專利名稱：雞傳染性法氏囊病病毒疫苗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒領(lǐng)域，尤指一種利用高壓力技術(shù)(high hydrostatic pressuretechnique)制備雞傳染性法氏囊病病毒疫苗。
雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)是引起雞急性高度接觸性傳染病—雞傳染性法氏囊病的病原，雞法氏囊是其侵染的靶器官，該病毒不僅直接引起雛雞發(fā)病，發(fā)病率近100％，死亡率20-30％，而且雛雞發(fā)病后可以導(dǎo)致長期嚴(yán)重的免疫抑制，大大增加了繼發(fā)感染的概率，是目前世界養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。目前一般采用注射IBDV疫苗來預(yù)防和控制IBDV感染，較廣泛使用的IBDV疫苗有雞法氏囊弱毒疫苗和雞法氏囊油乳劑滅活苗(閻繼業(yè)主編，畜禽藥物手冊，第二版，金盾出版社，1997，646-648)，前者是采取感染雞法氏囊病毒合格的雞胚和雞胚液加佐劑制成，后者則是發(fā)病雞的法氏囊磨碎后加入保護(hù)劑而成。
由于IBDV抗原變異快、血清亞型多等因素的影響，目前的弱毒疫苗在安全性和免疫效果上變化很大(彭發(fā)泉，中國畜禽傳染病，1995，355-58)。油乳劑滅活苗免疫效果較好，但病雞法氏囊來源少，成本高。用不同基因工程方法制備的IBDV疫苗可靠性和免疫效率變化也很大，而且成本較高，周期較長，目前還難以推廣應(yīng)用(姜平，蔡寶祥，中國獸醫(yī)雜志，1996，2253-54)。高壓力技術(shù)是研究生物體系的有效工具之一，同時在生物技術(shù)中顯示出很高的應(yīng)用價值(Heremans K.ed.，High PressureResearch in the Bioscience and Biotechnology，Leuven University Press，1997)。利用高壓力技術(shù)制備IBDV疫苗至今尚未見報導(dǎo)。病毒一般是由蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)成的大分子復(fù)合物，其外殼蛋白包含多個亞基，如同寡聚蛋白在高壓力下會解離并發(fā)生構(gòu)象漂移，在一定的高壓力范圍內(nèi)病毒外殼蛋白亞基也可能解離并發(fā)生更加復(fù)雜的變化，降低壓力后病毒難以恢復(fù)天然狀態(tài)，從而影響到病毒的感染性，另一方面表面抗原(外殼蛋白亞基)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象又可能不改變，因此免疫原性不受高壓力影響(Ruan K.and Weber G.，Biochemistry，1989，282144-2153；Silva J.L.et al.，Current Opinion in Srtuctural Biology，1996，6166-175)。病毒在高壓力下的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化雖然已有文獻(xiàn)報導(dǎo)，但本發(fā)明首次將理論與實(shí)踐相結(jié)合，制備出了安全、高效的雞傳染性法氏囊病病毒疫苗。
本發(fā)明的目的是提供一種安全、高效的雞傳染性法氏囊病病毒疫苗，該疫苗對雛雞具有很好的免疫保護(hù)作用，它是利用高壓力技術(shù)處理天然IBDV原材料制得，能夠廣泛用于預(yù)防和控制雞傳染性法氏囊病。
本發(fā)明是利用高壓力(high hydrostatic pressure)技術(shù)制備得到的雞傳染性法氏囊病病毒疫苗。該高壓力疫苗經(jīng)感染性和免疫性能測試證實(shí)具有安全、穩(wěn)定和高效免疫保護(hù)等特性。
