專利名稱：骨形態(tài)形成因子人mp52的冷凍干燥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨形態(tài)形成因子人MP52的冷凍干燥組合物及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及包含骨形態(tài)形成因子人MP52和甘露醇的冷凍干燥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)形成因子人MP52作為TGF-β家族的骨生成有關(guān)的因子，已于1994年首次分離得到了其cDNA(生物化學(xué)和生物物理研究通訊，第204卷，1994年第2期)。接著，采用基因重組技術(shù)得到了未喪失骨形態(tài)形成活性的骨形態(tài)形成因子人MP52(WO96/33215)。將骨形態(tài)形成因子人MP52冷凍干燥，在保存中會(huì)出現(xiàn)其體積減少(萎縮)，再溶解時(shí)會(huì)出現(xiàn)粉末凝集。
為了解決這些問題，在同樣屬于TGF-β家族的蛋白質(zhì)，并與骨形態(tài)形成因子人MP52的性質(zhì)最為相近的BMP-2中，加入添加劑——氨基酸、糖類或多元醇(特表平6-508777)。因此，本發(fā)明者嘗試著將這些添加劑用于骨形態(tài)形成因子人MP52，但是并未解決上述問題。也就是說，即使在骨形態(tài)形成因子人MP52中加入0.5～2.5％丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸等中性或堿性氨基酸之后冷凍干燥，再溶解時(shí)仍出現(xiàn)凝集。當(dāng)加入0.5～1％蔗糖或葡聚糖等糖類后冷凍干燥，觀察到冷凍干燥產(chǎn)品顏色變?yōu)榈S綠色并萎縮。當(dāng)加入0.5～1％多元醇如山梨醇后冷凍干燥，在冷凍干燥過程中骨形態(tài)形成因子人MP52溶解，無法得到冷凍干燥品。
發(fā)明描述本發(fā)明者為了解決上述問題反復(fù)進(jìn)行了悉心的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果在骨形態(tài)形成因子人MP52中加入甘露醇后冷凍干燥，確認(rèn)在冷凍干燥產(chǎn)品的保存過程中未出現(xiàn)著色或萎縮，再溶解時(shí)未出現(xiàn)凝集，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種包含骨形態(tài)形成因子人MP52和甘露醇的骨形態(tài)形成因子人MP52冷凍干燥組合物。作為本發(fā)明的骨形態(tài)形成因子人MP52，優(yōu)選使用WO96/33215中公開的采用基因工程方法制得的骨形態(tài)形成因子人MP52(以下也稱作rhMP52)。作為甘露醇，優(yōu)選使用日本藥典中所規(guī)定的甘露醇。骨形態(tài)形成因子人MP52與甘露醇的混合比優(yōu)選1∶5～50(重量比)。
本發(fā)明的組合物可以按照常規(guī)方法將骨形態(tài)形成因子人MP52與甘露醇的混合鹽酸溶液冷凍干燥，從而很容易的制得。具體地說，在純化的骨形態(tài)形成因子人MP52的鹽酸溶液中加入預(yù)定量的甘露醇，混合，過濾得到的混合物鹽酸溶液，將濾液裝入無菌小瓶中冷凍干燥，從而得到本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的組合物在使用時(shí)，用注射用蒸餾水或弱酸(約pH3)，例如鹽酸溶液或枸櫞酸緩沖液等溶解后，以治療有效量對(duì)患者使用。
本發(fā)明的組合物中甘露醇的優(yōu)選含量由穩(wěn)定性試驗(yàn)決定。穩(wěn)定性試驗(yàn)按照日本藥典第13版編寫的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中的方法進(jìn)行，并觀察和測(cè)定了試驗(yàn)開始時(shí)和3個(gè)月后的外觀性狀、溶液澄明度、電泳、水分含量，以及保存6個(gè)月后的異位骨生成能力。
其結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)開始時(shí)和3個(gè)月后外觀性狀和溶液澄明度沒有變化。另外，從電泳和水分含量測(cè)定結(jié)果可以得知，包含上述重量比甘露醇的任何一種制劑在試驗(yàn)開始時(shí)和3個(gè)月后都比較穩(wěn)定。
冷凍干燥產(chǎn)品的水分含量一般優(yōu)選2％以下。從上述結(jié)果可以判斷，包含甘露醇的骨形態(tài)形成因子人MP52組合物作為藥品，優(yōu)選量為5～50mg(最優(yōu)選10mg)，其中骨形態(tài)形成因子人MP52優(yōu)選1mg。
