專利名稱：Vegi,一種血管發(fā)生和腫瘤生長的抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
在非常特限情況中，人或動物在正常生理?xiàng)l件下會進(jìn)行血管發(fā)生，在組織或器官中產(chǎn)生新血管。例如，血管發(fā)生通常見于傷口愈合，胚胎發(fā)育及黃體，子宮內(nèi)膜及胎盤的形成。術(shù)語“內(nèi)皮”指位于漿膜腔，淋巴管及血管內(nèi)的一薄層扁平上皮細(xì)胞。術(shù)語“抗血管發(fā)生”或“血管發(fā)生抑制活性”指分子一般地抑制血管發(fā)生的能力。
控制的及非控制的血管發(fā)生被認(rèn)為以相似方式進(jìn)行?；@的內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞形成毛細(xì)血管。血管發(fā)生開始于由內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放的酶對基膜的侵蝕。位于血管腔內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞隨之通過基膜突出。血管發(fā)生刺激物使內(nèi)皮細(xì)胞遷移通過侵蝕的基膜。遷移的細(xì)胞形成親本血管的“萌芽”，在此內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂及增殖。內(nèi)皮萌芽彼此形成毛細(xì)環(huán)，產(chǎn)生新的血管。
持續(xù)的非調(diào)節(jié)血管發(fā)生發(fā)生于大量疾病狀態(tài)，腫瘤轉(zhuǎn)移及內(nèi)皮細(xì)胞異常生長并導(dǎo)致見于這些病癥的病理損害。各種各樣的呈非調(diào)節(jié)血管發(fā)生的病理性疾病狀態(tài)已被一起歸類于血管發(fā)生依賴性或血管發(fā)生相關(guān)性疾病。
在腫瘤生長期間，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，侵入基質(zhì)，沿血管發(fā)生刺激物的源頭如癌細(xì)胞遷移，與血管周圍細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞相互作用，并最后形成連接腫瘤組織和血液循環(huán)的毛細(xì)血管(J.Folkman(1995)Nat.Med.127-31)。盡管無容置疑地高度復(fù)雜，且調(diào)節(jié)血管發(fā)生的機(jī)制還未知，但漸漸清楚的是此程序的初始或終止是血管發(fā)生正性和負(fù)性調(diào)節(jié)物間平衡的結(jié)果。通常在腫瘤組織中明顯正調(diào)節(jié)的許多血管生成因子已被闡述，包括一些成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，如FGF-1(G.Gimenez-Grallego et al..(1985)科學(xué)2301385)，F(xiàn)GF-2(L.Schweigeretal.，(1987)Nature 325257)，及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子家族(VEGF)的成員(D.W.Leung e1 al.，(1989)Science 2461306)，以及這些生長因子的受體(L.W.Burrus and B.B.Olwin(1989)生物化學(xué)雜志26418647；S.Wennstrom et a1.(1991)生長因子4197；B.Terman etal.(1992)生物化學(xué)生物物理研究通訊1871579；C.de Vries et al，(1992)科學(xué)255；989)。本文前述及下文引用的所有文獻(xiàn)全部并入?yún)⒖肌?br> 也已報(bào)道了一些血管發(fā)生的抑制劑，包括血小板反應(yīng)蛋白(D.J.Good et al.(1990)美國科學(xué)院院刊876624)，抑管張素(M.S.O’Reilly et al.(1994)細(xì)胞79315)，內(nèi)抑制素(endostatin)(M.S.O’Reilly et al.(1997)細(xì)胞88277)，及血小板因子-4(E.Maioneet al.(1997)科學(xué)24777)。顯而易見，正常血管發(fā)生當(dāng)需要時被迅速激活，當(dāng)不再需要時被迅速終止，而病理性血管發(fā)生一旦開始，通常拖延并難以結(jié)束。這表明在正常血管生長過程中起作用的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制在病理性血管發(fā)生過程中未起作用或被抑制。已推測從許多前體中釋放血管發(fā)生抑制劑的蛋白酶解活性部分負(fù)責(zé)血管發(fā)生下調(diào)節(jié)，這通過從纖溶酶原到抑管張素的蛋白酶解激活及從膠原ⅩⅤⅢ到內(nèi)抑制素的蛋白酶解激活表明(M.S.O’Reilly，(1997)Cell 88277)。許多己知血管發(fā)生調(diào)節(jié)物是多效的，并能對其它細(xì)胞類型以及產(chǎn)生調(diào)節(jié)物的細(xì)胞起作用，盡管可想象內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生自泌因子抑制血管發(fā)生過程或保持成熟血管的靜止。目前對此血管發(fā)生的自泌調(diào)節(jié)物還未加以闡述。在本申請中闡述了一新的血管發(fā)生自泌負(fù)性調(diào)節(jié)物，稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑(VEGI)，特別地由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。
盡管本發(fā)明申請中闡述的蛋白質(zhì)首先作為TNF-γ在1994年11月7日申請的EP95903521.3中闡述，但其中未揭示此蛋白質(zhì)的血管發(fā)生抑制功能。此蛋白質(zhì)通過用衍生自各種內(nèi)皮細(xì)胞的RNA構(gòu)建8個cDNA文庫而發(fā)現(xiàn)，從各種內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生30，000個表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)。內(nèi)皮細(xì)胞特有的ESTs進(jìn)一步鑒定了其與已知蛋白家族特別是細(xì)胞因子的序列同源性。一組EST的推斷的氨基酸序列含有腫瘤壞死因子(TNFs)的共有氨基酸序列。為獲得全長cDNA克隆，用放射標(biāo)記的探針從原始克隆之一中篩選人臍靜脈內(nèi)皮(HUVE)細(xì)胞文庫。分離出一些陽性克隆并測試序列。最長的cDNA克隆含有編碼174個氨基酸開放讀框及在3’和5’末端的長未翻譯區(qū)的4.5kb插入片段。一框內(nèi)終止密碼子在推斷的起始密碼子的上游表明翻譯不能在更上游開始。此新蛋白質(zhì)與人TNFα，TNFβ，及Fas配體呈20-30％的序列同源。用此cDNA克隆做模板，與推定的開放讀框一致，在體外轉(zhuǎn)錄及翻譯試驗(yàn)中產(chǎn)生分子量為22KD的蛋白質(zhì)。對此蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水分析推定12個氨基酸的疏水區(qū)緊隨在14個非疏水氨基酸的N-末端區(qū)段之后。這與類似于TNFs的Ⅱ型跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)一致(B.B.Aggarwal and K.Natarajan(1996)Eur.Cytokine News.793)。
對各種譜系的22種不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA制備物的最新Northern分析表明，此蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄只在二種內(nèi)皮細(xì)胞系中檢測到HUVE細(xì)胞和代次較低的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。在代次較高的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中未檢測到mRNA，在人動脈細(xì)胞中也未見。成鮮明對照的是TNF家族成員大多數(shù)在免疫細(xì)胞中表達(dá)(B.B.Aggarwal andK.Natarajan(1996)見前述)。例如，TNFα由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，而TNFβ主要由促分裂原刺激的T淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞產(chǎn)生。相似地，F(xiàn)as和其它TNF家族成員的配體，CD27，CD30，CD40，OX40和4-1BB在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中均表達(dá)。用多組織Northem印跡，VEGI轉(zhuǎn)錄物發(fā)現(xiàn)在胎盤、肺、腎、骨骼肌，腦、肝、胸腺、睪丸、卵巢及外周血淋巴細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明鑒定并闡述了此蛋白質(zhì)的新功能。上述蛋白質(zhì)的截短形式已發(fā)現(xiàn)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長。因而將此蛋白質(zhì)稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑(VEGI)。將由相應(yīng)于推定的胞外結(jié)構(gòu)域的39-174殘基組成一的VEGI的截短形式在E.coli中表達(dá)，分離，并進(jìn)行各種細(xì)胞分析測試。發(fā)現(xiàn)VEGI的截短形式特別抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制體外模型中類毛細(xì)管形成，并抑制在雌性無胸腺裸鼠乳墊中人乳癌異種移植物的生長。
發(fā)明概述本發(fā)明一般地涉及一種內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制劑，尤其涉及血管發(fā)生抑制劑，及其使用方法。VEGI的完整核苷酸序列見SEQ ID NO1，SEQ ID NO8，SEQ ID NO26中所示，編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO26中所示，編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO9和SEQ ID NO27。發(fā)現(xiàn)由相當(dāng)于推定胞外結(jié)構(gòu)域的39-174位殘基(SEQ ID NO3)組成的蛋白質(zhì)截短形式特異抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。發(fā)現(xiàn)VEGI可抑制體外血管發(fā)生模型中類毛細(xì)管的形成。最后，發(fā)現(xiàn)VEGI可抑制在無胸腺裸鼠中異種移植腫瘤的生長。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種血管發(fā)生抑制劑，所述抑制劑包括本發(fā)明的VEGI多核苷酸，多肽或在藥物可接受稀釋劑內(nèi)的藥物可接受量的修飾形式的VEGI。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種血管發(fā)生促進(jìn)劑，所述促進(jìn)劑包括在藥物可接受稀釋劑中，藥物可接受量的抗體，反義寡核苷酸，拮抗劑，核酶，降低或消除VEGI功能的藥物或制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制血管發(fā)生的方法，其包括給人或動物施用一種組合物，該組合物含有有效抑制血管發(fā)生劑量的基本純化的本發(fā)明的VEGI多核苷酸，多肽或修飾形式的VEGI。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種加速血管發(fā)生的方法，其包括給人或動物施用一種組合物，該組合物含有降低或消除VEGI功能的抗體、反義寡核苷酸，拮抗劑、核酶、藥物或制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷病理性血管發(fā)生的方法，其包括檢測樣本中VEGI多肽的存在與否，所述方法包括以下步驟(ⅰ)將疑有病理性血管發(fā)生的個體的樣本與特異于本發(fā)明VEGI多肽的抗體接觸；并(ⅱ)檢測VEGI與抗體之間形成的復(fù)合物存在與否。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷病理性血管發(fā)生的方法，其包括檢測樣本中VEGI多核苷酸(優(yōu)選RNA)的存在與否，所述方法包括以下步驟(ⅰ)將疑有病理性血管發(fā)生的個體的樣本與特異結(jié)合VEGI多核苷酸(如RNA)的寡核苷酸接觸；并(ⅱ)檢測VEGI多核苷酸與特異于其的寡核苷酸之間形成的雙鏈體存在與否。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用聚合酶鏈反應(yīng)診斷病理性血管發(fā)生的方法，所述方法包括用如SEQ ID NO1，SEQ ID NO8和SEQ ID NO26所示的VEGI核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，其特別擴(kuò)增VEGI的區(qū)域。引物可用于擴(kuò)增VEGI DNA或VEGI RNA，后者通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)DNA(cDNA)后進(jìn)行。PCR分析通過將擴(kuò)增產(chǎn)物與用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)相對比進(jìn)行定量。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測樣本中VEGI多核苷酸的方法，其包括通過雜交分析分析樣本中VEGI RNA或DNA的存在與否。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一診斷或預(yù)測試劑盒，其包括結(jié)合本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽的抗體，與VEGI DNA或RNA雜交的寡核苷酸，和/或擴(kuò)增VEGI DNA或RNA的PCR引物，及適用于檢測樣本中存在的VEGI的輔助試劑。由于VEGI作為膜蛋白起作用，膜結(jié)合VEGI的天然存在的可溶形式可作為其拮抗劑，且檢測所述可溶形式的方法包含在本發(fā)明其它實(shí)施方案中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷分析，其包括檢測VEGI多核苷酸中突變的存在，突變導(dǎo)致VEGI表達(dá)或功能的降低或提高。如此分析包括雜交分析，限制性酶切圖譜多態(tài)分析，及基因測序等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療或改善疾病或過程的治療方法和組合物，所述疾病或過程由血管發(fā)生引發(fā)，包括但非限于血管瘤，實(shí)體腫瘤、白血病、轉(zhuǎn)移癌、毛細(xì)管擴(kuò)張、牛皮癬、硬皮病、原發(fā)性皮膚淀粉樣變、心肌血管發(fā)生、斑新生血管形成，冠脈并行，缺血肢血管發(fā)生，角膜病，潮紅，新血管形成性青光眼，糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，關(guān)節(jié)炎，糖尿病性新血管形成；其中血管發(fā)生是非控制的或過度的，并需要抑制。所述方法包括對需要如此治療的個體提供有效量的本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽，如此血管發(fā)生被抑制。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或改善疾病的治療方法和組合物，此類疾病如斑退化，創(chuàng)傷愈合，消化道潰瘍，骨折，疤痕疙瘩，血管發(fā)生，血細(xì)胞生成，排卵，月經(jīng)及胎盤形成，其中血管發(fā)生是所需的，所述方法包括給需要如此治療的個體施用本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽的拮抗劑，特異于VEGI多核苷酸的反義寡核苷酸，或存在于藥物可接受稀釋劑中藥物可接受量的降低或消除VEGI功能的抗VEGI的抗體，制劑或藥物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種癌生長的阻抑物或抑劑劑組合物，此組合物含有基本純化的本發(fā)明VEGI多核苷酸或多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測及預(yù)測癌癥的方法，其通過檢測樣本中本發(fā)明VEGI多核苷酸或多肽的存在與否，或檢測改變VEGI表達(dá)和功能的VEGI多核苷酸中突變存在與否而進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測試有抑制血管發(fā)生活性的可能制劑或藥物的方法，其通過測試藥物或制劑是否能正調(diào)節(jié)VEGI表達(dá)而進(jìn)行。與其它血管發(fā)生抑制劑類似，由于VEGI可能被蛋白酶激活，此蛋白酶從細(xì)胞膜釋放蛋白質(zhì)，因而蛋白酶以及其它激發(fā)該活性的制劑如金屬離子將被用作提高VEGI表達(dá)的制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測試可能的抗腫瘤制劑或藥物的方法，其通過測試此藥物或制劑是否能通過正調(diào)節(jié)VEGI表達(dá)而抑制血管發(fā)生而進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測試可能的刺激血管發(fā)生的藥物或制劑，其通過測試此藥物或制劑是否能阻斷VEGI功能(如抑制血管發(fā)生)而進(jìn)行。在此情況中，對如上述激活VEGI的蛋白酶或激發(fā)該活性所需或促進(jìn)激發(fā)該活性的制劑如金屬離子的抑制可用于負(fù)調(diào)節(jié)VEGI，從而正調(diào)節(jié)血管發(fā)生。
附圖簡要描述

圖1代表VEGI轉(zhuǎn)錄物的Northem印跡分析。A組，在人細(xì)胞中VEGI的表達(dá)Jurkat，人T細(xì)胞白血病細(xì)胞；L923，人胚腎細(xì)胞；HL60，人早幼粒細(xì)胞白血?。籚.E，人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(第10代)；A431，人表皮樣癌；V.E-2，人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(第20代)；Raji，人Burkitt’s淋巴癌；A.E，人動脈內(nèi)皮細(xì)胞；THP-1，人單核細(xì)胞白血?。籆CD-29Lu，人肺氣腫；CAMA1，乳癌；AN3CA，子宮癌；SK.UT.1，子宮癌；MG63，成骨細(xì)胞瘤；HOS，成骨細(xì)胞瘤；MCF7，乳癌；OVCAR-3，卵巢癌；CAOV-3，卵巢癌；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；AOSMIC，平滑肌。估計(jì)信使大小為6.5kb。B組，在各類人組織中VEGI表達(dá)。進(jìn)行了三次獨(dú)立的印跡。示出此三組試驗(yàn)的任一的陽性結(jié)果。
圖2表明VEGI對內(nèi)皮細(xì)胞和乳癌細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞數(shù)對所示VEGI濃度標(biāo)繪圖。示出ABAE細(xì)胞(空心圓)而非MDA-MB231(三角形)或MDA-MB-435(正方形)細(xì)胞的生長被抑制。
圖3示出VEGI抑制在膠原凝膠上的ABAE細(xì)胞形成類毛細(xì)管的能力，通過在存在各種濃度VEGI時，ABAE細(xì)胞形成類毛細(xì)管的程度，與當(dāng)將VEGI不存在于培養(yǎng)基中時所得結(jié)果相對比而獲得在柱之上所提供的p值(t-檢驗(yàn))。類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的豐度以相對于總測定面積的白色區(qū)域的百分率測定。
圖4表明通過VEGI，對在無胸腺裸鼠中的人乳癌異種移植腫瘤的生長的抑制。A組作為接種后時間(天數(shù))的函數(shù)標(biāo)繪出的MDA-MB-231異種移植腫瘤的大小(mm2)。B組作為接種后時間(天數(shù))的函數(shù)標(biāo)繪出的im-DA-MB-435異種移植腫瘤大小(mm2)?？招膱A，用載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞共接種，實(shí)心圓，用分泌的VEGI轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞共接種。
圖5A，5B和5C圖示了本發(fā)明的VEGI-α多肽的cDNA(SEQIDNO8)和相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO9)。初始27個氨基酸(下劃線)是推定的前導(dǎo)序列。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫代表氨基酸。潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)在圖5A，5B和5C中VEGI-α氨基酸序列中黑體的天冬酰胺符號(N)及在VEGI-α核苷酸序列中編碼天冬酰胺殘基的第一個核苷酸之上以黑體(#)標(biāo)示。潛在的N-連接的糖基化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置N-29～N-32(N-29，Y-30，T-31，N-32)及N125～D128(N-125，V-126，S-127，D-128)。潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)在圖5A，5B和5C中以VEGI-α氨基酸序列中的黑體的蘇氨酸符號(T)及在VEGI-α核苷酸序列中編碼蘇氨酸殘基的第一個核苷酸上用黑體的(*)標(biāo)示。潛在的PKC磷酸化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置T-32～K-34(T-32，N-33，K-34)和T-50～R-52(T-50，F(xiàn)-51，R-52)。潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)也在圖5A、5B和5C中，以VEGI-α氨基酸序列中的黑體的絲氨酸或蘇氨酸符號(S或T)標(biāo)示，及在VEGI-α核苷酸序列中編碼絲氨酸或蘇氨酸殘基的第-個核苷酸之上用(*)標(biāo)示。潛在的CK2磷酸化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置S-83～E-86(S-83，Y-84，P-85，E-86)；S-96～E-99(S-96，V-97，C-98，E-99)；S-115～E-118(S-115，L-116，Q-117，E-118)；S-130～D-133(S-130，L-131，V-132，D-133)；及T-135～D-138(T-135，K-136，E-137，D-138)。潛在的十四烷基化位點(diǎn)也在圖5A，5B和5C中以VEGI-α氨基酸序列中的雙下劃線示出。潛在的十四烷基化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-α氨基酸序歹的下列位置中G-20～K-25(G-20，L-21，A-22，F(xiàn)-23，T-24，K-25)及G-111～L-116(G-111，A-112，M-113，F(xiàn)-114，S-115，L-116)。
圖6A和6B圖示了本發(fā)明VEGI-β多肽的cDNA(SEQ ID NO26)及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO27)。使用標(biāo)準(zhǔn)單字母代表氨基酸。氨基酸甲硫氨酸-1至色氨酸-35是預(yù)測的胞內(nèi)區(qū)。氨基酸殘基丙氨酸-36至丙氨酸-61(下劃線處)是推定的跨膜序列。氨基酸殘基谷氨酰胺-62至亮氨酸-251(下劃線處)是推定的跨膜序列。潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)在圖6A和6B中，以在VEGI-β氨基酸序列中的黑體的天冬酰胺符號(N)標(biāo)示，及在VEGI-β核苷酸序列中編碼天冬酰胺殘基的第一個核苷酸之上以黑體的(#)標(biāo)示。潛在的N-連接的糖基化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-β氨基酸序的下列位置N-133～N-136(N-133，Y-134，T-135，N-136)及N-229～D-232(N-229，V-230，S-231，D-232)。潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)也在圖6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的黑體的絲氨酸或蘇氨酸符號(S或T)標(biāo)示，及在VEGI-β核苷酸序列中編碼蘇氨酸殘基的第一個核苷酸之上用(*)標(biāo)示。潛在的PKC磷酸化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-β氨基酸序列的下列位置S-23～R-25(S-23，C-24，R-25)；S-32～R-34(S-32，A-33，R-34)；T-135～K-137(T-135，N-136，K-137)；及T-154～R-156(T-154，F(xiàn)-155，R-156)。潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)也在圖6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的黑體的絲氨酸或蘇氨酸(S或T)標(biāo)示，及在VEGI-β核苷酸序列中編碼絲氨酸或蘇氨酸殘基的第一個核苷酸之上用(*)標(biāo)示。潛在的CK2磷酸化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-β氨基酸序列的下列位置S-8～E-11(S-8，F(xiàn)-9，G-10，E-11)；S-187～E-190(S-187，Y-188，P-189，E-190)；S-200～E-203(S-200，V-201，C-202，E-203)；S-219～E-222(S-219，L-220，Q-221，E-222)；S-234～D-237(S-234，L-235，V-236，D-237)；及T-239～D-242(T-239，K-240，E-241，D-242)。潛在的十四基化位點(diǎn)也在圖6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的雙下劃線標(biāo)示。潛在的十四烷基化序列發(fā)現(xiàn)位于VEGI-β氨基酸序列的下歹位置G-6～E-11(G-6，L-7，S-8，F(xiàn)-9，G-10，E-11)；G-124～G-129(G-124，L-125，A-126，F(xiàn)-127，T-128，K-129)；及G-215～L-220(G-215，A-216，M-217，F(xiàn)-218，S-219，L-220)。
圖7示出VEGI-α氨基酸序列(SEQ ID NO9)的分析。圖中示出α，β，轉(zhuǎn)角及卷曲區(qū)；親水性及疏水性；兩親區(qū)；柔性區(qū)；抗原指數(shù)及表面概率，用列舉的計(jì)算機(jī)程序的缺省參數(shù)預(yù)測。在“抗原指數(shù)或Jameson-Wolf”圖中，陽性峰值表示VEGI多肽的高抗原區(qū)，即從此區(qū)可獲得本發(fā)明的帶有表位的肽。
發(fā)明詳述盡管本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列和氨基酸序列在EP95903521.3中作為TNF-γ已經(jīng)闡述，但此分子的新的抗血管發(fā)生活性及新的內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性未被揭示。
因而，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的VEGI多核苷酸及多肽，及通過施用這些多核苷酸和多肽治療由血管發(fā)生引起的或與其相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽可分離自體液，包括但非限于血清、尿及腹水，或通過化學(xué)或生物學(xué)方法合成(如細(xì)胞培養(yǎng)，重組基因表達(dá))。重組技術(shù)包括用PCR從DNA源料中基因擴(kuò)增，及用逆轉(zhuǎn)錄酶/PCR從RNA源料中基因擴(kuò)增。VEGI抑制血管在組織中的生長，如非血管化的或血管化的腫瘤。本發(fā)明包括分子量約為22KD的蛋白質(zhì)，及此蛋白質(zhì)的任何修飾形式，包括但非限于截短的或翻譯后修飾物，如能壓制內(nèi)源生長因子的血管發(fā)生活性的此蛋白質(zhì)的糖基化形式。VEGI的核苷酸序列分別示于SEQID NO1，SEQ ID NO8，SEQ ID NO26，VEGI的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO9和SEQ ID NO27，VEGI的活性形式跨越SEQID NO22，所示蛋白質(zhì)的39～174氨基酸。VEGI的天然形式未確定。生物活性形式可能是二聚體、三聚體或多聚體。本發(fā)明還涉及包含于本發(fā)明VEGI多核苷酸或多肽內(nèi)序列的任何等位基因變異及特異性表位或區(qū)域，其導(dǎo)致血管發(fā)生的抑制。這些序列可用于設(shè)計(jì)抗-VEGI制劑如反義寡核苷酸，或用于生產(chǎn)抑制VEGI功能的抗體，如此序列和制劑可用于改善或預(yù)防與血管發(fā)生相關(guān)的疾病。
盡管示出并闡述了人VEGI的序列，應(yīng)了解的是由于人VEGI能抑制牛及鼠內(nèi)皮細(xì)胞生長，所以VEGI在物種之間是很保守的。來自其它物種的VEGI序列可用本申請揭示的序列及功能信息克隆。因而來自人之外其它物種的VEGI多核苷酸和多肽也包含于本申請內(nèi)。
本發(fā)明另外提供了分離的核酸分子，此分子包括編碼圖5A，5B和5C所示氨基酸序列(SEQ ID NO9)的VEGI多肽的多核苷酸，其通過對克隆的cDNA(HUVE091)測序而確定。本發(fā)明的VEGI多肽與人VEGI(SEQ ID NO10)，VEGI-β(SEQ ID NO11)，人淋巴毒素β(SEQ ID NO12)和FAS配體(SEQ ID NO13)呈序列同源。本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽功能包括但非限于抑制血管發(fā)生，作為抗腫瘤的類細(xì)胞因子分子，通過抑制骨及軟骨中與pannus侵入相關(guān)的血管發(fā)生和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖而治療關(guān)節(jié)炎，作為NF-κB和c-Jun激酶(JNK)的誘導(dǎo)劑，細(xì)胞粘附的誘導(dǎo)劑，及編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)劑。SEQ ID NO8所示的核苷酸序列可通過對cDNA克隆(HUVE091)進(jìn)行測序而得，該克隆在1994年10月26日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，登記號75927。保藏的質(zhì)粒包含在pBluescript SK(-)質(zhì)粒中(Stratagene，La Jolla，CA)。
本發(fā)明還提供分離的核酸分子，該分子含有編碼具有圖6A和6B所示氨基酸序列(SEQ ID NO27)的VEGI-β多肽的多核苷酸(SEQID NO26)，其通過對一克隆的cDNA(HEMCZ56)測序而確定。VEGI-β多肽是本文揭示的VEGI多肽的一剪切變體。SEQ ID NO26所示的核苷酸序列可通過對一cDNA克隆(HEMCZ56)測序而獲得，該克隆在1998年7月9日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，登錄號為203055。保藏的質(zhì)粒包含在pBluescript SK(-)質(zhì)粒中(Stratagene，La Jolla，CA.)核酸分子核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，就DNA分子或多核苷酸而言，是指脫氧核糖核苷酸的序列，就RNA分子或多核苷酸而言，指核糖核苷酸(A，G，C和U)的相應(yīng)序列，其中在特異的脫氧核糖核苷酸序列中的每個胸苷脫氧核糖核苷酸(T)由核糖核苷酸尿苷(U)置換。
應(yīng)用本文提供的信息，如圖5A，5B和5C中的核苷酸序列(SEQID NO8)，或圖6A，6B中的核苷酸序列(SEQ ID NO26)，用標(biāo)準(zhǔn)的克隆及篩選步驟，如用mRNA作起始物克隆cDNAs的程序，可獲得編碼VEGI或VEGI-β多肽的本發(fā)明的核酸分子(即多核苷酸)。例如，編碼VEGI多肽的多核苷酸通?？傻米员磉_(dá)VEGI的任何細(xì)胞或組織源料，如人腎和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。例如，圖5A，5B和5C(SEQ ID NO8)所述的核酸分子在衍生自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的-cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。此相應(yīng)于VEGI的cDNA克隆(HVVE091克隆)含有編碼174個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，大約頭27個氨基酸是推定的前導(dǎo)序列，如此成熟的蛋白質(zhì)含有147個氨基酸。此蛋白質(zhì)與兔TNF-α(Ito，H.，et al.，DNA 5157-165(1986)；Genbank登錄號.M 12846；SEQ ID NO14)在C-末端呈最高同源，在111個氨基酸長的序列中38％相同，58％相似。在TNF家族成員中保守的序列在VEGI中也是保守的。
另外，編碼VEGI-β多肽的多核苷酸通常可得自誘導(dǎo)的及靜息的內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈、扁桃體及一些其它細(xì)胞和組織類型。例如，圖6A和6B(SEQ ID NO26)中所述的核酸分子在衍生自誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的一cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。相應(yīng)于VEGI-β的該cDNA克隆(HEMCZ56)含有編碼251個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，大約頭35個氨基酸殘基是推定的胞內(nèi)區(qū)，且36-61位氨基酸是推定的跨膜區(qū)。62-251個氨基酸殘基是推定的胞外結(jié)構(gòu)域。
構(gòu)成胞外、跨膜及胞內(nèi)區(qū)的氨基酸殘基已經(jīng)通過計(jì)算機(jī)分析而被預(yù)測。因而熟練技術(shù)人員將意識到構(gòu)成這些區(qū)的氨基酸殘基可依于用于限定每個區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)輕微變化(如大約1-15個氨基酸殘基變化)。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖5A，5B和5C(SEQ ID NO9)的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或編碼由在1994年10月26日保藏在ATTC的，保藏號為75927的命名為HUVE091的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
