專利名稱：人胰島素衍生物的聚集體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作用持久的、人胰島素衍生物的水溶性聚集體，能形成這種聚集體的人胰島素衍生物，含有它們的藥物組合物，以及這種聚集體在治療糖尿病中的用途。
背景技術(shù)：
多尿癥是對糖尿病和尿崩癥患者中尿排泄過度病癥的總稱。糖尿病是一種代謝疾病，其中利用葡萄糖的能力或多或少地完全喪失了?？?cè)丝谥屑s有2％患有多尿癥。
自二十年代采用胰島素以來，在改善糖尿病的治療方面不斷取得進(jìn)步。為了幫助避免血糖水平過高，糖尿病患者經(jīng)常要進(jìn)行多次注射治療，由此在每餐中給藥胰島素。許多糖尿病患者采用每天多次注射胰島素的方案進(jìn)行治療，該方案包括每天注射一次或兩次持久作用胰島素，以補償基本需要，同時補充以彈丸注射迅速作用的胰島素，以補償與進(jìn)餐相關(guān)的需要。
持久作用型胰島素組合物是本領(lǐng)域中公知的。因此，一種主要類型的持久作用型胰島素組合物包含胰島素結(jié)晶或無定形胰島素的可注射含水懸液。在這些組合物中，所使用的胰島素化合物一般是精蛋白胰島素、鋅胰島素或精蛋白鋅胰島素。
當(dāng)使人或動物胰島素形成更高結(jié)合形式時，例如存在Zn2+離子時，將發(fā)生沉淀，得到結(jié)晶或無定形形式的產(chǎn)物(Brange，胰島素的蓋侖制劑，20-27頁，Springer Verlag 1987)。因此，在pH7并使用豬胰島素的6Zn2+/六聚物時，結(jié)果是幾乎完全從溶液中沉淀出來(Grant，生物化學(xué)雜志126，433-440，1972)。推測最大的可溶性聚集體由4個六聚物單位組成，相當(dāng)于分子量為約144kDa。Blundell等(糖尿病21(增刊2)，492-505，1972)描述了在pH7和Zn2+的存在下，豬胰島素的可溶性單位是六聚體。早先在pH2下的超速離心研究顯示，胰島素二聚物，Mw12kDa，是占優(yōu)勢的物質(zhì)(Jeffrey，自然197，1104-1105，1963；Jeffrey，生物化學(xué)5，489-498，1966；Jeffrey，生物化學(xué)5，3820-3824，1966)。Fredericq在pH8下使用相對胰島素為0.4-0.8％(w/w)的Zn2+進(jìn)行操作，他報道了相當(dāng)于十二聚體結(jié)構(gòu)的分子量72kDa，并且使用1％的Zn，得到約200-300kDa的分子量(生物化學(xué)與生物物理學(xué)文獻(xiàn)65，218-228，1956)。Blundell等(蛋白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展26，297-330，1972)全面回顧了動物胰島素的結(jié)合狀態(tài)。
使用胰島素懸液有某些缺點。因此，為了獲得精確的定量，在從小瓶中抽出或從藥筒中壓出確定體積的懸液之前，必須通過輕微振搖使胰島素顆粒均勻懸浮。而且，為了避免結(jié)塊或凝結(jié)，胰島素懸液在儲存時，溫度必須保持在比胰島素溶液更窄的范圍內(nèi)。
盡管早先人們認(rèn)為精蛋白無免疫原性，但現(xiàn)今的研究結(jié)果表明，精蛋白在人體中可能是有免疫原性的，它們用于醫(yī)療目的時，可能會導(dǎo)致抗體形成(Samuel等，利用微補體固定試驗進(jìn)行的有關(guān)精蛋白在人體和實驗動物體內(nèi)的免疫原性研究。臨床與實驗免疫學(xué)33，252-260頁(1978))。
另外，還有證據(jù)表明，精蛋白-胰島素復(fù)合物自身是免疫原性的(Kurtz等，用精蛋白-胰島素治療的患者體內(nèi)針對精蛋白的循環(huán)IgG抗體。糖尿病學(xué)25，322-324頁(1983))。因此，對于某些患者來說，必須避免使用含有精蛋白的持久作用型胰島素組合物。
另一種類型的持久作用型胰島素組合物是pH值低于生理pH值的溶液，由于溶液注射時pH值升高，胰島素將從中沉淀出來。其缺點是，胰島素固體顆粒充當(dāng)了局部刺激物，從而在注射部位引起組織炎癥。
WO91/12817(Novo NordiskA/S)公開了包含鈷(Ⅲ)胰島素絡(luò)合物的可溶性持久作用型胰島素組合物。這些絡(luò)合物的持久作用僅是中等水平，且生物可利用率降低了。
