專利名稱：氨基酸組合物及其在免疫抑制中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甘氨酸在制備藥物或營養(yǎng)制劑中的用途，該藥物或營養(yǎng)制劑可以對患者給藥以預防和/或治療由屬于環(huán)孢菌素和/或子囊霉素類物質誘發(fā)的腎功能障礙。
環(huán)孢菌素類包括一類結構上截然不同的、環(huán)狀、多N-甲基化的十一肽，通常各自或多或少具有免疫抑制、抗炎、抗病毒和/或抗寄生蟲活性。第一個被鑒定的環(huán)孢菌素類是真菌代謝產物環(huán)孢菌素A，或環(huán)孢素，其結構由《默克索引》第11版給出；Merck&Co.,Inc.；Rahway,新澤西，美國(1989)，見第2759表。后來被鑒定出來的環(huán)孢菌素是環(huán)孢菌素B、C、D和G，它們也列在《默克索引》第2759表中。大量合成的類似物也是已知的，其中具有代表性的實例公開在EP296123、EP 484281和GB 2222770中。環(huán)孢菌素A及其結構上相似的類似物和衍生物以及其代謝產物在本說明書中一般被稱為“環(huán)孢菌素類”。
子囊霉素是另一類通常的免疫抑制物質，也被稱為大環(huán)內酯免疫抑制劑，其中FK-506是最有名的。FK-506是一種由第9993號Streptomyces tsukubaensis產生的大環(huán)內酯免疫抑制劑。在《默克索引》(同上)的附錄第A5項中給出了FK-506的結構。保留了FK-506的基本結構和免疫學性質的大量相關化合物也是已知的。這些化合物公開在各種出版物中，例如EP 184162、EP 315973、EP 323042、EP423714、EP 427680、EP 465426、EP 474126、WO 91/13889、WO 91/19495、EP 484935、EP 532088、EP 532089、WO 93/5059等等。本說明書中，把子囊霉素、FK-506及其結構上相似的類似物和衍生物以及其代謝產物共同稱為“子囊霉素類”。
由于具有極為有用的藥學性質，環(huán)孢菌素類(特別是環(huán)孢菌素A和G)和子囊霉素類(例如FK-506)具有廣泛的應用，例如用于預防移植排斥反應，用于治療自體免疫疾病，如類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬，還用于治療多發(fā)耐藥性。環(huán)孢菌素類和子囊霉素類也具有一定副作用，最為顯著的是腎功能障礙，特別是腎毒性，尤其是在高劑量的情況下。腎毒性的特征在于腎血流量減少和腎小球濾過作用降低，使血清肌酸酐、堿性磷酸酶和尿素相應升高，以及近基細胞溶脹與壞死和巨噬細胞浸潤。某些研究顯示，缺氧頗具選擇性地損傷近端小管，而血流量的降低可能導致缺氧。在該病理學中已經提出的證據涉及細胞內的鈣，鈣通道阻斷劑在使損傷降至最小上是有效的。不過，Ca++通道阻斷劑不可能不產生損害。因此，針對對腎的這一重要副作用，目前尚沒有已知的有用的療法。
現在令人驚奇的發(fā)現，甘氨酸適合預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙。
按照本發(fā)明，更具體的發(fā)現是，食物中的甘氨酸抑制和/或改善長期環(huán)孢菌素A給藥所帶來的主要副作用之一-腎毒性。甘氨酸防止腎小球濾過率降低。甘氨酸也防止血清肌酸酐和尿素升高，并趨于使由環(huán)孢菌素A引起的堿性磷酸酶升高降至最小。食物中的甘氨酸還都防止了近端小管的溶脹與壞死和巨噬細胞的浸潤。因此，顯然，甘氨酸對由環(huán)孢菌素A引起的腎毒性具有重要的保護作用。
有鑒于上述作用，存在含有甘氨酸的藥物和/或營養(yǎng)制劑，以及使用甘氨酸的方法。為了用在本發(fā)明的藥物、營養(yǎng)制劑和方法中，甘氨酸宜以游離氨基酸的形式(相對鹽形式而言)、甘氨酸前體-特別是丙氨酸或絲氨酸(L-丙氨酸、L-絲氨酸)-的形式被使用，后者同樣以游離氨基酸形式、所述氨基酸的生理學上可接受的鹽形式、或所述氨基酸和/或其生理學上可接受的鹽的混合物形式被使用。甘氨酸優(yōu)選以游離氨基酸形式(相對鹽形式而言)、生理學上可接受的鹽形式或以游離氨基酸形式的甘氨酸與生理學上可接受的鹽形式的甘氨酸的混合物形式被使用；最優(yōu)選地，甘氨酸是游離氨基酸的形式。按照本發(fā)明，甘氨酸也可以二肽形式使用。
本發(fā)明因此提供了甘氨酸在制備藥物或營養(yǎng)制劑中的用途，該藥物或營養(yǎng)制劑用于由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的預防和/或治療。
本發(fā)明進一步提供了一種用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的方法，該方法包括在用一種環(huán)孢菌素或子囊霉素治療之前、同時或之后對人或其他哺乳動物給予一種含有甘氨酸的藥物或營養(yǎng)制劑，甘氨酸的含量能有效抑制和/或改善腎功能障礙。