本發(fā)明中IBDV疫苗的高壓力制備方法可通過三種方法取得制備疫苗的IBDV原材料1.IBDV強(qiáng)毒接種雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖，經(jīng)反復(fù)凍融、離心得到病毒培養(yǎng)液；2.將IBDV強(qiáng)毒接種雞胚絨毛尿囊膜進(jìn)行增殖，收獲絨毛尿囊膜及尿囊液，經(jīng)勻漿、離心等步驟得到病毒溶液；3.發(fā)病雞法氏囊體經(jīng)勻漿、生理鹽水稀釋、反復(fù)凍融、離心等步驟后得到病毒溶液。高壓力設(shè)備是根據(jù)Paladini和Weber的設(shè)計(jì)(Paladini A.A.and Weber G.，Rev.Sci.Instrum.，52419-427，1981)制造而成，該設(shè)備主要由高壓力容器和壓力發(fā)生器組成，使用液體(水、油、乙醇等)為壓力傳送介質(zhì)。首先將原材料無氣泡密封于耐壓的塑料管中(如聚乙烯塑料管)，然后置入高壓力容器，并與壓力發(fā)生器連接。選擇適當(dāng)?shù)膲毫?800-6000大氣壓)、溫度(0-25℃)及時間(20分鐘-6小時)，將原材料進(jìn)行處理，取出后即成為高壓力IBDV疫苗，無需其它后處理過程。壓力、溫度、時間等條件的選擇對于高壓力IBDV疫苗的制備十分重要。IBDV疫苗的高壓力制備方法簡便，周期短，可針對不同血清亞型的IBDV病毒較快地制得相應(yīng)的疫苗產(chǎn)品。
高壓力IBDV疫苗的感染性測試采用雞胚成纖維細(xì)胞、SPF(specificpacigen free)雞胚和SPF雛雞為模型，分別測定高壓力IBDV疫苗的細(xì)胞半致死量TCID50、雞胚致死率和雛雞致死率及發(fā)病狀況。測試結(jié)果顯示高壓力疫苗不導(dǎo)致細(xì)胞病變，雞胚致死率和雛雞致死率均為零，且雛雞無一發(fā)病，說明該高壓力疫苗已失去感染性。免疫性能測試以SPF雛雞為模型，肌肉注射高壓力IBDV疫苗進(jìn)行免疫，并做非免疫對照，天然IBDV強(qiáng)毒擦肛攻毒，計(jì)算保護(hù)率；對所有試驗(yàn)雞進(jìn)行病理解剖，觀察是否有IBDV感染發(fā)病的典型癥狀(大腿和胸部肌肉出血，法氏囊出血水腫，肌胃和腺胃交界出血)；用瓊脂糖抗原抗體雙擴(kuò)散方法跟蹤免疫后雛雞血清中IBDV中和抗體水平變化(用瓊擴(kuò)價表示)。測試結(jié)果表明非免疫雛雞攻毒后有高死亡率且全部具有典型發(fā)病癥狀，而高壓力疫苗免疫雛雞無一死亡，也無任何發(fā)病癥狀，且免疫雛雞血清IBDV中和抗體效價很高，說明該高壓力疫苗完全可以達(dá)到免疫保護(hù)雛雞的目的。此外，用本發(fā)明的高壓力技術(shù)制備的不同IBDV毒株的疫苗都具有上述特點(diǎn)。
本發(fā)明的高壓力IBDV疫苗具有安全、穩(wěn)定和高效免疫保護(hù)的特點(diǎn)，制備過程簡單，在-20℃可保存半年以上，免疫使用劑量僅需0.2毫升/只雛雞，免疫保護(hù)時間至少可達(dá)60天，可以廣泛用作預(yù)防和控制雞傳染性法氏囊病的藥物。
本發(fā)明利用高壓力技術(shù)制備得到IBDV疫苗，該疫苗可以有效地誘發(fā)雛雞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高效價的中和抗體，達(dá)到保護(hù)的目的，且產(chǎn)品穩(wěn)定性好，不會引起雛雞發(fā)病；與傳統(tǒng)方法制備的疫苗相比，高壓力疫苗完全采用物理方法制備而無化學(xué)試劑(如甲醛等)參與，尚未觀察到任何副作用。高壓力處理過程操作簡便，針對IBDV血清亞型多、抗原變異快的特點(diǎn)，只要能得到足夠量的天然病毒即可較快地得到相應(yīng)的疫苗產(chǎn)品，此外利用高壓力技術(shù)生產(chǎn)疫苗周期短，成本較低。高壓力疫苗可廣泛用于預(yù)防和控制雞傳染性法氏囊病。