在例如WO95/07931(Novo NordiskA/S)、WO96/00107(NovoNordiskA/S)和WO97/31022(Novo NordiskA/S)中公開了含有與B26-B30任何位置上的賴氨酸殘基中的ε-氨基連接的親脂取代基的可溶性胰島素衍生物。與可溶性人胰島素相比，這些衍生物經(jīng)皮下注射后具有持久作用，并且這種持久作用已由與皮下組織、血液和外周組織中白蛋白的可逆結(jié)合得到解釋(Markussen，糖尿病學(xué)39，281-288，1996；Kurzhals，生物化學(xué)雜志312，725-731，1995；Kurzhals，藥物科學(xué)雜志85，304-308，1996；和Whittingham，生物化學(xué)36，2826-2831，1997)。
然而，現(xiàn)在我們已發(fā)現(xiàn)了使某些可溶性胰島素衍生物作用延長的一種新機理。該新機理是基于部分或完全形成可溶性聚集體形式的衍生物，所述聚集體形式的特征是在確定的凝膠過濾系統(tǒng)中，其尺寸大于醛縮酶(Mw=158KDa)。
附圖的簡要描述

圖1．在使用SephacrylS-300HR柱的凝膠過濾系統(tǒng)中，KAV值相對于分子量的校正曲線，其中用包含125mM氯化鈉和pH7.4的20mM磷酸鈉的中性含水洗脫劑洗脫。很顯然，KAV與分子量的對數(shù)之間存在近似線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)顯示在表1中。
圖2．分別具有0、2和3 Zn2+/六聚物的LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰島素的凝膠過濾，其中使用SephacrylS-300HR柱，用包含125mM氯化鈉和pH7.4的20mM磷酸鈉的中性含水洗脫劑洗脫，結(jié)果證明了Zn2+對衍生物聚集體形成的重要性。28×1cm柱以15ml/h的速率洗脫。胰島素衍生物作為包含600μM衍生物，0、2或3Zn2+/6個胰島素分子、20mM NaCl、16mM苯酚、16mM間甲苯酚、pH7.5的7mM磷酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)制劑注射(200l)。
圖3．具有3 Zn2+/六聚物的LysB29(Nεω-羧基十七烷?；?des(B30)人胰島素的凝膠過濾，其中使用SephacrylS-300HR柱，用包含pH7.5的5mM磷酸鈉緩沖液、10mM氯化鈉、16mM苯酚、16mM間甲苯酚和1.6％(w/w)甘油的中性含水洗脫劑洗脫。與圖2的對比說明了氯化鈉的濃度對衍生物聚集體形成的重要性。
圖4．綴合配體的合成方案。
對本發(fā)明的描述本文中使用的詞語“胰島素衍生物”(以及相關(guān)詞語)是指其中至少有一個有機取代基連接到一個或多個氨基酸上的人胰島素或其類似物。
本文中使用的“人胰島素類似物”(以及相關(guān)詞語)的意思是指其中一個或多個氨基酸已被刪除和/或被其他氨基酸(包括非可編碼(non-codeable)氨基酸)替換的人胰島素，或包含附加氨基酸，即51個氨基酸以上的人胰島素。
本發(fā)明是基于一種新的聚集和可溶形式的胰島素衍生物的發(fā)現(xiàn)。該新的、可溶性聚集形式的胰島素衍生物經(jīng)皮下注射后緩慢離解，這使得它們適合用于長時間作用的胰島素制劑，優(yōu)點是該制劑不含沉淀。作為可溶制劑而不是懸浮制劑的優(yōu)點在于可以更精確地給藥；可避免振搖小瓶或筆狀管；允許使用更細(xì)的針頭，也就意味著注射過程中疼痛更?。桓菀坠嘧⑿∑炕蛩幫?；以及可避免在藥筒中裝入小球以便在沒有空氣時懸浮沉淀。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種胰島素衍生物的水溶性聚集體，其特征在于它具有比醛縮酶更大的尺寸，優(yōu)選大于鐵蛋白，該尺寸是用本文中規(guī)定的凝膠過濾系統(tǒng)測定的。
本發(fā)明的聚集體優(yōu)選具有利用SephacrylS-300HR凝膠通過凝膠過濾法測得相當(dāng)于KAV值小于0.32、優(yōu)選小于0.20的表觀容積，或者具有利用Superose6HR凝膠通過凝膠過濾法測得相當(dāng)于KAV值小于0.50、優(yōu)選小于0.40的表觀容積。
該聚集體優(yōu)選在pH6.8-8.5范圍內(nèi)是可溶的。
