專利名稱：去飽和酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的去飽和酶及其用途。
在過去的幾年里，已經(jīng)從高等植物(最值得注意的是鼠耳芥擬南芥菜(Arabidopsisthaliana))分離出許多微粒體和可溶性脂肪酸去飽和酶。這是用基因和生物化學(xué)的組合方法來產(chǎn)生和補(bǔ)充脂肪酸去飽和作用或延伸作用缺陷的突變型擬南芥菜而得到的(Somerville C，Browse J(1996)Trends Cell Biol.6，148-1153)。該方法的重要性通過分離并特性分析了編碼微粒體去飽和酶的基因而得到證實(shí)，這些去飽和酶例如是Δ12去飽和酶(Okuley J.等人，(1994)，Plant Cell 6.147-158)和Δ15去飽和酶(Arondel V，等人，(1992)Science 258，1353-1355)，它們分別由FAD2和FAD3基因編碼，在以前由于這些酶具有疏水性，因此很難采用經(jīng)典的純化技術(shù)獲得。分離了這些酶及相關(guān)的酶(例如蓖麻的Δ12羥化酶(van de Loo FN等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，6743-6747))，就能鑒定植物微粒體去飽和酶中許多保守的基序，其中最值得注意的是所謂的“組氨酸盒”(Shanklin，J等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，674306747)。含有這些基序的蛋白質(zhì)可歸類為含有兩個(gè)鐵中心的酶(Shanklin，J等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，2981-1986)。
WO93/11245(Du Pont)公開了從各種植物中分離出的編碼去飽和酶、尤其是Δ12和Δ15去飽和酶的各種核酸片段。最近，通過對(duì)這些組氨酸基序進(jìn)行高度簡(jiǎn)并的PCR，從積累γ-亞油酸(GLA)的植物琉璃苣(Borago officinalis)中分離出一個(gè)cDNA克隆。US5614393(Rhone-Poulenc Agrochimie)公開并要求了琉璃苣Δ6去飽和酶核苷酸序列的專利。盡管其說明書提示本領(lǐng)域技術(shù)人員可以毫不困難地從動(dòng)物細(xì)胞中分離出編碼Δ6去飽和酶的核酸，但是卻沒有指出合適的動(dòng)物細(xì)胞(與提示真菌和細(xì)菌細(xì)胞相反)，也沒有公開從動(dòng)物細(xì)胞分離這些核酸的技術(shù)。該分離的DNA克隆在轉(zhuǎn)基因煙草中顯示為異源表達(dá)，編碼一個(gè)微粒體Δ6去飽和酶(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)。Δ6位的去飽和作用是高等植物中不同尋常的修飾，只發(fā)生于種子和/或葉子中積累Δ6-不飽和脂肪酸GLA和十八碳四烯酸(OTA∶18∶4Δ6，9，12，15，也稱為硬脂四烯酸(stearidonic acid))的少數(shù)植物如琉璃苣、月見草(月見草屬)和紅漿果(茶藨子屬)中。
GLA是一種高價(jià)值的植物脂肪酸，廣泛用于治療多種醫(yī)學(xué)疾病，包括濕疹和乳腺痛?，F(xiàn)假定，GLA的應(yīng)用代替了內(nèi)源Δ6-不飽和脂肪酸的損失或滿足了對(duì)內(nèi)源Δ6-不飽和脂肪酸的增加的需要(Horrobin，D.F.(1990)Rev.Contemp.Pharmacother.11-45)。
為了參考目的，圖5簡(jiǎn)單地示出了認(rèn)為在某些生物(包括人)中發(fā)生并涉及Δ6去飽和酶的代謝途徑?？梢钥闯?，GLA可以在Δ6去飽和酶作用下體內(nèi)由亞油酸合成，而GLA可用來合成二高-GLA，而后者能在Δ5去飽和酶作用下轉(zhuǎn)變成花生四烯酸?；ㄉ南┧崾歉鞣N重要的類二十烷酸(包括前列腺素和白三烯)的前體。Δ6去飽和酶還將α亞油酸轉(zhuǎn)變成OTA。因此，Δ6去飽和酶顯然是這些生物活性分子生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵步驟(見圖5)。
以前分離的琉璃苣微粒體Δ6去飽和酶的序列與以前鑒定的植物微粒體去飽和酶/羥化酶的不同之處在于它含有與細(xì)胞色素b5同源的N-端延伸序列，而且第三個(gè)(最靠C端)組氨酸盒與共有序列H-X-X-H-H(Shanklin H等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，2981-1986)不同，以谷氨酰胺替代了第一個(gè)組氨酸。發(fā)現(xiàn)在藍(lán)細(xì)菌集胞藍(lán)細(xì)菌Δ6去飽和酶(GenBank IDL11421)情況下也是如此。WO93/06712(Rhone PoulencAgrochimie)公開了一種編碼分離自集胞藍(lán)細(xì)菌屬的Δ6去飽和酶的分離的核酸，并要求了該細(xì)菌Δ6去飽和酶及其應(yīng)用的專利權(quán)。
盡管Δ6脂肪酸去飽和酶作用在高等植物中是不同尋常的修飾，但是認(rèn)為它在動(dòng)物中是共同的。類二十烷酸(包括前列腺素和白三烯)生物合成途徑的第一步是必需脂肪酸亞油酸(18∶2Δ9，12)受Δ6去飽和酶作用去飽和形成GLA。這導(dǎo)致GLA迅速代謝(成為二高-GLA和花生四烯酸；即分別是20∶3Δ8，11，14和20∶4Δ5，8，11，14)。因此通常觀察不到GLA的積累。
線蟲Caenorhabitis elegans是非常有用的，因?yàn)樗倪z傳學(xué)被充分了解，并且與高等動(dòng)物(如人)有許多相似之處，因此非常適合用來開發(fā)用于這些動(dòng)物的去飽和酶。
本發(fā)明提供了具有去飽和酶活性的多肽，它包含

圖1所示的氨基酸序列。
圖1所示的氨基酸序列是存在于線蟲Caenorhabitis elegans中的Δ6去飽和酶的序列。這是非常有意義的，因?yàn)樵诒景l(fā)明之前沒有報(bào)道對(duì)動(dòng)物Δ6去飽和酶的成功測(cè)序和純化。由于C.elegans不積累GLA，因此從此線蟲分離Δ6去飽和酶對(duì)分離去飽和酶基因而言它是一個(gè)未曾想到的目標(biāo)。
本發(fā)明的去飽和酶與已知的去飽和酶明顯不同。經(jīng)用BESTFIT程序測(cè)定，本發(fā)明的Δ6去飽和酶與WO93/11245中描述的擬南芥菜的微粒體Δ12和Δ15去飽和酶之間的同源性分別為24％和16％。本發(fā)明的Δ6去飽和酶基因與Spychalla，J.P.等人Proc.Natl.Acad.Sci 94 1142-1147中描述的C.elegans FAT-1去飽和酶只有21％的相同性。本發(fā)明的Δ6去飽和酶與WO93/06712中的集胞藍(lán)細(xì)菌屬之間的序列同源性只有23％。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種分離的動(dòng)物Δ6去飽和酶。
圖1所示的氨基酸序列也是有意義的，因?yàn)槠渑c琉璃苣Δ6去飽和酶(在本發(fā)明之前僅有的另一個(gè)經(jīng)測(cè)序的真核生物Δ6去飽和酶)的序列相同性非常低實(shí)際上，該序列相同性低于32％。在如此低的相同性水平下，預(yù)計(jì)這兩種多肽將具有完全不同的功能。出乎意料的是，兩者均具有去飽和酶活性。
