專利名稱：骨基質明膠載體的去活方法
技術領域：
本發(fā)明是屬于生物醫(yī)學的材料制備領域，特別適用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的骨基質明膠載體。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，簡稱BMP)是一種具有獨特誘導成骨功能的機體蛋白因子，在機體骨組織再生和修復過程中發(fā)揮著關鍵作用?，F(xiàn)在已可從牛、馬、豬、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同種屬來源的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，或利用生物工程技術制備基因重組的人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。利用其誘導成骨活性，有望實現(xiàn)人體斷骨的快速再生連接和缺骨的快速再生修復，在骨科和口腔科臨床具有廣泛的應用前景，并具有重大的經(jīng)濟和社會效益。
為了充分發(fā)揮骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的獨特的誘導成骨活性并取得良好的臨床治療效果，需要滿足三個條件一、保證骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的天然立體構象和雙體結構的完整，使其活性不被破壞；二、使骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)與適當?shù)妮d體復合，為被誘導轉化的新生成骨細胞提供附著位點，同時載體還起到緩釋和引導成骨方向和范圍的作用；三、不引起免疫反應。
骨基質明膠(bone matrix gelatine，簡稱BMG)是從牲骨中提取的，主要成分是膠原蛋白。它成本低廉并具有良好的生物相容性。由于膠原蛋白組成和結構的高度保守，使其種屬差異極小，基本不引起免疫炎癥反應，可被人體自然吸收和同化。經(jīng)過去活處理的骨基質明膠(BMG)本身無誘導活性，并具有多孔網(wǎng)架的微觀結構，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的極佳的載體材料。
在牲骨中，天然存在的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和其它非膠原蛋白成分與骨基質明膠(BMG)相復合并構成了牛骨基質。為了制備安全實用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體材料骨基質明膠(BMG)，需要去除骨基質中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和大量的非膠原蛋白組分。這不僅可以得到無誘導成骨活性的惰性膠原載體，而且通過去除大量高種屬特異性的非膠原蛋白，得到無免疫原性的骨基質明膠(BMG)載體。所以去活處理是骨基質明膠(BMG)載體的制備中的關鍵步驟。
現(xiàn)有技術中主要是將牲骨經(jīng)粉碎并脫脂脫鈣后，用高濃度的強變性劑鹽酸胍將水不溶性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等非膠原性蛋白溶解抽提去除，水洗去胍后凍干，制成去活膠原載體。詳細過程參見U.S.Patent4975526。
上述現(xiàn)有方法在實踐中存在的問題主要是由于骨基質顆粒大小差異和鹽酸胍抽提效率等因素的影響，為了保證得到無誘導活性的載體，需要長時間的和反復的抽提，并可能在不同批次間存在差異。未被去除的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)由于雙體結構未被破壞，除去鹽酸胍后仍可能復性并具有活性；部分與膠原蛋白緊密結合的非膠原蛋白和被包裹其中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)蛋白始終難于被抽提去除。
本發(fā)明的目的是提出一種能夠破壞活性成分的天然結構，提高抽提去活效率，和保證骨基質明膠(BMG)載體的誘導惰性及無免疫原性的去活骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體骨基質明膠(BMG)的制取方法。
根據(jù)本發(fā)明的目的，我們所采用去活處理骨基質明膠(BMG)載體的方法是利用還原劑破壞其分子內和分子的二硫鍵，破壞其天然活性的空間構象，使雙體結構還原成單體結構，使其失去誘導活性并與膠原蛋白去復合，而且還利于被抽提除去。本發(fā)明的骨基質明膠載體骨基質明膠(BMG)的去活方法是將新鮮的牲骨股骨去骺端，剔除肌內，筋膜和骨髓后進行脫脂脫水處理，其特征在于脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進行后，并于4℃再進行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質DBM經(jīng)2molCaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH 8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用還原劑與變性劑溶液，按5-10倍體積與DBM混合并于室溫下抽提24-48小時。抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8-12小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質明膠(BMG)粉粒置于4℃保存。在上述本發(fā)明去活方法中二次抽提溶液還原劑是指0.05-0.2mol二硫蘇糖醇(DTT)溶液或0.7mol β-巰基乙醇(BME)溶液中的任意一種。而與還原劑混合的變性劑是指4-6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液或者說6-8mol尿素/0.5mol CaCl2pH7.0溶液中的任一一種。
采用本發(fā)明的骨基質明膠載體去活方法經(jīng)實驗具有以下特點將制備過程分為DBM粗制和骨基質明膠(BMG)精制兩部分并分別保存所制取得材料，有利于實現(xiàn)質量可控的載體材料的批量制備。
通過CaCL2、EDTA、55℃溫水順序抽提，可大約去掉20％的可溶性非膠原蛋白。