在已知大多數(shù)胰島素存在六聚物單位的條件下，可以觀察到胰島素衍生物的新的聚集體形式。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，該聚集體形式由六聚物亞單位組成，優(yōu)選有至少4個、更優(yōu)選5-50個、更優(yōu)選5-200個六聚物亞單位。本發(fā)明聚集體形式的任何六聚物亞單位可以具有任何已知的R6、R3T3或T6結(jié)構(gòu)(Kaarsholm，生物化學(xué)28，4427-4435，1989)。
我們還發(fā)現(xiàn)，象Zn2+和酚類化合物這樣的已知能使六聚物單位穩(wěn)定的物質(zhì)也可使一些胰島素衍生物的新的聚集體形式穩(wěn)定。形成聚集體的構(gòu)件可以是從胰島素的X射線結(jié)晶測定結(jié)構(gòu)得知的六聚物單位(Blundell，糖尿病2l(增刊2)，492-505，1972)。象Zn2+這樣的已知能以2或4 Zn2+/六聚物絡(luò)合物(Blundell，糖尿病21(增刊2)，492-505，1972)的形式穩(wěn)定六聚物單位的離子是有些衍生物聚集體形成所必需的，比如LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰島素。圖2顯示了LysB29(Nεω-羧基十七烷?；?des(B30)人胰島素的分別含有0、2和3 Zn2+/六聚物的制劑在本文所述的系統(tǒng)中的凝膠過濾。不存在Zn2+時，沒有形成聚集體，洗脫位置指示存在單體和二聚物。因此，本發(fā)明的聚集體中優(yōu)選每6個胰島素衍生物分子包含至少2個鋅離子，更優(yōu)選包含2-5個鋅離子，更優(yōu)選包含2-3個鋅離子。另外，該聚集體中每6個胰島素衍生物分子包含至少3個酚類化合物分子比較有利。在2 Zn2+/六聚物結(jié)構(gòu)的中心腔中，6個GluB13殘基提供了與多達(dá)3個Ca2+離子結(jié)合的結(jié)合部位(Sudmeier等，科學(xué)212，560-562，1981)。因此，加入Ca2+離子穩(wěn)定了該六聚物并可加入到藥物制劑中，條件是胰島素衍生物保持在溶液中。
本發(fā)明的聚集體皮下注射到人體中后的消失半衰期(disappearhalf-time)優(yōu)選與人胰島素NPH制劑的一樣長或比它更長。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，聚集體由具有結(jié)合白蛋白的胰島素衍生物組成，其結(jié)合白蛋白數(shù)比LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)人胰島素的低。
本發(fā)明中將采用的優(yōu)選的胰島素衍生物一級結(jié)構(gòu)是a)胰島素衍生物B鏈上的殘基B24-B30為序列Phe-X-X-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何可編碼的氨基酸或缺失；b)胰島素衍生物B鏈上的殘基B25-B30為序列Phe-X-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何可編碼的氨基酸或缺失；c)胰島素衍生物B鏈上的殘基B26-B30為序列Tyr-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何可編碼的氨基酸或缺失；d)胰島素衍生物B鏈上的殘基B27-B30為序列Thr-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何可編碼的氨基酸或缺失；e)胰島素衍生物B鏈上的殘基B28-B30為序列Pro-X-X，其中每個X獨立地代表任何可編碼的氨基酸或缺失；或者f)胰島素衍生物B鏈上的殘基B29-B30為序列Lys-X，其中X代表任何可編碼的氨基酸或缺失；條件是通過例如游離脂肪細(xì)胞測定或通過對胰島素受體的親和評定，該胰島素衍生物顯示出至少5％的效能。
本發(fā)明聚集體的胰島素衍生物的賴氨酸殘基上的取代基優(yōu)選為含有6-40個碳原子的親脂基。更優(yōu)選是具有6-40個碳原子、優(yōu)選具有12-36個碳原子的?；〈?br> 最優(yōu)選的?；问降挠H脂取代基如下CH3-(CH2)n-CO-，(COOH)-(CH2)n-CO-，(NH2-CO)-(CH2)n-CO-，HO-(CH2)n-CO-，其中4≤n≤38。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，親脂取代基是5-α石膽酸或5-β石膽酸。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，親脂取代基是膽酸、豬膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、豬脫氧膽酸或膽烷酸的5-α或5-B異構(gòu)體。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，親脂取代基是梭鏈孢酸、梭鏈孢酸衍生物或甘草亭酸。
