專利名稱：α-硫辛酸及其衍生物修飾的胰島素及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-硫辛酸或其衍生物對胰島素進(jìn)行化學(xué)修飾而制備得到的可以用于治療糖尿病的口服藥物-胰島素類似物及其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的多發(fā)性代謝疾病，國內(nèi)外發(fā)病率均呈上升趨勢。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國現(xiàn)有糖尿病患者3000萬人以上，糖尿病的發(fā)病率己高達(dá)3.2％。糖尿病是引起人類死亡占第三位的主要原因。胰島素是治療糖尿病的特效性多肽激素化合物，迄今為止尚無更有效的替代藥物。但是，由于胰島素是一種蛋白質(zhì)，易被胃腸道蛋白水解酶降解而失活，因此只能注射，不能口服。胰島素依賴型糖尿病人必須每日使用胰島素以降低血糖，維持生命的正常代謝。頻繁注射用藥，給需終身用藥的病人帶來極大的痛苦和不便。因此研究開發(fā)安全、方便而有效的胰島素非注射給藥途徑已經(jīng)成為世界各國醫(yī)藥界廣泛關(guān)注的重要課題。
口服胰島素一直是醫(yī)生和糖尿病患者夢寐以求的藥物，但迄今尚未取得突破性進(jìn)展。為了解決給藥途徑，延緩胰島素在體內(nèi)的降解或排泄，近年來國內(nèi)外對胰島素新劑型開展了廣泛研究，有經(jīng)口服、鼻腔、舌下、眼部、直腸、透皮吸收等多種途徑給藥，其中口服給藥是最受病人歡迎的途徑，成為目前倍受親睞的研究熱點，但國際上至今尚無較好的口服制劑。
化學(xué)修飾是口服胰島素的重要研究課題之一?，F(xiàn)有技術(shù)通過對胰島素進(jìn)行化學(xué)修飾，增強胰島素抵抗蛋白水解酶的破壞作用，進(jìn)而研制出適于口服的胰島素。Kuraray Co.，Ltd.的專利EP 0 511600 A2合成了[protein][Z]n的衍生物，其中[protein]為多肽蛋白質(zhì)包括胰島素，[Z]為-CO-W-COOH，式中W為長鏈的可含雜原子的碳水基團。N.Ekwuribe等人(專利PCT Int.Appl.WO 0078302)將一種低聚物共價連接到重組人胰島素上得到胰島素類似物M2，其口服降糖作用起效快，降糖效果與皮下注射相當(dāng)，劑量為皮下注射的2倍，美國Protein Delivery公司正進(jìn)行臨床試驗。Novo Nordisk A/S申請的專利WO 95/07931以及EliLilly公司的兩個專利EP 0 712861 A2及EP 0 712862 A2也分別介紹了化學(xué)修飾胰島素的合成方法。但有關(guān)給藥安全性及患者進(jìn)餐前后對用藥的影響等仍在研究之中，迄今尚無臨床試驗成功的報道。本研究組曾申請了發(fā)明專利“治療糖尿病的口服藥脂肪二酰氨基酸胰島素及其合成方法”(專利申請?zhí)?11284998.6)，此項發(fā)明采用的修飾劑為脂肪族二元羧酸的單氨基酸衍生物，得到的修飾胰島素可提高其抗酶解能力，但該修飾劑的活化中間體合成產(chǎn)率較低。本發(fā)明采用的修飾劑α-硫辛酸(Lipoic Acid，簡記為α-LA)是脂溶性維生素，存在于動物體內(nèi)，是微生物和原生動物生長發(fā)育所必需的物質(zhì)，無毒、無害、無刺激性，用其修飾胰島素具有良好的生物安全性，能夠提高胰島素的抗酶解能力，增強藥物的透膜吸收。本發(fā)明修飾胰島素所采用的基團與上述提及的專利所采用的都不同。本發(fā)明的化學(xué)修飾胰島素目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在采用化學(xué)修飾的方法將α-硫辛酸(α-LA)或其衍生物共價結(jié)合到胰島素的特定部位，得到胰島素類似物，保護(hù)胰島素易被胰蛋白酶進(jìn)攻的位點，使胰島素能夠抵抗胰蛋白酶的降解作用。
所選修飾劑α-LA存在于動植物體內(nèi)，是丙酮酸脫氫酶的輔助因子，屬代謝性抗氧劑，在生物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為還原型的二氫硫辛酸(DHLA)。近年來，α-LA和DHLA在抗氧化、糖代謝、糖尿病并發(fā)癥和其它多種疾病治療方面的重要作用受到國際生物醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。α-LA口服易被機體組織和細(xì)胞吸收，并能透過血腦屏障發(fā)揮多功能的抗氧化作用，被稱為“萬能生物抗氧劑”，是已知天然抗氧劑中效果最強的一種。α-LA可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基和活性氧；可以再生細(xì)胞中其它的抗氧化劑如VitE、VitC、GSH、硫氧還蛋白及泛醌等；近年來還發(fā)現(xiàn)α-LA對糖尿病及糖尿病慢性并發(fā)癥有一定的治療作用。硫辛酸不僅參與葡萄糖的代謝過程，而且直接介導(dǎo)胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖在外周組織中的分布。動植物組織中α-LA通常與蛋白質(zhì)分子中賴氨酸殘基的ε-氨基共價結(jié)合，以酰胺鍵的形式存在，因此，將α-LA共價結(jié)合到胰島素的側(cè)鏈氨基上與α-LA天然存在方式是一致的。利用這種具有特殊功能的含硫羧酸作為化學(xué)修飾基團不僅可以保護(hù)胰島素易受蛋白水解酶進(jìn)攻的位點，增加胰島素的脂溶性，促進(jìn)胰島素的吸收，增強葡萄糖代謝，而且還可減輕糖尿病所致的各種慢性并發(fā)癥。
該胰島素類似物的化學(xué)式為LA-Ins或LA-NHCHRCO-Ins。
式中LA為α-硫辛酸酰基，其結(jié)構(gòu)如下 R為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的側(cè)鏈；Ins為胰島素。