另外，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖6A和6B(SEQ ID NO27)的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或編碼由在1998年7月9日在保藏在ATCC的，保藏號為203055的命名為HEMCZ56的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
“分離的”核酸分子或多核苷酸指DNA或RNA分子，其已從其天然環(huán)境中移出。例如，包含在載體的重組DNA分子(多核苷酸)在本發(fā)明中被認(rèn)為是分離的。分離的DNA分子(多核苷酸)的其它例子包括保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子，或在溶液中純化的(部分或基本上純化的)DNA分子。分離的RNA分子(多核苷酸)包括本發(fā)明的DNA分子(多核苷酸)的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子或多核苷酸還包括合成生產(chǎn)的如此分子。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，其DNA形式可包括cDNA，基因組DNA及合成DNA。該DNA可以是雙鏈或單鏈的，且如果是單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括SEQ ID NO8中揭示的編碼成熟VEGI多肽的多核苷酸序列，SEQID NO26中描述的編碼成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，包含于保藏在ATCC，保藏號為75927的保藏克隆(HUVE091)內(nèi)的編碼成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，包含于保藏在ATCC，保藏號為203055的保藏克隆(HEMCZ56)內(nèi)的編碼成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，及含有不同于上述序列，但由于遺傳密碼的簡并性而編碼與SEQ ID NO1，SEQ ID NO8和SEQ ID NO26的DNA或保藏的cDNA所編碼的相同的成熟多肽的多核苷酸序列。當(dāng)然本領(lǐng)域熟知此遺傳密碼，因而本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)產(chǎn)生如此簡并變體。
本發(fā)明提供了編碼VEGI多肽蛋白成熟形式的核酸分子。此完整VEGI多肽的氨基酸序列包括一前導(dǎo)序列和一成熟蛋白質(zhì)，如圖5A，5B和5C(SEQ ID NO9)及SEQ ID NO2所示。根據(jù)信號假說，一旦生長蛋白質(zhì)鏈穿過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出已經(jīng)開始，由哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有一信號或分泌性前導(dǎo)序列，其從完整多肽中切割下以產(chǎn)生分泌的“成熟”形式的蛋白質(zhì)。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞和甚至昆蟲細(xì)胞以相同特異性切割分泌的蛋白質(zhì)。但在某些情況下，分泌蛋白的切割不是完全一致的，其導(dǎo)致兩或多種蛋白質(zhì)的成熟物種。另外，很早就已知分泌蛋白的切割特異性最終通過完整蛋白的一級結(jié)構(gòu)而確定，即，其是多肽的氨基酸序列中固有的。因而，本發(fā)明提供一編碼成熟VEGI多肽核苷酸序列，該成熟多肽具有由包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。“具有由包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟VEGI多肽”是指在由保藏克隆的人DNA序列編碼的完整開放讀框在哺乳動物細(xì)胞(如前述COS細(xì)胞)中表達(dá)產(chǎn)生的VEGI多肽的成熟形式。
編碼圖6A和6B(SEQ ID NO26)的成熟多肽，或編碼由保藏的cDNA(HEMCZ56)編碼的成熟多肽的多核苷酸可包括但非限于僅成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列及附加的編碼序列如前導(dǎo)或分泌序列或跨膜序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(及任選的附加編碼序列)及非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽5’和/或3’編碼序列的非編碼序列。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可融合有助于多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)及分泌的多核苷酸序列的相同讀框，例如，作為分泌序列調(diào)節(jié)多肽從細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白并可由宿主細(xì)胞切割前導(dǎo)序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可編碼是成熟蛋白加上附加的5’氨基酸殘基的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一種蛋白原，并且是失活形式的蛋白質(zhì)。一旦序列原被切割，剩下的是活性的蛋白質(zhì)。
因此，例如本發(fā)明的多核苷酸可編碼成熟蛋白質(zhì)，或編碼具有序列原的蛋白質(zhì)，或編碼具有序列原或前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸也可具有融入框內(nèi)的標(biāo)記序列的編碼序列其可使本發(fā)明的多肽純化。此標(biāo)記序列在細(xì)菌宿主情況下可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，以供純化與標(biāo)記物融合的成熟多肽，或例如當(dāng)使用哺乳動物宿主如COS-7細(xì)胞時，標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)記。此HA標(biāo)記相當(dāng)于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson，I.，et a1；Cell，37767(1984))。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸，以及含有其它編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變體，其編碼具有圖5A、5B和5C和6A及6B(SEQID NO2，SEQ ID NO9及SEQ ID NO27)的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的片段(即一部分)，類似物及衍生物，及由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽。此多核苷酸的變體可以是多核苷酸的天然發(fā)生的等位基因變體，或非天然發(fā)生的變體。
因此，本發(fā)明包括編碼如(SEQ ID NO2和SEQ ID NO9)所示相同的成熟多肽，或由保藏克隆HUVE091的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸，以及該多核苷酸的變體，此變體編碼圖1A和1B的多肽或由保藏克隆HUVE091的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物，該核苷酸變體包括缺失變體，取代變體及添加或插入變體。
另外，本發(fā)明包括編碼如SEQ ID NO27所示的成熟多肽或由保藏克隆HEMCZ56的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸，以及該核苷酸的變體，該變體編碼SEQ ID NO203055的多肽或由保藏克隆HEMCZ56的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。該核苷酸變體包括缺失變體、取代變體及添加或插入變體。
如上所示，多核苷酸可具有是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示編碼序列的天然發(fā)生的等位變體的或是保藏克隆HUVE091的編碼序列的天然發(fā)生的等位變體的編碼序列?；蛘?，此多核苷酸可具有是如SEQ ID NO26所示編碼序列或保藏克隆HEMCZ56的編碼序列的天然發(fā)生的等位變體的編碼序列。如本領(lǐng)域所知，等位變體是多核苷酸序列的一種變化形式，其可取代，缺失或加入一或多個核苷酸，但基本不改變編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及本文所述的分離的核酸分子的片段。具有保藏的cDNA(HUVE091和HEMCZ56)的核苷酸序列，或圖5A，5B和5C(SEQ NO1和SEQ ID NO8)及圖6A和6B(SEQ ID NO26)所示的核苷酸序列的，或其互補(bǔ)鏈的分離的核酸分子的片段，是指長度至少15nt，優(yōu)選至少20nt，更優(yōu)選至少30nt，還更優(yōu)選至少40，50，100，150，200，250，300，400，或500nt的片段。這些片段具有多種用途，包括但非限于如本文所述的診斷探針或引物。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，較長的長度為50-1500nt的片段也是實(shí)用的，相應(yīng)于保藏的cDNA克隆HUVE091、保藏的cDNA克隆HEMCZ56的核苷酸序列，SEQ ID NO8中揭示的核苷酸序列，或SEQ ID NO27中揭示的核苷酸序列的大部分，(如果不是全部)的片段同樣也是實(shí)用的。長度至少為20nt的片段是指如包括保藏的cDNA克隆(HUVE091和HEMCZ56)的核苷酸序列，SEQ ID NO1，SEQ ID NO8及SEQIDNO26所示的核苷酸序列的20或多個連續(xù)堿基的片段。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸片段編碼具有功能活性的多肽具有“功能活性”的多肽是指能顯示一或多種已知與完整的或成熟VEGI多肽相關(guān)的功能活性的多肽。此功能活性包括但非限于生物學(xué)活性(如抑制血管發(fā)生，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞粘附，抗原性[結(jié)合抗VEGI和/或抗VEGI-B抗體〔或與VEGI和/或VEGI-β多肽競爭結(jié)合對所述抗體的結(jié)合〕的能力，免疫原性(產(chǎn)生與VEGI和/或VEGI-β多肽結(jié)合的抗體的能力)，與其它VEGI多肽形成聚合物的能力，及與VEGI多肽受體或配體(如DR3)結(jié)合的能力。
本發(fā)明還提供具有與SEQ ID NO8的延伸片段相關(guān)的核苷酸序列的核酸分子，其己從以下相關(guān)cDNA克隆中確定HUVE091(SEQ IDNO15)，HMPAP05(SEQ ID NO16)，HSXCA44(SEQ ID NO17)，HEMFG66(SEQ ID NO18)，和HELAM93(SEQ ID NO19)。
本發(fā)明還提供具有與SEQ ID NO26的延伸片段相關(guān)的核苷酸序列的核酸分子，其已從以下相關(guān)cDNA克隆中確定HUVE091P01(SEQ ID NO28)，HMPTI24R(SEQ ID NO29)，HELAM93R(SEQ ID NO30)，和HEMFG66R(SEQ ID NO31)。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸片段含有或由含有SEQID NO8的1-2442核苷酸殘基的至少30個，優(yōu)選至少50個核苷酸的任何一部分的多核苷酸組成，優(yōu)選排除從上述cDNA克隆確定的核苷酸序列。本發(fā)明的VEGI多核苷酸片段的代表例子包括含有或由SEQ ID NO1[其互補(bǔ)多核苷酸鏈，或包含于保藏克隆HUVEO91的cDNA]的下述核苷酸組成的片段783-1304，800-1300，850-1300，900-1300，950-1300，1000-1300，1050-1300，1100-1300，1150-1300，1200-1300，1250-1300，783-1250，800-1250，850-1250，900-1250，950-1250，1000-1250，1050-1250，1100-1250，1150-1250，1200-1250，783-1200，800-1200，850-1200，900-1200，950-1200，1000-1200，1050-1200，1100-1200，1150-1200，783-1150，800-1150，850-1150，900-1150，950-1150，1000-1150，1050-1150，1100-1150，783-1100，800-1100，850-1100，900-1100，950-1100，1000-1100，1050-1100，783-1050，800-1050，850-1050，900-1050，950-1050，1000-1050，783-1000，800-1000，850-1000，900-1000，950-1000，783-950，800-950，850-950，900-950，783-900，800-900及850-900的。
在另外的特異實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸片段含有或由含有SEQ ID NO26從1-1116核苷酸殘基的至少30個，優(yōu)選至少50個核苷酸的任何一部分的多核苷酸組成，優(yōu)選除去從上述cDNA克隆中確定的核苷酸序列。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案包括編碼含有或由SEQ ID NO2的殘基-1-147(即-1至147)，1-147(即+1-147)，2-147，3-147，4-147，5-147，6-147，7-147，8-147，9-147，10-147，11-147，12-147，13-147的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。編碼這些多肽的多核苷酸也被提供。
本發(fā)明的VEGI-β多核苷酸片段的代表例子包括含有或由SEQID NO19[或其互補(bǔ)核苷酸鏈，或包含于保藏克隆HEMCZ46的cDNA]的下述核苷酸組成的片段1-1116，50-1116，100-1116，150-1116，200-1116，250-1116，300-1116，350-1116，400-1116，450-1116，500-1116，550-1116，600-1116，650-1116，700-1116，750-1116，800-1116，850-1116，900-1116，950-1116，1000-1116，1050-1116，1-1100，50-1100，100-1100，150-1100，200-1100，250-1100，300-1100，350-1100，400-1100，450-1100，500-1100，550-1100，600-1100，650-1100，700-1100，750-1100，800-1100，850-1100，900-1100，950-1100，1000-1100，1050-1100，1-1050，50-1050，100-1050，150-1050，200-1050，250-1050，300-1050，350-1050，400-1050，450-1050，500-1050，550-1050，600-1050，650-1050，700-1050，750-1050，800-1050，850-1050900-1050，950-1050，1000-1050，1-1000，50-1000，100-1000，150-1000，200-1000，250-1000，300-1000，350-1000，400-1000，450-1000，500-1000，550-1000，600-1000，650-1000，700-1000，750-1000，800-1000，850-1000，900-1000，950-1000，1-950，50-950，100-950，150-950，200-950，250-950，300-950，350-950，400-950，450-950，500-950，550-950，600-950，650-950，700-950，750-950，800-950，850-950，900-950，1-900，50-900，100-900，150-900，200-900，250-900，300-900，350-900，400-900，450-900，500-900，550-900，600-900，650-900，700-900，750-900，800-900，850-900，1-850，50-850，100-850，150-850，200-850，250-850，300-850，350-850，400-850，450-850，500-850，550-850，600-850，650-850，700-850，750-850，800-850，1-800，50-800，150-800，200-800，250-800，300-800，350-800，400-800，450-800，500-800，550-800，600-800，650-800，700-800，750-800，1-750，50-750，100-750，150-750，200-750，250-750，300-750，350-750，400-750，450-750，500-750，550-750，600-750，650-750，700-750，1-700，50-700，100-700，150-700，200-700，250-700，300-700，350-700，400-700，450-700，500-700，550-700，600-700，650-700，1-650，50-650，100-650，150-650，200-650，250-650，300-650，350-650，400-650，450-650，500-650，550-650，600-650，1-600，50-600，100-600，150-600，200-600，250-600，300-600，350-600，400-600，450-600，500-600，550-600，1-550，50-550，100-550，150-550，200-550，250-550，300-550，350-550，400-550，450-550，500-550，1-500，50-500，100-500，150-500，200-500，250-500，300-500，350-500，400-500，450-500，1-450，50-450，100-450，250-450，200-450，250-450，300-450，350-450，400-450，1-400，50-400，100-400，150-400，200-400，250-400，300-400，350-400，1-350，50-350，100-350，150-350，200-350，250-350，300-350，1-300，50-300，100-300，150-300，200-300，250-300，1-250，50-250，100-250，150-250，200-250，1-200，50-200，100-200，150-200，1-150，50-150，100-150，1-100，50-100及1-50。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段還包括如下核酸分子，此核酸分子編碼一或多個SEQ ID NO2的以下結(jié)構(gòu)域VEGI潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)N-29～N-32(N-29，Y-30，T-31，N-32)和N-125D-128(N-125，V-126，S-127，D-128)；潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)T-32～K-34(T-32，N-33，K-34)和T-50～R-52(T-50，F(xiàn)-51，R-52)；潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)S-83～E-86(S-83，Y-84，P-85，E-86)；S-96～E-99(S-96，V-97，C-98，E-99)；S-115～E-118(S-115，L-115，Q-117，E-118)；S-130～D-133(S-130，L-131，V-132，D-133)；及T-135～D-138(T-135，K-136，E-137，D-138)；及潛在的十四烷基化位點(diǎn)G-20～K-25(G-20，L-21，A-22，F(xiàn)-23，T-24，K-25)及G-111～L-116(G-111，A-112，M-113，F(xiàn)-114，S-115，L-116)。
本發(fā)明尤為優(yōu)選的多核苷酸是那些特征在于編碼VEGI的結(jié)構(gòu)或功能屬性的多核苷酸。該多核苷酸編碼包括VEGI的α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)(“α區(qū)”)，β-片層及β-片層形成區(qū)(“β區(qū)”)，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲及卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，親水區(qū)，疏水區(qū)，α兩親區(qū)，β兩親區(qū)，表面形成區(qū)，及高抗原指數(shù)區(qū)(即具有三或多個連續(xù)氨基酸殘基的抗原區(qū)，每個抗原指數(shù)高于或等于1.5)的氨基酸殘基。優(yōu)選區(qū)是圖7的陳列的那些，并包括但非限于用指出的計(jì)算機(jī)程序的缺省參數(shù)分析SEQ ID NO9描繪的氨基酸序列而鑒定的前述區(qū)域類型，此優(yōu)選的區(qū)域包括Gamier-Robsonα區(qū)，β區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)，Chou-Fasman α區(qū)，β區(qū)及卷曲區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)及疏水區(qū)，Eisenberg α及β兩親區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Emini表面形成區(qū)及抗原指數(shù)的Jameson-Wolf區(qū)。
在以如上述VEGI方式代表VEGI-β的數(shù)據(jù)用SEQ ID NO27中揭示的氨基酸序列可易于制備。如此，以上列出的VEGI的每種上列的結(jié)構(gòu)或功能屬性(即Gamier-Robson α區(qū)，β區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)，Chou-Fasman α區(qū)，β區(qū)及卷曲區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)及疏水區(qū)，Eisenberg α和β兩親區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Emini表面形成區(qū)及高抗原指數(shù)的Jameson-Wolf區(qū)等)同樣適用于VEGI和VEGI-β。
此方面的優(yōu)選區(qū)見于圖7中所列出的，但也可以是通過將圖7中的數(shù)據(jù)列表表示而代表或鑒別的。用于產(chǎn)生圖7數(shù)據(jù)的DNA*STAR計(jì)算機(jī)算法(設(shè)為原始缺省參數(shù))易于在如此列表方式中給出圖7中的數(shù)據(jù)。列表形式的圖7中數(shù)據(jù)可用于方便地測定優(yōu)選區(qū)的特異分界線。
圖7中所列的上述優(yōu)選區(qū)包括但非限于通過分析SEQ ID NO2，SEQ ID NO9和SEQ ID NO27所示氨基酸序列鑒定的前述區(qū)域類型。如圖7所列所示，該優(yōu)選區(qū)包括Gamier-Robson α區(qū)，β區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)，Chou-Fasman α區(qū)，β區(qū)及卷曲區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)及疏水區(qū)，Eisenberg α及β兩親區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Emini表面形成區(qū)及高抗原指數(shù)的Jameson-Wolf區(qū)。
在此方面高度優(yōu)選的片段是那些含有兼有一些結(jié)構(gòu)特征，如上述一些(如1，2，3或4)特征的VEGI和/或VEGI-β的區(qū)域。
本發(fā)明其它優(yōu)選核酸片段包括編碼VEGI多肽一或多個具有表位部分的核酸分子。尤其地，本發(fā)明的核酸片段包括如下核酸分子，此核酸分子編碼含有SEQ ID NO9從大約Thr-24至大約Asn-32的氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Ile-37至大約Ile-45的氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Met-54至Arg62的氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Gln-63至大約Asp-71氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Glu-57至大約Gly-65氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Val-80至大約Thr-88氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Leu-116至大約Val-124氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9從大約Asp-133至大約Phe-141氨基酸殘基的多肽。這些多肽片段通過分析Jameson-Wolf抗原指數(shù)，如圖7所示，已被確定具有VEGI多肽的抗原性表位。測定其它VEGI的如此表位具有部分的方法見下述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用上述Jameson-Wolf抗原指數(shù)分析，如圖7所示，可方便地測定具有VEGI-β蛋白抗原性表位的多肽片段。測定其它VEGI-β的如此表位具有部分的方法見下述。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及這樣的多核苷酸，其優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下，與本發(fā)明的多核苷酸的一部分多核苷酸序列雜交，如包含于ATCC保藏號75927的cDNA克隆，包含于ATCC保藏號203055的cDNA克隆，或本文所述VEGI多核苷酸片段?！皣?yán)格雜交條件”指在42℃，在含50％甲酰胺，5XSSC(750mm NaCl，75mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(PH7.6)，5X Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯及20μg/ml變性的，剪切的鮭精DNA的溶液中培養(yǎng)過夜，隨后在大約65℃在0.1XSSC中洗滌濾膜。與多核苷酸一“部分”雜交的多核苷酸是指與提及的多核苷酸的至少15個(nt)，優(yōu)選至少20nt，更優(yōu)選至少30nt，還更優(yōu)選30-70或80-150nt，或全長的核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些如上述可用作診斷探針及引物并詳見下述。當(dāng)然，只與聚A序列(如SEQ ID NO1，SEQ ID NO8或SEQ ID NO26所示VEGI cDNA的3’末端多段)雜交，或與T(或U)殘基的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸不包括在本發(fā)明的用于與本發(fā)明核酸一部分雜交的多核苷酸中，因?yàn)槿绱硕嗪塑账釋⑴c含聚A序列或其互補(bǔ)序列的任何核酸分子雜交(如實(shí)際上用寡dT作引物產(chǎn)生的任何產(chǎn)物雙鏈cDNA克隆)在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與本文揭示的參照多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽基本保持與由SEQIDNO1，SEQ ID NO8和/或SEQID NO26所示多核苷酸序列或保藏的cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸分子的變體，其編碼VEGI多肽的一部分，類似物或衍生物。變體可天然發(fā)生，如天然等位變體?！暗任蛔凅w”是指占據(jù)生物體的染色體上給定的基因座的基因的一些變化形式之一種(Genes Ⅱ，Lewin B.，ed.，John Wiley ＆ Sons.New York(1985))。非天然發(fā)生的變體可用已知誘變技術(shù)生產(chǎn)。
如此變體包括那些通過本文所述多核苷酸序列(包括片段)的核苷酸取代，缺失或加入而產(chǎn)生的。取代、缺失或加入可包含一或多個核苷酸。變體可以是在編碼區(qū)，非編碼區(qū)，或二者均改變動，在編碼區(qū)內(nèi)的改變可產(chǎn)生保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或加入。其中尤為優(yōu)選的是沉默取代，加入及缺失，其不改變VEGI多肽或其部分的性質(zhì)及活性。在此方面也尤為優(yōu)選的是保守取代。
本發(fā)明的另外實(shí)施方案涉及含如下多核苷酸序列的分離的核酸分子，該序列與具有選自由以下各項(xiàng)組成的一組的核苷酸序列的多核苷酸至少70％或80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％或99％相同性(a)編碼具有SEQ IDNO2或SEQ ID NO9(即SEQ ID NO9的-27～147位)的完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO9除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO9-26-147位)的VEGI多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO9的1-147位氨基酸序列的成熟VEGI多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO9的由SEQ ID NO9的1-147位示出氨基酸序列的VEGI多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(e)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVE091編碼的完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVE091編碼的除N末端甲硫氨酸之外完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(g)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVE091編碼的氨基酸序列的成熟VEGI多肽的核苷酸序列；(h)編碼具有由ATCC保藏號75927的cDNA克隆HUVE091編碼的氨基酸序列的成熟VEGI多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(i)編碼本文所述多肽片段的核苷酸序列；(j)互補(bǔ)于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的多肽也包括具有與上述(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)或(j)中所述序列至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有與以上那些序列至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及含如下多核苷酸序列的分離的核酸分子，該分子與具有選自以下序列的核苷酸序列的多核苷酸至少70％或80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選95％，96％，97％，98％或99％相同(a)編碼具有SEQ ID NO27完整氨基酸序列(即SEQ ID NO27的1-251位)的VEGI-β多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO27中除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO27的2-251位)的VEGI-B多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO27中所示62-251位氨基酸序列的成熟VEGI-β多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO27所示1-35位氨基酸序列的VEGI-β多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(e)編碼具有由SEQ ID NO27所示的62-251位氨基酸序列的VEGI-β多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(f)編碼具有由ATCC保藏號203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列的VEGI-β多肽的核苷序列；(g)編碼具有由ATCC保藏號203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的VEGI-β多肽的核苷酸序列；(h)編碼具有由ATCC保藏號203055的cDNA克隆HUVE091編碼的氨基酸序列的成熟VEGI多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(i)編碼本文所述多肽片段的核苷酸序列；(j)互補(bǔ)于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)或(I)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的多肽也包括具有與上述(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)或(j)中所述序列至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有與以上那些序列至少90％更優(yōu)選至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
具有與本發(fā)明的參照核苷酸序列至少如95％“相同性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了此多核苷酸序列中每100個編碼VEGI多肽的參照核苷酸序列核苷酸中可包括接近5個點(diǎn)突變之外，此多核苷酸的核苷酸序列與相關(guān)序列相同。換言之，為獲得具有與參照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中至多5％的核苷酸可被缺失或用其它核苷酸取代，或者占參照序列總核苷酸5％的核苷酸可被插入?yún)⒄招蛄兄小４藚⒄?對比)序列可以是SEQ ID NO1，SEQ ID NO8和SEQ ID NO26中揭示的全部核苷酸序列，或如本文所述的任何片段。
實(shí)際上，任何特殊的核苷酸分子是否與例如SEQ ID NO8，SEQID NO26所示的核苷酸序列，或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可應(yīng)用已知計(jì)算機(jī)程序如Bestift程序常規(guī)測定(Wisconsin序列分析軟件包第8版，用于Unix，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，University Research Park，575Science Drive，Modison，WI 53711)。Bestfit應(yīng)用Smith及Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981))以在兩個序列之間發(fā)現(xiàn)最佳同源區(qū)段。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序?qū)Ρ瘸绦驕y定一特殊序列是否與本發(fā)明的參照序列有例如95％相同性時，設(shè)立參數(shù)，當(dāng)然，使得相同性百分率根據(jù)全長參照核苷酸序列計(jì)算，且允許有接近參照序列總核苷酸數(shù)5％的同源性缺口。