在又一個優(yōu)選的實施方案中，親脂取代基利用氨基酸接頭與賴氨酸殘基相連。根據(jù)該實施方案，親脂取代基有利地經(jīng)γ-或α-谷氨?；宇^、或經(jīng)β-或α-天冬氨?；宇^、或經(jīng)α-酰氨基-γ-谷氨酰基接頭、或經(jīng)α-酰氨基-β-天冬氨?；宇^與賴氨酸殘基相連。
本發(fā)明還提供了能形成聚集體的新型胰島素衍生物。這些胰島素衍生物可以以聚集體的形式加入藥物制劑中，另一方面，它們也可以以非聚集體形式加入藥物制劑中，在這種情形中，經(jīng)皮下注射所述制劑后形成聚集體。
因此，本發(fā)明還涉及包含胰島素衍生物聚集體或經(jīng)皮下注射后形成聚集體的非聚集型胰島素衍生物的藥物制劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物制劑包含聚集體，其主要部分(優(yōu)選75％以上)具有比醛縮酶更大的尺寸，該尺寸是利用該制劑的介質(zhì)作為洗脫劑通過凝膠過濾確定的。
在另一個實施方案中，提供了包含能聚集和能迅速作用的胰島素類似物的藥物制劑，所述迅速作用的胰島素類似物優(yōu)選是人胰島素或下列胰島素類似物之一AspB28人胰島素，LysB28ProB29人胰島素或des(B30)人胰島素。這樣的制劑將提供迅速開始的作用以及長時間的作用。
在該實施方案中，藥物制劑優(yōu)選包含摩爾比為90∶10-10∶90的聚集型胰島素和迅速作用型胰島素。
通過加入能提高藥物制劑粘度的生理學(xué)上可接受的試劑，可以進(jìn)一步減慢聚集型胰島素在體內(nèi)的緩慢離解。因此，本發(fā)明的藥物制劑還可包含能提高粘度的試劑，優(yōu)選聚乙二醇、聚丙二醇、其共聚物、葡聚糖和/或聚交酯。
藥物制劑優(yōu)選進(jìn)一步包含緩沖物質(zhì)，諸如TRIS、磷酸鹽、甘氨酸或雙甘氨肽(或其它兩性離子物質(zhì))緩沖液；等滲劑，諸如NaCl、甘油、甘露糖醇和/或乳糖；和作為防腐劑的苯酚和/或間甲苯酚。在藥物制劑的輔助物質(zhì)中，用作等滲劑的氯化鈉和用于防腐的苯酚是特別重要的，因為它們能促進(jìn)制劑的聚集，并由此有效地延長從注射部位消失的時間。本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選包含濃度為10-150mM的Na+離子。
最優(yōu)選的藥物制劑是含有0.1-2mM的本發(fā)明胰島素衍生物、0.3-0.9％Zn(w/w相對于胰島素衍生物)、總濃度為5-50mM的酚化合物如苯酚或間甲苯酚或其混合物、以及濃度為10-150mM Na+離子的制劑。
本發(fā)明還涉及治療糖尿病的方法，該方法包含給予需要這種治療的患者有效量的本發(fā)明胰島素衍生物的水溶性聚集體，或有效量的能在皮下注射后形成水溶性聚集體的本發(fā)明胰島素衍生物。
本發(fā)明的胰島素衍生物可以用WO95/07931(Novo Nordisk A/S)，WO96/00107(Novo Nordisk A/S)，WO97/31022(Novo Nordisk A/S)，PCT申請No.DK97/00296(Novo Nordisk A/S)，EP 511 600(Kurakay有限公司)和EP712 862(Eli lilly)中公開的通用方法制備。表2中所列的衍生物已用下述方法制得將des(B30)人胰島素的LysB29的ε-氨基用活化為相應(yīng)N-羥基琥珀酰亞胺酯形式的配體選擇性?；?。該綴合配體可以利用常規(guī)肽化學(xué)法制備(圖4)。
在上述專利申請以及Markussen，糖尿病學(xué)39，281-288，1996；Kurzhals，生物化學(xué)雜志312，725-731，1995；Kurzhals，藥物科學(xué)雜志85，304-308，1996；和Whittingham，生物化學(xué)36，2826-2831，1997中列出的一些因白蛋白結(jié)合機理而具有持久作用的衍生物，確實也具有按照本發(fā)明形成高分子量可溶性聚集體的能力。WO95/07931的LysB29(Nε石膽酰-γ-Glu-)des(B30)人胰島素，和WO97/31022的LysB29(Nεω-羧基十七烷?；?)des(B30)人胰島素，是能在中性pH下形成高分子量可溶性聚集體的胰島素衍生物的例子。關(guān)于它們誘導(dǎo)聚集體形成的能力，在親脂取代基之間有選擇性。因此，兩個異構(gòu)體-LysB29(Nε石膽酰-γ-Glu-)des(B30)人胰島素和LysB29(Nε石膽酰-α-Glu-)des(B30)人胰島素中，只有第一種在所用制劑中形成聚集體，參見表1。