然而，本發(fā)明并不局限于具有圖1所示序列的Δ6去飽和酶。它還包括與其序列相同性至少為32％的其它去飽和酶。本發(fā)明的較佳的多肽與圖1所示序列有至少40％(更佳的至少50％)的氨基酸序列相同性。更佳的該序列相同性程度至少為75％。序列相同性為至少90％、至少95％或至少99％是最佳的。
出于本發(fā)明的目的，可用Wisconsin序列分析軟件包GCG 8.0的“BESTFIT”程序來測(cè)定序列相同性(無論是氨基酸還是核苷酸)。
當(dāng)有高度序列相同性時(shí)，氨基酸序列的差別可能相當(dāng)少。因此，例如可能少于20、10或甚至不到5個(gè)差別。
上述的多肽片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要它們具有去飽和酶活性，也就是說它們具有將雙鍵導(dǎo)入底物特定位置的能力(通過GCMS測(cè)定)，這是活性的最低限度。這些片段宜至少長(zhǎng)100個(gè)氨基酸。更佳的，該片段至少長(zhǎng)150個(gè)氨基酸。
總之，本發(fā)明的多肽具有去飽和酶活性，并且a)包含圖1所示氨基酸序列；b)相對(duì)于上述a)中定義的多肽有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入或替換，但是與該多態(tài)的氨基酸序列相同性至少為32％；或c)是上述a)或b)中確定的多肽的片段，其長(zhǎng)度至少有100個(gè)氨基酸。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”廣義上指包含由肽鍵連接在一起的多個(gè)氨基酸的特定分子。因此，其范圍內(nèi)包括的物質(zhì)有時(shí)在文獻(xiàn)中稱為肽、多肽或蛋白質(zhì)。
理想的是本發(fā)明的多肽具有一個(gè)細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域可以定義為含有一個(gè)血紅素輔基的電子運(yùn)送結(jié)構(gòu)域。較佳的是存在一個(gè)細(xì)胞色素b結(jié)構(gòu)域。更佳的是存在細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域(理想的是它包括H-P-G-G-X15-F-X3-6-H基序，其中X是任何氨基酸)。細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域存在于圖2B所示的琉璃苣Δ6去飽和酶和C.elegansΔ6去飽和酶氨基酸序列中。細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域宜為N-端結(jié)構(gòu)域—即它距去飽和酶的N端比C端近。這與其它去飽和酶相反。例如，酵母Δ9去飽和酶具有C-端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域，而植物Δ12和Δ15去飽和酶沒有任何b5結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的多肽宜具有一個(gè)或多個(gè)(最佳的有三個(gè))組氨酸盒。其中一個(gè)可能有H→Q替換。(這提供了認(rèn)為在一定范圍的動(dòng)物/植物種類中保守的一種組氨酸盒的變體。)本發(fā)明的多肽可以具有任何區(qū)域特異性(包括順/反活性)，但是較佳的它們是在C3和C7位(從基團(tuán)的COOH(Δ尾端)來計(jì)算)之間引入雙鍵的前端去飽和酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易通過測(cè)定去飽和酶引入的雙鍵的不同位置來區(qū)別不同的去飽和酶。這可用已知的分析技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如采用氣相色譜和質(zhì)譜法。
特別佳的去飽和酶是Δ6去飽和酶。
理想的是該去飽和酶天然存在于不積累GLA的一種或多種生物中(即此生物能產(chǎn)生GLA，但是GLA通常不能被檢測(cè)到，因?yàn)樗环浅Ｑ杆俚拇x掉)。這些去飽和酶可能天然存在于一種或多種動(dòng)物中。這些去飽和酶天然存在于一種或多種線蟲中，例如C.elegans中。
為了更全面地了解本發(fā)明的范圍，現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述在上述a)、b)和c)范圍內(nèi)的多肽。
范圍a)內(nèi)的多肽范圍a)內(nèi)的多肽可由圖1所示氨基酸序列組成，或可以具有一個(gè)額外的N端和/或一個(gè)額外的C端氨基酸序列。
額外的N端或C端序列可因各種理由而提供，提供這些額外序列的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。這些技術(shù)包括采用基因-克隆技術(shù)，從而將核酸分子連接在一起，然后用來在合適宿主中表達(dá)多肽。
為了改變特定多肽的特征，可以提供額外的序列。這可用于在特定表達(dá)系統(tǒng)中改進(jìn)表達(dá)或調(diào)節(jié)表達(dá)。例如，此額外的序列可以提供保護(hù)作用防止蛋白水解切割。
額外的序列還可用來改變多肽的性質(zhì)以幫助鑒定或純化。例如，可以由一個(gè)信號(hào)序列來指導(dǎo)多肽運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)的特定位置，或?qū)⒍嚯倪\(yùn)輸出細(xì)胞。不同的信號(hào)序列可用于不同的表達(dá)系統(tǒng)。
提供額外序列的另一個(gè)例子是使多肽與能被親和層析分離的部分連接。該部分可能是一個(gè)表位，而親和柱可包含結(jié)合所述表位(理想的是以高度特異性結(jié)合)的固定的抗體或固定的抗體片段。所得融合蛋白通?？赏ㄟ^加入合適的緩沖液來洗脫下柱。
然而，額外的N-端或C-端序列的存在僅僅是作為用來獲得本發(fā)明多肽的一種特定技術(shù)的結(jié)果，而不需要提供特定的有利特征。
范圍b)內(nèi)的多肽現(xiàn)在看上述b)中確定的多肽，應(yīng)理解這些多肽是上述a)中給出的多肽的變體。
通?？梢詫?duì)具有所需性質(zhì)的多肽氨基酸序列進(jìn)行各種改變，以便產(chǎn)生仍然具有該性質(zhì)的變體。上文a)中描述的多肽的這些變體在本發(fā)明范圍內(nèi)，并且在下文章節(jié)(ⅰ)至(ⅲ)中有更詳細(xì)的討論。它們包括等位基因和非等位基因變體。
(ⅰ)替換本發(fā)明變體的一個(gè)例子是上文a)中確定的多肽，只是有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其它的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，不同的氨基酸可具有相似的性質(zhì)。多肽中的一個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸通?？梢员灰粋€(gè)或多個(gè)其它的氨基酸替換而不至于除去該多肽的所需性質(zhì)(如去飽和酶活性)。
例如，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)通?？上嗷ヌ鎿Q。在這些可能的替換中，較佳的是甘氨酸和丙氨酸之間相互替換(因?yàn)樗鼈兙哂休^短的側(cè)鏈)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間相互替換(因?yàn)樗鼈兙哂休^長(zhǎng)的疏水性脂肪族側(cè)鏈)。其它?？上嗷ブg替換的氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。