在一特異實(shí)施方案中，參照(對比)序列(本發(fā)明的序列)與試驗(yàn)序列間相同性，也指作總體序列對比，應(yīng)用基于Bmtlag等的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序(Comp.App.Biosci，6237-245(1990))進(jìn)行測定。優(yōu)選的用于FASTDB的DNA序列對比中以計(jì)算相同性百分率的參數(shù)是Matrix=Unitary，K-tuple=4，Mismatch Penalty=l，JoiningPenalty-30，Randomization Group Length=0，Cutoff Score=1，GapPenalty=5，Gap Size Penalty 0.05，Window Size=500或等于試驗(yàn)核苷酸序列的長度，哪個較短取哪個。根據(jù)此實(shí)施方案，如果試驗(yàn)序列由于5’或3’缺失而非由于內(nèi)在缺失而比相關(guān)序列短，考慮到當(dāng)計(jì)算相同性百分率時，F(xiàn)ASTDB程序未考慮試驗(yàn)序列5’和3’的截短，因而對結(jié)果進(jìn)行手工校正。與對比序列相關(guān)比在5’或3’末端截短的試驗(yàn)序列相同性百分率的校正通過計(jì)算是試驗(yàn)序列的5’和3’的對比序列的未配對/對比的堿基數(shù)，占對比序列的總堿基數(shù)的百分率而得。測定核苷酸是否是配對/對比的，通過FASTDB序列對比結(jié)果而定。然后將此百分率從通過以上FASTDB程序用特異參數(shù)計(jì)算的相同性百分率中扣除，以得到最終相同性百分率。此校正值是此實(shí)施方案之目的。只有經(jīng)FASTDB序列對比顯示未與相關(guān)序列配對/對比的試驗(yàn)序列5’和3’堿基之外的堿基被計(jì)算以用于以手工調(diào)整相同性百分率。例如，將90個堿基的試驗(yàn)序列與100個堿基的對比序列對比以測定相同性百分率。缺失發(fā)生在試驗(yàn)序列5’末端，因而FASTDB對比未示出在5’末端頭10個堿基的配對/對比。此10個未配對堿基代表10％的序列(在5’和3’末端未配對的堿基數(shù)／對比序列中總堿基數(shù))，因此將此10％從經(jīng)FASTDB程序計(jì)算而得的相同性百分率中扣除。如果剩下的90個堿基完全配對，最終相同性百分率為90％。在另一個例子中，90個堿基的試驗(yàn)序列與100個堿基的對比序列對比，這次缺失是內(nèi)部缺失，因而在試驗(yàn)序列的3’或5’上沒有與對比序列未配對/對比的堿基。在此情況下，經(jīng)FASTDB計(jì)算而得的相同性百分率不用手工校正。再一次，只是未與相關(guān)對比序列配對/對比的試驗(yàn)序列的5’和3’堿基需要手工校正。根據(jù)此實(shí)施方案，無其它手工校正需要進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2多肽的多核苷酸至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％相同的多核苷酸以及其片段，所述片段至少有30個，優(yōu)選至少有50個堿基，本發(fā)明還涉及由如此多核苷酸編碼的多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO27多肽的多核苷酸至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％相同的多核苷酸以及其片段，此片段至少有30個，優(yōu)選至少有50個堿基，本發(fā)明涉及由如此多核苷酸編碼的多肽。
本申請涉及與SEQ ID NO1，SEQ ID NO8，SEQ ID NO26所示的多核苷酸序列或保藏的cDNA克隆的核酸序列，或其片段至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的核酸分子，不論它們是否編碼有VEGI功能活性的多肽。但優(yōu)選的是本發(fā)明的核酸分子編碼有VEGI功能活性的多肽。“有VEGI功能活性的多肽”是指在特定免疫分析和/或生物學(xué)分析中測定的，與本發(fā)明的VEGI和/或VEGI-β多肽(全長蛋白，或優(yōu)選成熟蛋白)的活性相似，但非必須相同的多肽。例如，在如實(shí)施例6中所述在ABAE細(xì)胞培養(yǎng)中，或在如實(shí)施例10所述絨毛尿囊膜(CAM)血管發(fā)生分析中，或在其它實(shí)施例及本領(lǐng)域中所述的一些其它方式中，通過測定VEGI抑制FGF-2誘導(dǎo)的類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)能力，可測定VEGI的活性。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將立即認(rèn)識到，大量具有與保藏的cDNA的核酸序列或SEQ ID NO1，SEQ IDNO8，SEQ ID NO26所示核酸序列或其片段至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的核酸分子，將編碼“具有VEGI活性”的多肽。事實(shí)上，由于這些核苷酸序列的簡并變體全部編碼相同多肽，在許多情況下，即使不進(jìn)行上述分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員也清楚。本領(lǐng)域進(jìn)一步認(rèn)識到是，不是簡并變體的該核酸分子，有一些也編碼有VEGI活性的多肽。這是由于本領(lǐng)域技術(shù)人員充分認(rèn)識可能或不能明顯影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸取代(如用一種脂族氨基酸取代另一種脂族氨基酸)。例如，J.U.Bowie等在“Decipheringthe Message in Protein SequencesTolerance to Anrino AcidSubstitutions”，Science 2471306-1310(1990)中提供了關(guān)于怎樣進(jìn)行表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)，其中作者指出蛋白質(zhì)能令人驚奇地耐受氨基酸取代。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含編碼如下VEGI多肽(如本文所述VEGI片段)的氨基酸序列的多核苷酸的分離的核酸分子，該多肽的氨基酸序列含有至少一個但不超過50個，優(yōu)選不超過40個，更優(yōu)選不超過30個，還更選不超過20個，10-20個，5-10個，1-5個，3-5個或1-3個保守氨基酸取代。當(dāng)然，以漸高優(yōu)選之中順序，高度優(yōu)選的是多核苷酸編碼的VEGI多肽的氨基酸序列具有含有不超過10，9，8，7，6，5，4，3，2或1個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
載體及宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明分離的多核苷酸的載體；用重組載體遺傳工程化的或其它方式工程化的產(chǎn)生本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞；以及經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，載體可以是如克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式的。工程化的宿主細(xì)胞可以在適于激活啟動子，選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增VEGI基因的修改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如溫度，pH等是那些適于宿主細(xì)胞選擇性表達(dá)并為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件。
本發(fā)明的多核苷酸通過重組技術(shù)可用于生產(chǎn)多肽。這樣，例如此多核苷酸可包含于各種表達(dá)載體中以表達(dá)多肽。如此載體包括染色體，非染色體及合成DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒與噬菌體DNA的組合物載體、病毒DNA如痘苗、腺病毒、禽痘病毒及擬狂犬病病毒。但其它任何載體只要在宿主中可復(fù)制并可生存也可應(yīng)用。
適當(dāng)?shù)腄NA序列可通過各種方法插入載體中。通常用本領(lǐng)域已知方法將DNA序列插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。該方法及其它方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知范圍內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列與指導(dǎo)mRNA合成的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動子)可操縱相連。如此啟動子的代表例子是LTR或SV40啟動子，E.coli Lac或trp，λ噬菌體P啟動子及其它已知控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。此表達(dá)載體也含有一為翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及一轉(zhuǎn)錄終止子。此載體還可包括適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增表達(dá)的序列。
另外，此表達(dá)載體優(yōu)選含有一或多個可選擇標(biāo)記基因，以為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型性狀，如對于真核細(xì)胞培養(yǎng)物為的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如在E.coli中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
如上所述的含適當(dāng)DNA序列，以及適當(dāng)?shù)膯幼踊蚩刂菩蛄械妮d體可用于轉(zhuǎn)化一適當(dāng)宿主，以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
適當(dāng)宿主的代表例子是細(xì)菌細(xì)胞如E.coli，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；昆蟲細(xì)胞如Drosophila S2和S19；動物細(xì)胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤，腺病毒，植物細(xì)胞等。選擇適當(dāng)?shù)乃拗鞲鶕?jù)本文教導(dǎo)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
更特別地，本發(fā)明還包括含有一或多個前述序列的重組構(gòu)建體。此構(gòu)建體含有一載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在其中本發(fā)明的序列已正向或反向插入。在此實(shí)施方案一優(yōu)選方面中，此構(gòu)建體還含有調(diào)節(jié)序列，包括如與所述序列可操作相連的啟動子。本領(lǐng)域已知大量合適的載體及啟動子，并且是可商購的。如以下載體細(xì)胞載體pHE4-5(ATCC登錄號.209311；及其變異)，pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，真核載體，pWLNEO，pSVZCAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但只要可在宿主中復(fù)制并生存的其它質(zhì)?；蜉d體也可應(yīng)用。
應(yīng)用CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)載體或其它具有可選擇標(biāo)記的載體可從任何所需基因中選擇啟動子區(qū)。二種適當(dāng)?shù)妮d體是PKK232-8及PCM7。特殊提到的細(xì)菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP，P，及trp。真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期及晚期SV40，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs，及鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動子在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。此宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。此構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可由受磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔實(shí)現(xiàn)(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)基本方法(1986))。
除含有本文所述的載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞之外，本發(fā)明還包括脊椎動物起源的尤其是哺乳動物起源的原化、次代及無限增殖化的宿主細(xì)胞，其已被工程化以缺失或置換內(nèi)源性遺傳物質(zhì)(如VEGI編碼序列)，和/或包括遺傳物質(zhì)(如異源多核苷酸序列)，該遺傳物質(zhì)可操作地與本發(fā)明VEGI多核苷酸相連，并激活、改變和/或擴(kuò)增內(nèi)源性VEGI多核苷酸。例如，本領(lǐng)域已知技術(shù)可用于經(jīng)同源重組合連接異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強(qiáng)子)及內(nèi)源性VEGI多核苷酸序列(見如美國專利5，641，670，1997年6月24日頒布；國際公開WO96/29411，1996年9月26日公開；；國際公開.WO94/12650，1994年8月4日公開；Koller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra et al；Nature 342435-438(1989)，每篇揭示全部并入?yún)⒖?宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以常規(guī)方式用于產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘撸景l(fā)明的多肽可通過常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。
在適當(dāng)?shù)膯幼拥目刂葡?，成熟蛋白質(zhì)可在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用衍生自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA生產(chǎn)如此蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)挠糜谡婧思霸怂拗鞯目寺〖氨磉_(dá)載體見于Sambrook等在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第2版，冷泉港r，N.Y.，(1989)中所述，并全部并入?yún)⒖肌?br> 高等真核細(xì)胞編碼本發(fā)明多肽的DNA對的轉(zhuǎn)錄，通過在載體中插入增強(qiáng)子序列而得以提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常大約10-300bp，作用于啟動子以提高其轉(zhuǎn)錄。實(shí)例包括在復(fù)制起點(diǎn)100-270bp的晚期側(cè)上的SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子，在復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)上的多瘤病毒增強(qiáng)子，及腺病毒增強(qiáng)子。
通常地，重組表達(dá)載體將包括復(fù)制起點(diǎn)及的使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因及釀灑酵母TRP1基因，及衍生自高表達(dá)的基因的啟動子以引導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。該啟動子可衍生自編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)α因素酸性磷酸酶或熱激蛋白的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列以合適方式翻譯起始與及終止序列，優(yōu)選能引導(dǎo)翻譯的蛋白直接分泌入壁膜間隙或胞外培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列裝配。任選地，異源序列可編碼一融合蛋白，該蛋白包括呈遞所需特性如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性或純化簡便性的N-末端鑒定肽。
細(xì)菌所用有效的表達(dá)載體的構(gòu)建是將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列，與合適的翻譯起始及終止信號一起插入具有，功能啟動子的可操縱閱讀相。此載體將含有一或多個表型選擇標(biāo)記及一復(fù)制起點(diǎn)，以保證載體的維持且如果需要，在宿主內(nèi)提供擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌及假單胞菌屬，鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的種，當(dāng)然其它細(xì)菌也可根據(jù)需要選擇應(yīng)用。
作為一代表性但非限制性實(shí)例，細(xì)菌用表達(dá)載體可包含衍生自可商購質(zhì)粒選擇標(biāo)記及的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，該質(zhì)粒包括熟知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件。如此商購載體包括如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)及GEM1(PromegaBioteec Medison，WI，USA)。這些pBR322“主鏈”部分與適當(dāng)啟動子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。
在轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并使該宿主菌株生長至適當(dāng)細(xì)胞密度后，通過適當(dāng)方法(如升溫或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，并將細(xì)胞培養(yǎng)一段時間。經(jīng)離心收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)方法破壞，并將所得粗提物進(jìn)一步純化。
用于蛋白質(zhì)表達(dá)的微生物細(xì)胞可通過任何常規(guī)方法破壞，包括冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎、或用細(xì)胞裂解劑，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括Gluzman(Cell 23175(1981))所述的猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系，及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa及BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體將含有一復(fù)制起點(diǎn)，一合適的啟動子及增強(qiáng)子，也包括任何必須的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體及受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，及5’側(cè)翼未轉(zhuǎn)錄序列。衍生自SV40剪接體的DNA序列及聚腺苷酸化位點(diǎn)可用于提供所要求的未轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。
通過以下方法，可從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化VEGI多肽硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集素層析。根據(jù)所需，在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型時可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行最后純化。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化產(chǎn)物，或化學(xué)合成產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(如培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞)中生產(chǎn)的。依于用于重組生產(chǎn)步驟之宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括一起始甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明人已產(chǎn)生出至少15種VEGI表達(dá)構(gòu)建體，以促進(jìn)不同VEGI多肽的生產(chǎn)的及在不同系統(tǒng)中VEGI多肽的生產(chǎn)。其中4種已經(jīng)被構(gòu)建為編碼全長VEGI多肽。此全長構(gòu)建體是(ⅰ)pQE9TNFg-27/147，(ⅱ)pQE70TNFg，(ⅲ)CITNFg及pcDNA3TNFg。在所列第一個表達(dá)構(gòu)建體(pQE9TNFg-27/147)情況中，此構(gòu)建體用于根據(jù)實(shí)施例1的方法生產(chǎn)具有N-末端6個組氨酸氨標(biāo)記的全長VEGI多肽。缺乏組氨酸靶的全長VEGI多肽在細(xì)菌中的生產(chǎn)是通過使用pQE70TNFg構(gòu)建體，基本如實(shí)施例1所做進(jìn)行。另外，缺乏組氨酸標(biāo)記的全長VEGI多肽在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)是通過pClTNFg或pcDNA3TNFg構(gòu)建體，根據(jù)實(shí)施例3的方法進(jìn)行。進(jìn)一步地，成熟VEGI多肽從哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生及分泌是在來自命名為pcDNA3/IL6TNFg-1/149構(gòu)建體的的白細(xì)胞介素(IL)-6信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)行。
其它VEGI表達(dá)構(gòu)建體用于從細(xì)菌、桿狀病毒及哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)各種VEGI突變蛋白。用pQE60細(xì)菌表達(dá)載體己產(chǎn)生出4種N-末端缺失突變。這些N-末端缺失突變構(gòu)建體是(Ⅰ)pQE60TNFg-3/147(代表可能的成熟VEGI多肽；由此構(gòu)建體表達(dá)的多肽與SEQ ID NO27的VEGI-β的107-251氨基酸殘基相同)，(ⅱ)pQE60TNFg 12/147(代表SEQ ID NO9的氨基酸殘基12-147及SEQ ID NO27的殘基116-251)，(ⅲ)pQE60TNFg 22/147(代表SEQ ID NO27的氨基酸殘基22-147和126-251殘基)，及(ⅳ)pQE60TNFg 28/147(代表SEQ ID NO27的28-147和132-251殘基)。每種表達(dá)構(gòu)建體均可用于在細(xì)菌系統(tǒng)中生產(chǎn)VEGI多肽，這些多肽針對全長VEGI多肽而言，在N末端分別缺失25，39，49及55個氨基酸，或針對全長VEGI-β多肽而言，在N末端分別缺失106，115，125及131個氨基酸。
還產(chǎn)生了另外的N-末端缺失突變細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體。用細(xì)菌表達(dá)載載體pHE4已產(chǎn)生出命名為pHE4 VEGI T30-L174，以表達(dá)如SEQ IDNO9的蘇氨酸-3至亮氨酸147殘基揭示的VEGI序列的蘇氨酸-30至亮氨酸-174氨基酸，，其完全相當(dāng)于SEQ ID NO27的蘇氨酸-107至亮氨酸-251的VEGI-β序列的蘇氨酸-107至亮氨酸251氨基酸殘基。產(chǎn)生的其它細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體包括pQE9.VEGI.his.T28-L174，pHE4.VEGI.T28-L174，pHE4，.VEGI.T51-L174和pHE4.VEGI.T58-L174。這些構(gòu)建體基于pQE9或pHE4細(xì)菌表達(dá)載體。構(gòu)建體的命名表明表達(dá)載體、基因名稱，及由此構(gòu)建體表達(dá)的氨基酸殘基(如pQE9.VEGI.T28-L174表示此pQE9細(xì)菌表達(dá)載體用于表達(dá)VEGI的蘇氨酸T28至亮氨酸L174氨基酸。
可用于從哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生分泌的成熟VEGI多肽的VEGI表達(dá)構(gòu)建體已生產(chǎn)出。此構(gòu)建體命名為pCl/IL6TNFg-3/147，其編碼與成熟VEGI序列融合的人IL-6基因的信號肽。一相似的構(gòu)建體已產(chǎn)生出，其基于pC4哺乳動物表達(dá)載體，含有與VEGI的12-149位氨基酸的氨基末端(SEQ ID NO9；即VEGI-β(SEQ ID NO27)的116-251位氨基酸融合的CK-b8信號肽(公布的PCT/US95/09058，6/23/95申請中揭示的CK-b8序列的-21～-1位氨基酸)。此構(gòu)建體命名為pC4/CK-b8TNFg12/147)。此構(gòu)建體的一變體己產(chǎn)生出，其可用于表達(dá)在VEGI羧基末端融合有人IgG Fc區(qū)的VEGI的12-147位氨基酸。此融合蛋白也在CK-β8信號肽引導(dǎo)下分泌，且命名為pC4/CK-β8 TNFg12/147/Fc。該融合分子的人Fc部分的序列見SEQ ID NO25所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它序列也可以使用。
VEGI的-3～147位氨基酸(SEQ ID NO9；相當(dāng)于VEGI-β(SEQ ID NO27)的102～251位氨基酸)可從桿狀病毒系統(tǒng)中用構(gòu)建體pA2GPTNFg-3/147表達(dá)及分泌。此表達(dá)構(gòu)建體編碼在其氨基末端融合有桿狀病毒GP信號肽的成熟VEGI編碼序列。
兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒VEGI表達(dá)構(gòu)建體也已產(chǎn)生。其中第一個命名為pGlSam EN/TNFg-3/149。此表達(dá)構(gòu)建體可用于從哺乳動物系統(tǒng)中生產(chǎn)全長VEGI多肽。已產(chǎn)生一相關(guān)的構(gòu)建體，pGlSamEN/CK-8βTNFg12/149用于在CK-β8信號肽的引導(dǎo)下，從哺乳動物系統(tǒng)中生產(chǎn)及分泌成熟VEGI多肽。
本發(fā)明的多肽還包括與上述那些多肽至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相似的多肽。本發(fā)明的多肽還包括那些與由保藏的cDNA編碼的多肽或SEQ ID NO9的多肽至少80％，優(yōu)選至少90％或95％，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相同的多肽，也包括這些多肽的至少有30個，優(yōu)選至少有50個氨基酸的部分。
生產(chǎn)上述重組或融合蛋白的方法本領(lǐng)域已知(通用克降見如，Marniatis，F(xiàn)itsch and Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(1982)或DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover ed.(1985))，并包括將用含編碼本發(fā)明多肽的DNA片段的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，在DNA片段被表達(dá)及重組或融合蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。另外，此蛋白質(zhì)或多核苷酸可與增強(qiáng)其功能或限定其在細(xì)胞中的定位的多肽，如實(shí)施例1-3中的分泌序列融合。通過本領(lǐng)域已知方法可分離重組或融合的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用于分析抑制或激活VEGI功能的藥物或制劑的效力，如宿主蛋白或化學(xué)衍生的制劑，或其它可與VEGI多核苷酸相互作用以下調(diào)或改變VEGI多肽表達(dá)或影響其抑制血管發(fā)生能力的蛋白質(zhì)。測試抗VEGI或抗血管發(fā)生的藥物或制劑效力的方法可例如是阻斷VEGI的內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制活性。即該抗VEGI制劑的存在將使VEGI抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的能力降低。結(jié)果，需要更多的VEGI以達(dá)到在無抗VEGI制劑時觀測到的可比抑制。另一方面，抗血管發(fā)生劑的存在可增大或協(xié)同VEGI抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的能力。結(jié)果達(dá)到在無此制劑下觀測到的相似抑制所需的VEGI濃度較低。
多肽及片段本發(fā)明還涉及分離的VEGI多肽，其具有SEQ ID NO2或SEQ IDNO9的推導(dǎo)的氨基酸序列，或具有由保藏的cDNA HUVE091編碼的氨基酸序列，以及該多肽的片段、類似物及衍生物。
本發(fā)明也涉及VEGI-β多肽，其具有SEQ ID NO27推導(dǎo)的氨基酸序列，或具有由保藏的cDNA HEMCZ56編碼的氨基酸序列，以及該多肽的片段，類似物及衍生物。
本發(fā)明的多肽及多核苷酸優(yōu)選以分離形式，并優(yōu)選在近于完全(如＞90％純化)至完全(如＞99％純化)純化范圍提供。術(shù)語“分離的”意為將物質(zhì)從其原始環(huán)境(如天然環(huán)境，如果其是天然發(fā)生的話)移出。例如，在活體動物體內(nèi)天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物分離的相同多核苷酸或多肽是分離的。“分離的多肽”是指已從重組宿主細(xì)胞中部分或基本純化的多肽。例如，VEGI多肽重組產(chǎn)生的形式可通過Smith及Johnson所述的一步法基本純化(Gene 6731-40(1988))。該多核苷酸可以是載體一部分和/或該多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且由于該載體或組合物不是其天然環(huán)境一部分所以其仍是分離的。根據(jù)本發(fā)明的分離的多肽和多核苷酸也包括天然或合成產(chǎn)生的分子。本發(fā)明的多肽和多核苷酸也可通過本領(lǐng)域已知蛋白質(zhì)純化法用本發(fā)明的抗VEGI抗體從天然或重組源料中純化。
術(shù)語“片段”，“衍生物”及“類似物”當(dāng)指SEQ ID NO2，SEQID NO9或SEQ ID NO27多肽及由保藏的cDNA編碼的多肽時，意為保持VEGI功能活性的多肽，即呈現(xiàn)一或多種與SEQ ID NO2，SEQ ID NO9或SEQ ID NO27揭示的，和/或由一或兩種保藏的克隆(HUVE091及HEMCZ56)編碼的全長和/或成熟VEGI多肽相關(guān)的功能活性。例如，具有所需免疫原性或抗原性的片段、衍生物或類似物可用于如免疫分析以進(jìn)行免疫、抑制VEGI活性等。因此，本發(fā)明一特異實(shí)施方案涉及一VEGI片段，其可被與SEQ ID NO2，SEQID NO9，SEQ ID NO27揭示的，和/或由一或兩種保藏克隆(HUVE091及HEMCZ56)編碼的VEGI多肽序列特異結(jié)合的抗體結(jié)合。
另一例子是，提供了具有VEGI生物學(xué)活性的VEGI片段、衍生物或類似物(如成熟VEGI多肽或VEGI-β多肽的胞外結(jié)構(gòu)域)。保持或缺失所需相應(yīng)VEGI性質(zhì)(如抑制細(xì)胞增殖、抑制腫瘤、抑制血管發(fā)生、通過抑制與侵入骨與軟骨相關(guān)的血管發(fā)生和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖抗關(guān)節(jié)炎，NF-κB及c-Jun激酶(JNK)的誘導(dǎo)劑，細(xì)胞吸附的誘導(dǎo)劑及編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)劑)的VEGI片段、衍生物及類似物可分別用作該性質(zhì)及其生理相關(guān)性的誘導(dǎo)劑或抑制劑。
本發(fā)明的多肽可作為具有跨膜區(qū)及胞內(nèi)及胞外結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合受體而存在，或它們可以溶解形式存在，其中跨膜區(qū)缺失。這種形式的VEGI的一個例子例如是SEQ ID NO27所示的，含跨膜、胞內(nèi)及胞外結(jié)構(gòu)域的VEGI-β多肽序列。
本領(lǐng)域應(yīng)知VEGI多肽的一些氨基酸序列在不明顯影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的前提下，可有一些變異。如果存在這種該序列差異，應(yīng)記住其將是確定蛋白質(zhì)活性的關(guān)鍵區(qū)域。因此，本發(fā)明還包括VEGI多肽的變異，其呈基本VEGI多肽活性，或其包括VEGI的區(qū)域如本文揭示的多肽片段。此變體包括缺失、插入、倒位、重復(fù)及根據(jù)本領(lǐng)域一般規(guī)則對活性影響較小地選擇的取代類型。例如，提供了怎樣產(chǎn)生表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)，其中作者指出有兩種主要方法用于研究氨基酸序列對變化的耐受(Bowie et a1.，Science 247-1306-1310(1990))。第一種方法依于進(jìn)化過程，其中突變是經(jīng)自然選擇接受或排斥的。第二種方法應(yīng)用遺傳工程在克隆基因的特異位置導(dǎo)入氨基酸變化，并選擇或篩選以鑒定保持功能的序列。如作者所述，這些研究已揭示蛋白質(zhì)對氨基酸取代非常耐受。作者進(jìn)一步指出，氨基酸在一定位置的改變似乎是允許的。例如，大多數(shù)隱蔽氨基酸殘基要求非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺湗O少有特征是保守的。其它如此表型沉默取代見如Bowie等人所述(見前述)及其引述的參考文獻(xiàn)。保守取代典型地見于脂族氨基酸Ala，Val，Leu及Ile之間一個對一個的置換；羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基Lys和Arg的交換，及芳香族殘基Phe，Tyr間的置換。