聚集體形成的測定使用對球狀蛋白具有1500kDa排阻極限、對線性葡聚糖具有400kDa排阻極限的凝膠，通過凝膠過濾法證明聚集形式。在該凝膠過濾中使用pH中性含水緩沖液系統(tǒng)，將聚集態(tài)的胰島素衍生物以藥物制劑的形式、600nmol胰島素/ml的濃度加到柱上。胰島素衍生物的聚集態(tài)在分子量為158kDa的醛縮酶之前洗脫。
用此部分中描述的條件進(jìn)行的凝膠過濾實驗是直接的物理化學(xué)方法，用來顯示胰島素衍生物的潛在聚集體形成性能。除了各種生物學(xué)因素外，在豬體內(nèi)皮下注射后的消失還反映了白蛋白結(jié)合和胰島素衍生物的聚合體形成性能的聯(lián)合作用。
使用SephacrylS-300HR柱，通過凝膠過濾，證明高分子量可溶性聚集體的形成，其中用包含125mM氯化鈉和pH7.4的20mM磷酸鈉的中性含水洗脫劑洗脫。選擇該緩沖液系統(tǒng)來模仿組織的離子強度和pH，為的是能夠在與皮下注射后類似的條件下檢測聚集的衍生物。顯然，在具有更低濃度的氯化鈉或者更低或更高pH值的其它緩沖液系統(tǒng)中，衍生物可能不以聚集態(tài)出現(xiàn)。但是，當(dāng)欲評定藥物制劑中的實際聚集狀態(tài)時，用該制劑的介質(zhì)(除了與胰島素結(jié)合的Zn2+)作為凝膠過濾的洗脫劑。
28×1cm柱以15ml/h的速率洗脫。胰島素衍生物作為包含600μM衍生物、200或300μM Zn2+、20mM NaCl(或不同的)、16mM苯酚、16mM間甲苯酚、pH7.5的7mM磷酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)制劑注射(200μl)。
SephacrylS-300HR的排阻極限由制造商Pharmacia作了說明，對球狀蛋白，為1500kDa分子量，對線性葡聚糖，為400kDa。在實踐中，不同大小溶質(zhì)的洗脫的特點在于有效容積，表達(dá)為KAV值KAV=(VE-VO)/(VT-VO)其中VE是洗脫容積，VO是空隙容積，例如藍(lán)葡聚糖的洗脫容積，VT是總?cè)莘e。因此，KAV值與柱尺寸無關(guān)。在該系統(tǒng)中，醛縮酶(Mw158kDa)在KAV約0.32處洗脫，白蛋白(Mw67kDa)在KAV約0.38處洗脫，胰島素單體形式(Mw6kDa)的KAV值為約0.71。使用一系列分子量標(biāo)準(zhǔn)物對柱進(jìn)行校正，結(jié)果顯示KAV與分子量的對數(shù)之間有近似線性關(guān)系，參見圖1。表1．大于醛縮酶(Mw158kDa)的結(jié)合性胰島素衍生物，小于醛縮酶的非結(jié)合性胰島素衍生物和用作分子大小標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物的KAV值、白蛋白結(jié)合常數(shù)和消失半衰期。在豬體內(nèi)的白蛋白結(jié)合常數(shù)和消失半衰期已利用LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)人胰島素作為參照化合物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。NPH胰島素在豬體內(nèi)的消失T50％已測量為10.5小時(Markussen等，1996年)?；衔?KAV白蛋白結(jié)合 消失Kass，(mol/l)-1T50％，小時形成大于醛縮酶的聚集體的人胰島素結(jié)合衍生物**LysB29(Nε-石膽酰基-y-Glu)des(B30)0.04* 0.3×10522.8LysB29(Nεω-羧基十七烷?；?des(B30) 0.0525×10518.7LysB29(Nεω-羧基十九烷酰基)des(B30) 0.0436×10521.9LysB29(Nε膽甾烯基氧基羰基) 0.00形成小于醛縮酶的聚集體的人胰島素非結(jié)合性衍生物**人胰島素***0.61 0 (2)人胰島素(無鋅) 0.72LysB29(Nε石膽?；?(無鋅) 0.74LysB29(Nε癸?；?