具有該特征的替換通常稱為“保守的”或“半保守的”氨基酸替換。
(ⅱ)缺失氨基酸缺失是可能有利的，因?yàn)檫@樣可以減少多肽的整體長(zhǎng)度和分子量而仍維持所需的活性。這樣能使特定目的所需的多肽數(shù)目減少。
(ⅲ)插入還可對(duì)上文a)中定義的多肽作氨基酸插入。插入可能改變?cè)摱嚯牡男再|(zhì)(例如有助于鑒定、純化或表達(dá))。
相對(duì)于上文a)定義的多肽序列摻入氨基酸變化(無論是替代、缺失還是插入)的多肽可用任何合適的技術(shù)來提供。例如，可通過定點(diǎn)誘變提供摻入所需序列變化的核酸序列。然后可用它來表達(dá)氨基酸序列中具有相應(yīng)改變的多肽。
范圍c)內(nèi)的多肽如上所述，減少多肽長(zhǎng)度通常是有利的。因此，本發(fā)明的特征c)包括了長(zhǎng)度至少有100個(gè)氨基酸、但不需要象圖1所示全長(zhǎng)多肽那樣長(zhǎng)的上述a)或b)的多肽的片段。理想的是這些片段的氨基酸長(zhǎng)度至少有200個(gè)，至少有300個(gè)或至少有400個(gè)。
現(xiàn)在將參照實(shí)施例來描述本發(fā)明多肽的各種用途。
可用本發(fā)明的多肽來獲得有用的分子。例如，Δ6去飽和酶可用來獲得γ-亞麻酸(GLA)或GLA是前體的代謝物。例如，可通過α-亞麻酸的Δ6去飽和作用來產(chǎn)生十八碳四烯酸(OTA；18∶4Δ6，9，12，15，n-3(或ω-3)脂肪酸的一個(gè)成員)。
GLA、OTA及其代謝物可用作藥品。它們可用來制備一種藥劑，該藥劑可用來治療涉及缺乏GLA或GLA體內(nèi)衍生的代謝物(例如類二十烷酸)的疾病?？芍委煹募膊“裾?、乳腺痛、高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病性神經(jīng)病、病毒性感染、痤瘡、高血壓、肝硬化和癌癥。
這些代謝物可由合適的宿主在體內(nèi)或體外產(chǎn)生。
當(dāng)在體外產(chǎn)生代謝物時(shí)，通常是分開提供本發(fā)明的去飽和酶及其底物，然后在希望產(chǎn)生該代謝物的時(shí)候?qū)⑺鼈兒喜?。因此，本發(fā)明的范圍包括一種制備GLA或OTA的方法，該方法包括用本發(fā)明的Δ6去飽和酶將亞油酸底物或α-亞麻酸底物分別轉(zhuǎn)變成GLA或OTA。
當(dāng)代謝物在諸如植物或動(dòng)物的生物中產(chǎn)生時(shí)，通常由有關(guān)的非人生物本身來提供本發(fā)明的去飽和酶底物。因此，代謝物的體內(nèi)產(chǎn)生可通過將編碼本發(fā)明去飽和酶的基因插入生物中并使該生物表達(dá)去飽和酶來實(shí)現(xiàn)。然后該去飽和酶作用于其底物。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽可用來在通常不具有這種活性的生物中提供去飽和酶活性，或在已經(jīng)具有一些去飽和酶活性的生物中提高去飽和酶活性的水平。如果需要，可以從這種生物中純化有用的代謝物?；蛘?，該生物本身可直接用作代謝物來源。下面將討論可用來提供具有去飽和酶活性的轉(zhuǎn)基因生物的特定的克隆技術(shù)。
本發(fā)明的多肽還可用作生物轉(zhuǎn)化作用的指示劑。例如，如果待轉(zhuǎn)化的生物不具有特定的去飽和酶以及用于轉(zhuǎn)化的編碼該去飽和酶的核酸，則在嘗試性轉(zhuǎn)化后可以進(jìn)行試驗(yàn)來確定去飽和酶是否存在。因此，在Δ6去飽和酶情況下，可進(jìn)行測(cè)定GLA存在的試驗(yàn)，GLA可作為簡(jiǎn)單的標(biāo)記來確定含有Δ6去飽和酶編碼序列的功能性轉(zhuǎn)基因盒的存在。
本發(fā)明的另一個(gè)用途是提供抗體。本發(fā)明的范圍包括結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。
較佳的抗體可特異性結(jié)合本發(fā)明多肽，因此可用來純化這些多肽。(例如可將它們固定并用來結(jié)合本發(fā)明的多肽。然后通過用合適的洗脫劑在合適的條件下進(jìn)行洗滌來洗脫該多肽。)本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體或其衍生物可用于診斷。例如，采用這種抗體或衍生物的結(jié)合試驗(yàn)可用來確定是否存在特定的去飽和酶。這可用來診斷由于缺乏功能性去飽和酶而引起的疾病。
本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
多克隆抗體可以這樣產(chǎn)生將本發(fā)明的多肽注射入動(dòng)物體內(nèi)，在合適的動(dòng)物宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、綿羊、山羊或猴子)中刺激該抗體生成。如果需要，一種佐劑可以和本發(fā)明多肽一起給予。然后，利用抗體與本發(fā)明多肽的結(jié)合，純化該抗體。
單克隆抗體可從雜交瘤產(chǎn)生。這些雜交瘤可通過將骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生所需抗體的脾細(xì)胞融合來形成，以形成無限增殖的細(xì)胞系。因此，可以采用眾所周知的Kohler&Milstein技術(shù)(Nature 256 52-55(1975))或該技術(shù)的變化方案。
現(xiàn)在，用來產(chǎn)生結(jié)合特定多肽的單克隆和多克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中已經(jīng)很好地建立。它們?cè)诿庖邔W(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書中有所討論，例如Roitt等人，《免疫學(xué)》第2版(1989)，Churchill Livingstone，London。
除了全抗體，本發(fā)明還包括能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體衍生物。因此，本發(fā)明包括抗體片段和合成的構(gòu)建物。Dougall等人在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中給出了抗體片段和合成構(gòu)建物的例子。
抗體片(段例)如包括Fab，F(xiàn)(ab′)2和Fv片段。(這些在上文的Roitt等人的書中有所描述)?？蓪?duì)Fv片段進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生稱為單鏈Fv(scFv)分子的合成構(gòu)建物。這包括共價(jià)連接Vh和V1區(qū)的肽接頭，該接頭賦予分子穩(wěn)定性?？刹捎玫钠渌铣蓸?gòu)建物包括CDR肽。這些是包含抗原結(jié)合決定簇的合成的肽。還可采用肽模擬物。這些分子通常是構(gòu)型受到限制的有機(jī)環(huán)，它模擬了CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)并包括與抗原相互作用的側(cè)鏈。