因此，SEQ IDNO9或SEQ ID NO27的多肽的片段、衍生物或類似物或由保藏的cDNAs編碼的多肽的片段、衍生物或類似物，可物以是(1)其中一或多個氨基酸殘基用保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)，且該取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的；或(2)其中一或多個氨基酸殘基包括取代基團(tuán)；或(3)其中成熟形式的VEGI與其它化合物融合，如可提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)(4)其中附加氨基酸與上述形式的多肽融合，如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列，或用于純化上述形式多肽或前蛋白序列的序列。根據(jù)本文教導(dǎo)，如此片段、衍生物及類似物被認(rèn)為包括在本領(lǐng)域范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明的VEGI可包括一或多個氨基酸取代、缺失或加入，經(jīng)天然突變或人為操作。如上所述，優(yōu)選是次要性質(zhì)的變化，如對蛋白質(zhì)折疊或活性無明顯影響的保守氨基酸取代(見表1)。
表1.保守氨基酸取代
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及多肽，其含有本文所述VEGI多肽的氨基酸序列，但與本文所述VEGI多核苷酸序列相比時，具有含至少一個但不超過50個保守氨基酸取代，優(yōu)選不超過40個，更優(yōu)選不超過30個，最優(yōu)選不超過20個保守氨基酸取代的氨基酸序列。當(dāng)然，依漸高之優(yōu)選性，特別優(yōu)選肽或多肽所具有的氨基酸序列含有VEGI多肽的氨基酸序列，其含有至少一個，但不超過10，9，8，7，6，5，4，3，2或1個保守氨基酸取代。
在另一特異實(shí)施方案中，SEQ ID NO2，SEQ ID NO9及SEQ IDNO27的氨基酸序列，由保藏的克隆編碼的多肽序列，和/或本文所述的任何多肽的片段(如胞外結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)區(qū))中的取代加入或缺失數(shù)目是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或150-50，100-50，50-20，30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2。
為改進(jìn)或改變VEGI多肽的特性，可進(jìn)行蛋白質(zhì)工程。本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)可用于生產(chǎn)包括單個或多個氨基酸取代，缺失，加入的新突變蛋白或融合蛋白。如此修飾的多肽呈現(xiàn)如活性增強(qiáng)或穩(wěn)定性增加。另外，它們可以較高產(chǎn)量純化，并比相應(yīng)的天然多肽溶解性好，至少在一定純化及貯存條件下。
因此，本發(fā)明還包括具有一或多個氨基酸殘基缺失、加入或取代的VEGI衍生物及類似物，以產(chǎn)生更適于在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)，放大等的VEGI多肽。例如，半胱氨酸殘基可被缺失，或被其它氨基酸殘基取代以消除二硫鍵；N-連接的糖基化位點(diǎn)可被改變或消除，以獲得如更易于從酵母宿主中回收并純化的同源產(chǎn)物的表達(dá)，已知酵母高度糖基化N-連接位點(diǎn)。最后，在本發(fā)明的VEGI多肽中任何一或多個糖基化識別序列上的任何一或兩個第1或第3位氨基酸的各種氨基酸取代，和/或在任何一或多個如此識別序列的第二位的氨基酸缺失。將防止VEGI多肽在修飾的三肽序列處糖基化(見如Miyajimo etal.，EMBO J5(6)1193-1197)。
本發(fā)明VEGI多肽中為功能所必需的氨基酸可通過本領(lǐng)域已知方法鑒別，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham and Wells，Science2441081-1085(1989))。后一種方法在分子中每個殘基導(dǎo)入單一丙氨酸突變。然后將所得突變體分子進(jìn)行生物活性測試，如受體結(jié)合或體外增殖活性。
特別感興趣的是荷電氨基酸用其它可產(chǎn)生較高度需要的優(yōu)良特性如低聚集的蛋白質(zhì)的荷電的或中性氨基酸取代。當(dāng)制備藥物配方時，因?yàn)榫奂w可以是免疫原性的，因而聚集不僅降低活性而且也是有問題的(Pinckard et a1.，clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins，et al..Diabetes 36838-845(1987)；Cleland，et al.，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarder Systems 10307-377(1993)。
由于VEGI是TNF相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員，為調(diào)節(jié)而不是完全消除VEGI的生物活性，在編碼保守的類TNF結(jié)構(gòu)域的氨基酸的序列中，即在SEQ ID NO9的17-147位，或SEQ ID NO27的121-251位，優(yōu)選在VEGI相關(guān)的多肽家族的所有成員是非保守的區(qū)域內(nèi)的殘基中，優(yōu)選進(jìn)行加入，取代或缺失。也是本發(fā)明一組成部分的是含編碼以上VEGI變體的核酸序列的分離的多核苷酸。
VEGI多肽的一些氨基酸在已知TNF相關(guān)的蛋白質(zhì)家族成員中是高保守的。通過在VEGI的如下殘基是進(jìn)行特異突變，可觀測到其對生物學(xué)活性的顯著影響，該殘基如酪氨酸-15(SEQ ID NO9中的編號)，亮氨酸-41，酪氨酸-43，酪氨酸-46，谷氨酰胺-48，亮氨酸-90，亮氨酸-116，甘氨酸-119，天冬氨酸-120，苯丙氨酸-141，苯丙氨酸-142，及亮氨酸-147，。當(dāng)然這些相同氨基酸殘基存在于SEQ ID NO27所示VEGI-β的相應(yīng)位置。
本發(fā)明還包括上述VEGI多肽的片段。本發(fā)明的多肽片段包括含有下述氨基酸序列的多肽，該序列包含于SEQ ID NO2和SEQ IDNO9中，由含于保藏克隆(HUVE091)的cDNA編碼，或由與包含于保藏克隆中核苷酸序列，揭示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO26中的核苷酸序列，或其互補(bǔ)鏈雜交(在嚴(yán)格雜交條件下)的核酸編碼。
多肽片段可以是“自由存在”的，或包含于較大肽之中，在該較大肽中此片段構(gòu)成其一部分或區(qū)域，優(yōu)選作為其單一連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明多肽片段的代表性實(shí)例包括例如含有或由以下氨基酸殘基組成的片段SEQID NO9和/或SEQ ID NO27的1-20，21-40，41-60，61-83，84-100，101-120，121-140，141-160，160-167，161-174，161-180，181-200，201-220，221-240，241-251。另外，多肽片段長度可以至少大約20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150個氨基酸。在此，“大約”包括在一端或兩端多或少一些氨基酸(即5，4，3，2或1個)的特別列舉的范圍。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽片段(即本文中所述那些)長度不超過250，225，200，185，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，90，80，75，60，50，40，30或25個氨基酸殘基。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案包括多肽片段，其含有或由VEGI的成熟結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO9的1-147氨基酸殘基)，VEGI-β的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO27的1-35氨基酸殘基)，VEGI-β的跨膜結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO27的36-61氨基酸)，和/或VEGI-β的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO27的62-251氨基酸)組成。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽片段含有或由SEQ ID NO9的亮氨酸35～纈氨酸49，色氨酸104～亮氨酸116，甘氨酸119～絲氨酸127，賴氨酸139～亮氨酸147組成。這些結(jié)構(gòu)域是經(jīng)與VEGI家族成員多肽對比鑒定為高相同性的區(qū)域。
本發(fā)明特別優(yōu)選的片段是具有VEGI結(jié)構(gòu)或功能特性的片段。該片段包括含VEGI的α-螺旋及α-螺旋形成區(qū)(“α區(qū)”)β折疊及β折疊形成區(qū)(“β區(qū)”)，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲及卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，疏水區(qū)，親水區(qū)，α兩親區(qū)，β兩親區(qū)，表面形成區(qū)，及高抗原指數(shù)區(qū)(即由具有抗原指數(shù)等于或大于1.5的氨基酸殘基組成的多肽的區(qū)域，用Jameson-Wolf程序的缺省參數(shù)鑒別)的氨基酸殘基。某些優(yōu)選區(qū)域見于圖7所揭示的，包括但非限于經(jīng)分析圖5A、5B和5C以SEQ ID NO2和SEQ ID NO9的氨基酸序列鑒別的前述類型區(qū)域，此優(yōu)選的區(qū)域包括Garnier-Robson預(yù)示的α區(qū)，β區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)；Chou-Fasman預(yù)測的α區(qū)，β區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)；Kyte-Doolitle預(yù)測的親水及疏水區(qū)；Eisenbergα及β兩親區(qū)；Emini表面形成區(qū)；及Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)，如用這些計(jì)算機(jī)程序的缺省參數(shù)預(yù)示的。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，本發(fā)明的類似物包括可通過切割蛋白原部分而激活的以生產(chǎn)活性成熟多肽蛋白原。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一VEGI多肽(如片段)，其含有或由本發(fā)明多肽的攜帶表位的部分組成。此多肽部分的表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位?！懊庖咴员砦弧笔侵?，當(dāng)整個蛋白質(zhì)是免疫原時激發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)部分。另一方面，抗體可結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域是指“抗原性表位”，蛋白質(zhì)的免疫原性表位通常少于抗原性表位數(shù)(見如Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813998-4001(1983))。
為選擇具有抗原性表位的肽或多肽(即含有抗體可結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域的肽或多肽)，本領(lǐng)域熟知模擬部分蛋白質(zhì)序列的相對短的合成肽通常能激發(fā)與部分模擬的蛋白反應(yīng)的抗血清(見如Sutcliffe，J.G.，et al.，Science 219660-666(1983))。能激發(fā)蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽通常在蛋白質(zhì)序列的一級序列中表示，可通過一系列簡單化學(xué)規(guī)則定性，并被限于既非完整蛋白質(zhì)的免疫優(yōu)勢區(qū)(即免疫原性表位)也非氨基或羧基末端。從而本發(fā)明的攜帶抗原性表位的肽及多肽可用于產(chǎn)生抗體，包括與本發(fā)明多肽特異結(jié)合的單克隆抗體(見Wilson et a1.，Cell 37767-778(1984))。
本發(fā)明具有抗原性表位的肽及多肽所含的序列優(yōu)選由包含于本發(fā)明多肽氨基酸序列中的至少7個，優(yōu)選至少9個，更優(yōu)選15-30個氨基酸組成。可用于生產(chǎn)VEGI特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制性實(shí)例包括含有SEQ ID NO9中大約從Thr-24～Asn-32的氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Ile-37～I(xiàn)le-45氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Met-54～Arg-62氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Gln-63～Asp-71氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Glu-57～Gly-65氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Val-80～Thr-88氨基酸殘基的多肽；含有SEQ ID NO9中大約從Leu-116～Val-124氨基酸殘基的多肽，及含有SEQ ID NO9中大約從Asp-133～Phe-141氨基酸殘基的多肽。通過分析Jameson-Wolf抗原性指數(shù)，已確定這些多肽片段具有VEGI多肽的抗原性表位，如圖7所示。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過用缺省參數(shù)，經(jīng)DNA*STAR分極VEGI-β多肽序列(SEQ ID NO27)所得數(shù)據(jù)，可易于測定VEGI-β的抗原性區(qū)域，并選擇如上述高抗原性指數(shù)的區(qū)域。
通過任何常規(guī)方法可生產(chǎn)具有表位的肽及多肽(見如Houghten，R．A.，et al.，Proc.Natl Acad Sci.USA 825131-5135(1985)；及Houghtent等人(1986)美國專利No.4，631，211。)本發(fā)明的具有表位的肽及多肽的作用包括但非限于根據(jù)本領(lǐng)域已知方法誘導(dǎo)抗體(見如Sutcliffe，(前述)；Wilson等(前述)，Chow，M.，eta1.，Proc.Natl Acad Sci.USA 82910-914；and Bittle，F(xiàn).J.，et al，J Gen.Virol 66；2347-2354(1985))。當(dāng)整個蛋白是免疫原時，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法(見如Geysen等所述)鑒別本發(fā)明具有免疫原性表位的肽。另外Geysen的美國專利No.5，194，392闡述一通用的檢測或測定是表位的拓?fù)涞葍r(jià)物(即“mimotope”)的單體(氨基酸或其它化合物)序列的方法，該拓?fù)涞葍r(jià)物與相應(yīng)抗體的特定互補(bǔ)位(抗原結(jié)合位點(diǎn))互補(bǔ)。更一般地，Geysen的美國專利No.4，433，092闡述了一種檢測或測定是配體的拓?fù)鋱D等價(jià)物的單體序列的方法，該等價(jià)物互補(bǔ)于相應(yīng)特定受體(如DR3)的配體結(jié)合位點(diǎn)。相似地，由Houghten等關(guān)于高烷基化寡肽混合物的美國專利No.5，480，971中揭示了線性C1-C7-烷基高烷基化的寡肽，及該肽的同群及文庫，以及用該肽同群和文庫測定與相應(yīng)受體分子優(yōu)選結(jié)合的高烷基化寡肽的序列的方法。因此，本發(fā)明的攜帶表位肽的非肽類似物通常也可經(jīng)這些方法產(chǎn)生。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識到，本發(fā)明的VEGI和/或VEGI-β多肽以及上述的其攜帶表位的片段，可以與免疫球蛋白(IgG)的部分恒定區(qū)組合得到嵌合多肽。這些融合蛋白易于純化并呈現(xiàn)延長的體內(nèi)半衰期。這已由例如由人CD4多肽的前兩個結(jié)構(gòu)域與哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈的恒定區(qū)的各種結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白示出(EP A394，827；Traunecker，et al.，Nature 33184-86(1988))。因?yàn)镮gG部分而具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白，在結(jié)合及中和其它分子方面比單體VEGI多肽或蛋白質(zhì)片段更有效(Fountoulakis et al.，J.Biochem.2703958-3964(1995))。例如，如上所述已生產(chǎn)出VEGI-Fc融合蛋白。
本發(fā)明VEGI多肽的片段(即部分)的應(yīng)用包括但非限于作為生產(chǎn)全長多肽的中間體。
就許多蛋白質(zhì)，包括膜結(jié)合蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或分泌蛋白的成熟形式而言，本領(lǐng)域已知一或多個氨基酸可以從其N-或C-末端缺失而基本不損失其生物學(xué)功能。例如，Ron等報(bào)道了(J.Biol.Chem.2682988(1993)修飾的KGF蛋白，其即使缺失N-末端3，8或27個氨基酸殘基，也具有肝素結(jié)合活性。另外，一些研究人員已報(bào)道TNF-α突變蛋白，其中N-末端2、4或7個氨基酸殘基已除去，當(dāng)與天然發(fā)生的TNF-α多肽相對比時，呈現(xiàn)功能活性提高2-3倍(Creasey，A.A.et al.，Cancer Res.47145-149(1987)；Sidhu，R.S.andBollon，A.P.Anticancer Res.91569-1576(1989)；Kamijo，R.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.160820-827(1989))。另外，即使在蛋白質(zhì)N或C末端缺失一或多個氨基酸引起蛋白質(zhì)改變或缺失一或多種生物學(xué)功能，但其它VEGI功能活性仍可被保存。
在本例中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是TNF多肽家族的成員，直至SEQID NO9的第35位亮氨酸(相當(dāng)于SEQ ID NO27的134位亮氨酸)的N-末端氨基酸缺失仍可保留一些生物學(xué)活性，如調(diào)節(jié)許多類型的造血及內(nèi)皮細(xì)胞生長與分化。具有包括SEQ ID NO9中第36位亮氨酸(相當(dāng)于SEQ ID NO27中第135位亮氨酸)進(jìn)一步N末端缺失的多肽，預(yù)計(jì)不能保留此生物學(xué)活性，因?yàn)橐阎赥NF相關(guān)的多肽中的此殘基在生物活性所需的保守區(qū)域的開始。
然而，即使全長VEGI多肽的N末端缺失一或多個氨基酸導(dǎo)致此多肽生物學(xué)功能的改變，或喪失一或多種生物學(xué)功能，但其它生物學(xué)活性仍可保存。因此當(dāng)全長或成熟多肽的少數(shù)殘基從N末端除去時，縮短的多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別全長或成熟多肽的抗體的能力仍可保存。缺失完整多肽N末端殘基的特定多肽是否保存該免疫學(xué)活性，通過本文所述方法及本領(lǐng)域已知的其它方法可易于測定。
據(jù)此，本發(fā)明還提供一種多肽，其從SEQ ID NO9揭示的VEGI氨基酸序列的，氨基末端缺失一或多個氨基酸，至多達(dá)第35位亮氨酸，并提供了編碼該多肽的多核苷酸。特別地，本發(fā)明提供了含有SEQID NO9的n1-149殘基的氨基酸序列的多肽，其中n1是一27～35范圍內(nèi)一整數(shù)，且35據(jù)信調(diào)節(jié)各類造血及內(nèi)皮細(xì)胞生長及分化所需的完整VEGI多肽(SEQ ID NO9所示)N末端的第一個殘基位置。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸SEQ ID NO9的-27～147，-26～147，-25～147，-24～147，-23～147，-22～147，-21～147，-20～147，-19～147，-18～147，-17～147，-16～147，-15～147，-14～147，-13～147，-12～147，-11～147，-10～147，-9～147，-8～147，-7～147，-6～147，-5～147，-4～147，-3～147，-2～147，-1～147，1-147，2-127，3-147，4-147，5-147，6-147，7-147，8-147，9-147，10-147，11-147，12-147，13-147，14-147，15-147，16-147，17-147，18-147，19-147，20-147，21-147，22-147，23-147，24-147，25-147，26-147，27-147，28-147，29-147，30-147，31-147，32-147，33-147，34-147及35-147。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
由此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種多肽，其從SEQ ID NO27所示的VEGI-β氨基酸序列的氨基末端缺失一或多個殘基，至多達(dá)第134位亮氨酸，并提供了編碼這些多肽的多核苷酸。特別地，本發(fā)明提供了含有SEQ ID NO27的n2-251殘基的氨基酸序列的多肽，其中n2是1-134之間的一整數(shù)，且135據(jù)信是調(diào)節(jié)各類VEGI-β多肽的造血及內(nèi)皮細(xì)胞活性這所需的、完整VEGI-β多肽(示于SEQ IDNO27)的N末端的第一個殘基位置。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸SEQ ID NO27的1～251，2～251，3～251，4～251，5～251，6～251，7～251，8～251，9～251，10～251，11～251，12～251，13～251，14～251，15～251，16～251，17～251，18～251，19～251，20～251，21～251，22～251，23～251，24～251，25～251，26～251，27～251，28～251，29～251，30～251，31～251，32～251，33～251，34～251，35～251，36～251，37～251，38～251，39～251，40～251，41～251，42～251，43～251，44～251，45～251，46～251，47～251，48～251，49～251，50～251，51～251，52～251，53～251，54～251，55～251，56～251，57～251，58～251，59～251，60～251，61～251，62～251，63～251，64～251，65～251，66～251，67～251，68～251，69～251，70～251，71～251，72～251，73～251，74～251，75～251，76～251，77～251，78～251，79～251，80～251，81～251，82～251，83～251，84～251，85～251，86～251，87～251，88～251，89～251，90～251，91～251，92～251，93～251，94～251，95～251，96～251，97～251，98～251，99～251，100～251，101～251，102～251，103～251，104～251，105～251，106～251，4107～251，108～251，109～251，110～251，111～251，112～251，113～251，114～251，115～251，116～251，117～251，118～251，119～251，120～251，121～251，122～251，123～251，124～251，125～251，126～251，127～251，128～251，129～251，130～251，131～251，132～251，133～251，134～251和135～251。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
如上所述，即使多肽的N-末端缺失一或多個氨基酸導(dǎo)致多肽生物學(xué)功能的改變，或喪失了一或多種生物學(xué)功能，其它生物學(xué)活性仍被保存。因此，縮短的VEGI突變蛋白誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別全長或成熟多肽的能力，當(dāng)少數(shù)全長或成熟多肽的殘基被除去時，仍可保存。缺失完整蛋白N末端殘基的特定多肽是否保存該免疫學(xué)活性，通過本文所述方法及本領(lǐng)域已知其它方法可易于測定。缺失大量N末端氨基酸殘基的VEGI突變蛋白可保存一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。事實(shí)上，由少至6個VEGI氨基酸殘基組成的肽通?？梢鹈庖邞?yīng)答。
由此，本發(fā)明還提供了一種多肽，其從SEQ ID NO9所示VEGI的預(yù)測成熟氨基酸序列氨基末端的缺失一或多個殘基，至多達(dá)SEQ IDNO9第142位的苯丙氨酸殘基，并提供了編碼該多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了含SEQ ID NO9的n3-147殘基的氨基酸序列的多肽，其中n3是1-169之間一整數(shù)，且170據(jù)信是VEGI多肽至少的免疫原性活性所需的完整VEGI多肽N末端的第一個殘基位置。
更特別地，本發(fā)明提供了編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸示于圖5A，5B和5C的VEGI序列的R-2～L-174；R3～L-174；F4～L-174；L5～L-174；S-6～L-174；K-7～L-174；V-8～L-174；Y-9～L-174；S-10～L-174；F-11～L174；P-12～L-174；M-13～L-174；R-14～L174；K-15～L-174；L-16～L-174；I-17～L-174；L-18～L-174；F-19～L-174；L-20～L-174；V-21～L-174；F-22～L-174；P-23～L-174；V-24～L-174；V-25～L-174；R-26～L-174；Q-27～L-174；T-28～L-174；P-29～L-174；T-30～L-174；Q-31～L-174；H-32～L-174；F-33～L-174；K-34～L-174；N-35～L-174；Q-36～L-174；F-37～L-174；P-38～L-174；A-39～L-174；L-40～L-174；H-41～L-174；W-42～L-174；E-43～L-174；H-44～L-174；E-45～L-174；L-46～L-174；G-47～L-174；L-48～L-174；A-49～L-174；F-50～L-174；T-51～L-174；K-52～L-174；N-53～L-174；R-54～L-174；M-55～L-174；N-56～L-174；Y-57～L-174；T-58～L-174；N-59～L-174；K-60～L-174；F-61～L-174；L-62～L-174；L-63～L-174；I-64～L-174；P-65～L-174；E-66～L-174；S-67～L-174；G-68～L-174；D-69～L-174；Y-70～L-174；F-71～L-174；I-72～L-174；Y-73～L-174；S-74～L-174；Q-75～L-174；V-76～L-174；T-77～L-174；F-78～L-174；R-79～L-174；G-80～L-174；M-81～L-174；T-82～L-174；S-83～L-174；E-84～L-174；C-85～L-174；S-86～L-174；E-87～L-174；I-88～L-174；R-89～L-174；Q-90～L-174；A-91～L-174；G-92～L-174；R-93～L-174；P-94～L-174；N-95～L-174；K-96～L-174；P-97～L-174；D-98～L-174；S-99～L-174；I-100～L-174；T-101～L-174；V-102～L-174；V-103～L-174；I-104～L-174；T-105～L-174；K-106～L-174；V-107～L-174；T-108～L-174；D-109～L-174；S-110～L-174；Y-111～L-174；P-112～L-174；E-113～L-174；P-114～L-174；T-115～L-174；Q-116～L-174；L-117～L-174；L-118～L-174；M-119～L-174；G-120～L-174；T-121～L-174；K-122～L-174；S-123～L-174；V-124～L-174；C-125～L-174；E-126～L-174；V-127～L-174；G-128～L-174；S-129～L-174；N-130～L-174；W-131～L-174；F-132～L-174；Q-133～L-174；P-134～L-174；I-135～L-174；Y-136～L-174；L-137～L-174；G-138～L-174；A-139～L-174；M-140～L-174；F-141～L-174；S-142～L-174；L-143～L-174；Q-144～L-174；E-145～L-174；G-146～L-174；D-147～L-174；K-148～L-174；L-149～L-174；M-150～L-174；V-151～L-174；N-152～L-174；V-153～L-174；S-154～L-174；D-155～L-174；I-156～L-174；S-157～L-174；L-158～L-174；V-159～L-174；D-160～L-174；Y-161～L-174；T-162～L-174；K-163～L-174；E-164～L-174；D-165～L-174；K-166～L-174；T-167～L-174；F-168～L-174；及F-169-L174。(圖5A，5B和5C所示VEGI氨基酸序列與SEQ ID NO9相同；但二者間計(jì)數(shù)模式不同；在此以上氨基酸殘基數(shù)反映的是圖5A，5B和5C的)，編碼這些多肽的多核苷酸也在本發(fā)明內(nèi)。
由此，本發(fā)明還提供了-種多肽，其具有缺失自SEQ ID NO27所示VEGI-β的成熟氨基酸序列氨基末端的至多第246位的苯丙氨酸殘基的一或多個殘基，并提供了編碼這些多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了含有SEQ ID NO27的n4-251殘基的氨基酸序列的多肽，其中n4是2-246之間-整數(shù)，且247據(jù)信是VEGI-β蛋白的至少免疫原性活性所需的完整VEGI-β多肽N末端的第一個殘基位置。
更特別地，本發(fā)明提供了編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸SEQ ID NO27所示VEGI-β序列的A-2～L-251；E-3～L-251；D-4～L-251；L-5～L-251；G-6～L-251；L-7～L251；S-8～L-251；F-9～L-251；G-10～L-251；E-11～L-251；T-12～L-251；A-13～L-251；S-14～L-251；V-15～L-251；E-16～L-251；M-17～L-251；L-18～L-251；P-19～L-251；E-20～L-251；H-21～L-251；G-22～L-251；S-23～L-251；C-24～L-251；R-25～L-251；P-26～L-251；K-27～L-251；A-28～L-251；R-29～L-251；S-30～L-251；S-31～L-251；S-32～L-251；A-33～L-251；R-34～L-251；W-35～L-251；A-36～L-251；L-37～L-251；T-38～L-251；C-39～L-251；C-40～L-251；L-41～L-251；V-42～L-251；L-43～L-251；L-44～L-251；P-45～L-251；F-46～L-251；L-47～L-251；A-48～L-251；G-49～L-251；L-50～L-251；T-51～L-251；T-52～L-251；Y-53～L-251；L-54～L-251；L-55～L-251；V-56～L-251；S-57～L-251；Q-58～L-251；L-59～L-251；R-60～L-251；A-61～L-251；Q-62～L-251；G-63～L-251；E-64～L-251；A-65～L-251；C-66～L-251；V-67～L-251；Q-68～L-251；F-69～L-251；Q-70～L-251；A-71～L-251；L-72～L-251；K-73～L-251；G-74～L-251；Q-75～L-251；E-76～L-251；F-77～L-251；A-78～L-251；P-79～L-251；S-80～L-251，H-81～L-251；Q-82～L-251；Q-83～L-251；V-84～L-251；Y-85～L-251；A-86～L-251；P-87～L-251；L-88～L-251；R-89～L-251；A-90～L-251；D-91～L-251；G-92～L-251；D-93～L-251；K-94～L-251；P-95～L-251；R-96～L-251；A-97～L-251；H-98～L-251；L-99～L-251；T-100～L-251；V-101～L-251；V-102～L-251；R-103～L-251；Q-104～L-251；T-105～L-251；P-106～L251；T-107～L-251；Q-108～L-251；H-109～L-251；F-110～L-251；K-111～L-251；N-112～L-251；Q-113～L-251；F-114～L-251；P-115～L-251；A-116～L-251；L-117～L-251；H-118～L-251；W-119～L-251；E-120～L-251；H-121～L-251；E-122～L-251；L-123～L-251；G-124～L-251；L-125～L-251；A-126～L-251；F-127～L-251；T-128～L-251；K-129～L-251；N-130～L-251；～R-131～L-251；M-132～L-251；N-133～L-251；Y-134～L-251；T-135～L-251；N-136～L-251；K-137～L-251；F-138～L-251；L-139～L-251；L-140～L-251；I-141～L-251；P-142～L-251；E-143～L-251；S-144～L-251；G-145～L-251；D-146～L-251；Y-147～L-251；F-148～L-251；I-149～L-251；Y-150～L-251；S-151～L-251；Q-152～L-251；V-153～L-251；T-154～L-251；F-155～L-251；R-156～L-251；G-157～L-251；M-158～L-251；T-159～L-251；S-160～L-251；E-161～L-251；C-162～L-251；S-163～L-251；E-164～L-251；I-165～L251；R-166～L-251；Q-167～L-251；A-168～L-251；G-169～L-251；R-170～L-251；P-171～L-251；N-172～L-251；K-173～L-251；P-174～L-251；D-175～L-251；S-176～L-251；I-177～L-251；T-178～L-L251；V-179～L-251；V-180～L-251；I-181～L-251；T-182～L-251；K-183～L-251；V-184～L-251；T-185～L-251；D-186～L-251；S-187～L251；Y-188～L-251；P-189～L251；E-190～L-251；P-191～L-251；T-192～L-251；Q-193～L-251；L-194～L-251；L-195～L-251；M-196～L-251；G-197～L-251；T-198～L251；K-199～L-251；S-200～L-251；V-201～L-251；C-202～L-251；E-203～L-251；V-204～L-251；G-205～L-251；S-206～L-251；N-207～L-251；W-208～L-251；F-209～L-251；Q-210～L-251；P-211～L-251；I-212～L-251；Y-213～L-251；L-214～L-251；G-215～L-251；A-216～L-251；M-217～L-251；F-218～L-251；S-219～L-251；L-220～L-251；Q-221～L-251；E-222～L-251；G-223～L-251；D-224～L-251；K-225～L-251；L-226～L-251；M-227～L-251；V-228～L-251；N-229～L-251；V-230～L-251；S-231～L-251；D-232～L-251；I-233～L-251；S-234～L-251；L-235～L-251；V-236～L-251；D-237～L-251；Y-238～L-251；T-239～L-251；K-240～L-251；E-241～L-251；D-242～L-251；K-243～L-251；T-244～L-251；F-245～L-251；和F-246～L-251；編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