*** 0.670.06×1055.1LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30) 0.511.0×10514.3LysB29(Nε石膽?；?α-Glu-)des(B30) 0.530.3×10511.8標(biāo)準(zhǔn)物****B9Asp，B27Glu人胰島素(單體，Mw 6kDa) 0.71 0 (1)核糖核酸酶(Mw13.7kDa) 0.63白蛋白(Mw67kDa)0.38醛縮酶(Mw158kDa) 0.32過氧化氫酶(Mw232kDa) 0.30鐵蛋白(Mw440kDa) 0.19甲狀腺球蛋白(Mw669kDa) 0.08*75％衍生物洗脫在主峰中，25％洗脫在單體或二聚物位置處。**作為包含600μM衍生物、200μM Zn2+、0-20mM氯化鈉、7mM磷酸鈉、16mM苯酚、16mM間甲苯酚、1.6％甘油和pH7.5的藥物制劑以200μl樣品上樣。***與**相同，但Zn2+為300μM。****標(biāo)準(zhǔn)物溶解于水中使用。
能形成可溶性高分子量聚集體并主要基于該性能而具有持久作用的胰島素衍生物的實例是LysB29(Nε石膽?；?γ-Glu)des(B30)人胰島素，參見表1。值得一提的是，這類化合物的消失半衰期與白蛋白結(jié)合常數(shù)之間的比值高。不能形成可溶性高分子量聚集體但基于白蛋白結(jié)合性能而具有持久作用的胰島素衍生物的實例是LysB29(Nε石膽?；?α-Glu-)des(B30)人胰島素和LysB29(Nε十四烷?；?des(B30)人胰島素，參見表1。值得一提的是，這類化合物的消失半衰期/白蛋白結(jié)合常數(shù)比值低。
在WO97/31022中，已將LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰島素配制成包含600nmol/ml衍生物、pH7.5的5mM磷酸鈉緩沖液、10mM氯化鈉、16mM苯酚、16mM間甲苯酚、2-3 Zn2+/六聚物和1.6％(w/v)甘油的藥物制劑。為了確定該制劑中的聚集程度，利用與上文中所述相同的柱進(jìn)行凝膠過濾，但是使用該制劑的介質(zhì)作為洗脫劑。Zn2+大部分是胰島素結(jié)合型，因此不被認(rèn)為是介質(zhì)的組分。由于洗脫劑含有酚類物質(zhì)，因此用HPLC監(jiān)測各級分中衍生物的濃度，參見圖3。KAV值約為0.45，指示六聚物或十二聚物單位是該制劑中的主要種類，即，在該公開的制劑中不存在胰島素衍生物的高分子量聚集體。
現(xiàn)已開發(fā)了另一種能測量胰島素衍生物形成可溶性高分子量聚集體能力的、適于HPLC設(shè)備的方法。柱的大小、注入容積和流速與第一種方法相當(dāng)，然而溫度升高至37℃，且磷酸鹽緩沖液變?yōu)槿u甲基氨基甲烷鹽酸鹽和另外的氯化鈉。象在第一種方法中一樣，聚集態(tài)胰島素定義為在凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)物醛縮酶之前洗脫。
表2中顯示了兩種鋅濃度的KAV值。與參照物L(fēng)ysB29(Nε十四烷?；?)des(B30)胰島素相比，從皮下注射部位消失的時間長與該胰島素衍生物易形成大聚集體的趨勢有關(guān)。
表2．用凝膠過濾法2測量的胰島素衍生物的聚集體形成。
1)對LysB29(Nε十四烷酰基-)des(B30)人胰島素標(biāo)準(zhǔn)化(T50％=14.3h)2)Superose 6HR10/30(Pharmacia Biotech)在37℃下用氯化鈉140mM、三羥甲基氨基甲烷10mM、疊氮化鈉0.02％(用鹽酸調(diào)至pH7.4)洗脫。跑90分鐘(0.25ml/min.)后，洗滌150分鐘(0.5ml/min.)。注入容積為200μl。
權(quán)利要求
1.一種胰島素衍生物的水溶性聚集體，其特征在于用上述指定的凝膠過濾系統(tǒng)測定，它具有比醛縮酶更大的尺寸。
2.權(quán)利要求1所述的聚集體，其特征在于用上述指定的凝膠過濾系統(tǒng)測定，它具有比鐵蛋白更大的尺寸。
3.如權(quán)利要求1所述的聚集體，其特征在于用SephacrylS-300HR凝膠經(jīng)凝膠過濾測定，它具有相當(dāng)于KAV值小于0.32、優(yōu)選小于0.20的表觀容積。
4.如權(quán)利要求1所述的聚集體，其特征在于用Superose6HR凝膠經(jīng)凝膠過濾測定，它具有相當(dāng)于KAV值小于0.50、優(yōu)選小于0.40的表觀容積。
