專利名稱：一種骨肽組合物及其制劑、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，具體講，涉及一種骨肽組合物及其制劑、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從動物骨中提取的提取物，其主要成分為小分子多肽類物質(zhì)，是由膠原蛋白分解而來的小分子肽類混合物，具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖，促進新骨形成，以及調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積，防止骨質(zhì)疏松的作用，臨床上主要用于促進骨折愈合。其中，多肽提取物可通過補充和增加各種成骨因子，直接作用于成骨軟骨及破骨細(xì)胞，促進骨與軟骨基質(zhì)的合成，加速損傷愈合與修復(fù)；同時，動物骨中的多肽提取物還可以促進體內(nèi)生長激素、促甲狀腺激素、甲狀腺激素的分泌，同時全面促進人體代謝、間接調(diào)節(jié)骨與軟骨的生長代謝，最終促進骨質(zhì)形成，提高骨愈合質(zhì)量?，F(xiàn)有技術(shù)中公開了很多關(guān)于骨肽、骨肽注射劑的報道和研究。針對骨肽提取的工藝做了一系列深入的研究。例如在專利申請200510076912. 8，骨肽注射液及其制備方法， 該專利中公開了一種新的骨肽注射液制備方法及由該方法得到的產(chǎn)品，其制備方法如下 1).將哺乳動物骨用鹽水熱壓煮提一次或多次，離心過濾，合并煮提液，在低溫下放置1 40小時，將提取液溫?zé)岷箅x心過濾，收集濾液備用；幻將濾液真空濃縮后加入乙醇，靜置沉淀，吸出上層醇液，定容回收乙醇，得水提液；幻將水提液加等體積蒸餾水，依次通過弱酸性陽離子樹脂柱、弱堿性陰離子樹脂柱、珠狀殼聚糖柱和殼聚糖改性活性炭柱，去雜純化， 得純凈稀藥液；4)將純凈稀藥液濃縮后，加壓過微孔濾膜，將濾液灌裝、熔封、熱壓滅菌，或?qū)⑺盟幰和ㄟ^冷凍干燥，得到凍干粉針劑。該方法制備工藝復(fù)雜，需要采用多種提取柱子，成本高，不適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。專利申請03111084. 3骨肽氯化鈉注射液及其制備工藝，公開了一種骨肽氯化鈉注射劑，該產(chǎn)品由骨肽溶液、氯化鈉和注射用水構(gòu)成，其制備工藝包括以下過程取胎牛四肢骨，加純水于100 120°C熱壓提取兩次，每次0. 5 2小時，提取液過濾，用HCI調(diào)pH值 3. 0 5. 5靜置15 M小時，離心，取上清液用NaOH調(diào)pH值8. 0 10. 0，在_10°C _25°C 冷凍M小時以上，取出融化，離心，取上清液，用HCI調(diào)pH值至6. 5 7. 5，加熱至70 IOO0C，離心，取上清液，用分子量5000 10000膜超濾，收集超濾液，制得骨肽溶液；在濃度為3%的氯化鈉溶液中加入0. 05 2% g/ml的活性炭，煮沸5 30分鐘，過濾脫炭，冷卻至室溫，0. 45um微孔濾膜過濾，加入處方量的所述的超濾液，調(diào)pH值6. 5 7. 5，用0. 22um 微孔濾膜除菌，于100 115C°C滅菌30分鐘。該專利的提取方法中采用了高壓提取，并且提取工藝的時程很長，會對提取物的生物活性產(chǎn)生影響。已有技術(shù)中未對所提取的骨肽提取物的成分進行分析，并且已有技術(shù)中的提取方法還有一系列缺陷，例如大分子物質(zhì)含量高、游離脂肪酸含量高等，本發(fā)明對提取技術(shù)進行了近一步的改進，大幅度的提高了產(chǎn)率，大大降低了大分子物質(zhì)、游離脂肪酸的含量；并且本發(fā)明還對所制備得到的骨肽提取物做了進一步的研究，研究了其組成成分，測定了其中含有的多肽物質(zhì)的序列及其含量，通過測定可知，本發(fā)明的骨肽提取物中多肽物質(zhì)的含量較現(xiàn)有技術(shù)有大幅度的提高。并且通過藥理實驗證明，本發(fā)明的骨肽提取物具有更好的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出一種骨肽組合物。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該骨肽組合物的制劑。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出該骨肽組合物的制備方法。本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提出該骨肽組合物的用途。為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種骨肽組合物，其特征在于，所述的骨肽組合物包括骨多肽化合物 A 8 10重量份、骨多肽化合物B 5 8重量份、骨多肽化合物C 5 8重量份、骨多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3 6重量份、游離氨基酸16 22重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游離脂肪酸0 0. 01重量份；其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列為SEQ ID NO=I ；骨多肽化合物B的氨基酸序列為SEQ ID NO 2 ；骨多肽化合物C的氨基酸序列為SEQ ID NO 3 ；骨多肽化合物D 的氨基酸序列為SEQ ID NO 4 ；骨多肽化合物E的氨基酸序列為SEQ ID NO :5。其中SEQ ID NO :1 的氨基酸序列為Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro -Arg ；SEQ ID NO :2 的氨基酸序列為Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu -Lys ；SEQ ID NO 3的氨基酸序列為Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-LyS-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu ；SEQ ID NO 4的氨基酸序列為Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg ；SEQ ID NO 5 的氨基酸序列為Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro_Arg。