相似地，已知有生物學(xué)功能的C末端缺失的突變蛋白的許多例子。例如，通過在蛋白質(zhì)羧基末端缺失8-10個氨基酸殘基，γ干擾素活性近于提高10倍(Dobeli et a1.，J.Biotechnology 7199-216(1988))。另外，一些研究人員已報(bào)道生物學(xué)失活TNF-α突變蛋白，其中C末端除去少如2個氨基酸(Carlino，J．A..et al.，J.Biol.Chem.262958-961(1987)；Creasey，A．A.，et al.，Cancer Res.47145-149(1987)；Sidhu，R.S.and Bollon，A.P.Anticancer Res.91569-1576(1989)；Gase，K.，et al.，Immunology 71368-371(1990))。
在本例中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是TNF多肽家族的成員，直至SEQID NO9的第146位的亮氨酸的(相當(dāng)于SEQ ID NO27第250位亮氨酸)C-末端氨基酸缺失可保留-些生物學(xué)活性，如調(diào)節(jié)各類造血及內(nèi)皮細(xì)胞的生長及分化。具有包括SEQ ID NO9的第146位亮氨酸(或在SEQ ID NO27的第250位的亮氨酸)的C-末端缺失的多肽預(yù)計(jì)不能保留該生物學(xué)活性，因?yàn)橐阎赥NF相關(guān)多肽中的此殘基是在生物學(xué)活性所需保守區(qū)域的起始處。
然而，即使蛋白質(zhì)C末端缺失一或多個氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)功能改變或喪失一或多種生物學(xué)活性，其它生物學(xué)活性仍可保存。因此，當(dāng)少數(shù)完整或成熟蛋白質(zhì)的殘基從C末端除去時縮短的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整或成熟蛋白質(zhì)的抗體的能力仍可保存。缺失完整蛋白C末端殘基的特定多肽是否保存該免疫學(xué)活性，通過本文所述方法及本領(lǐng)域已知其它方法可易于測定。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種多肽，其具有從SEQ IDNO9所示VEGI多肽的氨基酸序列至多到的羧基末端除去第146位亮氨酸殘基的一或多個殘基，并提供了編碼該多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO9氨基酸序列的-27-m1殘基的氨基酸序列的多肽，其中m1是146-147之間任一整數(shù)，且146據(jù)信是通過VEGI多肽調(diào)節(jié)各類造血和內(nèi)皮細(xì)胞生長及分化所需的完整VEGI多肽(示于SEQ ID NO9)C末端的第一殘基位置。
更特別地，本發(fā)明提供了編碼具有SEQ ID NO9的-27～146及-27～147殘基的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了一種多肽，其從SEQ ID NO27所示VEGI-β氨基酸序列的羧基末端的除去一或多個殘基至多到第250位亮氨酸，并提供了編碼該多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了具有SEQ IDNO27氨基酸序列的1-m2殘基的氨基酸序列的多肽，其中m2是250-251間任一整數(shù)，且249據(jù)信是調(diào)節(jié)各類造血及內(nèi)皮細(xì)胞生長及分化所需的完整VEGI-β多肽(示于SEQ ID NO27)C末端的第一殘基位。
更特別地，本發(fā)明提供了編碼具有SEQ ID NO27的1-250及1-251殘基的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了多肽片段，其含有或由從VEGI-α的氨基及羧基末端缺失一或多個氨基酸組成，其可被描述為具有SEQ ID NO9的n1-m1殘基，其中n及m為如上所述之整數(shù)。本發(fā)明還提供了一種多肽，其具從VEGI-β的氨基及羧基末端缺失一或多個氨基酸，其可被描述為具有SEQ ID NO27的n2-m2殘基，其中n2和m2為如上述之整數(shù)。
如上所述，即使多肽C末端缺失一或多個氨基酸導(dǎo)致多肽的生物學(xué)功能改變或喪失一或多種生物學(xué)功能，但其它生物學(xué)活性仍可保留。因此，當(dāng)少數(shù)完整或成熟多肽的殘基從C末端除去時縮短的VEGI變體蛋白誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別全長或成熟多肽的抗體的能力仍可保存。缺失全長多肽C末端殘基的特定多肽是否保存該免疫學(xué)活性，通過本文所述方法及本領(lǐng)域已知其它方法可易于測定。大量缺失C末端氨基酸殘基的VEGI變體蛋白保存一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。事實(shí)上，由少如6個VEGI氨基酸組成的肽通常就可引發(fā)免疫應(yīng)答。
由此，本發(fā)明還提供一種多肽，其從圖5A，5B和5C所示(或SEQID NO9)的氨基酸序列的羧基末端缺失一或多個殘基，至多到圖5A，5B和5C中第6位(或SEQ ID NO9中第一22位)絲氨酸殘基，并提供了編碼此多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了含有SEQ IDNO9的1-m3殘基的氨基酸序列的多肽，其中m3是6-174之間一整數(shù)，且6被認(rèn)為是VEGI-α的至少免疫原性活性所需的完整VEGI多肽C末端的第一殘基位置。
更特別地，本發(fā)明提供編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸圖5A，5B和5C所示VEGI序列的M-1～L-173；M-1～F-172；M-1～A171；M-1～G-170；M-1～F-169；M-1～F-168；M-1～T-167，M-1～K-166；M-1～D-165，M-1～E-164；M-1～K-163；M-1～T-162；M-1～Y-161；M-1～D-160；M-1～V-159；M-1～L-158；M-1～S-157；M-1～I(xiàn)-156；M-1～D-155；M-1～S-154；M-1～V-153；M-1～N-152；M-1～V-151；M-1～M-150；M-1～L-149；M-1～K-148；M-1～D-147；M-1～G-146；M-1～E-145；M-1～Q-144；M-1～L-143；M-1～S-142；M-1～F-141；M-1～M-140；M-1～A-139；M-1～G-138；M-1～L-137；M-1～Y-136；M-1～I(xiàn)-135；M-1～P-134；M-1～Q-133；M-1～F-132；M-1～W-131；M-1～N-130；M-1～S-129；M-1～G-128；M-1～V-127；M-1～E-126；M-1～C-125；M-1～V-124；M-1～S-123；M-1～K-122；M-1～T-121；M-1～G-120；M-1～M-119；M-1～L-118；M-1～L-117；M-1～Q-116；M-1～T-115；M-1～P-114；M-1～E-113；M-1～P-112；M-1～Y-111；M-1～S-110；M-1～D-109；M-1～T-108；M-1～V-107；M-1～K-106；M-1～T-105；M-1～I(xiàn)-104；M-1～V-103；M-1～V-102；M-1～T-101；M-1～I(xiàn)-100；M-1～S-99；M-1～D-98；M-1～P-97；M-1～K-96；M-1～N-95；M-1～P-94；M-1～R-93；M-1～G-92；M-1～A-91；M-1～Q-90；M-1～R-89；M-1～I(xiàn)-88；M-1～E-87；M-1～S-86；M-1～S-85；M-1～E-84；M-1～S-83；M-1～T-82；M-1～M-81；M-1～G-80；M-1～R-79；M-1～F-78；M-1～T-77；M-1～V-76；M-1～Q-75；M-1～S-74；M-1～Y-73；M-1～I(xiàn)-72；M-1～F-71；M-1～Y-70；M-1～D-69；M-1～G-68；M-1～S-67；M-1～E-66；M-1～P-65；M-1～I(xiàn)-64；M-1～L-63；M-1～L-62；M-1～F-61；M-1～K-60；M-1～N-59；M-1～T-58；M-1～Y-57；M-1～N-56；M-1～M-55；M-1～R-54；M-1～N-53；M-1～K-52；M-1～T-51；M-1～F-50；M-1～A-49；M-1～L-48；M-1～G-47；M-1～L-46；M-1～E-45；M-1～H-44；M-1～E-43；M-1～W-42；M-1～H-41；M-1～L-40；M-1～A-39；M-1～P-38；M-1～F-37；M-1～Q-36；M-1～N-35；M-1～K-34；M-1～F-33；M-1～H-32；M-1～Q-31；M-1～T-30；M-1～P-29；M-1～T-28；M-1～Q-27；M-1～R-26；M-1～V-25；M-1～V-24；M-1～P-23；M-1～F-22；M-1～V-21；M-1～L-20；M-1～F-19；M-1～L-18；M-1～I(xiàn)-17；M-1～L-16；M-1～K-15；M-1～R-14；M-1～M-13；M-1～P-12；M-1～F-11；M-1～S-10；M-1～Y-9；M-1～V-8；M-1～K-7及M-1～S-6(圖5A、5B和5C中所示VEGI氨基酸序列與SEQ ID NO9中所示相同，但二者之間計(jì)數(shù)模式不同；以上氨基酸殘基數(shù)反映的是圖5A、5B和5C的殘基數(shù))。也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了從VEGI多肽的氨基末端和羧基末端缺失一或多個氨基酸的多肽，其通?？杀幻枋鰹榫哂蠸EQ ID NO9的n3-m3殘基，其中n3和m3是以上所述的整數(shù)，編碼此多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了有一或多個殘基從SEQ ID NO27所示VEGI-β氨基酸序羧基末端缺失并至多到第6位的甘氨酸殘基的多肽，并提供了編碼如此多肽的多核苷酸。尤其本發(fā)明提供了含SEQ ID NO27的1-m4殘基的氨基酸序列的多肽，其中m4是6-250之間一整數(shù)，且6被認(rèn)為是VEGI-β蛋白的至少免疫原活性所需的完整的VEGI-β多肽C末端的第一殘基位置。
更特別地，本發(fā)明提供編碼含有或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸SEQ ID NO27中所示VEGI-β序列的M-1～L-250；M-1～F-249；M-1～A-248；M-1～G-247；M-1～F-246；M-1～F-245；M-1～T-244；M-1～K-243；M-1～D-242；M-1～E-241；M-1～K-240；M-1～T-239；M-1～Y-238；M-1～D-237；M-1～V-236；M-1～L-235；M-1～S-234；M-1～I(xiàn)-233；M-1～D-232；M-1～S-231；M-1～V-230；M-1～N-229；M-1～V-228；M-1～M-227；M-1～L-226；M-1～K-225；M-1～D-224；M-1～G-223；M-1～E-222；M-1～Q-221；M-1～L-220；M-1～S-219；M-1～F-218；M-1～M-217；M-1～A-216；M-1～G-215；M-1～L-214；M-1～Y-213；M-1～I(xiàn)-212；M-1～P-211；M-1～Q-210；M-1～F-209；M-1～W-208；M-1～N-207；M-1～S-206；M-1～G-205；M-1～V-204；M-1～E-203；M-1～C-202；M-1～V-201；M-1～S-200；M-1～K-199；M-1～T-198；M-1～G-197；M-1～M-196；M-1～L-195；M-1～L-194；M-1～Q-193；M-1～T-192；M-1～P-191；M-1～E-190；M-1～P-189；M-1～Y-188；M-1～S-187；M-1～D-186；M-1～T-185；M-1～V-184；M-1～K-183；M-1～T-182；M-1～I(xiàn)-181；M-1～V-180；M-1～V-179；M-1～T-178；M-1～I(xiàn)-177；M-1～S-176；M-1～D-175；M-1～P-174；M-1～K-173；M-1～N-172；M-1～P-171；M-1～R-170；M-1～G-169；M-1～A-168；M-1～Q-167；M-1～R-166；M-1～I(xiàn)-165；M-1～E-164；M-1～S-163；M-1～C-162；M-1～E-161；M-1～S-160；M-1～T-159；M-1～M-158；M-1～G-157；M-1～R-156；M-1～F-155；M-1～T-154；M-1～V-153；M-1～Q-152；M-1～S-151；M-1～Y-150；M-1～I(xiàn)-149；M-1～F-148；M-1～Y-147；M-1～D-146；M-1～G-145；M-1～S-144；M-1～E-143；M-1～P-142；M-1～I(xiàn)-141；M-1～L-140；M-1～L-139；M-1～F-138；M-1～K-137；M-1～N-136；M-1～T-135；M-1～Y-134；M-1～N-133；M-1～M-132；M-1～R-131；M-1～N-130；M-1～K-129；M-1～T-128；M-1～F-127；M-1～A-126；M-1～L-125；M-1～G-124；M-1～L-123；M-1～E-122；M-1～H-121；M-1～E-120；M-1～W-119；M-1～H-118；M-1～L-117；M-1～A-116；M-1～P-115；M-1～F-114；M-1～Q-113；M-1～N-112；M-1～K-111；M-1～F-110；M-1～H-109M-1～Q-108；M-1～T-107；M-1～P-106；M-1～T-105；M-1～Q-104；M-1～R-103；M-1～V-102；M-1～V-101；M-1～T-100；；M-1～L-99；M-1～H-98；M-1～A-97；M-1～R-96；M-1～P-95；M-1～K-94；M-1～D-93；M-1～G-92；M-1～D-91；M-1～A-90；M-1～R-89；M-1～L-88；M-1～P-87；M-1～A-86；M-1～Y-85；M-1～V-84；M-1～Q-83；M-1～Q-82；M-1～H-81；M-1～S-80；M-1～P-79；M-1～A-78；M-1～F-77；M-1～E-76；M-1～Q-75；M-1～G-74；M-1～K-73；M-1～L-72；M-1～A-71；M-1～Q-70；M-1～F-69；M-1～Q-68；M-1～V-67；M-1～C-66；M-1～A-65；M-1～E-64；M-1～G-63；M-1～Q-62；M-1～A-61；M-1～R-60；M-1～L-59；M-1～Q-58；M-1～S-57；M-1～V-56；M-1～L-55；M-1～L-54；M-1～Y-53；M-1～T-52；M-1～T-51；M-1～L-50；M-1～G-49；M-1～A-48；M-1～L-47；M-1～F-46；M-1～P-45；M-1～L-44；M-1～L-43；M-1～V-42；M-1～L-41；M-1～C-40；M-1～C-39；M-1～T-38；M-1～L-37；M-1～A-36；M-1～W-35；M-1～R-34；M-1～A-33；M-1～S-32；M-1～S-31；M-1～S-30；M-1～R-29；M-1～A-28；M-1～K-27；M-1～P-26；M-1～R-25；M-1～C-24；M-1～S-23；M-1～G-22；M-1～H-21；M-1～E-20；M-1～P-19；M-1～L-18；M-1～M-17；M-1～E-16；M-1～V-15；M-1～S-14；M-1～A-13；M-1～T-12；M-1～E-11；M-1～G-10；M-1～F-9；M-1～S-8；M-1～L-7；M-1～G-6。也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了有一或多個氨基酸從VEGI-β多肽的氨基及羧基末端缺失的多肽，其通常可被描述為具有SEQ ID NO27的n4-m4殘基，其中n4-m4是如上述之整數(shù)。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及多肽片段，其含有或由通式mx-nx所述的氨基酸組成，其中m和n分別相當(dāng)于任一以上這些符號所代表的氨基酸殘基，且x代表任一整數(shù)。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明特異的實(shí)施方案涉及編碼一多肽的核苷酸序列，該多肽由包含于ATCC.號75927的cDNA克隆編碼的完整VEGI氨基酸序列的一部分組成，其中該部分不包括ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列氨基末端的1～大約62個氨基酸，或不包括ATCC保藏號75927所合的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列羧基末端的大約1個氨基酸，或上述氨基及羧基末端缺失的任意組合。也提供了編碼所有以上缺失突變形式的多肽的多核苷酸。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼一多肽的核苷酸序列，該多肽由ATCC保藏號203055所含的cDNA克隆編碼的完整VEGI-β氨基酸序列的一部分組成，其中該部分不包括ATCC保藏號203055所含cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列氨基末端的從1-大約134個氨基酸，或不包括ATCC保藏號203055所含cDNA編碼的完整氨基酸序列氨基末端一定數(shù)目的氨基酸(其中該數(shù)目選自1～134之間任一整數(shù))，或缺失該完整氨基酸序列羧基末端的大約1個氨基酸，或以上氨基及羧基末端缺失的任意組合。編碼所有以上多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了含有如下氨基酸序列的分離的VEGI多肽，該氨基酸序列選自(a)具有SEQ ID NO9所示完整氨基酸序列(即SEQ IDNO9的-27～147位)的全長VEGI多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQID NO9所示除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；(即SEQ IDNO9的-26～147位)的全長VEGI多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQID NO9中1～147位氨基酸序列的推斷的成熟VEGI多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆HUVE091編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆HUVE091編碼的除N-末端甲硫氨酸酚的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏號75927所含的cDNA克隆HUVE091編碼的推斷的成熟VEGI多肽的完整氨基酸序列。本發(fā)明的多肽還包括具有與(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所述序列至少70％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選至少90％，還更優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。
本發(fā)明還提供含有如下氨基酸序列的分離的VEGI多肽，該氨基酸序列選自(a)具有SEQ ID NO27所示完整氨基酸序列(即SEQ IDNO27的1～251位)的全長VEGI-β多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQID NO27除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO27的2～251位)的全長VEGI-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ IDNO27的62-251位氨基酸序列的推斷的成熟VEGI-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏號203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏號203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；及(f)由于ATCC保藏號203055的cDNA克隆HEMCZ56編碼的推斷的成熟VEGI多肽的完整氨基酸序列。本發(fā)明的多肽還包括具有與以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所述序列至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，還更優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的多肽，及其片段。在特異的實(shí)施方案中，這些多肽有至少10個，15，20，25，30個，更優(yōu)選至少50個氨基酸。
具有與本發(fā)明的參照VEGI多肽的氨基酸序列至少如95％“相同性”的氨基酸序列的多肽，是指除了此多氨基酸序列中每100個VEGI多肽的參照氨基酸序列可包括接近5個氨基酸改變之外，此多肽的氨基酸序列與相關(guān)序列相同。換言之，為獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參照序列中至多5％的氨基酸殘基可被缺失或用其它氨基酸取代，或者占參照序列總氨基酸5％的氨基酸可被插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些變化可發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位，或發(fā)生在那些末端位之間的任何部位，散布在參照序列中單個殘基之中或相關(guān)序列中一或多個連續(xù)基團(tuán)中。
實(shí)際上，任何特殊多肽是否與圖5A，5B及5C(SEQ ID NO9)所示氨基酸序列由保藏cDNA克隆HUVE091編碼的氨基酸序列或其片段，至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，應(yīng)用已知計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Gencties Computer Group，University Researeh Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)通常可測定。當(dāng)用Bestfit或任何其它序列對比程序測定一特殊序列是否與本發(fā)明的相關(guān)序列至少95％相同時，當(dāng)然要設(shè)立參數(shù)，這樣相同性百分率在全長相關(guān)氨基酸序列之上計(jì)算，且允許占相關(guān)序列總氨基酸殘基數(shù)5％的同源缺失存在。
在特異的實(shí)施方案中，相關(guān)序列(本發(fā)明的序列)與試驗(yàn)序列之間的相同性，也指作總體序列對比，可應(yīng)用基于Brutlag等的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序測定(Corp App.Biosci.b237-245(1990)、FASTDB氨基酸序列對比中所用的優(yōu)選參數(shù)是Matrix=PAM0，K-tuple=2，Mismatch Pencalty=1，Joining Denalty=20，Randomization GroupLength=0，Cutoff Score=l，Window Size=序列長，Gap Penalty=5，GapSize Penalty=0.05，Window Sizw=500或試驗(yàn)序列長，無論哪個較短。根據(jù)此實(shí)施方案，如果試驗(yàn)序列由于N-末端的缺失而非內(nèi)在缺失而關(guān)序列短，考慮到FASTDB程序在計(jì)算總體相同性百分率時不能說明試驗(yàn)序列N-及C-末端截短的原因，因而要進(jìn)行人為校正。就與相關(guān)序列相關(guān)的試驗(yàn)序列在N-及C-末端的截短而言，通過計(jì)算是試驗(yàn)序列N-及C-末端的相關(guān)序列的殘基數(shù)，其未與相應(yīng)試驗(yàn)殘基匹配/對比，占相關(guān)序列總堿基的百分?jǐn)?shù)而加以校正相同性百分率。殘基是否是匹配／對比的可通過FASTODB序列對比的結(jié)果加以測定。然后將此百分?jǐn)?shù)從用特殊參數(shù)經(jīng)以上FASTDB程序計(jì)算出的相同性百分率中除去，以得到最終相同性百分率。此最終相同性百分率范圍是此實(shí)施方案目的所在。只有未與相關(guān)序列匹配/對比的試驗(yàn)序列的N-及C-末端殘基被認(rèn)為是人為調(diào)正相同性百分率范圍的目的所在。即只有相關(guān)殘基位在試驗(yàn)序列的最遠(yuǎn)的N-及C-末端殘基之外。例如，將有90個氨基酸殘基的試驗(yàn)序列與有100個氨基酸殘基的相關(guān)序列對比以測定相同性百分率。缺失發(fā)生在試驗(yàn)序列的N-末端，從而FASTDB對比示出N末端頭10個殘基的匹配/對比。此10個未配對殘基代表序列的10％(未配對的N-末端及C-末端的殘基數(shù)/相關(guān)序列中總殘基數(shù))，因此將此10％從由FASTDB程序計(jì)算出的相同性百分率中減去。如果剩余的90個堿基充分配對，則最終相同性百分率為90％。在另一實(shí)施例中，對比了有90個殘基的試驗(yàn)序列與有100個殘基的相關(guān)序列。這次缺失是內(nèi)在缺失，因此在試驗(yàn)序列的N或C-末端沒有未與相關(guān)序列匹配/對比的殘基。在此由FASTDB計(jì)算出的相同性百分率不用人為校正。再一次，在用于FASTDB序列對比中，只有殘基位在試驗(yàn)序列的N-及C-末端終點(diǎn)，其未與相關(guān)序列匹配/對比，此時相同性百分率需人為校正。不需進(jìn)行其它人為校正。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO9的多肽(尤其成熟多肽)，以及與SEQ ID NO9的多肽至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％相似性(優(yōu)選相同性)的多肽，也包括如此多肽的一部分，此部分一般至少含有30個，優(yōu)選至少含有50個氨基酸。
本發(fā)明的多肽還包括SEQ ID NO27的多肽(尤其該肽的胞外結(jié)構(gòu)域)，以及與SEQIDNO27的多肽至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％相似性(優(yōu)選相同性)的多肽，也包括如此多肽的一部分，此部分一般至少含有30個，優(yōu)選至少含有50個氨基酸。
本發(fā)明的其它多肽包括與在此所述的多肽至少70％，90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相似性的多肽。本發(fā)明的多肽也包括那些與在此所述多肽至少70％，80％，優(yōu)選至少90％或95％，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽。在特異的實(shí)施方案中，如此多肽含有至少30個，優(yōu)選至少50個氨基酸。
如本領(lǐng)域已知，二多肽之間“相似性”通過對比氨基酸序列及一種多肽對第二種多肽序列的保守氨基酸取代加以測定。二多肽“相似性％”是指通過用Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，SI53711)是測定相似性設(shè)立的efcuclt，對比二多肽的氨基酸序列產(chǎn)生的相似性范圍。Bestfit用Smith及Waterman的局部同源對比(Advaces in Applied Mathematics 2；482-489，1981)以發(fā)現(xiàn)二序列間最相似主節(jié)段。
如在此所用，“衍生自”SEQ ID NO2，SEQ ID NO9及SEQ IDNO27的多肽或氨基酸序列，是指具有與由上述序列編碼的多肽相同氨基酸的多肽，或其一部分，其中此部分由至少2-5個，優(yōu)選至少8-10個，更優(yōu)選至少11-15個氨基酸組成，或者是用上述序列編碼的多肽可免疫學(xué)鑒別的。
本發(fā)明還包括融合蛋白，其中全長VEGI多肽或其片段、變體、衍生物或類似物與不相關(guān)的蛋白質(zhì)融合。這些融合蛋白通常可在本文所揭示的VEGI核苷酸及多肽序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，VEGI和、或VEGI-β多肽及其片段(包括具有表位的片段)可與部分免疫球蛋白(IgG)的恒常區(qū)組合，得到嵌合(融合蛋白)。這些融合蛋白易于純化且在體內(nèi)呈延長的半衰期。這已由如由人CD4-多肽的頭兩個區(qū)及哺乳動物免疫球蛋白重或輕鏈各種恒常區(qū)組成的嵌合蛋白表明(EPA 394，827；Taunecker，et al.，Nature 33184-86(1988)。由于IgG部分而具有二硫鍵連的嵌合結(jié)構(gòu)的融合蛋白，比VEGI單體蛋白或單蛋白質(zhì)片段在結(jié)合及中和其它分子中更有效。(Fountoulakis，et al.，J.Biochem.270395803964(1995))。如一實(shí)施例所述，在此所述的VEGI-Fc融合蛋白自己生產(chǎn)出。包含在本發(fā)明內(nèi)的VEGI融合蛋白的其它實(shí)例包括但非限于VEGI多肽序列與任何使融合蛋白在細(xì)胞表面顯示的氨基酸序列的融合；或與酶，熒光蛋白質(zhì)，或提供標(biāo)記功能的發(fā)光的蛋白質(zhì)融合。
功能活性VEGI多肽及其片段、變體、衍生物及類似物的功能活性可通過各種方法分析。
例如，在一實(shí)施方案中，其中分析了結(jié)合能力或用全長VEGI多肽競爭結(jié)合抗VEGI抗體的能力，可應(yīng)用各種本領(lǐng)域已知免疫分析法，包括但非限于用如放射免疫分析法技術(shù)競爭及非競爭分析系統(tǒng)，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，“夾心”免疫分析，免疫放射分析，凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)，免疫擴(kuò)散分析，原位免疫分析如(用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)，Westren印跡，沉淀反應(yīng)，凝集分析(如凝膠凝膠分析，血凝分析)，補(bǔ)體結(jié)合分析，免疫熒光分析，A蛋白分析，及免疫電泳分析等。在一實(shí)施方案中，通過檢測第一抗體上的標(biāo)記來檢測抗體結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合以檢測抗體。在又一實(shí)施方案中，第二抗體是標(biāo)記的。本領(lǐng)域已知許多方法檢測免疫分析中的結(jié)合，并是在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在其它實(shí)施方案中，其中TNF-配體是鑒別的，可通過如本領(lǐng)域已知方法分析結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，VEGI結(jié)合其底物的生理相關(guān)物(信號轉(zhuǎn)導(dǎo))可被分析。
另外，本文所述的分析(見實(shí)施例5～8及10)及本領(lǐng)域已知其它分析通常可用于測定VEGI多肽及其片段、變體衍生物及類似物激發(fā)VEGI相關(guān)生物活性的能力(如抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管發(fā)生，及體內(nèi)或體外細(xì)胞粘附)。
技術(shù)人員將知其它方法，并包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
抗體特異識別一或多個VEGI表位，或VEGI保守變體的表位，或VEGI的多肽片段的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。因此，多肽，其片段或其它衍生物，或其類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原從而產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是如多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合、單鏈及人源化抗體，以及Fab片段，F(xiàn)(ab’)片段，F(xiàn)ab表達(dá)文庫的產(chǎn)物，抗獨(dú)特型抗體，及上述任一的表位結(jié)合片段。本領(lǐng)域各種已知步驟可用于生產(chǎn)此抗體及片段。
產(chǎn)生的抗相應(yīng)于本發(fā)明序列的多肽的抗體，可通過將此多肽直接注入動物，或?qū)⒋硕嚯氖┯糜趧游?，?yōu)選非人而得到。然后如此獲得的抗體將與多自身肽結(jié)合。以此方式，即使只編碼多肽一片段的序列可用于產(chǎn)生結(jié)合整個天然多肽的抗體?？贵w的作用包括但非限于從表達(dá)此多肽的組織中分離此多肽，并在生物樣本中檢測VEGI，及可用作診斷或預(yù)后技術(shù)的一部分，據(jù)此可測試患者VEGI的異常量，該抗體也可用于抑制VEGI生物學(xué)活性的方法中。
就抗體的產(chǎn)生而言，可將各種宿主動物經(jīng)注射VEGI多肽(如相當(dāng)于多肽的一功能結(jié)構(gòu)域如胞外結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行免疫。該宿主動物可包括但非限于兔、鼠小和大鼠等。依于宿主物種應(yīng)用各種佐劑以提高免疫應(yīng)答，此佐劑包括但非限于Freund佐劑(完全及不完全的)，無機(jī)凝膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂，Pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳狀液，KLH(匙孔戚血藍(lán)蛋白)，二硝基苯酚及潛在有用的人佐劑如BCG(bacille-Calmette-Guerin)及Corynebacteriumparvum。多克隆抗體是衍生自免疫動物血清的抗體分子的異質(zhì)群體。