LA-Ins的合成路線如下 具體合成步驟是①將α-硫辛酸(α-LA)溶于乙醚中，加入與α-LA等摩爾的苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加等摩爾的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的乙醚溶液；滴加完畢后，0℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3h，然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3h；停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物，得澄清透明濾液，將濾液冷卻結(jié)晶，過濾，得針狀晶體，真空干燥至恒重，即得硫辛酰苯并三唑(I)，產(chǎn)率約75％。
②胰島素的?；磻?yīng)在水和N-甲基-吡咯烷酮的混合溶劑中進(jìn)行，在0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，水的體積百分含量為25％～75％，再加入摩爾數(shù)約為胰島素用量30～50倍的TEA。
③將摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍的(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將(I)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時；④向步驟③的反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷凍離心，去掉上清。沉淀經(jīng)冷凍干燥至恒重，得到硫辛酸?；葝u素(II)(LA-Ins)。
LA-NHCHRCO-Ins的合成路線為 具體合成步驟是①將α-硫辛酸(α-LA)溶于乙醚中，40～50℃回流，同時向其中滴加三氯化磷，三氯化磷與α-LA的摩爾比約為1/2～2/3。滴加完畢，繼續(xù)在50～60℃回流反應(yīng)4～5h。停止反應(yīng)后，減壓蒸出乙醚，即得α-硫辛酰氯。
②將前述氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸)之一溶于水中，再加入相當(dāng)于該水溶液3～5倍體積的四氫呋喃(THF)，然后加入與氨基酸等摩爾的三乙胺(TEA)。在0～10℃下，邊攪拌邊緩慢滴加α-硫辛酰氯的THF溶液，α-硫辛酰氯的摩爾數(shù)約為氨基酸的1.02～1.05倍。加畢，攪拌反應(yīng)2～3h，然后調(diào)溫至20～30℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3h。停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入等體積的石油醚，分除水層。有機層冷卻結(jié)晶，過濾得硫辛酰氨基酸(III)，用丙酮重結(jié)晶，產(chǎn)率20～40％。
③將(III)溶于THF中，加入與(III)等摩爾的苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加與(III)等摩爾的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的THF溶液。滴加完畢后，冰浴下攪拌反應(yīng)2～3h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮后，冷卻結(jié)晶。過濾，得粉狀物，真空干燥至恒重，即得硫辛酰氨基酸苯并三唑(IV)，按(III)的用量計，產(chǎn)率約30～60％。
④胰島素的?；磻?yīng)在水和N-甲基-吡咯烷酮的混合溶劑中進(jìn)行。在0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，水的體積百分含量為25％～75％，再加入摩爾數(shù)約為胰島素用量30～50倍的TEA。
⑤將摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍的(IV)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將(IV)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～4小時；⑥向上述反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷凍離心，去掉上清。沉淀經(jīng)冷凍干燥至恒重，得到產(chǎn)物硫辛酰氨基酸?；葝u素(V)-LA-NHCHRCO-Insulin。
所得修飾胰島素用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析。色譜系統(tǒng)為Agilent 1100，色譜柱為Phenomenex公司的Jupiter C18反相柱(250×4.6mm，5μm，30nm)；流動相A為磷酸鹽緩沖液(pH3.0)，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速1ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃，檢測波長214nm。流動相梯度如下0min 74％A-26％B4min 70％A-30％B8min 70％A-30％B14min 64％A-36％B
25min 64％A-36％B相同的色譜條件下，未修飾的豬胰島素的保留時間(tR)為9.5min，而修飾胰島素的tR均大于9.5min。
用正常小鼠考察所得修飾胰島素的降血糖活性，并與天然胰島素對照；同時用胰蛋白酶對修飾胰島素進(jìn)行體外降解試驗。