合成的構(gòu)建物包括嵌合分子。因此，例如人化(或靈長(zhǎng)化)抗體或其衍生物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。人化抗體的一個(gè)例子是具有人構(gòu)架區(qū)、但有嚙齒類動(dòng)物超變區(qū)的抗體。
合成的構(gòu)建物還包括包含額外部分的分子，該額外部分除抗原結(jié)合性外還為分子提供了某些所需的性質(zhì)。例如該部分可能是一個(gè)標(biāo)記(例如熒光或放射活性標(biāo)記)?；蛘撸赡苁且环N藥物活性劑。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括核酸分子。
這些核酸分子a)編碼本發(fā)明的多肽；或b)與上文a)定義的分子互補(bǔ)；或c)與上文a)或b)定義的分子雜交。
這些核酸分子及其用途在下文有更詳細(xì)的討論考慮到熟知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性，本發(fā)明的多肽可以由多種核酸分子編碼。所有這些編碼核酸分子均在本發(fā)明范圍內(nèi)。較佳的編碼核酸分子編碼了圖1所示的多肽。它們包括含有圖1所示編碼序列的核酸分子及其簡(jiǎn)并性變體。
核酸分子可以直接使用?；蛘?，它們可被插入載體中。
核酸或含有該核酸的載體可用于克隆。它們可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來導(dǎo)入非人宿主中，從而能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽。另外，可以采用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
用來克隆、表達(dá)和純化多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。各種這些技術(shù)公開在標(biāo)準(zhǔn)的教科書中，例如Sambrook等人《分子克隆》第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Old&Primrose《基因操作理論》第5版，Blackwell ScientificPublications(1994)；以及Stryer《生物化學(xué)》第4版，W H Freeman and Company(1995)。
利用合適的表達(dá)系統(tǒng)，可以產(chǎn)生所需形式的多肽。例如，多肽可以由微生物(如細(xì)菌或酵母)、培育的昆蟲細(xì)胞(可能是被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)產(chǎn)生。
然而，較佳的宿主是植物或植物的繁殖性物質(zhì)，例如油菜、向日葵、谷類包括玉米、煙草、莢果包括花生和大豆、紅花、油棕、椰子和其它棕櫚、棉花、芝麻、芥菜、亞麻籽、蓖麻、琉璃苣和月見草，或它們的繁殖性物質(zhì)。
現(xiàn)在，提供植物或植物繁殖性物質(zhì)的技術(shù)已經(jīng)很好地建立了。該技術(shù)例如在WO96/21022中有所討論。從動(dòng)物中分離出的去飽和酶已經(jīng)成功地在植物中表達(dá)。例如，Spychalla，J.P.等人(見上文)描述了在轉(zhuǎn)基因擬南芥菜中表達(dá)C.elegans去飽和酶。另外，EP0550162(Pioneer Hi-Bred International，Inc)公開了從轉(zhuǎn)化了產(chǎn)生脂肪酸的構(gòu)建物的大鼠和植物中分離的編碼Δ9去飽和酶的嵌合基因構(gòu)建物。該出版物中描述的去飽和酶與本發(fā)明的Δ6去飽和酶只有22％的相同性。
下面討論可采用的特定技術(shù)。當(dāng)然應(yīng)理解這些技術(shù)沒有限制性。
(ⅰ)基于根癌農(nóng)桿菌的載體系統(tǒng)它們包括Ti為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，例如pGV3850，其中T-DNA已經(jīng)被拆除。需要的是存在一個(gè)可選擇的標(biāo)記(例如提供抗生素抗性的標(biāo)記)。
還可采用中間載體(Ⅳ)。它們很小，因此比大的Ti為基礎(chǔ)的載體更容易操縱。Ⅳ通常是由克隆到大腸桿菌衍生的質(zhì)粒載體(如pBR322)的T-DNA產(chǎn)生的載體。Ⅳ通常是接合缺陷型的，因此可以采用精通接合的質(zhì)粒(例如pRK2013)來移動(dòng)Ⅳ，從而使它能轉(zhuǎn)移到土壤桿菌接受者中。然后在土壤桿菌中會(huì)發(fā)生體內(nèi)同源重組，以使Ⅳ插入一個(gè)殘留的、拆除的Ti質(zhì)粒中，以便產(chǎn)生一個(gè)在土壤中能自主復(fù)制的共合體。
另一種變化方案是采用雙元Ti載體。這里，可以在大腸桿菌(如pRK252)中復(fù)制的小質(zhì)粒上提供攜帶外來DNA的修飾的T-DNA區(qū)。然后，通過三親交配，將該質(zhì)粒(有時(shí)稱為微小Ti(mini-Ti或micro-Ti))偶聯(lián)轉(zhuǎn)移到含有相容vir基因的根癌農(nóng)桿菌(以反式提供vir功能)中。
甚至還可采用沒有Ti序列的雙元載體。在這里可以用細(xì)菌mob和oriT功能來促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。同樣，可以反式提供vir功能。
上述載體系統(tǒng)可用Horsch等人(Science 227，119-31(1985))的方法或其變化方案來將基因轉(zhuǎn)移到植物。在這里，可以從雙子葉植物葉片上沖下小圓片，對(duì)它們進(jìn)行表面消毒，然后放在包含根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中，該根癌農(nóng)桿菌含有重組T-DNA，在T-DNA中待轉(zhuǎn)移的外來基因伴有一個(gè)可選擇標(biāo)記(例如neo基因)。然后培育這些圓片2天，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中篩選可選擇的標(biāo)記。(對(duì)于neo可選擇標(biāo)記，可以用含卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn))。用含有羧芐青霉素的培養(yǎng)基殺死根癌農(nóng)桿菌。芽苗通常在2-4周后從胼胝體發(fā)育。然后將它們切下，在大到足以移植到土壤中時(shí)，移植到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中。
(ⅱ)基于發(fā)根土壤桿菌的載體系統(tǒng)這些系統(tǒng)包括Ri衍生的質(zhì)粒。通常認(rèn)為Ri T-DNA是無害的，因此這些質(zhì)?？烧J(rèn)為與拆除的Ti質(zhì)粒等效?，F(xiàn)已建立了基于Ri質(zhì)粒的Ⅳ共合體系統(tǒng)。
(ⅲ)基于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的植物原生質(zhì)體適用的技術(shù)在H.Jones編輯的《植物基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法》Human Press Methodsin Molecular Biology，49，1995中有所描述。