特定抗原同質(zhì)群體的抗體即單克隆抗體可通過任何培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)獲得。這包括但非限于Kohler及Milstein的雜交瘤技術(shù)(Nature 256495-497)(1975))及美國專利No.4，376，110，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor，et al..Immunology Today 472(1983)；Cole，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030(1983))，及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole.et al.，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss.Inc.，PP.77-96(1985))。該抗體可以是任何免疫球蛋白類的，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD及其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可以體或體外內(nèi)培養(yǎng)。Mabs在體內(nèi)的高滴度生產(chǎn)使其成為目前代表性優(yōu)選生產(chǎn)方法。
另外，通過剪接適當(dāng)?shù)目乖禺愋允罂贵w分子基因與適當(dāng)生物學(xué)活性人抗體分子基因，為生產(chǎn)“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)(Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855(1 984)；Neuberger，et al.，Nature312604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314452-454(1985))也可以應(yīng)用。嵌合抗體是一分子，其中不同部分衍生自不同動物物種，如那些具有衍生自鼠mAb可變區(qū)及人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。
抗VEGI在人體內(nèi)應(yīng)用可優(yōu)選用“人源化的”嵌合單克隆抗體。此抗體可用衍生自產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的遺傳構(gòu)建體生產(chǎn)。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)嵌合抗體的方法(Morrison，Science 2291202(1985)；Oi et al.，Bio Techniques 4214(1986)；Cabilly，et al.，U.S專利4816567；Taniguchi，et al.，EP 171496；Morrison，et al.，EP 173494；Neuberger，et al.，WO 8601533；Robinson，et al.，WO 8702671；Boulianne et al.，Nature312643(1984)；Neuberger，et al.，Nature 314268(1985))。
或者，生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.專利4，946，778；Bird，Science242423-426(1988)；Huston，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；and Ward et al.，Nature 334544-546(1989))可用于生產(chǎn)抗VEGI多肽的單鏈抗體。單鏈抗體是通過經(jīng)氨基酸鏈連接Fv區(qū)的重鏈及輕鏈片段得到單鏈多肽而生成的。
識別特異性表位的抗體片段可通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，該片段包括但非限于可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段，及可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。或者，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse et al.，Science 2461275-(1281(1989))而迅速及容易地鑒別具有所需特異性的單克隆Fab片段。
VEGI多肽的抗體可用本領(lǐng)域熟知技術(shù)，用于產(chǎn)生“模擬”O(jiān)bR的獨(dú)特型抗體(見如Greenspan ＆ Bona，F(xiàn)ASEB J.7(5)437-444；(1989)aNissinoff，J.Immunol.147(8)2429-2438(1991))。例如，與VEGI胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并競爭性抑制配體與VEGI結(jié)合的抗體，可用于產(chǎn)生“模擬”VEGI胞外結(jié)構(gòu)域的抗獨(dú)特型抗體，并因而結(jié)合及中和VEGI配休。如此中和抗獨(dú)特型抗體或其Fab片段可用于中和VEGI配體的治療中。
因此，如上所述，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員用標(biāo)準(zhǔn)方法可產(chǎn)生本發(fā)明VEGI蛋白(或多肽)的單克隆及多克隆抗體。本領(lǐng)域熟知生產(chǎn)抗體的物質(zhì)及方法(見如Goding，單克隆抗體原則及實(shí)踐，第4章，1986)。另外，多肽可與其它提高其抗原性的蛋白質(zhì)或多肽融合，從而生產(chǎn)較高滴度的抗體。該蛋白或多肽例如可包括任何佐劑或載體，如氫氧化鋁。這些抗體可用于被動抗體治療，其中特異結(jié)合VEGI的抗體可用于調(diào)節(jié)依賴血管發(fā)生的病程，如繁殖，發(fā)育，傷口愈合，及組織修補(bǔ)等。
免疫及循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的及其它疾病在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減輕動物及人體內(nèi)血管發(fā)生相關(guān)疾病癥狀的方法，該方法通過給患者施用有效量的VEGI進(jìn)行。由于血管發(fā)生為腫瘤生存之所需，因而抑制或逆轉(zhuǎn)血管發(fā)生可降低或消除腫瘤。當(dāng)為患者提供VEGI時，施用劑量將依于如患者年齡、體重、身高、性別、現(xiàn)病史、既往史等因素而變化。一般地，所用的以上化合物的劑量在1pg/kg～10mg/kg(體重)范圍內(nèi)，盡管也可應(yīng)用較低或較高劑量。本發(fā)明的方法涉及單一及多次施用，同時或持續(xù)一段時間提供。
通過用如含SEQ ID NO1所述本發(fā)明的VEGI多核苷酸或其一部分，或其等位基因形式的腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)?；虿《据d體，可提供VEGI多核苷酸。所用載體優(yōu)選能為細(xì)胞提供VEGI多核苷酸，由此該多核苷酸被轉(zhuǎn)錄及翻譯，并產(chǎn)生VEGI多肽。本發(fā)明的多核苷酸也可以DNA，包入脂質(zhì)體內(nèi)膠囊化的DNA，或截留于含病毒包膜受體蛋白的蛋白脂質(zhì)體內(nèi)的DNA施用(Kanoda，Y.et al.，(1989)Science243375)?；蛘?，本發(fā)明的多核苷酸可與載體一起被注射，載體可以是如細(xì)胞因子之蛋白質(zhì)，例如白細(xì)胞介素-2，或是聚賴氨酸糖蛋白載體。本領(lǐng)域已知此載體蛋白和載體及使用方法(見如Ascadi G.et al.，Nature 1991，352815)。另外，本發(fā)明的多核苷酸可包被在極小的金珠之上，且所述此珠可用基因槍導(dǎo)入皮膚(Ulmer，J.B.et al.，Science1993，2591745)。
或者，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以藥物可接受配方提供本發(fā)明的VEGI多肽。這些配方可通過標(biāo)準(zhǔn)途徑施用。通常地，該組合物可通過局部、穿皮、腹膜內(nèi)、口腔、直腸、或非腸道(如靜脈內(nèi)、皮下，或肌內(nèi))途徑施用。另外，本發(fā)明的VEGI多肽可摻入生物可降解聚合物中，植入需藥物釋放或植入處的附近，使VEGI多肽緩慢釋放，此生物可降解聚合物及其應(yīng)用見如Brem等在J，Neurosurg74441-446(1991)中所述。
該VEGI多肽配方包括那些適于口腔、直腸、眼(包括玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi))，鼻腔、局部(包括口腔及舌下)，陰道或非腸道(包括皮下、腹膜內(nèi)及硬膜外)施用的。該VEGI多肽配方可以單位劑量形式常規(guī)存在，并可通過常規(guī)制藥技術(shù)制備。此技術(shù)包括加入相關(guān)的活性成分及藥行載體或受體。一般地，此配方的制備通過均勻并充分地混和活性成分及液體載體，或細(xì)分的固體載體，或二種載體，然后如果需要，將產(chǎn)物制成一定形狀。
適于非腸道施用的配方包括含水及不含水的無菌注射液，其可含有抗氧化劑，緩沖液及溶質(zhì)，此溶質(zhì)使配方與受體的血液等滲；且含水及不含水無菌懸浮液可包括懸浮劑及增稠劑。此配方可以單位劑量，或多劑包含物如密封的安瓿及小瓶存在，并可貯存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用前只需加入無菌液體載體如注射用水。即時注射液及懸浮液可從無菌粉末，顆粒及前述片劑中制備。
優(yōu)選的單位劑量配方含有一日劑量或單位，一日亞劑量或其適當(dāng)組分的施用成分的。應(yīng)知除該成分尤其以上提及的成分之外，本發(fā)明的配方可包括本領(lǐng)域常規(guī)應(yīng)用的考慮到配方類型的其它制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減輕患者體內(nèi)不受控制的病理性血管發(fā)生癥狀的方法，其通過為所述患者施用有效量的VEGI多核苷酸，VEGI多肽或其類似物，或能誘導(dǎo)內(nèi)源性或外源性VEGI多肽的表達(dá)，或內(nèi)源性或外源性VEGI多核苷酸的表達(dá)，如此減輕病理性血管發(fā)生的癥狀。此疾病包括但非限于血管瘤，實(shí)體腫瘤、白血病、轉(zhuǎn)移癌、毛細(xì)管擴(kuò)張、牛皮癬、硬皮病、原發(fā)性皮膚淀粉樣變、心肌血管發(fā)生、斑新血管形成，冠脈并行(coronary collaterals)，缺血肢血管發(fā)生，角膜病，潮紅，新血管形成性青光眼，糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，關(guān)節(jié)炎，糖尿病性新血管形成。在此所述的疾病不包括癌癥或各種良性腫瘤。
在一特異實(shí)施方案中，本發(fā)明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽與治療有效量的其它負(fù)調(diào)節(jié)血管發(fā)生的分子組合，該分子可以但非限于是血小板因子4，血小板反應(yīng)蛋白1，金屬蛋白酶的組織抑制劑(IMPTl和TIMP2)，催乳素(16Kda片段)，抑管張素(纖溶酶原的38KDa片段)，bFGF可溶解受體，轉(zhuǎn)化生長因子β，α干擾素，及胎盤增殖蛋白相關(guān)蛋白。
與新血管發(fā)生相關(guān)的，可用本發(fā)明VEGI-α和/或VEGI-β多肽治療的眼科疾病包括但非限于新血管形成性青光眼，糖尿病性視網(wǎng)膜病，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，晶狀體后纖維組織形成，眼色素層炎，早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病，斑點(diǎn)退化，角膜移植新血管形成及其它眼科炎癥及與脈絡(luò)膜或虹膜新血管形成相關(guān)的疾病(見如Waltman，et al.，1978 Am.J.Ophthal.85704-710 and Gartner，et al.，1978，Surv.Ophthal.22291-312)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)患者體內(nèi)血管發(fā)生的方法，其通過為所述患者施用有效量的能降低VEGI多肽功能的制劑進(jìn)行，降低VEGI多肽功能可通過降低VEGI多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，降低編碼VEGI多肽的RNA量，如經(jīng)用VEGI特異性核酶或特異于VEGI RNA的反義寡核苷酸，或經(jīng)蛋白酶的抑制而抑制VEGI多肽的產(chǎn)生，該蛋白酶可加工和/或激活上述VEGI多肽(Kayagaki，et al.，(1995)J.Exp.Med.1821777-1783；Black.Et al.(1997)Nature，385729-733)，或經(jīng)破壞或除去使或促進(jìn)VEGI多肽活化的制劑和/或金屬離子，或經(jīng)破壞VEGI受體直接抑制VEGI多肽功能，或經(jīng)用識別并結(jié)合VEGI多肽的抗體，或經(jīng)用抑制VEGI多肽功能的拮抗劑。本領(lǐng)域已知核酶及反義寡核苷酸的工程化及釋放(見Usman N.，et al.，(1996)Curr.Opin.Struct.Biol.6527533及Ho and Parkinson，(1997)Semin.Oncol.24187-202)，并能輸送入哺乳動物細(xì)胞，如經(jīng)與脂質(zhì)混合或經(jīng)用病毒或質(zhì)粒載體。此類疾病包括但非限于斑退化，創(chuàng)傷愈合，消化道潰瘍，骨折疤痕疙瘩，血管發(fā)生，血細(xì)胞生成，排卵，月經(jīng)及胎盤形成。
其它實(shí)施方案在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種檢測樣本中是否存在VEGI多肽的方法，以診斷或預(yù)后與血管發(fā)生相關(guān)的疾病，用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法，通過在表面(即一固體支持物)包被特異于VEGI多肽的抗體，如微量滴定板或膜(如硝基纖維素膜)，并將包被表面與血清、組織或其它得自穎有血管發(fā)生相關(guān)疾病的人的生物學(xué)或化學(xué)樣本接觸，可進(jìn)行診斷分析。樣本中VEGI多肽與特異于其的抗體之間形成的所得復(fù)合物的存在與否可通過本領(lǐng)域已知的任何通用方法檢測，如熒光抗體光譜或比色法。該檢測方法可用于如診斷或預(yù)后癌癥。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，其含有特異于VEGI多肽的抗體及本領(lǐng)域熟知的并適用于檢測血清、組織或其它樣本中VEGI多肽存在與否的輔助試劑。此組織樣本可得自猴、人或其它哺乳動物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及RNA，DNA或其它核苷酸序列，其用于用PCR或RT-PCR檢測VEGI多核苷酸的存在與否。示于SEQID NO1，SEQ ID NO8或SEQ ID NO26中的本發(fā)明DNA序列可用于設(shè)計(jì)在PCR中與VEGI多核苷酸序列，或與編碼VEGI多肽的RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的VEGI cDNA特異結(jié)合的引物，從而檢測VEGI多核苷酸的存在與否，或與標(biāo)準(zhǔn)對照對VEGI多核苷酸定量。此引物長度可以是7-40個，優(yōu)選10-15個，更優(yōu)選18-25個核苷酸。本領(lǐng)域熟知PCR或RT-PCR所需試劑及對照物。然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物VEGI多核苷酸序列的存在與否，例如通過雜交或不雜交的凝膠分級分離，通過放射化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是僅需少量樣本產(chǎn)生足夠量的DNA模板以進(jìn)行PCR或RT-PCR。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一診斷試劑盒，其含有特異于VEGI多核苷酸的PCR或RT-PCR引物，及一輔助試劑，該試劑是本領(lǐng)域熟知并適用于檢測VEGI多核苷酸存在與否，或用PCR或RT-PCR確定編碼樣本中VEGI多肽的RNA的數(shù)量。此樣本可得自人或其它哺乳動物。
VEGI在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及黑質(zhì)組織中表達(dá)。就一些免疫及循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的疾病而言，VEGI-α和/或VEGI-β基因表達(dá)水平的明顯變化(提高或降低)可在免疫及循環(huán)系統(tǒng)組織中，或其它取自具有與“標(biāo)準(zhǔn)”VEGI-α和/或VEGI-β基因表達(dá)水平相關(guān)的疾病的個體的細(xì)胞或體液(如血清、血漿、尿、滑液或脊液)中檢測，“標(biāo)準(zhǔn)”VEGI-α和/或VEGI-β基因表達(dá)水平即在免疫及循環(huán)系統(tǒng)組織中或在取自無免疫及循環(huán)系統(tǒng)疾病個體的體液中VEGI-α和/或VEGI-β的表達(dá)水平。
因此，本發(fā)明提供一種在診斷免疫及循環(huán)系統(tǒng)疾病中有效的診斷方法，其包括測定編碼VEGI-α和/或VEGI-β蛋白質(zhì)的基因，在免疫及循環(huán)系統(tǒng)組織中或在其它取自個體的細(xì)胞或體液中的表達(dá)水平，并將測定的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)VEGI-α和/或VEGI-β基因表達(dá)水平相對照，其中與標(biāo)準(zhǔn)相對比基因表達(dá)水平提高或降低是免疫及循環(huán)系統(tǒng)疾病的象征。
當(dāng)免疫及循環(huán)系統(tǒng)中疾病的診斷已經(jīng)根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行時，本發(fā)明是有效的預(yù)測指示劑，從而呈降低的VEGI-α和/或VEGI-β基因表達(dá)的患者將比表達(dá)水平接近標(biāo)準(zhǔn)水平的患者經(jīng)歷更差的臨床結(jié)果。
“分析編碼VEGI-α和/或VEGI-β蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平”是指直接或間接定性或定量測定或估計(jì)VEGI-α和/或VEGI-β，或編碼VEGI-α和/或VEGI-β多肽的mRNA在第一種生物學(xué)樣本中的水平，直接測定如測定或估計(jì)絕對多肽水平或RNA水平，間接測定如對比在第二種生物樣本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平。優(yōu)選地，測定或估計(jì)在第一種生物樣本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平，并與標(biāo)準(zhǔn)VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平相對比，標(biāo)準(zhǔn)是得自取自無此疾病個體的第二種生物樣本，或通過平均無此免疫及循環(huán)系統(tǒng)疾病群體的水平而測定的。本領(lǐng)域應(yīng)知，一旦已知標(biāo)準(zhǔn)VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平，其可以重復(fù)用作對照標(biāo)準(zhǔn)。
“生物樣本”是指任何得自個體，體液，細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物，或其它含VEGI-α和/或VEGI-β多肽或mRNA的源料的生物樣本。如上所指明的，生物樣本包括體液(如血清，血漿，尿，滑液及脊液)，其含有游離VEGI-α和/或VEGI-β多肽，及包括免疫及循環(huán)系統(tǒng)組織，和其它發(fā)現(xiàn)表達(dá)完整或成熟VEGI-α和/或VEGI-β多肽或VEGI-α和/或VEGI-β受體的組織源料。本領(lǐng)域熟知從哺乳動物獲得組織活檢及體液的方法。當(dāng)生物樣本包括mRNA時，組織活檢的生物樣本是優(yōu)選的。
用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，如Chomczynski及Sacchi所述的一步氰酸胍-苯酚-氯仿方法(Anal.Biochem.162156-159(1989))可從生物樣本中分離總細(xì)胞RNA。然后用任何適當(dāng)方法分析編碼VEGI-α和/或VEGI-β多肽的mRNA的水平，包括Northem印跡分析，S1核酸酶作圖，PCR，RT-PCR，及RT-LCR。
可用基于抗體的技術(shù)分析生物樣本VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平。例如，用經(jīng)典免疫組織學(xué)方法可研究組織中VEGI-α和/或VEGI-β多肽表達(dá)(Jalkanen，M.，等，J.Cell.Biol.101976～985(1985)；Jalkanen，M.，et al.，J.Biol 1053087-3096(1987))。其它用于檢測VEGI-α和/或VEGI-β多肽基因表達(dá)的基于抗體的方法包括免疫分析，如ELISA及RIA。合適的抗體分析標(biāo)記本領(lǐng)域已知，并包括酶標(biāo)記如葡萄糖氧化酶，及放射性同位素如125I，14C，35S，3H，112In及99mTc，及熒光物標(biāo)記如熒光素及羅丹明，及生物素。
除分析在得自個體的生物樣本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平之外，也可通過成像檢測體內(nèi)VEGI-α和/或VEGI-β多肽。體內(nèi)VEGI-α和/或VEGI-β成像的抗體標(biāo)記或標(biāo)志包括那些通過X光，NMR或ESR可檢測的。對X光而言，合適的標(biāo)記包括放射性同位素如鋇或鍶，其發(fā)射可檢測的輻射，但對試驗(yàn)病人無明顯損害。適于NMR和ESR的標(biāo)志包括那些具有可檢測特性自旋的標(biāo)志，如氚，其可通過標(biāo)記相關(guān)雜交瘤的養(yǎng)分而摻入抗體中。
將已用適當(dāng)?shù)目蓹z測的顯像劑組分如放射性同位素(如131I，112In，99mTc)，不透射線物質(zhì)，或經(jīng)核磁共振(NMR)可檢測的物質(zhì)標(biāo)記的VEGI-α和/或VEGI-β多肽特異性抗體或抗體片段，導(dǎo)入(如非腸道，皮下或腹膜內(nèi))哺乳動物中，以診查免疫系統(tǒng)疾病。本領(lǐng)域?qū)⒅獣允茉囌叩拇笮〖八蔑@像系統(tǒng)將決定需產(chǎn)生診斷顯像的顯像劑組分的數(shù)量。在放射性同位素組分的情況中，對受試驗(yàn)的人而言，注射的放射活性物質(zhì)的量將在大約5～20毫居里99mTc范圍。然后標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)選在含VEGI-α和/或VEGI-β多肽的細(xì)胞位置積聚。體內(nèi)腫瘤顯像見于Burchiel等所述(第13章腫瘤成像癌癥的放射化學(xué)檢測，，Burchiel，S.W.和Rhodes，B．A.，eds.，MassonPubliching Inc.(1982))。
如上所述，VEGI-α和/或VEGI-β多核苷酸及多肽可用于診斷含有異常高或低VEGI-α和/或VEGI-β活性表達(dá)的疾病。給定其中表達(dá)VEGI-α和/或VEGI-β的細(xì)胞和組織，以及通過VEGI-α和/或VEGI-β調(diào)節(jié)的活性，很明顯個體中VEGI-α和/或VEGI-β的表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)或“正?！彼较啾让黠@的變化(提高或降低)，產(chǎn)生與體系相關(guān)的病理?xiàng)l件，其中VEGI-α和/或VEGI-β是表達(dá)的和/或是活性的。
本發(fā)明還用于診斷或治療哺乳動物，尤其是人體內(nèi)各種免疫及循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如此疾病包括細(xì)菌、病毒或其它寄生蟲感染，免疫缺陷，炎癥疾病，淋巴腺疾病，自身免疫疾病，移植物對宿主疾病，及任何免疫及循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞功能失調(diào)，包括但非限于自身免疫性疾病，白血病、淋巴瘤、免疫抑制、免疫性、體液免疫、炎性腸道疾病，骨髓抑制等。
由于VEGI多肽可誘導(dǎo)細(xì)胞NF-κB及c-jun N末端激酶(JNK)的活性，因此其也可用于治療性地調(diào)節(jié)如由細(xì)菌、病毒及其它寄生蟲引起的感染，免疫缺陷，炎癥疾病，淋巴腺疾病，自身免疫疾病，移植物抗宿主疾病，自身免疫性，免疫抑制，炎癥腸道疾病，骨髓抑制及相關(guān)后遺癥等細(xì)胞及免疫系統(tǒng)疾病。
由于VEGI-α和/或VEGI-β屬于TNF超家族，它們還可調(diào)節(jié)血管發(fā)生。另外，由于VEGI-α和/或VEGI-β多肽抑制免疫細(xì)胞功能，其將具有廣泛抗炎作用，VEGI-α和/或VEGI-β多肽可用作抗新血管發(fā)生劑，以刺激宿主防御細(xì)胞如胞毒T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的侵染及活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將識別一些非癌癥癥狀，其中血管增殖是非所需的。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于增強(qiáng)宿主抗抵抗性慢性及急性感染的防御力，如經(jīng)殺微生物的淋巴細(xì)胞的引誘及激活抗肌細(xì)菌感染。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于抑制T細(xì)胞增殖，其通過抑制IL-2生物合成治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于刺激傷口愈合，可經(jīng)清除殘?jiān)按龠M(jìn)炎癥細(xì)胞的結(jié)締組織復(fù)原進(jìn)行。以相同方式，VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于治療其它纖維性疾病，包括肝硬化，骨關(guān)節(jié)炎及肺纖維化。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也提高嗜紅性粒細(xì)胞的存在，其具有殺傷侵入組織的如schistosomiasis trichinosis及蛔蟲等寄生蟲幼蟲的獨(dú)特功能。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于調(diào)節(jié)造血，其通過調(diào)節(jié)各種造血原細(xì)胞的活性及分化而進(jìn)行，如在化療后從骨髓中釋放成熟白細(xì)胞，即在干細(xì)胞遷移中。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于治療敗血病。
也將為熟練技術(shù)人員知曉的是由于本發(fā)明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽是TNF家族成員，成熟分泌形式的蛋白質(zhì)可以可溶形式經(jīng)蛋白酶裂解從表達(dá)VEGI的細(xì)胞中釋出。因而，當(dāng)將VEGI-α和/或VEGI-β的成熟形式或可溶胞外結(jié)構(gòu)域從外源加至細(xì)胞，組織或個體中時，此多肽將發(fā)揮其對其個體靶細(xì)胞的生理作用。也可將表達(dá)此Ⅱ型跨膜多肽的細(xì)胞加入細(xì)胞，組織或個體中，且這些加入的細(xì)胞將結(jié)合表達(dá)VEGI-α和/或VEGI-β受體的細(xì)胞，從而表達(dá)VEGI-α和/或VEGI-β多肽的細(xì)胞可作用于具有靶細(xì)胞的受體(如調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長及調(diào)節(jié))。
因此，應(yīng)知由VEGI-α和/或VEGI-β在個體中活性比標(biāo)準(zhǔn)或正常水平降低所致的疾病，尤其免疫及循環(huán)系統(tǒng)疾病，可以通過施用VEGI-α和/或VEGI-β多肽(以成熟或胞外結(jié)構(gòu)域多肽形式)進(jìn)行治療。因此，本發(fā)明還提供一種治療機(jī)體中需要VEGI-α和/或VEGI-β活性水平提高的方法，包括為該個體施用一藥物組合物，該組合物含有一定量的本發(fā)明分離的VEGI-α和/或VEGI-β多肽，尤其是本發(fā)明VEGI-α和/或VEGI-β多肽的成熟形式，有效地提高在如此個體中VEGI-α和/或VEGI-β活性水平。
VEGI的細(xì)胞粘附活性可用于傷口愈合。VEGI具有強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，其是VEGI在傷口愈合中起作用的標(biāo)記。VEGI的細(xì)胞粘附作用在傷口愈合中也起作用。
VEGI多肽也可用于治療需生長促進(jìn)活性的疾病，如再狹窄。如上所述，VEGI呈現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞生長具有強(qiáng)增殖作用。由此，VEGI也可用于調(diào)節(jié)造血及內(nèi)皮細(xì)胞生長。
由于VEGI多肽能刺激T細(xì)胞活性，因此其是免疫應(yīng)答的一重要中介體。由此，該多肽可用于刺激抗各種寄生蟲、細(xì)菌及病毒感染的免疫應(yīng)答。VEGI多肽可裂解病毒感染的細(xì)胞，并從而用于抑制HIV感染的細(xì)胞。
VEGI多肽也可通過增強(qiáng)T細(xì)胞增殖應(yīng)答而用于治療自身免疫疾病，如Ⅰ型糖尿病。
表2.VEGI活性概述
注*只在高劑量?！?”代表活性的相對水平?！?”代表在測試濃度范圍未檢測到活性。
VEGI可用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，如動脈內(nèi)皮細(xì)胞。在近于10μg/ml濃度，VEGI可近于完全地抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，而對人乳腺癌細(xì)胞生長無明顯作用。結(jié)果，VEGI可用于治療其中內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制是有益的疾病。
本發(fā)明的VEGI多肽已用于降低體內(nèi)由內(nèi)皮細(xì)胞形成的類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的形成。本發(fā)明的VEGI多肽可用于在應(yīng)答血管生成因子如FGF-2中，抑制類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)中內(nèi)皮細(xì)胞組織化形成。進(jìn)一步地，本發(fā)明分離的VEGI可用于在修改的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中抑制內(nèi)皮細(xì)胞在毛細(xì)管中生長及組織化。結(jié)果，本發(fā)明的VEGI可用于抑制體外從內(nèi)皮細(xì)胞中形成毛細(xì)管或類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的多核苷酸及多肽可用作研究試劑，用于發(fā)現(xiàn)治療及診斷人體疾病。
本發(fā)明提供一種鑒別VEGI受體的方法。編碼該受體的基因可通過各種本領(lǐng)域已知方法如配體淘選及FACS分選。(Coligan，et al.，Current Protocols in Immune.，1(2)，Chapter 5，(1991)。優(yōu)選地，應(yīng)用表達(dá)克隆，其中聚腺苷酸化RNA從對VEGI應(yīng)答的細(xì)胞中制備，且將從此RNA中產(chǎn)生的文庫分成集合體，并用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或其它對VEGI無應(yīng)答的細(xì)胞。將生長于玻璃載體片上轉(zhuǎn)染的細(xì)胞曝光以標(biāo)記VEGI?？赏ㄟ^各種方法包括碘化或包含位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識別位點(diǎn)，以標(biāo)記VEGI。在固定及培養(yǎng)后，將此載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別陽性集合體，并制備亞集合體，并用重復(fù)制備亞集合體及重篩選用方法重轉(zhuǎn)染，最后產(chǎn)生編碼推定受體的單克隆。
如一受體鑒別的選擇方法，標(biāo)記的VEGI可與細(xì)胞膜或表達(dá)受體分子的提取制備物光親和連接。將交連物經(jīng)PAGE解離并在X線下曝光。切除含VEGI受體的標(biāo)記復(fù)合物，并解離為肽片段，并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測序。得自微時測序的氨基酸序列將用于設(shè)計(jì)一系列簡并寡核苷酸探針，以篩選一cDNA文庫以鑒別編碼推定受體的基因。
此VEGI多肽組合物將配制成與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐相一致，并考慮到患者的臨床癥狀〔尤其只用VEGI多肽治療的副作用〕。VEGI多肽的釋放位點(diǎn)，施用方法，施用程序表及其它方面已為從業(yè)者所知。VEGI多肽的“有效量”經(jīng)如此條件測定。
拮抗劑可與藥物可接受載體如后文所述的載體組合應(yīng)用。
本發(fā)明的VEGI多肽及興奮劑及拮抗劑可與適當(dāng)藥物載體組合應(yīng)用。該組合物含有治療有效量的化合物，及藥物可接受載體或受體。該載體包括但非限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其組合物。配方應(yīng)適于施用方式。
本發(fā)明還提供一藥物成套試劑或試劑盒，其含有一或多個裝有一或多個本發(fā)明藥物組合物的成分的容器。與此容器相關(guān)的是政府機(jī)構(gòu)管理使用或出售藥品或生物制品生產(chǎn)者的規(guī)定，其規(guī)定了生產(chǎn)機(jī)構(gòu)使用或出售此制品施用于人經(jīng)過認(rèn)可。另外，本發(fā)明的藥物組合物可與其它治療性化合物聯(lián)合應(yīng)用。
此藥物組合物可以如經(jīng)局部、靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑等常規(guī)方式施用。此藥物組合物是以有效治療和或預(yù)防量施用。通常地，它們以至少10g/kg(體重)施用，在多數(shù)情況下將以每天不超過8mg/kg(體重)施用。在大多數(shù)情況中，考慮到施用途徑，癥狀等，劑量每天在大約10g/kg-1mg/kg體重之間。
已知各種釋放系統(tǒng)，并可用于施用本發(fā)明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽，如在脂質(zhì)體中包入膠囊，微粒，微膠囊，受體介導(dǎo)的胞吞(見如Wu and Wu 1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)。導(dǎo)入方法包括但非限于局部，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，硬膜外，眼，及口服途徑。此化合物可通過任何常規(guī)途徑施用，例如經(jīng)灌注或藥團(tuán)注射，經(jīng)內(nèi)皮或粘膜皮層吸收(如口腔粘膜，直腸及小腸粘膜等)，并可與其它生物活性制劑一起施用。
在一特異的實(shí)施方案中，期望在需要處理的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥物組合物。這可通過如但非限于在手術(shù)期間局部灌注，局部施用如與傷口包扎連用，經(jīng)注射，經(jīng)導(dǎo)管方式，經(jīng)栓劑，或經(jīng)植入，所述植入是一多孔，非多孔，或凝膠物包括膜，如腸系膜或纖維。