用正常小鼠考察所得修飾胰島素的降血糖活性，并與天然胰島素對照。取24只體重約30g昆明小鼠，禁食12小時，隨機分成四組。將修飾胰島素和胰島素分別用磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)配成0.18IU/ml的注射液，小鼠腹膜皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg體重)?？瞻捉M注射等量的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)。尾靜脈采血，測定不同時間的血糖值。結(jié)果證明，與胰島素相比，修飾胰島素不僅保持降糖活性，而且起效快，在體內(nèi)持續(xù)作用時間延長，如圖1所示。
將上述修飾胰島素用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)配成36IU/ml，加入一定量的胰蛋白酶(胰島素∶胰蛋白酶＝25∶1)，在37℃下保溫2h、4h、6h、8h、10h、12h，取體重約30g禁食12小時的正常昆明小鼠(每組不少于6只)，皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg體重)，尾靜脈采血，測定注射后60min的血糖值。體外抗酶解實驗結(jié)果表明，所得修飾胰島素抵抗胰蛋白酶降解作用的能力提高，即使酶解12h仍然有一定的降糖作用；而未修飾的胰島素酶解4h基本失去生物活性，如圖2所示。


圖1胰島素(Ins)和修飾胰島素(LA-Ins)的降血糖作用縱坐標(biāo)為實測血糖平均值(P＜0.05＝，單位為mmol/L；橫坐標(biāo)為時間，單位為分鐘(min) ○標(biāo)記的曲線為空白組，●標(biāo)記的曲線為胰島素組，▲標(biāo)記的曲線為LA-Ins。
圖2酶解時間對胰島素(Ins)和修飾胰島素(LA-Ins)[降糖能力的影響縱坐標(biāo)為相對降糖率(％)，橫坐標(biāo)為酶解時間，單位為小時(h) ●標(biāo)記的曲線為胰島素組，▲標(biāo)記的曲線為LA-Ins相對降糖率指已酶解的胰島素(或修飾胰島素)注射后60min引起的血糖降低值除以未酶解的胰島素(或修飾胰島素)注射后60min引起的血糖降低值。
具體實施例方式
例1α-硫辛酸?；葝u素(LA-Ins)的制備稱取2.06g α-硫辛酸(0.01mol)溶于20ml無水乙醚，加入1.19g苯并三唑(0.01mol)，攪拌溶解。然后，在0℃下緩慢滴加2.08gDCC的30ml乙醚溶液。滴加完畢后，繼續(xù)在0℃下攪拌反應(yīng)2h。再調(diào)溫至20℃，攪拌反應(yīng)3h。然后，室溫放置過夜。次日過濾除去白色不溶物。將濾液置冰箱冷卻。次日析出針狀結(jié)晶。過濾，得針狀晶體，即硫辛酰苯并三唑，產(chǎn)率約75％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M硫辛酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)160min。停止反應(yīng)，向澄清的反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即LA-Ins，產(chǎn)率約95％(按胰島素的用量計算)。RP-HPLC測得LA-Ins的保留時間為17.6min。
例2α-硫辛酸?；葝u素(LA-Ins)的制備稱取2.06g α-硫辛酸(0.01mol)溶于20ml無水乙醚，加入1.19g苯并三唑(0.01mol)，攪拌溶解。然后，在0℃下緩慢滴加2.08gDCC的30ml乙醚溶液。滴加完畢后，繼續(xù)在0℃下攪拌反應(yīng)3h。再調(diào)溫至20℃，攪拌反應(yīng)2h。然后，室溫放置過夜。次日過濾除去白色不溶物。將濾液置冰箱冷卻。次日析出針狀結(jié)晶。過濾，得針狀晶體，即硫辛酰苯并三唑，產(chǎn)率約75％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及1ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M硫辛酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)120min。停止反應(yīng)，向澄清的反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即LA-Ins，產(chǎn)率約95％。RP-HPLC測得LA-Ins的保留時間為17.6min。
例3α-硫辛酸?；葝u素(LA-Ins)的制備稱取2.06g α-硫辛酸(0.01mol)溶于20ml無水乙醚，加入1.19g苯并三唑(0.01mol)，攪拌溶解。然后，在0℃下緩慢滴加2.08gDCC的30ml乙醚溶液。滴加完畢后，繼續(xù)在0℃下攪拌反應(yīng)2h。再調(diào)溫至20℃，攪拌反應(yīng)2h。然后，室溫放置過夜。次日過濾除去白色不溶物。將濾液置冰箱冷卻。次日析出針狀結(jié)晶。過濾，得針狀晶體，即硫辛酰苯并三唑，產(chǎn)率約75％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M硫辛酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向澄清的反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即LA-Ins，產(chǎn)率約97％。RP-HPLC測得LA-Ins的保留時間為17.6min。
例4α-硫辛酰甘氨酸?；葝u素(LA-NHCH2CO-Ins)的制備將1.5g(0.02mol)甘氨酸溶于15ml水和60mlTHF的混合溶劑中，再加入2.75mlTEA。在0℃下，緩慢滴加4.7g α-硫辛酰氯的THF溶液。加畢，攪拌反應(yīng)2h，然后調(diào)溫至20℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水層。有機層冷卻結(jié)晶，過濾得α-硫辛酰甘氨酸，產(chǎn)率約30％。