5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的聚集體，其特征在于它在pH6.8-8.5范圍內(nèi)是可溶的。
6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的聚集體，它基本上由胰島素衍生物的六聚亞單位組成。
7.如權(quán)利要求6所述的聚集體，它由至少4個、優(yōu)選5-50個、更優(yōu)選5-200個聚集的六聚亞單位組成。
8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的聚集體，其中每6個胰島素衍生物分子包含至少2個鋅離子，優(yōu)選包含2-5個鋅離子，更優(yōu)選包含2-3個鋅離子。
9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的聚集體，其中每6個胰島素衍生物分子包含至少3個酚類化合物分子。
10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的聚集體，它在皮下注射到人體中后的消失半衰期與人胰島素NPH制劑的一樣長或更長。
11.如權(quán)利要求1-10任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物具有比LysB29(Nε-十四烷?；?des(B30)人胰島素更低的白蛋白結(jié)合性。
12.如權(quán)利要求1-11任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B24-B30為序列Phe-X-X-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何氨基酸或缺失，至少一個X是Nε-取代的賴氨酸殘基。
13.如權(quán)利要求1-12任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B25-B30為序列Phe-X-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何氨基酸或缺失，至少一個X是Nε-取代的賴氨酸殘基。
14.如權(quán)利要求1-13任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B26-B30為序列Tyr-X-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何氨基酸或缺失，至少一個X是Nε-取代的賴氨酸殘基。
15.如權(quán)利要求1-14任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B27-B30為序列Thr-X-X-X，其中每個X獨立地代表任何氨基酸或缺失，至少一個X是Nε-取代的賴氨酸殘基。
16.如權(quán)利要求1-15任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B28-B30為序列Pro-X-X，其中每個X獨立地代表任何氨基酸或缺失，至少一個X是Nε-取代的賴氨酸殘基。
17.如權(quán)利要求1-16任一項所述的聚集體，其中胰島素衍生物B鏈上的殘基B29-B30為序列Lys-X，其中X代表任何氨基酸或缺失。
18.如權(quán)利要求12-17任一項所述的聚集體，其中賴氨酸殘基上的取代基是含有6-40個碳原子的親脂基。
19.如權(quán)利要求18所述的聚集體，其中取代基是具有6-40個碳原子、優(yōu)選具有12-36個碳原子的?；?。
20.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中?；荂H3-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
21.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中?；?COOH)-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
22.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中?；?NH2-CO)-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
