專利名稱：骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。主要適用于隨人工骨植入人體，促進(jìn)新骨發(fā)育生長，加速生理固定。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenefic protein，簡稱BMP)是一種具有獨(dú)特誘導(dǎo)成骨功能的機(jī)體蛋白因子，在機(jī)體骨組織再生和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可使斷骨快速再接，在骨科和口腔科中具有廣泛和應(yīng)用前景。
目前，制備BMP有兩種方法一種是利用生化提取法直接從牛、馬、豬、羊、兔、鼠等畜牲骨或骨肉瘤中提取混合型BMP；另一種是利用基因重組法合成單一型的人BMP?；蛑亟M人BMP的誘骨或骨活性強(qiáng)，比生化提取法制備的BMP高103-106倍。BMP雖具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨活性，但植入人體時(shí)，吸收代謝快，作用時(shí)間短，難以充分發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨效應(yīng)；另外，BMP在修復(fù)大尺寸骨缺損時(shí)無支架作用。因此，BMP在臨床應(yīng)用時(shí)還需要與某一載體材料復(fù)合，才以使其自身得到緩釋與支撐。
膠原(collagen)是構(gòu)成生物體組織結(jié)構(gòu)的一種含量最多的蛋白質(zhì)，約占人體蛋白質(zhì)總量的25-30％，其功能主要是承受負(fù)荷、連接組織和器官、保護(hù)機(jī)體等，在機(jī)體發(fā)育過程中還有協(xié)助引導(dǎo)組織分化和器官形成的作用。根據(jù)多肽鏈類型的不同、膠原可分5個(gè)類型，在生物體內(nèi)是以Ⅰ型膠原為主。醫(yī)用膠原是從牛皮、牛肌腱或豬皮、豬肌腱中提取。膠原具有優(yōu)良的生物相容性，對(duì)組織無毒性、無刺激、抗原性弱，對(duì)血小板有較高的親合性，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、加快傷口愈合，是BMP的理想載體材料之一。將BMP與膠原復(fù)合，既有利于BMP的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)的發(fā)揮，又能使膠原組織修復(fù)作用得到加強(qiáng)。
在現(xiàn)有技術(shù)中，文獻(xiàn)(《The Journal of Biological Chemistry》vol.265,No.22,PP13198-13205)提供了一各骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原復(fù)合的方法，該方法是將骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入到約6M鹽酸胍中，制成含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的鹽酸胍溶液，然后再將膠原置于其中，經(jīng)攪拌、混合，加乙醇低溫沉淀，最后用乙醇沖洗，無毒下涼干，冷凍干燥，保存待用。該方法的主要缺點(diǎn)是(1)在制備過程中，沒有加醋酸緩沖液，因此，不能有效地使BMP與膠原復(fù)合；(2)沒有加明膠，粒狀膠原與BMP沉淀物難于調(diào)制成型；(3)沒有強(qiáng)調(diào)膠原粒度，以增加其骨傳導(dǎo)作用。
本發(fā)明的目在于提供一種方法簡單和效果好的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型的制造方法，所制得復(fù)合劑型能有效地使骨形態(tài)發(fā)生蛋白在體內(nèi)得到緩釋，能充分發(fā)揮蛋形態(tài)發(fā)生蛋白的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)。
根據(jù)上述目的，本發(fā)明以鹽酸胍溶液和醋酸緩沖液為介質(zhì)制備上述所需的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型。其制造方法的具體工藝步驟如下(1)制備膠原醋酸緩沖液將粒狀的膠原溶于50-60℃醋酸緩沖液中，浸泡0.3-1.0小時(shí)，醋酸緩沖液中膠原的加入量為0.1-0.6mg/ml，醋酸緩沖液的酸堿度PH為4.5-5.0，醋酸濃度15-25mM，由此得膠原醋酸緩沖液；(2)制備骨形態(tài)發(fā)生蛋鹽酸胍-醋酸緩沖液，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入鹽酸胍與醋酸緩沖液的混合液中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白的加入量為鹽酸胍-醋酸緩沖液混合液的0.3-0.7mg/ml，鹽酸胍的濃度為5-7M，醋酸緩沖液的酸堿度PH為4.5-5.0，濃度為12-25mM，鹽酸胍與醋酸緩沖液的配比(ml/ml)為(0.5-1.5)∶(1.5-2.5)；(3)將上述分別制備的膠原醋酸緩沖液與骨形態(tài)發(fā)生蛋白鹽酸胍-醋酸緩沖液混合液混合，并在20-30℃溫度下攪拌，之后靜置0.5-2小時(shí)；兩者的混合比例為1∶1；(4)將乙醇加入上述混合液中，經(jīng)振蕩混勻后在-50--80℃溫度下保存0.5-1.5小時(shí)，隨即進(jìn)行離心沉淀，乙醇的加入量(ml)為混合液的1.5-2.5倍；
(5)用85％和100％的乙醇對(duì)沉淀物分別進(jìn)行沖洗，用85％乙醇沖洗兩次，用100％乙醇沖洗一次，沖洗后無毒下涼干，涼干后，加入10％的明膠，在30℃溫度下將粒狀沉淀物調(diào)制成型，經(jīng)冷凍干燥后，保存待用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)所用介質(zhì)鹽酸胍溶液和醋酸緩沖液來源廣泛，原材料成本低。