將1.32g(0.005mol)α-硫辛酰甘氨酸溶于20mlTHF中，加入0.595g(0.005mol)苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的THF溶液20ml。滴加完畢后，0℃下攪拌反應(yīng)2h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌3h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮約一半后，置冰箱冷凍結(jié)晶。過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得α-硫辛酰甘氨酸苯并三唑，產(chǎn)率約40％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M α-硫辛酰甘氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即α-硫辛酰甘氨酸?；葝u素(LA-NHCH2CO-Ins)。RP-HPLC測得LA-NHCH2CO-Ins的保留時間為17.25min。
例5α-硫辛酰甘氨酸?；葝u素(LA-NHCH2CO-Ins)的制備將1.5g(0.02mol)甘氨酸溶于15ml水和45mlTHF的混合溶劑中，再加入2.75mlTEA。在冰浴下，緩慢滴加4.7g α-硫辛酰氯的THF溶液。加畢，攪拌反應(yīng)3h，然后調(diào)溫至30℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水層。有機層冷卻結(jié)晶，過濾得α-硫辛酰甘氨酸，產(chǎn)率約25％。
將1.32g(0.005mol)α-硫辛酰甘氨酸溶于20mlTHF中，加入0.595g(0.005mol)苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的THF溶液20ml。滴加完畢后，0℃下攪拌反應(yīng)3h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮約一半后，置冰箱冷凍結(jié)晶。過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得α-硫辛酰甘氨酸苯并三唑，產(chǎn)率約30％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及1ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1Mα-硫辛酰甘氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)200min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即α-硫辛酰甘氨酸酰化胰島素(LA-NHCH2CO-Ins)。RP-HPLC測得LA-NHCH2CO-Ins的保留時間為17.25min。
例6α-硫辛酰丙氨酸酰化胰島素(LA-NHCH(CH3)CO-Ins)的制備將1.78g(0.02mol)丙氨酸溶于15ml水和60mlTHF的混合溶劑中，再加入2.75mlTEA。在冰浴下，緩慢滴加4.7g α-硫辛酰氯的THF溶液。加畢，攪拌反應(yīng)2h，然后調(diào)溫至20℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水層。有機層冷卻結(jié)晶，過濾得α-硫辛酰丙氨酸，產(chǎn)率約30％。
將1.4g(0.005mol)α-硫辛酰丙氨酸溶于20mlTHF中，加入0.595g(0.005mol)苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的THF溶液20ml。滴加完畢后，0℃下攪拌反應(yīng)3h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮約一半后，置冰箱冷凍結(jié)晶。過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得α-硫辛酰丙氨酸苯并三唑，產(chǎn)率約20％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M α-硫辛酰丙氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)200min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即α-硫辛酰丙氨酸酰化胰島素(LA-NHCH(CH3)CO-Ins)。RP-HPLC測得LA-NHCH(CH3)CO-Ins的保留時間為17.4min。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)修飾的胰島素，其化合物通式為LA-Ins，式中LA為α-硫辛酸?；浣Y(jié)構(gòu)如下 Ins為胰島素。
2.權(quán)利要求1的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，合成路線和具體合成的步驟如下 具體合成步驟是①將α-硫辛酸(α-LA)溶于乙醚中，加入苯并三唑，攪拌溶解；冰浴下，滴加等摩爾的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的乙醚溶液；滴加完畢后，0℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3小時，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3小時；停止反應(yīng)后，過濾，濾除不溶物，將濾液冷卻結(jié)晶，過濾，得針狀晶體，真空干燥至即得硫辛酰苯并三唑(I)；②0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，再加入三乙胺；③將硫辛酰苯并三唑(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將式(I)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時；④向步驟③的反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷凍離心；沉淀經(jīng)冷凍干燥，得到硫辛酸?；葝u素(II)(LA-Ins)。