本發(fā)明VEGI-α和/或VEGI-β多肽的局部施用至少可治療一些本文所示的眼科疾病，其由有效量的本發(fā)明VEGI-α和/或VEGI-β多肽及眼科學(xué)可接受賦形劑如緩沖鹽水，礦物油，植物油(如豆油或花生油)，石油嗜喱，Miglyol 182，醇溶液或脂質(zhì)或類脂產(chǎn)物組成。這些組合物也可包括防腐劑，抗氧化劑，抗生素，免疫抑制劑及其它生物或藥物有效制劑，其對本發(fā)明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽無明顯影響。
根據(jù)本發(fā)明，通過體內(nèi)表達(dá)該多肽，VEGI多肽及興奮劑及拮抗劑也可應(yīng)用，此興奮劑及拮抗劑也是多肽。通常稱之為“基因療法”。
因此，例如患者細(xì)胞可用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA工程化，然用將工程化的細(xì)胞提供給患者以用該多肽進(jìn)行治療。本領(lǐng)域已熟知此方法，并經(jīng)本文教導(dǎo)更顯而易見。例如，細(xì)胞可經(jīng)用含編碼本發(fā)明多肽RNA的逆轉(zhuǎn)錄毒顆粒工程化。
相似地，細(xì)胞可通過體內(nèi)表達(dá)多肽而體內(nèi)工程化，如經(jīng)本領(lǐng)域已知步驟。例如，產(chǎn)生含編碼本發(fā)明多肽RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的秤細(xì)胞可施用于病人，以體內(nèi)工程化細(xì)胞并體內(nèi)表達(dá)多肽。通過本發(fā)明的教導(dǎo)，這些及其它施用本發(fā)明多肽的方法應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒之外的，如腺病毒，其在與適當(dāng)釋放載體組合后可用于工程化細(xì)胞。
從中上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但非限于Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白病毒，猿白血病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒。在一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體衍生自Moloney鼠白血病病毒。
此載體包括一或多個啟動子，可應(yīng)用的適當(dāng)啟動子包括但非限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；及由Miller等所述的人CMV啟動子(Biotechniques 7980-990(1989))，或任何其它啟動子(如細(xì)胞啟動子如真核細(xì)胞啟動子包括但非限于組蛋白，poi Ⅲ，及b-肌動蛋白啟動子)。其它可應(yīng)用的病毒啟動子包括但非限于腺病毒啟動子，TK啟動子，及B19細(xì)小病毒子。根據(jù)本文教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于選擇適當(dāng)啟動子。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在適當(dāng)啟動子的控制之下?？蓱?yīng)用的適當(dāng)啟動子包括但非限于腺病毒啟動子如腺病毒主要晚期啟動子；或hetorologous啟動子如CMV啟動子；RSV啟動子；可誘導(dǎo)啟動子如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子如Herpes Simplex的苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上述修改的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRS)；b-肌動蛋白啟動子；及人生長素啟動子。此啟動子也可以是天然啟動子，其控制編碼多肽的基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？赊D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括但非限于PE501，PA317，b-2，b-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，CRE，β-CRIP，GP+E-86，GP+envAm12，及如由Miller(Human Gene Theapy 15-14(1990))所述的DAN細(xì)胞系，其全部并入?yún)⒖?。此載體可通過本領(lǐng)域任何已知方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。如此方法包括但非限于電穿孔，應(yīng)用脂質(zhì)體及CaPo4沉淀。一種選擇是逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體可膠囊化入脂質(zhì)體中，或與脂質(zhì)偶聯(lián)，然后施用于宿主。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生包括編碼多肽的核酸序列的感染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可將此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒用于在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。此轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？赊D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但非限于胚胎干細(xì)胞，胚胎癌性細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種篩選化合物的方法，其用于鑒別那些模擬VEGI(興奮劑)或阻止VEGI效應(yīng)(拮抗劑)的化合物。該方法的一實(shí)例是利用VEGI多肽在存在共促分裂原(comitogen)ConA的情況下有效地刺激人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。獲得內(nèi)皮并將其在補(bǔ)加10％熱滅活的胎牛血清(Hyclone Labs，Logan，VT)，1％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素，0.1％慶大霉素(Gibco Life Technologies，GrandIsland，NY)的RPM1 1640中，在有2g/ml ConA(Calbiochem，La Jolla，CA情況下，在96孔平底培養(yǎng)盤(Costar，Cambridge，MA)中培養(yǎng)。將Con-A及待篩選的化合物加入至終體積為0.2ml。在37℃，60h之后，將培養(yǎng)物用1Ci[3H]胸苷(5Ci/mmol；1Ci=37BGq；NEN)脈沖12-18h，并于玻璃纖維濾器(PhD；Cambridge Technology，Watertown，MA)上收獲。用液體閃爍計(jì)數(shù)儀(Beckman Instruments.Irvine，CA)測定三份培養(yǎng)物的平均[3H]胸苷結(jié)合(cpm)。有效的[3H]胸苷結(jié)合表明內(nèi)皮細(xì)胞增殖的刺激。
或者，在VEGI多肽和受體的相互作用后，測定已知的第二信使系統(tǒng)的應(yīng)答，并在有或無此化合物的情況下對比。該第二信使系統(tǒng)包括但非限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌苷酸水解。
為分析拮抗劑，進(jìn)行上述分析，但在本分析中VEGI與篩選的化合物一起加入，此化合物在存在VEGI多肽之下抑制[3H]胸苷結(jié)合的能力表明此化合物是VEGI拮抗劑?；蛘撸ㄟ^將VEGI及一潛在拮抗劑與膜結(jié)合受體或重組受體在適當(dāng)條件下組合，進(jìn)行競爭抑制分析，從而可檢測VEGI拮抗劑?？赏ㄟ^如放射活性標(biāo)記VEGI，從而與受體結(jié)合的VEGI分子數(shù)可確定潛在拮抗劑的效應(yīng)。
或者，將表達(dá)VEGI受體的哺乳動物細(xì)胞或膜制備物用標(biāo)記的VEGI在存在此化合物的情況下培養(yǎng)，然后測定此化合物增強(qiáng)或破壞此相互作用的能力。
本發(fā)明的此實(shí)施方案另一方面提供了一種鑒別與VEGI多肽特異結(jié)合的受體蛋白或其它配體結(jié)合蛋白(如DR3)的方法。例如，一細(xì)胞區(qū)室如膜或其制備物，可從表達(dá)結(jié)合VEGI多肽的分子的細(xì)胞中制備。將此制備物與標(biāo)記的VEGI多肽保溫，并將與受體或其它結(jié)合蛋白結(jié)合的VEGI多肽復(fù)合物分離，并根據(jù)本領(lǐng)域已知常規(guī)方法定性。或者，VEGI多肽可與固體支持體結(jié)合，從而將溶解自細(xì)胞的結(jié)合分子與柱結(jié)合，然后根據(jù)常規(guī)方法洗脫及定性。
在本發(fā)明對興奮劑或拮抗劑的分析中，一細(xì)胞區(qū)室如膜或其制備物可從表達(dá)結(jié)合VEGI的分子的細(xì)胞中制備，如經(jīng)VEGI信號或調(diào)節(jié)途徑調(diào)制的分子。將此制備物在有或無也許是VEGI興奮劑或拮抗劑的候選分子的情況下，用標(biāo)記的VEGI多肽培養(yǎng)。該候選分子結(jié)合結(jié)合分子的能力反映在標(biāo)記的配體結(jié)合降低中。無償結(jié)合的分子，即不誘導(dǎo)VEGI對結(jié)合VEGI結(jié)合分子的效應(yīng)的分子，大多數(shù)是良好拮抗劑。結(jié)合較好并引發(fā)與VEGI相關(guān)的相同或相近效應(yīng)的分子是興奮劑。潛在興奮劑及拮抗劑的類VEGI效應(yīng)可通過如在候選分子與細(xì)胞或適當(dāng)細(xì)胞制備物相互反應(yīng)之后，測定第二信使系統(tǒng)活性，并將此效應(yīng)與VEGI或引發(fā)如VEGI相同效應(yīng)的分子的效應(yīng)相對比。用于此目的第二信使系統(tǒng)包括但非限于AMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌酸水解第二信使系統(tǒng)。
分析VEGI拮抗劑的另一實(shí)例是競爭分析，其是在適當(dāng)條件下將VEGI多肽和潛在拮抗劑與膜結(jié)合的VEGI受體分子或重組VEGI受體分子組合，進(jìn)行競爭抑制分析。可通過如放射活性將VEGI多肽標(biāo)記，從而與受體分子結(jié)合的VEGI分子數(shù)可精確測定以評價(jià)潛在拮抗劑的效應(yīng)。
潛在拮抗劑包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的小有機(jī)分子、肽、多肽及抗體，從而抑制或消滅其活性。潛在拮抗劑也可以是結(jié)合在結(jié)合分子上相同位點(diǎn)的小有機(jī)分子、肽、多肽，如類似的相關(guān)蛋白質(zhì)或抗體，結(jié)合分子如受體分子，而不誘導(dǎo)VEGI誘導(dǎo)的活性，從而通過使VEGI不能結(jié)合而阻止VEGI的作用。
其它潛在拮抗劑包括反義分子。反義技術(shù)可用于通過反義DNA或RNA或通過三螺旋形成控制基因表達(dá)。反義技術(shù)見于許多研究所論述(如Okano，J.Neurochem 56560(1991)；“Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression.”CRC Press，Boca Rator，F(xiàn)L(1988))。三螺旋形成見于許多研究論述(如Lee，et al.，Nucleic AcidsResearch 63073(1979)；Cooney，et al.，Science 241456(1988)；Dervan，etal.，Science 2511360(1991))。這些方法基于多核苷酸與互補(bǔ)DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸5’編碼部分可用于設(shè)計(jì)一長度大約10～40堿基對的反義RNA寡核苷酸。一DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于包含于轉(zhuǎn)錄中基因的一區(qū)域，從而阻止轉(zhuǎn)錄及VEGI產(chǎn)生。此反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，并破壞mRNA分子翻譯為VEGI多肽。上述寡核苷酸可被輸入細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可體內(nèi)表達(dá)以抑制VEGI多肽的產(chǎn)生。
特異于VEGI多肽的抗體可用作拮抗劑，其與VEGI結(jié)合并阻止其與其受體結(jié)合。單克隆抗體對此尤為有效。但特異于VEGI受體的抗體可介導(dǎo)另外的細(xì)胞應(yīng)答，其趨于在VEGI與其受體相互作用時增強(qiáng)VEGI的效應(yīng)。
潛在的VEGI拮抗劑也包括VEGI突變體，其與VEGI受體結(jié)合并且不引發(fā)第二信使應(yīng)答，以有效地將受體與其天然配體阻斷。特異設(shè)計(jì)的寡核苷酸及小分子也可結(jié)合VEGI受體〔如DR3〕，并阻止其與VEGI結(jié)合。小分子例子包括但非限于小肽或類肽分子。
另一種潛在VEGI拮抗劑是VEGI受體的可溶形式，其結(jié)合VEGI并阻止其與膜結(jié)合的VEGI受體相互作用。在此方式中，該受體不被VEGI刺激。
其它潛在VEGI拮抗劑是用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可用于通過三螺旋形成或者反義DNA或RNA控制基因表達(dá)，二種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分，用于設(shè)計(jì)一長度大約為10～40堿基對的反義RNA寡核苷酸。一DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于參于轉(zhuǎn)錄的基因的一區(qū)域(三螺旋一見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al.，Science，241；456(1988)；and Dervan et al.，Science，2511360(1991))，從而阻止轉(zhuǎn)錄及VEGI產(chǎn)生。此反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，并阻斷mRNS分子翻譯為VEGI多肽(Antisense-Okanno，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynueleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L(1988))。上述寡核苷酸也可被輸送入細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可在體內(nèi)表達(dá)，以抑制VEGI的產(chǎn)生。
VEGI拮抗劑也可用于處理惡病質(zhì)，其是由VEGI抑制的脂蛋白脂酶的全身性缺陷所致的脂質(zhì)明顯缺損。VEGI拮抗劑還用于治療腦瘧疾，其中VEGI似乎起病原體作用。
VEGI拮抗劑還可用于防止移植排斥，其通過防止在移植物存在下，VEGI對免疫系統(tǒng)的刺激而進(jìn)行的。
VEGI拮抗劑還可用于治療骨質(zhì)疏松，這是因?yàn)閂EGI可誘導(dǎo)骨的再吸收。
VEGI拮抗劑還可用作抗炎劑，這是因?yàn)閂EGI介導(dǎo)一增強(qiáng)的炎癥應(yīng)答。
拮抗劑還可用于治療內(nèi)毒性休克，也稱作膿毒性休克。此危險(xiǎn)疾病是由對細(xì)菌或其它類型感染的過份應(yīng)答所致。此應(yīng)答導(dǎo)致VEGI水平升高，而引起休克及組織損傷。
本發(fā)明還涉及一診斷分析，以檢測VEGI多肽在各種組織中水平的變化，由于與正常對照組織樣本相比，蛋白質(zhì)的過表達(dá)可確定疾病是否發(fā)生或是否易感疾病，如腦瘧疾，用于檢測衍生自宿主的樣本中VEGI水平的分析已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，且包括放射免疫方法，競爭結(jié)合分析，Westem印跡分析，ELISA分析及“夾心”分析。ELISA分析(Coligan et a1.，Current Protocols in Immmunology，1(2)，Chapter6，(1991))最初包括制備特異于VEGI抗原的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。另外制備抗單克隆抗體的報(bào)道抗體。報(bào)道抗體附著于一可檢測試劑，如放射性，熒光性或?qū)嵤├械睦备^氧化物酶。從宿主中除去樣本并在固體支持物上如結(jié)合樣本中蛋白質(zhì)的聚苯乙烯培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)民上任何游離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，通過用非特異性蛋白質(zhì)如BSA培養(yǎng)包被。接著，將單克隆抗體在培養(yǎng)皿中保溫，在此期間單克隆抗體與吸附于聚苯乙烯皿上的任何VEGI多肽附著。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。將連于辣根過氧化物酶的報(bào)道抗體置于皿中，使報(bào)道抗體與和VEGI結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合。然后洗去未吸附的報(bào)道抗體。然后向皿中加入過氧化物酶底物。當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對比時，在所給時間內(nèi)顯色量是所供患者樣本體積中VEGI的量。
競爭分析可以應(yīng)用，其中將特異于VEGI多肽的抗體吸附于固體支持物，并將標(biāo)記的VEGI和衍生自宿主的樣本從固體支持物中通過，檢測的標(biāo)記量，如經(jīng)液體閃爍層析檢測，然后可與樣本中VEGI量相關(guān)。
“夾心”分析類似于ELISA分析。在“夾心”分析中，將VEGI從固體支持物中通過，并與吸附于固體支持物的抗體結(jié)合。然后將第二抗體與VEGI結(jié)合。將標(biāo)記的并特異于第二抗體的第三抗體接著通過固體支持物，并與第二抗體結(jié)合，然后可定量。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個外顯子并因而不會使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對含有個別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體一特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至50或60個堿基cDNA。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，Human Chromosomesa Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中發(fā)現(xiàn)(可在線從JohnsHopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個體和未感染個體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個體中觀察到某一突變而未在任何正常個體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個潛在的致病基因中的一個(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個基因)。
使用上述技術(shù)，VEGI的染色體位置以非常高的可靠性定位于9q32。以前的染色體作圖已將幾個發(fā)育缺陷與染色體9的這一區(qū)域中的基因座連鎖。
實(shí)施例以下描述的是本發(fā)明的實(shí)施例，其僅為舉例性的，并非對本發(fā)明范圍的限制。根據(jù)本發(fā)明，在權(quán)利要求書范圍內(nèi)的各種實(shí)施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
以下將參照實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤彽玫降模蛘呤枪娍梢圆皇芟拗频氐玫降?，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μgDNA。對特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時的溫育時間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1 VEGI多肽的細(xì)菌表達(dá)及純化構(gòu)建一表達(dá)載體，該載體含有一編碼缺失了推定的全長VEGI-α多肽N末端的38個氨基酸的多核苷酸。用特異于VEGI-α編碼序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼N末端缺失的VEGI-α多核苷酸的DNA序列。分別在3’及5’序列中加入產(chǎn)生限制位點(diǎn)以促進(jìn)克隆的其它核苷酸。該5’寡核苷酸引物具有5’-GCGCCA TGG CTC TGCACT GGG AAC AT-3’(SEQ ID NO3)序列，其含Nco Ⅰ限制位點(diǎn)隨后是編碼序列的18個核苷酸。3’引物具有5’-CGC AAG CTTCTA TAG TAA GAA GGC TCC-3’(SEQ ID NO4)序列，其含HindⅢ限制位點(diǎn)隨后是18個互補(bǔ)于編碼序列最后15個核苷酸及終止密碼子的核苷酸。在用適當(dāng)?shù)南拗泼赶?，將擴(kuò)增的VEGI-αDNA產(chǎn)物克隆入PQE 60(Qiagen)載體中，隨后連接。將此連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli細(xì)胞(M15/rep4菌株)中。將含所需構(gòu)建體的克隆生長至600nm光密度為0.4-0.6，然后加入IPTG至終濃度為1mM，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。3小時后，收獲細(xì)胞并從破壞的細(xì)胞中純化包涵體，并將包涵體的蛋白質(zhì)溶于8M尿素中。將溶解的蛋白質(zhì)在2XPBS中通過PD-10柱，從而除去尿素，交換緩沖液并折疊蛋白質(zhì)。通過進(jìn)一步層析除去內(nèi)毒素將蛋白質(zhì)純化。所得VEGI-α多肽制備物經(jīng)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)純度高于90％，且含＜10EU內(nèi)毒素/mg。
另外，編碼全長VEGI-αORF，的DNA序列，ATCC保藏號75927的DNA序列，用相應(yīng)于VEGI-α蛋白的5’及3’序列的PCR寡核苷酸引物最初擴(kuò)增。分別在5’及3’序列中加入其它相應(yīng)于VEGI-α的核苷酸。5’寡核苷酸引物示于SEQ ID NO13，并具有5’-GCGCGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3’序列，其含有BamHI限制酶位點(diǎn)，隨后是起始自初始甲硫氨酸密碼子的VEGI-α編碼序列的頭24個核苷酸。3’序列為5’-CGC GTCTAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3’(SEQIDNO14)，其含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)的序列及22個VEGI-α的核苷酸。此限制酶位點(diǎn)相當(dāng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen)中限制酶位點(diǎn)。然后用Bam HI及Xba I消化pQE-9。將擴(kuò)增的序列連于pQE-9中，并插入具編碼組氨酸標(biāo)記的序列及RBS的框架中。然后將此連接混合物用于轉(zhuǎn)化商標(biāo)為M15/rep4的得自Qiagen的E.coli菌株，步驟如Sambrook，J.等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，Cold Spring LaboratoryPress，(1989)所述。M15/rep4含有質(zhì)粒pREP4的多重拷貝，其表達(dá)LacI阻抑物，并還賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過其在LB平板上的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化體，并選擇氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制分析證實(shí)。將含所需構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。此O/N培養(yǎng)物用于以1∶100～1∶250比率接種大培養(yǎng)物。將細(xì)胞生長至光密度600(O.D.600)在0.4～0.6之間。然后加入IPTG至終濃度為1mM。IPTG通過失活1acI阻抑物，清除P/O引導(dǎo)提高基因表達(dá)。將細(xì)胞培養(yǎng)3～4小時以上，然后經(jīng)離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶于離液劑6M鹽酸胍中(發(fā)現(xiàn)鹽酸胍濃度高于或等于2.5M，則回收的重組蛋白質(zhì)的純度水平較高)。澄清后，通過在鎳螯合柱上，在使其被含6-組氨酸-標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下層析，從此溶液中純化溶解的VEGI-α多肽(Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411177-184(1984))。經(jīng)在鎳螯合柱上第二次層析將VEGI-α多肽(90％純化)經(jīng)6M鹽酸胍，pH5.0從柱中洗脫，并為再復(fù)性之目的在PBS緩沖液中透析。將此表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到除PQE-9之外其它細(xì)菌表達(dá)載體也可用于表達(dá)VEGI多肽。如此優(yōu)選的細(xì)菌表達(dá)載體是pHE4-5。pHE4-5可作為pHE4-5/MPIFD23質(zhì)粒DNA而獲得(此構(gòu)建體含有一編碼非相關(guān)ORF的非相關(guān)插入)。pHE4-5/MPIFD23質(zhì)粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852，保藏日1997年9月30日(登錄號209311)。p718限制位點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可便于應(yīng)用通用分子生物學(xué)技術(shù)，用本發(fā)明的VEGI ORF或其變體置換pHE4-5/MPIFD23質(zhì)粒中不相關(guān)的ORF。
實(shí)施例2用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆及表達(dá)VEGI多肽將編碼全長VEGI-α多肽的DNA序列，ATCC NO75927的，應(yīng)用相當(dāng)于基因5’及3’序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增。此5’引物序列為5’-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAGCAA AGT C-3’(SEQ ID NO15)并含有一Barn HI限制酶位點(diǎn)(黑體字處)后接VEGI-α編碼序列的24個核苷酸(翻譯起始密碼子“ATG下劃線)。3’引物序列為5’-CGC GTC TAG ACT ATA GTAAGA AGG CTC CAA AGA AGG-3’(SEQ ID NO16)，并含有限制內(nèi)切酶XbaI的切割位點(diǎn)及互補(bǔ)于VEGI-α編碼序列的3’未翻譯序列的22個核苷酸。用商購的試劑盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)將擴(kuò)增的序列從1％瓊脂糖凝膠中分離。然后將此片段用內(nèi)切酶Bam HI及XbaI消化，并接著在1％瓊脂糖凝膠上再純化。此片段標(biāo)示為F2。
載體pA2(PVL941載體的修飾物，上述)用于應(yīng)用桿狀病毒表述系統(tǒng)表達(dá)VEGI-α多肽(參見Summers，M.D.and Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)程序方法年報(bào)，Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin NO.1555)。此表達(dá)載體含有苜蓿銀蚊夜蛾核多角體病毒AcMNPV的強(qiáng)多角體蛋白啟動子，后接限制內(nèi)切酶BamHI及XbaI的識別位點(diǎn)。SV40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效聚腺苷酸化。為便于選擇重組病毒，將E.coli的β-半乳糖苷酶基因與多角體蛋白啟動子同向插入，后接多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號，此多角體蛋白序列的兩側(cè)為用于進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組的病毒序列的。一些其它桿狀病毒載體可用于替換pA2，如pRGl，pAc373，pVL941及pAcIN(Luckow，V.A.and Summers，M.D.，Virology，17031-39)。
將質(zhì)粒用限制酶Bam HI及XbaI消化，然后用牛小腸磷酸酶經(jīng)本領(lǐng)域已知程序去磷酸化。接著用商購試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)從1％瓊脂糖凝膠上將DNA分離。此載體DNA標(biāo)示為V2。
將片段F2與去磷酸化的質(zhì)粒V2用T4 DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化E coli XLl藍(lán)色細(xì)胞，克隆片段的序列經(jīng)DNA測序確定。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Felgner et al.，Proc Natl Acad Sci USA 847413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBac VEGI-α與1.0μg商購線性的桿狀病毒(“BaculoGold桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA)共轉(zhuǎn)染。
將1μg BaculoGobl病毒DNA與5μg質(zhì)粒pBac VEGI-α混合于含50μg玩血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，GaithersburgMD)的微滴定培養(yǎng)平板的無菌孔中，隨后加入10μg Lipofectin及90μg Grace’s培養(yǎng)基，混合并在室溫培養(yǎng)15分鐘，然后將此轉(zhuǎn)染混合物滴加至Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)，該昆蟲細(xì)胞種植在含無血清的1ml Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板中，將此平板前后搖晃以混合新加入的溶液。然后將此平板在27℃培養(yǎng)5小時，5小時之后，從平板移出轉(zhuǎn)染溶液，并加入用10％胎牛血清補(bǔ)加的1mlGrace’s昆蟲培養(yǎng)基。將平板放入溫箱中，并在27℃持續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，并基本如Summers及Smith(見前述)所述進(jìn)行噬斑分析。一處修改是，具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)用于使藍(lán)染噬斑易于分離(“噬斑分析”的詳細(xì)論述也可見于Life Technologies Inc.，Geithersburg出版的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及桿狀病毒使用手冊P9-10)。
在系列稀釋4天后，將病毒加入細(xì)胞中，用Eppendorf移液管尖挑取藍(lán)染噬斑。然后將含重組病毒的瓊脂重懸浮于含200μl Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中，經(jīng)短暫離心移出瓊脂，并且將含重組桿狀病毒的上清液用于感染植于35mm培養(yǎng)皿中的Sf 9細(xì)胞。4天后，收集這些培養(yǎng)皿的上清液然后在4℃貯存。
將Sf 9細(xì)胞在補(bǔ)加10％熱滅活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將此細(xì)胞用重組桿狀病毒V-VEGI-α在感染復(fù)數(shù)(MOI)為2下感染。6小時后，除去培養(yǎng)基，并用不含甲硫氨酸及半胱氨酸的SF 900Ⅱ培養(yǎng)基置換(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小時后，加入5μCi的[35S]-甲硫氨酸及5μCi的[35S]-半胱氨酸(Amersham)。上在進(jìn)一步培養(yǎng)16小時，然后將其離心收集并經(jīng)SDS-PAGE及放射自顯影觀察標(biāo)記蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3重組VEGI-α在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞二氫葉酸還原酶陰性(DHFR-)細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心?；救缦滤鰧EGI-α cDNA克隆入pC1 CHO細(xì)胞表達(dá)載體中。將編碼全長VEGI-α多肽的人cDNA序列用引物擴(kuò)增，該引物特異于VEGI-α編碼序列的5’及3’末端，5’引物GCG gga tcc GCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACAAGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTCCTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT GTG AGA C(SEQ ID NO5)，其含有Bam HI限制位點(diǎn)，后接“Kozak”序列(小寫字母處)，及IL6編碼序列的頭84個堿基和VEGI-α編碼序列的13個堿基；3’引物CGC ggatcc GAT ATT TGC TCT CCT CCTCA(SEQ NO6)，其含有Bam HI限制位點(diǎn)，后接17個非翻譯區(qū)的核苷酸及終止密碼子。將擴(kuò)增的片段凝膠純化，并用Bam HI消化。將CHO細(xì)胞表達(dá)載體(pC1)用Ban HI消化，然后通過瓊脂糖凝膠純化。將擴(kuò)增的VEGI-α編碼序列用T4 DNA連接酶與純化的pCl載體連接。接下來轉(zhuǎn)化HB 101細(xì)胞。通過PCR篩選/酶消化鑒別陽性克隆(pC1VEGI)，并用自動DNA測序確定插入的DNA序列。如R.Gettzet al.，Eur LT Biochemistry 210.545(1992)所述進(jìn)行穩(wěn)定CHO細(xì)胞克隆的選擇與擴(kuò)增。將CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體CHO-VEGI-α及CHO-載體保持在含10％FCS的MEM-a培養(yǎng)基中(透析)。