植物的轉(zhuǎn)化可通過除去植物細(xì)胞壁提供原生質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞壁可用任何合適的方法來除去，這些方法包括機(jī)械破碎或用溶解細(xì)胞和分解果膠的酶進(jìn)行處理。然后可通過離心將原生質(zhì)體與其它組分分離，然后用諸如電穿孔的技術(shù)用異源DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。在合適的培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體將長(zhǎng)出新的細(xì)胞壁并且同樣分裂。然后可以誘導(dǎo)莖干和根，形成小植株。
(ⅳ)生物溶解素的轉(zhuǎn)染可用攜帶DNA或RNA的高速微粒將該DNA或RNA輸送入植物細(xì)胞中。這種技術(shù)可以產(chǎn)生各種各樣的轉(zhuǎn)基因植物，并且適合單子葉植物和雙子葉植物。例如，可以采用包被了DNA或RNA的金或鎢顆粒。發(fā)射微粒的合適裝置包括火藥為基礎(chǔ)的裝置、電荷為基礎(chǔ)的裝置和風(fēng)動(dòng)裝置。
(ⅴ)病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)DNA植物病毒載體包括花椰菜花葉病毒(它感染一定范圍的雙子葉植物)和雙粒病毒組(它們感染各種雙子葉植物和單子葉植物)。RNA植物病毒占多數(shù)，它們包括雀麥草花葉病毒(它感染許多禾本科植物，包括大麥)和煙草花葉病毒(它感染煙草植物)。
從前文描述的內(nèi)容可以理解，編碼本發(fā)明多肽的核酸分子可以在各種生物中克隆和表達(dá)。
除了編碼本發(fā)明多肽的核酸分子(在文中稱為“編碼性”核酸分子)外，本發(fā)明還包括與其互補(bǔ)的核酸分子。因此，例如雙鏈核酸分子的兩條鏈均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)(無論它們彼此是否相互結(jié)合)。本發(fā)明還包括了mRNA分子和互補(bǔ)的DNA分子(例如cDNA分子)。
本發(fā)明還包括了能與上述的一個(gè)或多個(gè)核酸分子雜交的核酸分子。這些核酸分子在本文中稱為“雜交性”核酸分子。
本發(fā)明的雜交性核酸分子在其長(zhǎng)度上與上述范圍a)或b)中的核酸分子可能有高度的序列相同性(例如至少50％，至少75％，或至少90％的序列相同性)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一給定單鏈核酸分子與另一單鏈核酸分子的序列相同性程度越高，則它在合適條件下與另一單鏈核酸分子之互補(bǔ)的單鏈核酸分子雜交的可能性就越大。
本發(fā)明雜交分子需要的長(zhǎng)度至少為10個(gè)核苷酸，較佳的至少為25個(gè)、至少為50個(gè)、至少為100個(gè)或至少為200個(gè)核苷酸。
較佳的雜交性分子能在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)例子是在約35℃至65℃的溫度下用約0.9摩爾的鹽溶液進(jìn)行嘗試性雜交。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當(dāng)?shù)馗淖冞@些參數(shù)，以便將探針長(zhǎng)度、堿基組成、存在的離子的類型等變量考慮在內(nèi)。
最佳的，本發(fā)明的雜交性核酸分子與具有圖1所示編碼序列的DNA分子或其等價(jià)的RNA雜交、或與上述任一分子的互補(bǔ)序列雜交。
雜交性核酸分子例如可用作探針或引物。
探針可用來純化和/或鑒別核酸。例如，它們可用來鑒別所有或部分去飽和酶基因的存在，因此可用于診斷。
引物可用于核酸或其部分的擴(kuò)增，例如用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。
除了用作探針或引物外，本發(fā)明的雜交性核酸分子還可用作反義分子，通過與互補(bǔ)的核酸分子結(jié)合來改變本發(fā)明多肽的表達(dá)。(通常，這可通過提供與通常被翻譯的RNA分子結(jié)合的核酸分子并因形成雙鏈體而防止翻譯來實(shí)現(xiàn)。)還可以核酶形式提供雜交性分子。通過結(jié)合并切割包含被該核酶識(shí)別的特定靶序列的RNA分子，核酶也可用來調(diào)節(jié)表達(dá)。
從前述討論可以理解，有許多核酸均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，除非上下文另有表示，本發(fā)明的核酸分子可以具有下列特征中的一個(gè)或多個(gè)1)它們可能是DNA或RNA(包括天然存在的DNA或RNA結(jié)構(gòu)的變體，這些變體具有非天然存在的堿基和/或非天然存在的骨架)。
2)它們可能是單鏈或雙鏈。
3)它們可能以重組體形式提供，即與異源5′和/或3′側(cè)接序列共價(jià)連接，從而提供了一個(gè)非天然存在的嵌合分子(例如載體)。
4)它們可能沒有天然存在的5′和/或3′側(cè)接序列。
5)它們可以基本上純的形式提供，例如用探針來分離具有所需靶序列的克隆的分子，或采用化學(xué)合成技術(shù)。因此，它們提供的形式可以是基本上不含污染性蛋白質(zhì)和/或其它核酸的形式。
6)它們可能具有內(nèi)含子(例如全長(zhǎng)基因)或不具有內(nèi)含子(例如cDNA)。
現(xiàn)在將僅僅以實(shí)施例并參照附圖來描述本發(fā)明，在圖1至6中圖1顯示了全長(zhǎng)C.elegans cDNA pCeD6.1的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。N端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域以及變異的第三個(gè)組氨酸盒的位置用下劃線表示。該cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與W08D2.4的殘基1-38和68-473所預(yù)計(jì)的相同。
圖2A顯示了C.elegans cDNA CeD6.1的推導(dǎo)的氨基酸序列與C.elegans預(yù)計(jì)蛋白W08D2.4的序列的比較(MywormD6=CeD6.1；cew08d2=ORF W08D2.4)。
圖2B顯示了琉璃苣Δ6去飽和酶(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)與C.elegans cDNA CeD6.1(Boofd6=琉璃苣Δ6去飽和酶；ceeld6=CeD6.1)的推導(dǎo)氨基酸序列的比較。
圖3顯示了在誘導(dǎo)條件(亞油酸鹽和半乳糖)下生長(zhǎng)的釀酒酵母總脂質(zhì)的甲酯。
圖4顯示了在攜帶pYCeD6.1的酵母中鑒定出的新的峰的GC-MS分析。
圖5顯示了n-6必需脂肪酸在哺乳動(dòng)物中的代謝的流程簡(jiǎn)圖。
圖6顯示了轉(zhuǎn)化的擬南芥菜植物(A)(對(duì)照)或表達(dá)C.elegansΔ6去飽和酶的轉(zhuǎn)化的擬南芥菜植物(B)的葉片物質(zhì)的脂肪酸和甲酯。
實(shí)施例1-Δ6去飽和酶基因的分離和在酵母中的表達(dá)用已知的琉璃苣Δ6脂肪酸去飽和酶(Sayanova O等人(1997)同上)在NCBI EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索氨基酸序列，將搜索限制在含有變異的組氨酸盒Q-X-X-H-H的序列。