3.按照權(quán)利要求2的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，步驟①所述的苯并三唑與加入的α-硫辛酸等摩爾；步驟②所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑，水的體積百分含量為25％～75％；所述的三乙胺摩爾數(shù)約為胰島素用量的30～50倍；步驟③所述的硫辛酰苯并三唑(I)的摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍；
4.一種化學(xué)修飾的胰島素，化合物通式為LA-NHCHRCO-Ins，式中LA為α-硫辛酸?；浣Y(jié)構(gòu)如下 Ins為胰島素，R為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的側(cè)鏈。
5.權(quán)利要求4的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，合成路線和具體合成的步驟如下LA-NHCHRCO-Ins的合成路線為 具體合成步驟是①將α-硫辛酸(α-LA)溶于乙醚中，40～50℃回流，同時向其中滴加三氯化磷；滴加完畢，繼續(xù)在50～60℃回流反應(yīng)4～5小時；停反應(yīng)后，將乙醚蒸出，即得α-硫辛酰氯；②將氨基酸溶于水中，再加入相當(dāng)于該水溶液3～5倍體積的四氫呋喃(THF)，然后加入三乙胺(TEA)；在0～10℃下，攪拌滴加α-硫辛酰氯的THF溶液，加畢，攪拌反應(yīng)2～3小時，調(diào)溫至20～30℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3小時；停反應(yīng)后，鹽酸酸化至pH2～3，加入等體積的石油醚，分除水層；有機層冷卻結(jié)晶，過濾即得硫辛酰氨基酸(III)；③將硫辛酰氨基酸(III)溶于THF中，加入苯并三唑，攪拌溶解；冰浴下，滴加與二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的THF溶液；滴完后，冰浴下攪拌反應(yīng)2～3小時；然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3小時；停止反應(yīng)后，過濾，除濾液不溶物并濃縮，冷卻結(jié)晶；過濾干燥，即得硫辛酰氨基酸苯并三唑(IV)；④0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，再加入三乙胺；⑤將硫辛酰氨基酸苯并三唑(IV)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將(IV)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～4小時；⑥向上述反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷凍離心，沉淀經(jīng)冷凍干燥，即得到產(chǎn)物硫辛酰氨基酸?；葝u素(V)-LA-NHCHRCO-Insulin。
6.按照權(quán)利要求5的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，步驟①所述的三氯化磷與α-LA的摩爾比約為1/2～2/3；步驟②所述的氨基酸，為下列氨基酸之一甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸；所述的三乙胺(TEA)與加入的氨基酸等摩爾；所述的α-硫辛酰氯的摩爾數(shù)約為氨基酸用量的1.02～1.05倍；步驟③所述的苯并三唑及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與硫辛酰氨基酸(III)的用量是等摩爾的；步驟④所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑，水的體積百分含量為25％～75％；所述的三乙胺摩爾數(shù)約為胰島素用量的30～50倍；步驟⑤所述的硫辛酰氨基酸苯并三唑(IV)的摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍。
7.權(quán)利要求1和4的化學(xué)修飾胰島素在用于制備治療糖尿病的口服藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種可以用于治療糖尿病的口服藥物－α－硫辛酸或其衍生物修飾的胰島素及其制備方法。α－硫辛酸或其衍生物作為化學(xué)修飾基團不僅可以保護(hù)胰島素易受胰蛋白酶進(jìn)攻的位點，而且可增強胰島素的脂溶性，促進(jìn)胰島素的吸收。合成方法是將α－硫辛酸或其衍生物共價結(jié)合到胰島素的特定部位得到胰島素類似物L(fēng)A－Ins或LA－NHCHRCO－Ins。動物實驗證明，與胰島素相比，所得修飾胰島素不僅保持降糖活性，而且抵抗胰蛋白酶降解作用的能力明顯提高。
文檔編號C07K14/62GK1528789SQ20031011124
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者黃濤, 黃開勛, 徐輝碧, 黃 濤 申請人:華中科技大學(xué)