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的骨肽組合物包括骨多肽化合物A 8. 5 10重量份、骨多肽化合物B 5. 5 8重量份、骨多肽化合物C 5. 5 8重量份、骨多肽化合物D 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3. 2 6重量份、游離氨基酸16 22重量份、核糖 0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游離脂肪酸O 0. 005重量份。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的氨基酸包括門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為所述的微量元素包括鈣、鋰、鈉、鎂、硅、磷、鉀、硫、 錳、鐵和鍶。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的骨肽組合物制備的注射劑，包括粉針、水針和輸液。其中，所述的制劑采用公知的方法制備，可制備出不同劑量的制劑以適應(yīng)患者的需要。本發(fā)明還涉及該骨肽組合物的制備方法，包括以下步驟
1.取健康新鮮冷凍的哺乳動物的四肢骨，洗凈，壓碎；2.壓碎的四肢骨用骨泥機磨成骨泥，放入提取罐中，加3 6倍量水，80 100°C 保溫攪拌1 2小時，取上清液儲存；將得到的骨渣加入2 4倍量水，80 100°C保溫攪拌1 2小時，取上清液；合并二次得到的上清液濃縮至原料重；3.將步驟O)中得到的溶液于-5 0°C條件下，放置12 M小時，除去上層脂肪；4.溶液用鹽酸調(diào)pH值4. 5 5. 5，加熱煮沸15 30min，過濾，冷卻后，于-5 0°c條件下放置12 Mh，去除上層脂肪，低溫離心；5.酸性濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值7. 5 9. 5，加熱煮沸15 30min，過濾，冷卻后，于-5 0°C條件下放置12 Mh，去除上層脂肪，低溫離心；6.溶液用鹽酸調(diào)至中性，用10000分子量的超濾器超濾，超濾液濃縮至規(guī)定體積；7.溶液用鹽酸調(diào)pH值4. 5 5.0，按溶液量的0.1%加入藥用活性炭，加熱至 100°C攪拌吸附30min，冷卻降溫至30 35°C，用0. 22 μ m微孔濾膜過濾得精濾液；8.精濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH6. 5 7. 5，用6000道爾頓的超濾器超濾，得超濾液；9.超濾液減壓干燥，即得本發(fā)明的骨肽組合物。本發(fā)明制備方法的第一優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟O)中，將所述的骨泥采用微波作用，微波功率為450W，作用時間為5 30分鐘，優(yōu)選5 15分鐘。本發(fā)明制備方法的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的骨肽組合物制備方法中的濃縮均采用減壓濃縮，溫度為50 80°C，優(yōu)選60 70°C。本發(fā)明制備方法的第三優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟中的(3)、(4)、(5)中，在0°C條件下放置12 18h，去除上層脂肪，低溫離心去除沉淀。本發(fā)明制備方法的第四優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟中的⑷和(5)中，所述的離心的條件為2000 4000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選2000 3000轉(zhuǎn)/分鐘；離心10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘。本發(fā)明制備方法的第五優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(9)中還可以添加賦形劑、穩(wěn)定劑、PH值調(diào)節(jié)劑。將本發(fā)明制備得到的骨肽組合物通過高效液相色譜法進行分析，測得5種含量較高的多肽化合物，分別將其命名為骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D和骨多肽化合物E，并采用質(zhì)譜法進行分析、測序，測得其氨基酸序列。同時采用高效液相色譜法測定了骨肽組合物中氨基酸的種類，采用比色法測定了其核糖的含量， 采用原子吸收分光光度法測定了其微量元素的含量，采用滴定法測定了其游離脂肪酸的含量。下面對本發(fā)明的內(nèi)容進行進一步的解釋和說明本發(fā)明提出了一種成分確切的骨肽組合物，經(jīng)過檢測，本發(fā)明的骨肽組合物中含有多肽化合物的總重量份為25. 5 39. 5，其中含量豐富的有5種多肽，本發(fā)明對含量相對豐富的多肽化合物采用高效液相色譜進行了分離，其中包括多肽化合物A 8 10重量份、 多肽化合物B 5 8重量份、多肽化合物C 5 8重量份、多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、 多肽化合物E3 6重量份；并且采用質(zhì)譜法對5種多肽化合物的氨基酸序列進行了分析。
其中，高效液相色譜分離的條件為C18色譜柱，250mmX50. 0mm, 5u ；流動相A 含 0. 05%甲酸的水溶液；流動相B 乙腈；流速:lml/min ；柱溫:40°C ；梯度洗脫
權(quán)利要求