23.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中酰基是HO-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
24.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中親脂取代基是5-α石膽酸或5-β石膽酸。
25.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中親脂取代基是膽酸、豬膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、豬脫氧膽酸或膽烷酸的5-α或5-β異構(gòu)體。
26.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中親脂取代基是脫氫石膽酸的5-α或5-β異構(gòu)體。
27.如權(quán)利要求19所述的聚集體，其中親脂取代基是梭鏈孢酸、梭鏈孢酸衍生物或甘草亭酸。
28.如權(quán)利要求19-27所述的聚集體，其中?；冒被峤宇^與賴氨酸殘基相連。
29.如權(quán)利要求28所述的聚集體，其中氨基酸接頭是α-谷氨酰基或γ-谷氨?；Y(jié)合的或者β-或α-天冬氨?；Y(jié)合的。
30.如權(quán)利要求28所述的聚集體，其中氨基酸接頭是γ-氨基丁酰基、β-丙氨?；?、α-酰氨基-γ-谷氨酰基、或α-酰氨基-β-天冬氨酰基結(jié)合的。
31.一種新的能形成上述權(quán)利要求任一項所述聚集體的胰島素衍生物。
32.一種藥物制劑，它包含如權(quán)利要求1-30任一項所述的胰島素衍生物的聚集體。
33.如權(quán)利要求32所述的藥物制劑，它包含權(quán)利要求1-30任一項所述的聚集體，其主要部分，優(yōu)選75％以上，具有比醛縮酶更大的尺寸，該尺寸是利用該制劑的介質(zhì)作為洗脫劑通過凝膠過濾確定的。
34.一種包含聚集型胰島素衍生物和迅速作用型胰島素類似物的藥物制劑，其中后者優(yōu)選是人胰島素或AspB28人胰島素、LysB28ProB29人胰島素或des(B30)人胰島素。
35.如權(quán)利要求34所述的藥物制劑，其中聚集型胰島素與迅速作用型胰島素的摩爾比為90∶10-10∶90。
36.如權(quán)利要求32-35任一項所述的藥物制劑，它包含能提高粘度的試劑，優(yōu)選聚乙二醇、聚丙二醇、其共聚物、葡聚糖和/或聚交酯。
37.如權(quán)利要求32-36任一項所述的藥物制劑，它包含一種緩沖物質(zhì)，優(yōu)選TRIS、磷酸鹽或甘氨酸緩沖液。
38.如權(quán)利要求32-37任一項所述的藥物制劑，它包含一種兩性離子緩沖物質(zhì)，優(yōu)選雙甘氨肽。
39.如權(quán)利要求32-38任一項所述的藥物制劑，它包含等滲劑，優(yōu)選NaCl、甘油、甘露糖醇和/或乳糖。
40.如權(quán)利要求32-39任一項所述的藥物制劑，它包含濃度為10-150mM的Na+離子。
41.如權(quán)利要求32-40任一項所述的藥物制劑，它包含作為防腐劑的苯酚和/或間甲苯酚。
42.一種藥物制劑，它含有0.1-2mM權(quán)利要求31所述的胰島素衍生物、0.3-0.9％Zn(w/w，相對于胰島素衍生物)、總濃度為5-50mM的酚類化合物如苯酚或間甲苯酚或其混合物、以及濃度為10-150mM的Na+離子。
43.一種治療糖尿病的方法，包括給予需要這種治療的人有效量的如權(quán)利要求1-30任一項所述的胰島素衍生物的水溶性聚集體。
44.一種治療糖尿病的方法，包括給予需要這種治療的人有效量的、能在皮下注射后形成水溶性聚集體的權(quán)利要求31所述胰島素衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有持久作用曲線的人胰島素衍生物的水溶性聚集體。可溶性胰島素衍生物作用的延長與一種新機理有關(guān)。該機理是基于部分或完全形成可溶性聚集體形式的衍生物,該聚集體形式的特征是在所定義的凝膠過濾系統(tǒng)中,其尺寸大于醛縮酶(Mw=158KDa)。
文檔編號A61KGK1281466SQ9881044
公開日2001年1月24日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月24日
發(fā)明者S·黑弗倫德, P·巴爾施密特, I·喬納森, T·霍格-詹森 申請人:諾沃挪第克公司