由于高壓力技術(shù)適用于IBDV所有血清亞型，下面以IBDVNM和LH毒株為例對本發(fā)明的技術(shù)特征作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1.用高壓力方法制備IBDV疫苗(細(xì)胞增殖病毒)按常規(guī)方法(戴華生等編著，新實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)，中國學(xué)術(shù)出版社，1983，108)用雞胚成纖維細(xì)胞增殖IBDV NM毒株，收獲的培養(yǎng)液在-20℃和25℃凍融3次、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘去沉淀，所得含病毒上清液作為原材料，將此材料無氣泡密封于塑料管中并置入高壓力容器，與壓力發(fā)生器相連，以乙醇為壓力傳送介質(zhì)。本例中所采用的處理?xiàng)l件為800大氣壓、10℃、6小時，經(jīng)處理即得到高壓力IBDV疫苗。
實(shí)施例2.用高壓力方法制備IBDV疫苗(雞胚增殖病毒)按常規(guī)方法(黃禎祥主編，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科技出版社，1990，124)經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種IBDV NM毒株進(jìn)行增殖(每個雞胚接種0.1毫升種毒)，收獲的絨毛尿囊膜和尿囊液經(jīng)勻漿、-20℃和25℃凍融3次、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘去沉淀，所得含病毒上清液作為原材料，將此材料無氣泡密封于塑料管中并置入高壓容器，與壓力發(fā)生器相連，以乙醇為壓力傳送介質(zhì)。本例中所采用的處理?xiàng)l件為6000大氣壓、25℃、20分鐘，經(jīng)處理即得到高壓力IBDV疫苗。
實(shí)施例3.用高壓力方法制備IBDV疫苗(法氏囊病毒)采集感染IBDV LH毒株并已發(fā)病的雞的法氏囊，勻漿，用生理鹽水10倍(V/V)稀釋、-20℃和25℃凍融3次、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘去沉淀，所得含病毒上清液作為原材料，將此材料無氣泡密封于塑料管中并置入高壓容器，與壓力發(fā)生器相連，以乙醇為壓力傳送介質(zhì)。本例中所采用的處理?xiàng)l件為3000大氣壓、0℃、3小時，經(jīng)處理即得到IBDV高壓疫苗。
實(shí)施例4.高壓力方法制備的IBDV疫苗(見實(shí)施例1)感染性測定按常規(guī)方法(戴華生等編著，新實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)，中國學(xué)術(shù)出版社，1983，30，113)測定并計(jì)算實(shí)施例1中的高壓力IBDV疫苗和天然IBDV對照對于雞胚成纖維細(xì)胞的半致死量(TCID50)。測定結(jié)果天然IBDV對照的TCID50值達(dá)10-6，有較高的感染性，而高壓力IBDV疫苗不導(dǎo)致雞胚成纖維細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變，即失去了雞胚成纖維細(xì)胞感染活性。
實(shí)施例5.高壓力方法制備的IBDV疫苗(見實(shí)施例2)感染性測定將實(shí)施例2中的高壓力IBDV疫苗和天然IBDV對照分別接種(腿部肌肉注射)7日齡SPF雛雞5只，每只0.8毫升，逐日觀察雛雞死亡情況。測定結(jié)果7日內(nèi)對照組5只雞全部死亡，病理解剖表明有典型發(fā)病癥狀(如前所述)，而疫苗組5只雞無一死亡，且無發(fā)病癥狀，這說明該高壓力疫苗無致病性。
實(shí)施例6.高壓力方法制備的IBDV疫苗(見實(shí)施例3)感染性測定按常規(guī)方法(黃禎祥主編，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科技出版社，1990，124)將實(shí)施例3的高壓力IBDV疫苗和天然IBDV對照分別接種SPF雞胚絨毛尿囊膜(每個雞胚接種0.1毫升)，每組5只雞胚，每只雞胚接種0.1毫升，逐日觀察雞胚死亡情況。測定結(jié)果7天內(nèi)對照組5只雞胚全部死亡，而高壓疫苗組5只雞胚無一死亡，說明該疫苗無雞胚感染活性。