鑒定出C.elegans EST，搜索C.elegans EST工程數(shù)據(jù)庫(kù)(Prof.Y.Kohara實(shí)驗(yàn)室(National Institute of Genetics，Mishima，Japan)；日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)其作進(jìn)一步特性分析，以鑒定相關(guān)的粘?？寺?。
通過這些搜索鑒定，從C.elegans EST工程獲得命名為yk436b12的部分448堿基對(duì)的cDNA克隆，用它來篩選C.elegans cDNA文庫(kù)(混合階段；也由Prof Kohara提供)。這表明克隆yk436b12與形成染色體Ⅳ一部分的粘粒W08D2(Genbank登錄號(hào)Z70271)上存在的部分基因同源。用蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)程序Genefinder(Wilson R等人(1994)Nature 368 32-38)預(yù)計(jì)粘粒W0D2的堿基21-2957編碼了473個(gè)殘基的ORF，該ORF被5個(gè)內(nèi)含子間隔斷。Wilson，R.等人公開了C.elegans染色體Ⅲ的部分序列。鑒定出許多陽(yáng)性物，并作進(jìn)一步純化，通過測(cè)序確認(rèn)全長(zhǎng)克隆編碼了一個(gè)轉(zhuǎn)錄物，通過對(duì)C.elegans基因組工程測(cè)序的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索確定，該轉(zhuǎn)錄物可能轉(zhuǎn)錄自粘粒W08D2上命名為W08D2.4的基因。
檢查該預(yù)計(jì)的多肽(由Sanger Centre Nematode Sequencing Project，Hinxton，UK命名為W08D2.4)，揭示它具有許多特征使人會(huì)聯(lián)想起微粒體脂肪酸去飽和酶，包括三個(gè)組氨酸盒。然而，該預(yù)計(jì)蛋白序列表明N-端結(jié)構(gòu)域的存在與細(xì)胞色素b5類似，含有在細(xì)胞色素b5蛋白中發(fā)現(xiàn)的診斷性H-P-G-G基序(Lederer F(1994)Biochimie.76，674-692)。由于我們從琉璃苣中分離出的Δ6去飽和酶也含有N端b5結(jié)構(gòu)域，因此這表明W0D2.4可能編碼了一個(gè)Δ6去飽和酶。
更仔細(xì)地檢查該序列，結(jié)果揭示存在變異的第三個(gè)組氨酸盒，H被Q置換(再次與琉璃苣Δ6去飽和酶中觀察到的相同)。W08D2.4和琉璃苣Δ6去飽和酶之間的相似程度小于52％，因此該相似程度低。獲得的低于31％的相同性程度也是低的。
因?yàn)閃08D2.4由含有許多(6)內(nèi)含子的基因編碼，因此需要分離出一個(gè)全長(zhǎng)cDNA來驗(yàn)證用Genefinder程序預(yù)計(jì)的序列，另外使ORF表達(dá)來確定編碼的功能。
用EST插入物yk436b12(由Prof Y.Kohara慷慨贈(zèng)與)來篩選cDNA文庫(kù)，鑒定出許多陽(yáng)性噬斑。將它們純化至均一，切割，對(duì)所得拯救噬菌粒的最大插入物(約1450bp)進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果確認(rèn)我們分離的cDNA確實(shí)與W08D2.4同源，cDNA的5′和3′端與粘粒W08D2序列的堿基9至3079等價(jià)。由于Genefinder程序預(yù)計(jì)為基因產(chǎn)物W08D2.4開始的ATG起始密碼子確實(shí)是cDNA克隆中的第一個(gè)甲硫氨酸，我們有理由認(rèn)為我們已經(jīng)真正地分離出全長(zhǎng)cDNA。圖1中顯示了一個(gè)典型cDNA克隆(命名為pCeD6.1；長(zhǎng)度為1463 bp)的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列；推導(dǎo)出的氨基酸序列在該蛋白質(zhì)的大部分中與W08D2.4所預(yù)計(jì)的相同。N-端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域以及變異的第三個(gè)組氨酸盒的位置用下劃線表示。該cDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列與W08D2.4的殘基1-38和68-473所預(yù)計(jì)的相同。
然而，編碼W08D2.4預(yù)計(jì)的殘基38-67(Y-S-I……L-Y-F)的DNA序列不存在該cDNA克隆中。這意味著CeD6.1的推導(dǎo)氨基酸序列實(shí)際上長(zhǎng)443個(gè)氨基酸，這與W08D2.4預(yù)計(jì)的長(zhǎng)473個(gè)殘基不同。這兩個(gè)氨基酸序列之間的僅有的另一個(gè)區(qū)別是殘基401發(fā)生M→V替代，這是由A→G堿基(堿基1211)變化而產(chǎn)生的。象琉璃苣Δ6去飽和酶以及CeD6.1的推導(dǎo)氨基酸序列(圖2B)那樣，在圖2A中比較這兩個(gè)序列。W08D2.4預(yù)計(jì)的額外序列可能產(chǎn)生于內(nèi)含子-外顯子邊界的不正確預(yù)計(jì)。
注意N端存在H-P-G-G細(xì)胞色素b5基序(由堿基96-108編碼)以及第三個(gè)組氨酸盒中的HQ替換(由堿基1157-1172編碼)。
通過PCR方法，將W08D2.4的編碼序列導(dǎo)入酵母表達(dá)載體pYES2中。利用具有5′突出端的寡核苷酸在5′和3′端分別引入KpnI和SacI位點(diǎn)。用TnT系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，檢查構(gòu)建物的保真性。
具體地說，然后用克隆pCeD6.1作為模板來PCR擴(kuò)增整個(gè)預(yù)計(jì)的編碼序列(長(zhǎng)度為443個(gè)氨基酸殘基)，并克隆到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)中，產(chǎn)生pYCeD6。利用pYES2中存在的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，進(jìn)行該質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯，檢查PCR-產(chǎn)生的序列的保真性。
利用Promega TnT偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，產(chǎn)生翻譯產(chǎn)物，用SDS-PAGE進(jìn)行分析，并按照生產(chǎn)商說明書進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果揭示(數(shù)據(jù)未顯示)質(zhì)粒pYCeD6產(chǎn)生了一個(gè)約55kD的產(chǎn)物，而對(duì)照(pYES2)沒有產(chǎn)生任何蛋白產(chǎn)物，這表明該構(gòu)建物是正確的。
用乙酸鋰方法(Guthrie c，F(xiàn)ink GR(1991)Meths Enz.194)將所得質(zhì)粒導(dǎo)入酵母(釀酒酵母)中，加入半乳糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在1％tergitol洗滌劑NP-40存在下向酵母中加入0.2 mM亞油酸鹽(鈉鹽)。