另外，分別測(cè)定了添加10、25、50mg甘露醇的骨形態(tài)形成因子人MP52冷凍干燥組合物在保存6個(gè)月后的異位骨生成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論保存溫度和甘露醇的添加量如何，均觀察到異位骨生成。由這些試驗(yàn)結(jié)果可以確認(rèn)，在骨形態(tài)形成因子人MP52中加入甘露醇后冷凍干燥，不會(huì)對(duì)骨形態(tài)形成因子人MP52產(chǎn)生任何不利影響，而且可以長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例具體地說明本發(fā)明。實(shí)施例1 rhMP52組合物的制備在按照WO96/33215公開的制備方法得到的純化rhMP52的10mM鹽酸水溶液(1mg/ml)中，分別加入日本藥典規(guī)定的D-甘露醇10、25和50mg，并混合，使用0.22μm的濾膜過濾得到的混合物，于無菌條件下在每個(gè)小瓶中填充該濾液1ml。將其冷凍干燥，從而制得藥物產(chǎn)品形態(tài)的本發(fā)明的組合物。實(shí)施例2 rhMP52組合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)將實(shí)施例1得到的rhMP52冷凍干燥組合物填充于氣密、透明的小瓶中，分別在2～8℃、25℃及40℃條件下保存。保存3個(gè)月后，基于下述判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下性狀(外觀)組合物仍然為白色餅狀物，無顏色變化，判定為“無變化”。
(溶液澄明度)溶解于1ml注射用蒸餾水的組合物溶液為無色、澄明、無凝聚，判定為“無變化”。
(電泳)通過膠片掃描儀掃描傳送出的紅色膠片，得到圖像，然后測(cè)定各譜帶的積分光密度(Integration Optical DensityIOD)％，通過面積百分率計(jì)算出主譜帶的純度。
(水分含量)使用微量水分計(jì)測(cè)定其水分含量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)于性狀，本發(fā)明組合物的外觀和溶液澄明度都沒有發(fā)生變化，而僅含rhMP52的冷凍干燥產(chǎn)品出現(xiàn)凝集。電泳結(jié)果表明，各組合物表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性(％)。
水分含量(％)的測(cè)量結(jié)果如表1所示。表1說明各組合物水分含量均沒有太大變化。說明本發(fā)明組合物與單純r(jià)hMP52的產(chǎn)品相比，制備時(shí)和保存后的水分含量均較低，因此很難發(fā)生萎縮。
表13 個(gè) 月 后組合物試驗(yàn)開始時(shí) 2-8℃25℃40℃單純r(jià)hMP529.7 9.2 7.6 7.8+甘露醇10ml 1.6 1.6 1.4 1.2+甘露醇25ml 0.9 0.7 0.6 0.5+甘露醇50ml 0.6 0.5 0.4 0.4實(shí)施例3 rhMP52的異位骨生成能力實(shí)施例1得到的rh MP52組合物1小瓶(1mg/小瓶)，分別在4℃和25℃保存6個(gè)月后，在其中加入1ml注射用蒸餾水制成給藥液，以20μg/20μl的量給ICR小鼠(購自日本Crea公司)肌肉注射，2周后，通過軟性X射線照片觀察有無異位骨生成(n＝2)。其結(jié)果如表2所示。
表2組合物 4℃ 25℃單純r(jià)hMP52有骨生成有骨生成+甘露醇10ml 有骨生成有骨生成+甘露醇25ml 有骨生成有骨生成+甘露醇50m有骨生成有骨生成工業(yè)實(shí)用性骨形態(tài)形成因子人MP52的冷凍干燥產(chǎn)品存在著保存時(shí)發(fā)生變色或萎縮，再溶解時(shí)發(fā)生凝集的問題。但是，本發(fā)明的冷凍干燥組合物不存在上述問題。本發(fā)明的冷凍干燥組合物中的骨形態(tài)形成因子人MP52即使長(zhǎng)期保存也很穩(wěn)定，其純度、水分含量、異位骨生成能力基本無變化。因此本發(fā)明可以用于制藥領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.骨形態(tài)形成因子人MP52的冷凍干燥組合物，其包括骨形態(tài)形成因子人MP52和甘露醇。
2.如權(quán)利要求1所述的冷凍干燥組合物，其中骨形態(tài)形成因子人MP52與甘露醇以1∶5-50(重量)的比例混合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的冷凍干燥組合物，其中骨形態(tài)形成因子人MP52采用基因工程方法制備。
4.骨形態(tài)形成因子人MP52冷凍干燥組合物的制備方法，包括在純化的骨形態(tài)形成因子人MP52溶液中加入甘露醇，將得到的混合物冷凍干燥。
5.如權(quán)利要求4所述的冷凍干燥組合物的制備方法，其中骨形態(tài)形成因子人MP52與甘露醇以1∶5～50(重量)的比例混合。
6.如權(quán)利要求4或5所述的冷凍干燥組合物的制備方法，其中骨形態(tài)形成因子人MP52采用基因工程方法制備。
全文摘要
通過將骨形態(tài)形成因子人MP52與甘露醇以1∶5～50(重量比)混合后冷凍干燥,能夠得到穩(wěn)定的骨形態(tài)形成因子人MP52冷凍干燥組合物,它可以防止骨形態(tài)形成因子人MP52的冷凍干燥產(chǎn)品保存時(shí)變色、萎縮,并防止再溶解時(shí)的凝集。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1244127SQ9880198
公開日2000年2月9日 申請(qǐng)日期1998年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月30日
發(fā)明者稻垣實(shí)津子, 市川秀樹 申請(qǐng)人:赫斯·馬里恩·魯索株式會(huì)社