實(shí)施例7.高壓力方法制備的IBDV疫苗(見實(shí)施例2)免疫性能測定以實(shí)施例2中IBDV疫苗為例測定高壓力疫苗的免疫性能。7日齡SPF雛雞10只分為二組非免疫對照組和高壓力IBDV疫苗免疫組各5只，免疫組每只雞腿部肌肉注射0.8毫升高壓力IBDV疫苗進(jìn)行免疫，對照組每只雞注射等量的生理鹽水。15日后以天然IBDV強(qiáng)毒株擦肛攻毒，觀察雛雞發(fā)病和死亡情況。測定結(jié)果60小時內(nèi)對照組5只雛雞全部死亡，且有明顯發(fā)病癥狀(如前所述)，而高壓力IBDV疫苗免疫組5只雞無一死亡，僅有1只雞有輕微發(fā)病癥狀(大腿肌肉輕度出血)。本結(jié)果說明本發(fā)明的高壓力IBDV疫苗有比較好的免疫保護(hù)作用。
實(shí)施例8.高壓力方法制備的IBDV疫苗(見實(shí)施例3)免疫性能測定以實(shí)施例3的IBDV疫苗為例測定高壓力疫苗的免疫性能。17日齡SPF雛雞18只分為二組非免疫對照組6只，高壓力IBDV疫苗免疫組12只，免疫組雞腿部肌肉注射高壓力IBDV疫苗進(jìn)行免疫，每只0.2毫升，同時對照組注射等量生理鹽水，免疫40天后以天然IBDV強(qiáng)毒擦肛攻毒。測定結(jié)果非免疫對照組6只雞在4天內(nèi)死亡5只，死亡率為83％，而高壓力IBDV疫苗免疫組12只雞全部存活；病理解剖表明對照組6只雞100％有典型發(fā)病癥狀(如前所述)，而免疫組12只雞無一出現(xiàn)發(fā)病癥狀。免疫后血清IBDV中和抗體水平變化用瓊脂糖抗原抗體雙擴(kuò)散試驗(yàn)測定(1.2％瓊脂糖)(黃禎祥主編，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科技出版社，1990，182-183)，免疫后第二周血清IBDV中和抗體效價即達(dá)1∶8，第四周血清抗體效價可達(dá)到1∶64，這說明本發(fā)明的高壓力IBDV疫苗確能有效誘導(dǎo)血清IBDV抗體產(chǎn)生，達(dá)到免疫保護(hù)的目的。
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性法氏囊病病毒疫苗，其特征在于它是采用高壓力技術(shù)處理天然雞傳染性法氏囊病病毒原材料制得的病毒疫苗。
2.按權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒疫苗的制備方法，其特征在于是將天然雞傳染性法氏囊病病毒原材料置入高壓力設(shè)備中處理，壓力為800-6000大氣壓，溫度為0-25℃，時間為20分鐘-6小時。
3.按權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒疫苗的應(yīng)用，其特征在于該病毒疫苗可用作預(yù)防和控制雞傳染性法氏囊病的藥物。
全文摘要
一種雞傳染性法氏囊病病毒疫苗、高壓力制備方法及應(yīng)用。采用高壓力技術(shù)制備得到IBDV疫苗,可以穩(wěn)定有效地誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生高效的中和抗體,達(dá)到免疫保護(hù)的目的,且高壓力疫苗本身無致病性和副作用。高壓力技術(shù)生產(chǎn)過程簡單,周期短,成本低,對于不同病毒血清亞型可以很快得到相應(yīng)的疫苗產(chǎn)品。高壓力疫苗可廣泛用作預(yù)防和控制雞傳染性法氏囊病的藥物。
文檔編號A61P31/14GK1247090SQ98111059
公開日2000年3月15日 申請日期1998年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月4日
發(fā)明者阮康成, 錢建飛, 田少敏, 邵國青, 唐國慶, 毛洪先 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所