質(zhì)粒的表達(dá)，VEGI-α-HA衍生自載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，該載體含有1)SV 40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E coli復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動子，后接多接頭區(qū)，SV 40內(nèi)含子，及聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼完整VEGI-α前體及融入其3’末端的血凝素抗源(HA)標(biāo)記的DNA片段克隆入載體的多接頭區(qū)，因而重組蛋白質(zhì)表達(dá)在CMV啟動子的引導(dǎo)下。該HA標(biāo)記相當(dāng)于衍生自以前描述的流感血凝素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Chcrenson，M.Conolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記與我們的靶蛋白的融合使較易用識別HA表位的抗體檢測重組蛋白。
質(zhì)粒構(gòu)建策略如下述將編碼VEGI-α的DNA序列，ATCC＃75927用兩種引物通過PCR在克隆的最初的EST上構(gòu)建，5’引物(SEQID NO15)含有-Bam HI位點(diǎn)，后接起始自起始密碼子的VEGI-α編碼序列的24個核苷酸；3’序列5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGATAGTAAGAAGGCTCCAAAG-3’(SEQ ID NO17)，含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)，翻譯終止密碼子，HA靶及VEGI-α編碼序列(不包括終止密碼子)的后18個核苷酸的序列。因而，PCR產(chǎn)物含有Bam HI位點(diǎn)，VEGI-α編碼序列，后接融入框內(nèi)的HA標(biāo)記，接著HA標(biāo)記的翻譯終止密碼子及XbaI位點(diǎn)。用Bam HI及XbaI限制酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段及載體pcDNAI/Amp并連接在一起。將連接混合物轉(zhuǎn)化入E.coli菌株SURE(商購自Stratagene Cloning Systems，11099 North TorreyPines Road，La Jolla，OA 92037)，將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物置于氨芐青霉素培養(yǎng)平板上，并選擇抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制分析檢測正確片段的存在與否。為表達(dá)重組VEGI-α多肽，將COS細(xì)胞用表達(dá)載體通過DEAE-葡聚糖法轉(zhuǎn)染。(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1989))。VEGI-α-HA蛋白的表達(dá)通過放射標(biāo)記及免疫沉淀法檢測(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。在轉(zhuǎn)染2天后，將細(xì)胞用[35S]-S-半胱氨酸標(biāo)記8小時。然后收集培養(yǎng)基，并用去污劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5；Wilson.I.Et al.，Id.37767)(1984))裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物及培養(yǎng)基均用HA特異單克隆抗體沉淀。然后將沉淀的蛋白質(zhì)在15％SDS-PAGE凝膠上分析。
實(shí)施例4VEGI在各種細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行RNA印跡分析以檢測VEGI在人組織中的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)分離總細(xì)胞RNA樣本(Brotecx Laboratories，Inc.6023South Loop East，Houston，TX77033)。將2μg分離自每個人特異組織的總RNA在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上分離，并印跡在尼龍濾膜上(Sambrook，F(xiàn)ritsch，and Maniatis，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Press，(1989))。根據(jù)Stratagene Prime-It試劑盒用50ng VEGI-αcDNA進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)以產(chǎn)生[32p]標(biāo)記的VEGI-αcDNA。將此標(biāo)記的DNA用Select-G-50柱純化(5Prime-3Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后將濾膜與放射標(biāo)記的1，000，000cpm/mlr全長VEGI-α探針在0.5M NaPO4，pH7.4及7％ SDS中，在65℃雜交一夜。在用0.5X SSC，0.1％SDS在室溫洗2次及在60℃洗2次后，用增感屏在-70℃對印跡進(jìn)行X光片曝光。VEGI-α的信使RNA在腎中是高豐度的。
VEGI在內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，這已通過對從22種各種譜系的不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞中制備的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析而確認(rèn)(圖1A)。VEGI信使只在二種類型的內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中檢測出HUVE細(xì)胞及早期代次的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。mRNA在晚期代次的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中未檢測出，在人動脈細(xì)胞中也未檢測出。鮮明對比的是TNF家族成員大多數(shù)在免疫細(xì)胞中表達(dá)CB.B.Aggarwal and K.Natarajan，見前述)。例如，TNF-α由巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性細(xì)胞及T細(xì)胞產(chǎn)生，而TNF-β主要由促細(xì)胞分裂原刺激的T淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞產(chǎn)生。相似地，F(xiàn)as CD27，CD30，CD40，OX40，及4-1BB配體都在免疫系統(tǒng)的各型細(xì)胞中表達(dá)。
應(yīng)用多重組織Northem印跡，檢測到VEGI轉(zhuǎn)錄物在胎盤、肺、腎、骨骼肌、胰、脾、前列腺、小腸及結(jié)腸中表達(dá)。在心、腦、肝、胸腺、睪丸、卵巢及周圍血淋巴細(xì)胞中檢測到微量VEGI信號。由VEGI在大多數(shù)主要器官中表達(dá)可推測此基因產(chǎn)物可在正常血管功能中起作用。
進(jìn)行Northern印跡分析也用于測定相對關(guān)于HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)物增殖狀態(tài)，VEGI RNA的相對表達(dá)水平。在這些試驗(yàn)中，將等量的分離自HUVEC細(xì)胞的總RNA(15μg)進(jìn)行電泳分離并如上述印跡。在接種后1，2，3，4，6及7天從培養(yǎng)物中分離RNA。VEGI RNA只在新種植的培養(yǎng)物(1，2及3天)中低水平呈現(xiàn)。但隨著培養(yǎng)物中HUVEC細(xì)胞開始達(dá)到鋪滿(4，6及7天)明顯可見VEGI RNA的表達(dá)。這些試驗(yàn)表明VEGI表達(dá)隨著培養(yǎng)物或組織中的細(xì)胞開始達(dá)到非增殖或低增殖的靜止?fàn)顟B(tài)而提高。
實(shí)施例5VEGI介導(dǎo)的ABAE細(xì)胞增殖的抑制將細(xì)胞以適當(dāng)密度以三份重復(fù)植于24孔平板中(ABAE細(xì)胞，8，000個細(xì)胞/孔；MDA-MB-231，2，000個細(xì)胞/孔；MDA-MB-435，2，000個細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)基含有IMEM(Gibco)及10％FCS。在ABAE細(xì)胞培養(yǎng)基中有FGF-2(1ng/ml)。將培養(yǎng)物在37℃，5％CO2下保持6天。細(xì)胞被胰蛋白酶消化，并用Coulter計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)。回收的總ABAE細(xì)胞的1/5用于校正與癌細(xì)胞對比。
將相當(dāng)于殘基38-174組成的推定的胞外結(jié)構(gòu)域的VEGI-α截短的變體如上述在E.coli中表達(dá)，純化，并在各種細(xì)胞分析中檢測。發(fā)現(xiàn)截短的多肽特異抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(圖2)。在10mg/ml，成年牛動脈內(nèi)皮(ABAE)細(xì)胞的生長近于完全抑制，半最大抑制濃度(IC50)大約為1mg/ml(大約70nM)。重組多肽的活性可與抑管張素，內(nèi)抑制素及血小板因子4相比。相反，此多肽在相似試驗(yàn)條件下不能抑制人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)的生長。VEGI-α缺失突變體也發(fā)現(xiàn)對人T細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat)，人Burkitts淋巴瘤細(xì)胞(Raji)，人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)或人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL60)的增殖幾乎沒有影響，此突變體呈現(xiàn)與不同受體結(jié)合，因?yàn)樽⒁獾脚c檢測的TNF受體超家族的任何成員無相互作用，該成員包括TNF R1，TNF R2，F(xiàn)as，DR3及DR4(G.J.Mazzei et al.(1995)J.Biol.Chem.2707205)?，F(xiàn)已示出一些TNF家族成員，包括TNF-α和Fas配體，是從膜結(jié)合前體中徑金屬蛋白酶激活(M.Tanaka等(1996)Nat.Med.2317；R.A.Black etal.，(1997)Nature 385729)。
實(shí)施例6VEGI介導(dǎo)的類毛細(xì)管形成的抑制此分析用于測定截短的VEGI-α多肽抑制成年牛動脈內(nèi)皮(ABAE)細(xì)胞培養(yǎng)物中FGF-2誘導(dǎo)的類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)形成的能力。通過向含1X DMEM的每個孔中加入0.5ml預(yù)冷的0.7mg/ml大鼠尾I型膠原(Becton Dickinson Labwares，Bedford，MA)溶液，并用NaHCO3調(diào)正至中性pH，制備三維膠原凝膠平板(24孔)。在膠原凝膠形成后(大約1-2mm厚)，將ABAE細(xì)胞以5×104個/孔種植于孔內(nèi)。將培養(yǎng)物在37℃在用5％CO2增濕的培養(yǎng)儀中，保持在含10％小牛血清(HyClone，Logan，UT)，補(bǔ)加L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM中直至培養(yǎng)物鋪滿。然后用含20ng/mlFGF-2的新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，通過用0.1，0.3，1，3，或10μg/ml的VEGI-α12-147補(bǔ)加培養(yǎng)基，分析VEGI-α12-147作為ABAE培養(yǎng)物中FGF-2誘導(dǎo)的類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)形成的抑制劑，的作用。然后將所有培養(yǎng)物保持在37℃，48小時，然后用冷卻甲醇(-20℃)固定。
由ABAE細(xì)胞形成的類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的豐度通過用Kotron IBAS圖象分析儀，借助于Hamamatsu C2400圖象攝影機(jī)及Zeiss Axioshop顯微鏡的進(jìn)行分析。類毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的豐度是以測定總測定區(qū)域內(nèi)白色區(qū)域的百分?jǐn)?shù)標(biāo)示。作為對照血管生成因子FGF-2刺激體外血管發(fā)生的EC50值大約為5ng/ml。作為進(jìn)一步的對照，在10ng/mlFGF-2觀測到最大刺激效應(yīng)。
實(shí)施例7VEGI介導(dǎo)的腫瘤生長抑制用異種移植的腫瘤樣本，進(jìn)行VEGI多肽對血管發(fā)生的潛在效應(yīng)的體內(nèi)分析。在此試驗(yàn)方法中，將一百萬個人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)注入雌性裸鼠的乳房脂肪層中，單獨(dú)注入或與用表達(dá)VEGI-α的哺乳動物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，或與只用CHO載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞混合注入(5×106個細(xì)胞/鼠)。在這些試驗(yàn)中表達(dá)的VEGI多肽由SEQ ID NO2所示多肽除去N末端22個氨基酸組成。此VEGI突變蛋白的N末端22個氨基酸由人白細(xì)胞介素6(IL6)的分泌信號肽(Hirano，T.，et al.，Nature 32473-76(1986)取代。
在此實(shí)施例中觀測的VEGI多肽的抗血管發(fā)生活性表明VEGI多肽可抑制腫瘤生長。VEGI潛在的抗癌活性用上述異種移植腫瘤樣本可測定，當(dāng)將乳腺癌細(xì)胞植入雌性無胸腺裸鼠的乳房脂肪層時，其是高致瘤性的。通過Northern印跡分析確定轉(zhuǎn)染子中構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。將過量表達(dá)分泌形式VEGI-α的CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基濃縮并部分純化，并發(fā)現(xiàn)其能抑制ABAE細(xì)胞生長，而載體轉(zhuǎn)染的或全長VEGI轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基無任何作用(數(shù)據(jù)未示出)。在人乳腺癌異種移植樣本中檢測VEGI-α的潛在抗癌活性。將可溶的VEGI-α轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞及人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)共注入乳房脂肪層中，并在注射后監(jiān)測異種移植腫瘤的生長。
過表達(dá)可溶VEGI-α突變蛋白的CHO細(xì)胞引發(fā)對由MDA-MB-231細(xì)胞形成的人乳腺癌異種移植腫瘤的生長的顯著抑制效應(yīng)(圖4A)，而載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞對腫瘤生長無效應(yīng)。相似地，觀測到對裸鼠中MDA-MB-435腫瘤生長的顯著抑制(圖4B)。在每種情況中，過表達(dá)全長VEGI-α的CHO細(xì)胞在相似的試驗(yàn)條件下，對異種移植腫瘤的生長無效應(yīng)。在異種移植樣本中觀測到的可溶VEGI的抗腫瘤效應(yīng)可歸因于對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管發(fā)生效應(yīng)。
然后將用人乳癌細(xì)胞與表達(dá)的VEGI-α的CHO細(xì)胞或載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞共注射的鼠隨機(jī)取用，并每周測二次腫瘤情況。通過用測徑器測垂直徑，乘以二維直徑的測定值而計(jì)算估計(jì)腫瘤大小。在第0天并約間隔5天至28天測量腫瘤。在每種情況中，用表達(dá)VEGI-αCHO細(xì)胞與人乳癌細(xì)胞共注射所致腫瘤的大小。比用載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞與乳癌細(xì)胞共注射所致腫瘤的大小明顯較小。
基于這些發(fā)現(xiàn)，我們設(shè)想VEGI是一血管發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞特異的陰性調(diào)節(jié)劑，其可在成熟血管的保持或血管發(fā)生過程的終止中起作用。生理?xiàng)l件下的內(nèi)皮是一靜止組織，大約1％的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷增殖(J.Denekamp(1990)Cancen Metas，Rev.9267)。保持內(nèi)皮靜止的機(jī)制還未明確，可以想像存在自我半限制機(jī)制，其中內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一生長抑制劑，其通過自泌途徑對內(nèi)皮細(xì)胞自身起作用。VEGI在此重要機(jī)制中起作用。
實(shí)施例8重組VEGI-α抑制WEHI164，ABAE及L929細(xì)胞生長的能力，及誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞粘附的能力粘壁靶細(xì)胞制備自在PBS中胰蛋白酶消化的鋪滿培養(yǎng)物，非粘壁靶細(xì)胞收獲自靜止培養(yǎng)物，并用培養(yǎng)基洗一次。將靶細(xì)胞以3×105個/ml懸浮在含10％FCS的培養(yǎng)基中。將0.1ml等份分散入含0.1ml連續(xù)稀釋的細(xì)胞測試樣本(WEHI164及L929)的96孔平底微滴定平板中。持續(xù)培養(yǎng)70小時。以0.5μg/ml濃度加入TNF-α，TNF-β及細(xì)菌產(chǎn)生的VEGI-α。通過向每孔中加入20μl MTS及吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液進(jìn)行MTS分析，確定胞毒性及增殖活性。在培養(yǎng)3小時后，通過ELISA平板讀數(shù)儀測定在492nm的OD。OD492是與孔中存活細(xì)胞數(shù)成比例的。胞毒性百分率如下計(jì)算胞毒性％=(100-OD試驗(yàn)/OD對照)×100。VEGI-α誘導(dǎo)一形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為黑色圓形細(xì)胞(代表殺傷的細(xì)胞)。
由SEQ ID NO2所示完整VEGI-α氨基酸序列的12-147位氨基酸組成的截短形式的VEGI-α多肽(VEGI-α12-147)也用于測試VEGI-α對內(nèi)皮細(xì)胞生長的效應(yīng)。用VEGI-α12-147處理成年牛動脈內(nèi)皮(ABAE)細(xì)胞得到ABAE培養(yǎng)物中細(xì)胞生長的幾乎完全抑制，但對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435或MDA-MB-231中的細(xì)胞無作用。10μg/mlVEGI-α39-174可達(dá)到對內(nèi)皮細(xì)胞生長的幾乎完全抑制，IC50值大約為1μg/ml(大約70nM)。
為測試VEGI-α的粘附能力，使用HL-60細(xì)胞，在顯微鏡下觀測及經(jīng)兩個獨(dú)立調(diào)查者的主觀評價(jià)測定細(xì)胞粘附及細(xì)胞與細(xì)胞接觸。在這些試驗(yàn)中，VEGI-α呈誘導(dǎo)細(xì)胞粘附。未用VEGI-α處理的培養(yǎng)物含有布滿培養(yǎng)血的細(xì)胞。但用VEGI-α處理的培養(yǎng)物含有明顯聚集一起的細(xì)胞。
實(shí)施例9基因治療表達(dá)從實(shí)驗(yàn)者中經(jīng)皮膚活檢得到成纖維細(xì)胞。將所得組織置入組織培養(yǎng)基中，并分成小片。將小塊組織置于組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，每瓶約10片。將此瓶例置，緊閉并置于室溫下過夜。在室溫下2小時后，將燒瓶翻轉(zhuǎn)，組織塊仍固定在瓶底。同時加入新鮮培養(yǎng)基(如Ham’sF12培養(yǎng)基，補(bǔ)加10％FBS，青霉素及鏈霉素)。然后將此培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)近一周。這時加入新鮮培養(yǎng)基并每2-3天更換一次。在又培養(yǎng)二周后，單層成纖維細(xì)胞已出現(xiàn)。將此單層細(xì)胞用胰蛋白酶消化并按比例置入較大燒瓶中。
將側(cè)翼為Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.，DNA，7219-25(1988))，用Eco RI和Hind Ⅲ消化，接著用小牛腸磷酸酶處理，將線性載體在瓊脂凝膠上分級分離并用玻珠純化。
將編碼本發(fā)明多肽的cDNA用分別相應(yīng)于5’及3’末端序列的PCR引物擴(kuò)增。5’引物含有-EcoRI位點(diǎn)，3’引物包括一Hind Ⅲ位點(diǎn)。將等理的Moloney鼠肉瘤病毒線性骨架與擴(kuò)增的EcoRI和HindⅢ片段混合，用T4 DNA連接酶連接。將所得混合物保持在適于兩片段連接的條件下。此連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后在含卡那霉素的瓊脂平板上涂布，以確認(rèn)載體具有相應(yīng)適當(dāng)插入的基因。
將兼嗜性pA317或GP+am12包裝細(xì)胞在有10％小牛血清(CS)，青霉素及鏈霉素的Dulbecco修飾的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中組織培養(yǎng)達(dá)到鋪滿密度，然后在培養(yǎng)基中加入含此基因的MSV載體，并將包裝細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)?，F(xiàn)在包裝細(xì)胞產(chǎn)生含基因的感染病毒顆粒(此包裝細(xì)胞現(xiàn)稱為生產(chǎn)細(xì)胞)。
向轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基，并接著從10cm鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的平板中收集培養(yǎng)基。將含感染病毒顆粒的用過的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過濾器過濾，以除去脫附的生產(chǎn)細(xì)胞。然后將此培養(yǎng)基用于感染成纖維細(xì)胞。從亞鋪滿成纖維細(xì)胞的平板中除去培養(yǎng)基，并迅速用生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基替換。除去此培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。如果病毒的滴度高，則所有成纖維細(xì)胞將被感染而不需選擇。如果滴度非常低，則需使用具有選擇標(biāo)記如neo或his的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后將工程化成纖維細(xì)胞注射入宿主，單獨(dú)注射或在cytodex3微載體珠上生長至鋪滿之后應(yīng)用?，F(xiàn)在成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
實(shí)施例10雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管發(fā)生分析基本如Nguyen等(Microvasc.Res.4731-40(1994))及Iruela-Arispe和Dvorak(Thromb.Haemost.78672-677(1997))所述進(jìn)行CAM分析。該方法基于直接置于CAM上的膠原凝膠片中新毛細(xì)管的生長。將血管生成因子FGF-2(100ng)或VEGI(250ng)包埋在膠原凝膠片中，并放置與CAM接觸。在放置凝膠片24小時后，用Nikon熒光顯微鏡對凝膠中血管發(fā)生進(jìn)行定量。用CCD Sony照相機(jī)將圖像轉(zhuǎn)入PowerPCI00 AV。用HN Image1.61軟件評價(jià)熒光強(qiáng)度。陽性對照(其只含有血管生成因子)的熒光強(qiáng)度被認(rèn)為是最大血管發(fā)生應(yīng)答，并設(shè)為100。由于分析的可變性，抑制超過20％被認(rèn)為是顯著的。作為試驗(yàn)性測定VEGI-α對FGF-2或VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的效應(yīng)，將細(xì)菌產(chǎn)生的VEGI-α(250ng)與FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)混合并包埋于膠原凝膠片中。然后如上述將此片與CAM接觸。VEGI-α明顯地抑制膠原凝膠中新毛細(xì)管生長。
根據(jù)以上教導(dǎo)對本發(fā)明做各種修改與改變是可能的，因而在權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于所特定描述的方式實(shí)施。
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT細(xì)則13之二)
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序列表＆＃60110＆＃62人體基因組科學(xué)有限公司＆＃60120＆＃62VEGI，一種血管生成和腫瘤生長的抑制劑＆＃60130＆＃62PF141PCT2＆＃60140＆＃62未給出＆＃60141＆＃621998-11-02＆＃60150＆＃6208/963，272＆＃60151＆＃621997-11-03＆＃60160＆＃6231＆＃60170＆＃62PatentIn Ver.2.0＆＃60210＆＃621＆＃60211＆＃622683＆＃60212＆＃62DNA＆＃60213＆＃62人＆＃60220＆＃62＆＃60221＆＃62CDS＆＃60222＆＃62(1022)..(1543)＆＃60220＆＃62＆＃60221＆＃62信號肽＆＃60222＆＃62(1022)..(1096)＆＃60220＆＃62＆＃60221＆＃62成熟肽＆＃60222＆＃62(1097)..(1543)＆＃60400＆＃621ttctctcctg tctctctctt tcattcatac actgagtcat tcagagatgg cttctctcca 60actcggagct gcaagtaatt ctggatctgg tcacacacac aaagtcccca gagttgccaa 120tttatctagt tcatctgtgc ctgttcaaga tgatgtaact aaacatttac cttcagggag 180gtgtttccaa agaattttca tcgatatata gaaatcaaga gaaaatccat actatcacca 240aatcaagaga aattccatac tatcaccagt tggccaactt tccaagtcta gtgcagaaat 300ccaaggcacc tcacacctag agttcctata cctctgagac tccagaggaa agaacaagac 360agtgcagaag gatatgttag aacccactga aaacctagaa ggttaaaaag gaagcatacc 420ctcctgacct ataagaaaat tttcagtctg cagggggata tccttgtggc ccaagacatt 480ggtgttatca tttgactaag aggaaattat 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權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，包括選自如下一組的多核苷酸(a)編碼SEQ ID NO2的氨基酸1-174的多肽的多核苷酸；(b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸23-174的多肽的多核苷酸；(c)編碼SEQ ID NO2的氨基酸39-174的多肽的多核苷酸；(d)編碼具有抑制血管發(fā)生活性的(a)多肽的片段的多核苷酸；(e)與SEQ ID NO1的互補(bǔ)體雜交的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼具有抑制血管發(fā)生活性的多肽；(f)編碼(a)多核苷酸的等位基因形式的多核苷酸；以及(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的互補(bǔ)鏈。
2.分離的多肽，包括選自如下一組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的氨基酸1-174；(b)SEQ ID NO2的氨基酸23-174；(c)SEQ ID NO2的氨基酸39-174；(d)具有抑制血管發(fā)生活性的(a)的氨基酸序列的片段；(e)具有抑制血管發(fā)生活性的多肽，其中所述的多肽包括由與SEQ ID NO1的互補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的分離的多肽，其中所述的多肽包括一分泌信號。
4.一種血管發(fā)生抑制劑，包括能從細(xì)胞膜釋放權(quán)利要求2的多肽的蛋白酶。
5.血管發(fā)生的促進(jìn)劑，所述的啟動因子包括在藥物學(xué)可接受稀釋劑中的藥物學(xué)可接受量的降低或消除VEGI功能的抗體、藥物或制劑。
6.權(quán)利要求5的血管發(fā)生的促進(jìn)劑，其中所述的藥物或制劑是能消化VEGI RNA的核酶。
7.權(quán)利要求5的血管發(fā)生的促進(jìn)劑，其中所述的藥物或制劑降低或消除VEGI轉(zhuǎn)錄或翻譯。
8.權(quán)利要求5的血管發(fā)生的促進(jìn)劑，其中所述的藥物或制劑是反義寡核苷酸。
9.抑制血管發(fā)生的治療方法，包括給予人或動物足以抑制血管發(fā)生劑量的包括權(quán)利要求1的核酸分子的組合物。
10.權(quán)利要求9的抑制血管發(fā)生的治療方法，其中所述的核酸分子包括與控制基因表達(dá)的調(diào)控序列可操縱相連的VEGI多核苷酸。
11.促進(jìn)血管發(fā)生的治療方法，包括給予人或動物足以促進(jìn)血管發(fā)生劑量的權(quán)利要求5的血管發(fā)生的促進(jìn)劑。
12.診斷病理性血管發(fā)生的方法，包括下述步驟(ⅰ)將來自疑有病理性血管發(fā)生的人或動物的樣品與識別權(quán)利要求2的多肽的抗體接觸；以及(ⅱ)檢測該多肽和該抗體之間形成的復(fù)合物存在與否。
13.一種診斷或預(yù)后試劑盒，包括VEGI多肽的抗體和適用于檢測權(quán)利要求12中的樣品中是否存在VEGI多肽的輔助試劑。
14.診斷病理性血管發(fā)生的方法，包括下述步驟(ⅰ)將來自疑有病理性血管發(fā)生的人或動物的樣品與一種寡核苷酸接觸，該寡核苷酸與權(quán)利要求1的多核苷酸結(jié)合；以及(ⅱ)檢測該寡核苷酸和該多核苷酸之間形成的雙螺旋的存在與否。
15.一種診斷或預(yù)后試劑盒，包括與VEGI RNA互補(bǔ)的寡核苷酸和適用于檢測權(quán)利要求14中的樣品中是否存在VEGI多核苷酸的輔助試劑。
16.診斷病理性血管發(fā)生的方法，包括在來自疑有病理性血管發(fā)生的人或動物的樣品中檢測VEGI多核苷酸的多態(tài)性是否存在的步驟。
17.權(quán)利要求16的診斷病理性血管發(fā)生的方法，其中所述的檢測經(jīng)Southern雜交進(jìn)行。
18.權(quán)利要求16的診斷病理性血管發(fā)生的方法，其中所述的檢測經(jīng)測序VEGI多核苷酸進(jìn)行。
19.治療或改善由不受控制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，包括給予需要如此治療或改善的人或動物以藥物學(xué)可接受量的權(quán)利要求1的核酸分子。
20.權(quán)利要求19的治療或改善由不受控制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，其中所述的核酸分子包括與控制基因表達(dá)的調(diào)控序列可操縱相連的VEGI多核苷酸。
21.治療或改善由受抑制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，包括給予需要如此治療或改善的人或動物以權(quán)利要求5的血管發(fā)生的促進(jìn)劑。
22.權(quán)利要求21的治療或改善由受抑制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，其中所述的制劑是反義寡核苷酸。
23.權(quán)利要求21的治療或改善由受抑制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，其中所述的過程是創(chuàng)傷愈合。
24.權(quán)利要求21的治療或改善由受抑制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，其中所述的制劑是特異于VEGI RNA的核酶。
25.檢測或預(yù)后癌癥的方法，所述的方法包括(ⅰ)將疑有癌癥的人或動物的樣品與識別權(quán)利要求2的多肽的抗體接觸；以及(ⅱ)檢測該多肽和該抗體之間形成的復(fù)合物是否存在。
26.體外測試可能具有血管發(fā)生抑制活性的制劑或藥物的方法，所述方法包括在一體外分析中測量所述制劑或藥物增加權(quán)利要求2的多肽的抗血管發(fā)生活性的能力。
27.權(quán)利要求26的體外測試具有血管發(fā)生抑制活性的制劑或藥物的方法，其中所述的藥物或制劑是抗腫瘤藥物或制劑。
28.體外測試藥物或制劑促進(jìn)血管發(fā)生的方法，所述方法包括在一體外分析中測量所述藥物或制劑降低或消除權(quán)利要求2的多肽的功能的能力。
29.抑制血管發(fā)生的治療方法，包括給予人或動物足以抑制血管發(fā)生劑量的包括權(quán)利要求2的多肽的組合物。
30.治療或改善由不受控制的血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或過程的治療方法，包括給予需要如此治療或改善的人或動物以藥物學(xué)可接受量的權(quán)利要求2的多肽。
31.治療癌癥的方法，包括給予人或動物足以抑制癌癥劑量的包括權(quán)利要求2的核酸分子的組合物。
32.治療癌癥的方法，包括給予人或動物足以抑制癌癥劑量的包括權(quán)利要求2的多肽的組合物。
33.權(quán)利要求30的治療方法，所述的疾病或過程為下述一組的成員(a)毛細(xì)管擴(kuò)張；(b)牛皮癬硬皮病；(c)心肌血管發(fā)生；(d)斑新血管形成；(e)缺血肢血管發(fā)生；(f)潮紅；(g)新血管形成性青光眼；(h)糖尿病性視網(wǎng)膜??；(i)晶狀體后纖維組織形成；(j)糖尿病性新血管形成；(k)新血管形成性青光眼；(l)晶狀體后纖維組織形成；(m)眼色素層炎；(n)早產(chǎn)性視網(wǎng)膜??；(o)斑點(diǎn)退化；(p)角膜移植新血管形成；(q)移植物對宿主疾??；(r)炎性腸疾病；(s)骨髓抑制；和(t)再狹窄。
全文摘要
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑,VEGI,其能夠抑制細(xì)胞模型中的血管發(fā)生以及動物模型中的腫瘤發(fā)生,本發(fā)明還涉及其應(yīng)用方法。
文檔編號A61K31/711GK1285845SQ98812880
公開日2001年2月28日 申請日期1998年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月3日
發(fā)明者李魯遠(yuǎn), 翟一帆, 余國良, 倪健, 馬克·E·李普曼, 克雷格·A·羅森 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司, 喬治敦大學(xué)醫(yī)學(xué)中心