1.一種骨肽組合物，其特征在于，所述的骨肽組合物包括骨多肽化合物A 8 10重量份、骨多肽化合物B 5 8重量份、骨多肽化合物C 5 8重量份、骨多肽化合物D 4. 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3 6重量份、游離氨基酸16 22重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游離脂肪酸0 0. 01重量份；其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；骨多肽化合物B的氨基酸序列為SEQ ID NO 2 ；骨多肽化合物C的氨基酸序列為SEQ ID NO 3 ；骨多肽化合物D的氨基酸序列為SEQ ID NO 4 ；骨多肽化合物E的氨基酸序列為SEQ ID NO :5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肽組合物，其特征在于，所述的骨肽組合物包括骨多肽化合物A 8. 5 10重量份、骨多肽化合物B 5. 5 8重量份、骨多肽化合物C 5. 5 8重量份、骨多肽化合物D 5 7. 5重量份、骨多肽化合物E 3. 2 6重量份、游離氨基酸16 22 重量份、核糖0. 3 5. 4重量份、微量元素0. 04 0. 12重量份、游離脂肪酸0 0. 005重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肽組合物，其特征在于，所述的氨基酸包括門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和酪氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肽組合物，其特征在于，所述的微量元素包括鈣、鋰、鈉、 鎂、硅、磷、鉀、硫、錳、鐵和鍶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨肽組合物，其特征在于，將所述的骨肽組合物制備成注射劑，所述的注射劑包括水針、粉針和輸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的骨肽組合物，其特征在于，所述的注射劑中還添加賦形劑、穩(wěn)定劑、PH值調(diào)節(jié)劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一權(quán)利要求所述的骨肽組合物，其特征在于，所述骨肽組合物的制備方法包括以下步驟取健康新鮮冷凍的哺乳動物的四肢骨，洗凈，壓碎；(2)壓碎的四肢骨用骨泥機磨成骨泥，放入提取罐中，加3 6倍量水，80 100°C保溫攪拌1 2小時，取上清液儲存；將得到的骨渣加入2 4倍量水，80 100°C保溫攪拌 1 2小時，取上清液；合并二次得到的上清液濃縮至原料重；(3)將步驟O)中得到的溶液于-5 0°C條件下，放置12 M小時，除去上層脂肪；(4)溶液用鹽酸調(diào)pH值4.5 5. 5，加熱煮沸15 30min，過濾，冷卻后，于-5 0°C 條件下放置12 Mh，去除上層脂肪，低溫離心；(5)酸性濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值7.5 9. 5，加熱煮沸15 30min，過濾，冷卻后， 于-5 0°C條件下放置12 Mh，去除上層脂肪，低溫離心；(6)溶液用鹽酸調(diào)至中性，用10000分子量的超濾器超濾，超濾液濃縮至規(guī)定體積；(7)溶液用鹽酸調(diào)pH值4.5 5. 0，按溶液量的0. 加入藥用活性炭，加熱至100°C 攪拌吸附30min，冷卻降溫至30 35°C，用0. 22 μ m微孔濾膜過濾得精濾液；(8)精濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH6.5 7. 5，用6000道爾頓的超濾器超濾，得超濾液；(9)超濾液減壓干燥，即得本發(fā)明的骨肽組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的骨肽組合物，其特征在于，在步驟O)中，將所述的骨泥采用微波作用，微波功率為450W，作用時間為5 30分鐘，優(yōu)選5 15分鐘；然后再放入提取罐中提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的骨肽組合物，其特征在于，所述的骨肽組合物制備方法中的濃縮均采用減壓濃縮，溫度為50 80°C，優(yōu)選60 70°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的骨肽組合物，其特征在于，在步驟中的(3)、(4),(5)中，在 0°C條件下放置12 18h，去除上層脂肪；在步驟中的(4)和(5)中，所述的離心的條件為 2000 4000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選2000 3000轉(zhuǎn)/分鐘；離心10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘。
11.權(quán)利要求1所述的骨肽組合物在制備抗炎，鎮(zhèn)痛，促進骨折愈合藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種骨肽組合物，該骨肽組合物包括骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C 5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游離氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游離脂肪酸0～0.01重量份；其中對骨多肽化合物A、B、C、D、E的氨基酸序列進行了測定；本發(fā)明還涉及該骨肽組合物的制備方法及用途，該骨肽組合物的制備方法簡便、易于操作、收率高，所制備的骨肽組合物的生物活性高。
文檔編號A61P29/00GK102188692SQ20111011050
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者叢艷, 俞嘉林, 吳晶晶, 權(quán)曉丹 申請人:俞嘉林