利用pYES2攜帶的URA3可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化并選擇能在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母，結(jié)果揭示酵母菌落攜帶重組質(zhì)粒pYCeD6。通過誘導(dǎo)pYES2中存在的GAL啟動(dòng)子獲得了pYCeD6表達(dá)。這在細(xì)胞以棉子糖作為碳源生長(zhǎng)過夜后進(jìn)行，在低水平洗滌劑存在下，在培養(yǎng)基中添加亞油酸鹽(18∶2)。后一添加是必需的，因?yàn)棣?去飽和酶的通常底物為18∶2脂肪酸，它并不天然存在于釀酒酵母中。
通過甲酯的GC分析酵母總脂肪酸。用GC-MS確認(rèn)GLA的存在(Sayanaova等人(1997)同上)。
更詳細(xì)地說，在誘導(dǎo)后使培養(yǎng)物繼續(xù)生長(zhǎng)，并取出等份進(jìn)行GC分析。當(dāng)用GC分析從攜帶質(zhì)粒pYCeD6并在半乳糖和亞油酸鹽存在下生長(zhǎng)的酵母中分離出的總脂肪酸的甲酯時(shí)，觀察到有一個(gè)額外的峰(圖3)。在圖3中，A圖是對(duì)照(空)載體pYES2轉(zhuǎn)化的酵母，B圖用pYCeD6.1來轉(zhuǎn)化酵母。常見的脂肪酸-甲酯鑒定為16∶0(峰1)、16∶1(峰2)、18∶0(峰3)、18∶1(峰4)、18∶2(峰5；外源提供)。B圖中額外的峰(6)對(duì)應(yīng)于18∶3 GLA，其用箭頭表示。這與真實(shí)的GLA標(biāo)準(zhǔn)品的滯留時(shí)間相同，表明轉(zhuǎn)基因酵母能Δ6-去飽和亞油酸。在任何一個(gè)對(duì)照樣品(用pYES2轉(zhuǎn)化)中均未發(fā)現(xiàn)有這樣的峰。用GC-MS確認(rèn)該額外峰的身份，結(jié)果為陽(yáng)性，鑒定出該化合物為GLA(圖4)。在圖4實(shí)驗(yàn)中，如前所述(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)用質(zhì)譜法分析樣品，用所得數(shù)據(jù)來搜索概貌庫(kù)。鑒定出該樣品為GLA。顯示新峰(A)與真實(shí)的GLA(B)的質(zhì)譜比較；肉眼和計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的檢查揭示它們是相同的。這確證CeD6.1編碼了一個(gè)C.elegansΔ6去飽和酶，而該cDNA可能由預(yù)計(jì)編碼ORF W08D2.4的基因轉(zhuǎn)錄得到，但是CeD6.1的推導(dǎo)氨基酸序列比W08D2.4的推導(dǎo)氨基酸序列短30個(gè)殘基。
實(shí)施例2-C.elegansΔ6去飽和酶在植物中的表達(dá)將C.elegansΔ6去飽和酶的編碼序列亞克隆到植物表達(dá)載體pJD330中，該載體含有病毒35S啟動(dòng)子和一個(gè)Nos終止子。然后將所得的盒或啟動(dòng)子/編碼序列/終止子亞克隆到植物雙元轉(zhuǎn)化載體pBin19中，將所得質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。然后通過真空-滲入花序用該農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化擬南芥菜。收獲種子并接種到含有卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基中。由于pBin 19賦予對(duì)該抗生素的抗性，因此只有轉(zhuǎn)化的植物材料才會(huì)生長(zhǎng)。鑒定有抗性的株系，自體受精產(chǎn)生純合的材料。用線蟲去飽和酶在酵母中表達(dá)的相同方法分析葉片物質(zhì)中的脂肪酸概貌。用GC分離脂肪酸甲酯，通過已知標(biāo)準(zhǔn)品和GCMS比較，鑒定圖6中所示的新的峰。在(B)中可以看到兩個(gè)新的峰，它們被鑒定為γ亞麻酸(峰1)和十八碳四烯酸(峰2)。這些分別是前體脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸的Δ6去飽和作用的產(chǎn)物。
本發(fā)明者已經(jīng)表明，C.elegans cDNA(CeD6.1)編碼一個(gè)Δ6去飽和酶，該序列與預(yù)計(jì)的ORF W08D2.4相同，只是在后一蛋白的N-端區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)30殘基的插入物。還不清楚CeD6.1預(yù)計(jì)推導(dǎo)的氨基酸序列是代表了W08D2.4的一個(gè)剪接變體，還是Genefinder程序?qū)?nèi)含子/外顯子接頭錯(cuò)誤預(yù)計(jì)的結(jié)果。然而，CeD6.1顯然編碼Δ6去飽和酶。
該C.elegans序列編碼的ORF看來與我們以前分離的高等植物Δ6脂肪酸去飽和酶(Sayanova O等人(1997)同上)有關(guān)，因?yàn)樗鼈兌己酗@示出與細(xì)胞色素b5同源的N端結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)證實(shí)，微粒體脂肪酸去飽和酶用游離的微粒體細(xì)胞色素b5作為它們的電子供體(Smith MA，等人(1990)Biochem.J.272，23-29，Smith MA等人(1992)Biochem.J.287，141-144)，而這些酶的絕大多數(shù)已經(jīng)鑒定的序列看來不含此額外的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域(Okuley J等人(1994)Plant Cell 6，147-158，Aronel V.等人(1992)Science 258，1353-1355和Napier，J.A.等人(1997)Biochemical J，328717-8)。
在本發(fā)明之前只知道兩個(gè)含有細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域的去飽和酶例子，一個(gè)是琉璃苣Δ6去飽和酶，另一個(gè)是酵母微粒體Δ9(OLE1)去飽和酶(Napier JA等人(1997)Biochemical J，同上和Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Cehm 270，29766-29772)。然而，OLE1含有C端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域(Napier J A等人(1997)Biochemical J.在版以及Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Chem.270，29766-29772)。細(xì)胞色素b5的原因可能是該Δ6去飽和酶是“前端(front-end)型”去飽和酶。(“前端型”去飽和作用可以定義成脂肪酸鏈上最終的去飽和反應(yīng)，通常在預(yù)先存在的鍵和羧基Δ端之間引入雙鍵(Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Chem 270，29766-29772和Aitzetmuller K，Tseegsuren，N(1994)J.Plant Physiol.143，538-543)。)無論如何，現(xiàn)在認(rèn)為變異的組氨酸盒以及N端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物和植物中均是保守的，其證據(jù)是它們存在于琉璃苣和線蟲的Δ6去飽和酶中。