(2)本發(fā)明采用醋酸緩沖液能有效地使BMP與膠原相互吸附，提高其復(fù)合效率。
(3)本發(fā)明采和50-500μm膠原顆粒和10％明膠調(diào)制成型所制取的復(fù)合劑型能有效地使BMP在體內(nèi)得到緩釋，充分發(fā)揮BMP的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)，加強(qiáng)新生骨的傳導(dǎo)；另外，可使膠原的組織修復(fù)作用得到加強(qiáng)，特別是使骨愈合過程得到明顯加快。實(shí)驗(yàn)表明，將BMP與膠原顆粒劑型放入對(duì)孔式種植體內(nèi)，植入牙槽骨內(nèi)一個(gè)月就有大量骨小梁在牙種植體的對(duì)孔內(nèi)形成，并與牙槽骨融合一起，能有效地防止種植牙的松動(dòng)。
實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明所述的制造方法制備3批骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型。
經(jīng)備料后，首先將粒頭膠原放入溫度為50-60℃的醋酸緩沖液中，并浸泡一定時(shí)間，使之得到膠原醋酸緩沖液，膠原及醋酸緩沖液的加入量、濃度和酸堿度如表1所示。
另外，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白加到鹽酸胍與醋酸緩沖液的混合液中。鹽酸胍與醋酸緩沖液兩者的濃度、配比，以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白的加入量如表2所示。
接著將上述分別制備膠原醋酸緩沖液與骨形態(tài)發(fā)生蛋白鹽酸胍-醋酸緩沖液混合，在一定溫度下攪拌，并靜置一段時(shí)間。兩者混合攪拌溫度、靜置時(shí)間，兩者混合比例如表2所示。
隨后在上述兩者混合液中加入乙醇，經(jīng)振蕩混合均勻后在-50--80℃溫度下保存一定時(shí)間，隨即進(jìn)行離心沉淀。乙醇加入量、混勻后保存溫度和時(shí)間如表3所示。
最后用85％和100％的乙醇對(duì)沉淀物分別進(jìn)行清洗，清洗涼干后，加入10％的明膠，在30℃溫度下將粒狀沉淀物調(diào)制成型。
將本發(fā)明實(shí)施例2所制取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原復(fù)合劑型放入對(duì)孔式種植體內(nèi)，植入牙槽骨內(nèi)，一個(gè)月后就有大量骨小梁在牙種植體的對(duì)孔內(nèi)形成，并與牙槽骨融合一起，能有效地防止種植牙的松動(dòng)。表1實(shí)施例膠原和醋酸緩沖液的加入量、濃度及酸堿度
表2實(shí)施例鹽酸胍和醋酸緩沖液的濃度、配比以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白的加入量
表3實(shí)施例乙醇加入量，混勻后保存溫度及時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型的制造方法，其特征在于該方法包括如下工藝步驟(1)制備膠原醋酸緩沖液將粒狀的膠原溶于50-60℃醋酸緩沖液中，浸泡0.3-1.0小時(shí)，醋酸緩沖液中膠原的加入量為0.1-0.6mg/ml，醋酸緩沖液的酸堿度PH為4.5-5.0，醋酸濃度15-25mM，由此得膠原醋酸緩沖液；(2)制備骨形態(tài)發(fā)生蛋鹽酸胍-醋酸緩沖液，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入鹽酸胍與醋酸緩沖液的混合液中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白的加入量為鹽酸胍-醋酸緩沖液混合液的0.3-0.7mg/ml，鹽酸胍的濃度為5-7M，醋酸緩沖液的酸堿度PH為4.5-5.0，濃度為12-25mM，鹽酸胍與醋酸緩沖液的配比(ml/ml)為(0.5-1.5)∶(1.5-2.5)；(3)將上述分別制備的膠原醋酸緩沖液與骨形態(tài)發(fā)生蛋白鹽酸胍-醋酸緩沖液混合液混合，并在20-30℃溫度下攪拌，之后靜置0.5-2小時(shí)；兩者的混合比例為1∶1；(4)將乙醇加入上述混合液中，經(jīng)振蕩混勻后在-50--80℃溫度下保存0.5-1.5小時(shí)，隨即進(jìn)行離心沉淀，乙醇的加入量(ml)為混合液的1.5-2.5倍；(5)用85％和100％的乙醇對(duì)沉淀物分別進(jìn)行沖洗耳恭聽，用85％乙醇沖洗兩次，用100％乙醇沖洗一次，沖洗后無毒下涼干，涼干后，加入10％的明膠，在30℃溫度下將粒狀沉淀物調(diào)制成型，經(jīng)冷凍干燥后，保存待用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于膠原的粒度為50-500μm。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。主要涉及骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原顆粒復(fù)合劑型的制備。該方法首先是將膠原溶于醋酸緩沖液中,另將骨形態(tài)發(fā)生蛋白加入到鹽酸胍與醋酸緩沖液的混合液中。將上述兩種液體混合,經(jīng)攪拌靜置一定時(shí)間后,加入乙醇,隨即進(jìn)行離心沉淀。將沉淀物沖洗涼干后,即成為本發(fā)明所需制取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與膠原復(fù)合劑型。
文檔編號(hào)A61K47/00GK1230402SQ98125300
公開日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1998年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者孫箭華, 李曉光, 孫福玉, 沈淙, 王春華, 孟慶恩, 周蕙, 劉鼎新 申請(qǐng)人:冶金工業(yè)部鋼鐵研究總院