin在低濃度下通過抑制酪氨酸酶的合成，從而具有抑制黑色素生成的作用，下面通過實驗例對本發(fā)明作進一步地說明。實驗例1Enopetin對鏈霉菌黑色素形成的抑制作用實驗指示菌鏈霉菌X59，由四川省宜賓地區(qū)土壤中分離實驗方法將鏈霉菌X59接種在含有甘油1．5％，L-酪氨酸0．05％，天冬素0．1％，K2HPO40．05％，MgSO40．05％，NaCl0．05％，F(xiàn)eSO40．001％，微量元素溶液0．1ml，pH7．2～7．4的ISP7瓊脂斜面上，于28℃培養(yǎng)5天，無菌水制成一定濃度的孢子懸液，按0．5％接種量接種于凝固的含有0．2％Bacto-酵母膏的ISP7瓊脂平板上，涂布均勻，干燥后，將浸有樣品溶液的無菌紙片(直徑6mm)貼在平板上即采用紙片瓊脂擴散法，置28℃培養(yǎng)4天，從平板背面測定黑色素抑制圈，對照品為四環(huán)素和維基尼亞霉素。實驗結果Enopeptin-A和Enopeptin-B對鏈霉菌X59黑色素合成抑制活性(黑色素抑制圈mm)<tablesid="table1"num="001"><table>25012562．531．251684(μg／ml)Enopeptin-A30282420+-+-Enopeptin-B251914-四環(huán)素抑菌1510維基尼亞霉素抑菌抑菌抑菌6</table></tables>+-活性弱結論Enopeptin-A對鏈霉菌X59黑色素合成抑制活性強于Enopeptin-B，而Enopeptin-A和Enopeptin-B對鏈霉菌X59黑色素合成抑制活性都強于對照組四環(huán)素和維基尼亞霉素。實驗例2Enopeptin-A及Enopeptin-B對黑色素瘤B16細胞黑色素合成的影響細胞株黑色素瘤B16BL6，實驗方法取生長良好的細胞用胰酶消化后計數(shù)，配成濃度為5×105／ml的細胞液，每瓶接種4ml；第二天加藥，每濃度2瓶；給藥72小時后用0．25％胰酶消化細胞，然后用1ml完全培養(yǎng)基沖洗細胞放入離心管；臺盼藍染色，活細胞計數(shù)；離心，用1×PBS洗2遍；加1ml裂解液，室溫靜置30分鐘，用紫外分光光度計測OD470。計算1×106個細胞含黑色素的量。實驗結果<tablesid="table2"num="002"><table>樣品編號濃度(μg／ml)抑制合成(％)樣品編號濃度(μg／ml)抑制合成(％)Enopeptin-A0．000019543．9Enopeptin-B0．00007848．90．00007827．00．00031346．80．00031328．40．0012534．60．0012522．60．00533．70．00514．00．0231．30．0217．90．080．70．081．5</table></tables>結論兩樣品均在低濃度時有抑制黑色素瘤產生黑色素的作用。Enopeptin-A在0．078ng／ml時對黑色素瘤細胞的黑色素合成抑制率為48．9％。制劑實施例1含Enopeptin-A乳膏的制備油相Enopeptin-A活性物質0．1～1000μg硬脂酸90g硬脂醇36g月桂氮卓酮(脂溶性)2g硬脂酸丁酯72g吐溫-8012g水相1，2-丙二醇100g甘油60gLGP-002(防腐劑)1g水加足至油水相共計1000g按處方比例分別稱量，將油相、水相分別于75-85℃水浴上加熱，攪拌，熔化再將油相緩緩加入水相中，邊加邊攪拌待乳化完全，攪拌至冷凝，分裝即得。制劑實施例2含Enopeptin-A的溶液劑Enopeptin-A活性物質0．03-1000μg溶劑(二甲基亞砜、水、丙二醇)共制成1000ml防腐劑(LGP-002，山梨酸鉀等)適量將活性物質加入二甲基亞砜溶解后，再加入丙二醇、水、防腐劑至1000ml。制劑實施例3含Enopeptin-A的膜劑Enopeptin-A活性物質0．03-1000μg溶劑(二甲基亞砜、丙二醇等)2-20％著色劑(色素、TiO2等)0．1-2％成膜材料(PVA、KVP、阿拉伯膠等)30-40％表面活性劑(吐溫-80、十二烷基硫酸鈉等)1-2％填充劑(液體石蠟等)適量將精制的成膜材料溶解于水中，濾過，加入已溶解的主藥，充分攪拌溶解，再制膜，切割一定尺寸的膜片，用紙或聚乙烯薄膜包裝。成膜材料漿液配制-加入已溶解的主藥、著色劑等-脫泡-涂膜-干燥-脫膜-含量測定-包裝制劑實施例4含Enopeptin-A的凝膠劑Enopeptin-A活性物質0．03-1000μg液體石蠟5-20％非離子表面活性劑1-25％防腐劑(LGP-002、苯甲酸等)適量溶劑(二甲基亞砜、水等)加至1000g非離子表面活性劑聚氧乙烯(4)月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯。制劑實施例5含Enopeptin-A的搽劑Enopeptin-A活性物質0．03-1000μg穩(wěn)定劑芳香劑(乳酸乙酯等)適量助溶劑(三乙二醇月桂酸酯、二甲基亞砜)2-20％PEG-200(表面活性劑)1-20％1，2-丙二醇(溶劑)10-40％水加至1000ml將主藥溶在二甲基亞砜等中，再加入溶劑1，2-丙二醇再加入穩(wěn)定劑表面活性劑，加水至1000ml。制劑實施例6含Enopeptin-A的凝膠劑Enopeptin-A活性物質0．03-1000μg液體石蠟5-30％非離子表面活性劑[聚氧乙烯(4)月桂酸酯]1-2％甘油1-10％1，2-丙二醇10-20％聚苯乙烯1-40％權利要求1．一種包含Enopeptin-A或其鹽為活性有效成分與人體耐受的各種輔劑結合組成的抑制人體皮膚黑色素沉著的藥物制劑。2．如權利要求1所述的藥物制劑，包含Enopeptin-A或其鹽為有效成分；與人體耐受的輔劑如硬脂酸、硬脂醇、月桂氮卓酮、硬脂酸丁酯、吐溫-80、1，2-丙二醇、甘油、防腐劑LGP-002、水混合組成乳膏。3．一種包含Enopeptin-B或其鹽為活性有效成分和人體耐受的各種輔劑結合組成的抑制人體皮膚黑色素沉著的藥物制劑。全文摘要本發(fā)明公開了Enopeptin－A和Enopeptin－B在低濃度下具有抑制黑色素合成的活性以及采用Enopeptin－A和Enopeptin－B作為活性成分和人體耐受的各種輔劑結合制備可抑制黑色素色斑生成的復合制劑的方法和其醫(yī)療及美容護膚用途。文檔編號A61K38/02GK1280009SQ9911740公開日2001年1月17日申請日期1999年12月1日優(yōu)先權日1999年7月7日發(fā)明者田敏,陸群,劉瑜,俞朵申請人:國家藥品監(jiān)督管理局四川抗菌素工業(yè)研究所