因此，本發(fā)明能鑒定其它Δ6去飽和酶，以及通過這些基序的存在來鑒定的其它“前端型”去飽和酶。
權(quán)利要求
1．一種具有去飽和酶活性的多肽，它a)具有圖1所示的氨基酸序列；b)相對(duì)于上述a)中定義的多肽有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入或替換，但是與該序列的氨基酸序列相同性至少為32％；或c)是上述a)或b)中定義的多肽的片段，其長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，它具有細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，它具有細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。
4．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它具有至少一個(gè)組氨酸盒。
5．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它具有三個(gè)組氨酸盒。
6．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它是前端型去飽和酶。
7．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它是Δ6去飽和酶。
8．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它天然存在于不積累GLA的生物中。
9．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它天然存在于真核細(xì)胞中。
10．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它天然存在于動(dòng)物中。
11．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它天然存在于線蟲中。
12．根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的多肽，它天然存在于C.elegans中。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，它含有圖1所示的氨基酸序列或該序列的一部分。
14．一種多肽，它包含前述任一權(quán)利要求所述的多肽，該多肽與另一部分共價(jià)相連。
15．權(quán)利要求1至14任一所述的多肽在產(chǎn)生或篩選抗體中的應(yīng)用。
16．權(quán)利要求1至14任一所述的多肽作為轉(zhuǎn)化用標(biāo)記的應(yīng)用。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽的應(yīng)用，該應(yīng)用是作為植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記。
18．一種抗體或其衍生物，它與權(quán)利要求1至14任一所述的多肽結(jié)合。
19．權(quán)利要求18所述的抗體或其衍生物在診斷中的應(yīng)用。
20．一種測(cè)定一種生物中是否具有權(quán)利要求1至14任一所述的多肽的方法，該方法包括測(cè)定該生物是否具有結(jié)合權(quán)利要求18所述的抗體或其衍生物的多肽。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該生物是人。
22．根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，該方法宜在體外進(jìn)行。
23．權(quán)利要求1至14任一所述的多肽在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
24．權(quán)利要求1至14任一所述的多肽在制備一種藥劑中的應(yīng)用，該藥劑用來治療涉及GLA缺陷或體內(nèi)GLA衍生的代謝物缺陷的疾病。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的多肽的應(yīng)用，其中該代謝物是類二十烷酸。
26．根據(jù)權(quán)利要求23、24或25所述的應(yīng)用，其中疾病是濕疹、乳腺痛、高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病性神經(jīng)病、病毒性感染、痤瘡、肝硬化、高血壓和癌癥。
27．一種制備GLA的方法，該方法包括用權(quán)利要求1至14任一所述的多肽將亞油酸轉(zhuǎn)變成GLA。
28．一種制備OTA的方法，該方法包括用權(quán)利要求1至14任一所述的多肽將α亞油酸轉(zhuǎn)變成OTA。
29．一種核酸分子，它a)編碼權(quán)利要求1至14任一所述的多肽；或b)與上文a)中定義的核酸分子互補(bǔ)；或c)與上文a)或b)中定義的核酸分子雜交。
30．一種載體，它包含權(quán)利要求29所述的核酸分子。
31．一種宿主，它包含權(quán)利要求27所述的核酸分子或權(quán)利要求30所述的載體。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的宿主，它是植物或植物繁殖性物質(zhì)。
33．根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的宿主，它是油菜、向日葵、谷類包括玉米、煙草、莢果包括花生和大豆、紅花、油棕、椰子和其它棕櫚、棉花、芝麻、芥菜、亞麻籽、蓖麻、琉璃苣和月見草；或上述任一的繁殖性物質(zhì)。
34．一種獲得權(quán)利要求1至14任一所述的多肽的方法，該方法包括在使所述多肽表達(dá)的條件下培育權(quán)利要求31至33任一所述的宿主，然后純化所述多肽。
35．權(quán)利要求29所述的核酸分子作為探針或引物的應(yīng)用。
36．權(quán)利要求29所述的核酸分子或權(quán)利要求30所述的載體在制備某生物中的應(yīng)用，該生物能在其體內(nèi)積累GLA或從GLA衍生的代謝物。
37．權(quán)利要求29所述的核酸分子或權(quán)利要求30所述的載體在制備耐寒生物中的應(yīng)用。
38．一種生產(chǎn)權(quán)利要求31至33任一所述的宿主的方法，該方法包括將權(quán)利要求29所述的核酸或權(quán)利要求30所述的載體插入一生物內(nèi)。
全文摘要
編碼C.elegans△
文檔編號(hào)A61P9/10GK1285874SQ98812900
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1998年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月24日
發(fā)明者J·A·內(nèi)皮爾 申請(qǐng)人:布利斯脫大學(xué)