通過高濃度鹽酸胍或尿素的變性作用，將水不溶性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和其它非膠原蛋白的分子內和分子間氫鍵破壞，破壞其蛋白空間構象；通過DTT和BME的還原作用，破壞骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等非膠原蛋白的分子內和分子間二硫鍵，使多聚體和雙體解離為單體，破壞蛋白的活性結構。利用變性劑和還原劑的協(xié)同作用，使緊密地包聚在骨基質高度交聯(lián)結構中的不溶性蛋白易于被溶解抽提，并不再具有維持其生理活性的分子結構和構象，提高了抽提去活效率。
通過熱酸處理使與膠原蛋白有化學鍵合的蛋白解離下來，而對膠原蛋白纖維只有少量的降解作用。
經(jīng)上述制備和去活處理的骨基質明膠骨基質明膠(BMG)不再具有潛在的誘導成骨活性和免疫原性，而具有微觀多孔網(wǎng)架結構和良好的生物相容性，是一種易與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)復合的可降解的安全的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體。
實施例冶金部鋼鐵研究總院生物材料與工程中心于1994年8月至11月間在河北省大廠縣收集新鮮牛股骨按照上述方法經(jīng)過清理、破碎、清洗、脫脂脫水、研磨粉碎、篩分、脫鈣、清洗、脫脂脫水、干燥保存等步驟制備了約20千克的牛骨脫鈣骨基質(DBM)。于1995年初至1998年中在中心實驗室用(DBM)材料制備骨基質明膠(BMG)，并通過動物實驗檢測載體的安全性和效果，取得滿意的結果。形成上述制備方法。按照上述方法分別制備了4批共800克牛骨骨基質明膠(BMG)載體，經(jīng)過小鼠皮下植入實驗檢驗，組織切片觀察，均未發(fā)現(xiàn)有誘導成骨活性和免疫炎癥反應，生物安全性良好。
以下為實施例的具體實施方案。
實施例1；本實施例是采用10Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進行后并于4℃再進行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質(DBM)經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.07mol-硫蘇糖醇(DTT)的4mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液按7倍體積與脫鈣骨基質(DBM)混合并于室溫下抽提30小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質明膠粉粒置于4℃保存。
實施例2；本實施例是采用5Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進行后并于4℃再進行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol EDTA pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.7mol β-巰基乙醇(BME)的6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液按9倍體積與脫鈣骨基質(DBM)混合并于室溫下抽提40小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理10小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質明膠粉粒置于4℃保存。
實施例3；本實施例是采用5Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進行后并于4℃再進行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.15mol硫蘇糖醇(DTT)的8mo1尿素/0.5mo1 CaCl2pH7.0溶液按6倍體積與脫鈣骨基質(DBM)混合并于室溫下抽提24小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理11小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質明膠粉粒置于4℃保存。
權利要求
1.一種骨基質明膠載體的去活方法，該方法是將新鮮的牲骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進行脫脂、脫水處理，其特征在于脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進行后并于4℃再進行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥，保存，再將所獲材料脫鈣骨基質DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有還原劑與變性劑溶液，按5-10倍體積與DBM混合并于室溫下抽提24-48小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8-12小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質明膠粉粒置于4℃保存。
2.根據(jù)權利要求1所述去活方法，其特征在于還原劑是指0.05-0.2mol二硫蘇糖醇(DTT)溶液或0.7molβ-巰基乙醇(BME)溶液中的任意一種。
3.根據(jù)權利要求1、2所述去活方法，其特征在于還原劑的變性劑是指4-6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液或者說6-8mol尿素/0.5mol CaCl2pH7.0溶液中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學的材料制備領域。特別適用于生物醫(yī)學中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的骨基質明膠載體。本發(fā)明方法是利用還原劑破壞其分子內和分子間的二硫鍵和天然活性的空間構象,使雙體結構還原成單體結構,失去誘導活性并與膠原蛋白去復合。該方法的特點是破壞維持蛋白質生理活性的分子結構和構象,提高了抽提去活效率。
文檔編號A61L27/00GK1225819SQ9812567
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月21日 優(yōu)先權日1998年12月21日
發(fā)明者李曉光, 孫福玉, 沈淙, 王春華, 王勃生, 楊志偉, 姜雪松 申請人:冶金工業(yè)部鋼鐵研究總院