本發(fā)明更進一步提供了一種含有甘氨酸的、用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的藥物或營養(yǎng)制劑。
本發(fā)明還提供了一種含有治療有效量的環(huán)孢菌素或子囊霉素并結合甘氨酸的藥物或營養(yǎng)制劑，甘氨酸的含量能有效抑制和/或改善由該環(huán)孢菌素或子囊霉素誘發(fā)的腎功能障礙。
甘氨酸在預防和/或治療腎功能障礙腎毒性上是特別有用的。
特別地，甘氨酸進一步可用于治療和/或預防由環(huán)孢菌素類中的環(huán)孢菌素A(環(huán)孢素)和PSC 833([3’-脫氧-3’-氧代-MeBmt]1[Val]2-環(huán)孢素，例如EP 296122中所述)、特別是由環(huán)孢菌素A誘發(fā)的腎功能障礙。
甘氨酸也特別可用于治療和/或預防由子囊霉素FK-506和ASM(33-表-氯-33-脫氧-子囊霉素，例如EP 427680的實施例66a中所述)、特別是由FK-506誘發(fā)的腎功能障礙。
而且，甘氨酸特別可用于預防和/或治療由免疫抑制性環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙。
營養(yǎng)制劑或藥物可以對患者腸內給藥或胃腸外給藥。腸內給藥途徑是優(yōu)選的。特別預期的腸內給藥途徑是口服給藥和/或管飼法。藥物或制劑宜以含水液體的形式給藥。適合于腸內用藥形式的藥物或制劑因此優(yōu)選為含水形式或粉末形式，其中該粉末在使用前宜加入到水中。對于在管飼法中的用途來說，加水量尤其取決于患者對流體的需要和狀況。對急性治療來說，胃腸外用藥途徑是優(yōu)選的。
藥物或制劑可以配制成以每24小時釋放給患者1至80g、優(yōu)選為10至60g、特別優(yōu)選為15至30g的甘氨酸。藥物或制劑的給藥量在很大程度上取決于患者的特殊需要。甘氨酸的這種每日劑量適合所需效果的治療以及適合預防/預處理。含有甘氨酸的藥物或制劑對患者的給藥量可以是使患者血漿中的甘氨酸濃度升高至0.5與2.0mM之間、優(yōu)選為1.0至2.0mM。盡管較之更高的濃度是可以預料得到的，但預期如果提高該酸的濃度，由于制劑或藥物的給藥將獲得顯著的臨床效果，因此在1.2至1.5mM的范圍內。在外傷性、分解代謝過度的患者中，使血漿甘氨酸、絲氨酸或丙氨酸水平升高至對應于健康個體血漿甘氨酸水平的約0.2至0.3mM甚至是有益的。
優(yōu)選地，藥物或營養(yǎng)制劑僅含有甘氨酸以及任意性可有可無的L-精氨酸或L-鳥氨酸作為游離氨基酸(相對蛋白結合或肽結合氨基酸而言)。
若甘氨酸是以藥物的形式給藥，這樣的藥物每100g將含有0.1至99g的甘氨酸。
一般來說，若甘氨酸是以營養(yǎng)制劑的形式給藥，可取得有利的效果，根據情況，該營養(yǎng)制劑可以是一種全配方食物(即，基本上供應所有必需的能量、氨基酸、維生素、礦物質和微量元素的食物)或一種食物補充劑(dietary supplement)。食物補充劑一般提供總的每日熱量攝取量的5至20％，優(yōu)選約為10％。營養(yǎng)制劑方便的是采取含水液體的形式。營養(yǎng)制劑因此可含有碳水化合物、類脂脂肪(脂肪來源)和/或蛋白質(氮源)來源，和甘氨酸，其特征在于甘氨酸在該配方食物中的含量約為0.2至60g/100g配方干重，優(yōu)選為5至45g、特別優(yōu)選為7.5至30g/100g干重。營養(yǎng)制劑優(yōu)選進一步含有其他營養(yǎng)學上有利的成分，例如維生素、礦物質、微量元素、纖維(優(yōu)選為可溶性纖維)。碳水化合物的量在0-85重量％范圍內、優(yōu)選為25至75重量％，脂肪的量在0-30重量％范圍內，蛋白質的量在0-75重量％范圍內、優(yōu)選為15至65％。優(yōu)選的營養(yǎng)制劑含有下列成分基本上由甘氨酸和碳水化合物組成的食物補充劑，基本上由甘氨酸、碳水化合物和蛋白質組成的食物補充劑和/或基本上由甘氨酸、碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素、礦物質、微量元素和任意性可有可無的纖維組成的全配方食物。這樣的食物補充劑或全配方食物優(yōu)選進一步含有L-精氨酸或其他生理學上可接受的、與氧化氮的合成有關的化合物，例如L-鳥氨酸或甘油，其中L-精氨酸是優(yōu)選的。
適合的氮源實例包括營養(yǎng)學上可接受的蛋白質，例如衍生于大豆或牛乳的蛋白質，如乳清、酪蛋白酸鹽或脫脂奶粉，和/或其蛋白質水解產物。適合的碳水化合物源包括所有的糖、麥芽糖糊精和淀粉。適合的脂肪源實例包括甘油三酯，以及甘油二酯和甘油一酯。
適合加入本發(fā)明藥物或制劑中的維生素實例包括營養(yǎng)學上可接受形式的維生素E、維生素A、維生素D、維生素K、葉酸、硫胺素、核黃素、維生素B1、B2、B6及B12、煙酸、生物素和泛酸。
適合加入本發(fā)明藥物或制劑中的礦質元素和微量元素實例包括營養(yǎng)學上可接受形式的鈉、鉀、鈣、亞磷、鎂、錳、銅、鋅、鐵、硒、鉻和鉬。
藥物或制劑特別優(yōu)選含有營養(yǎng)學上可接受形式的β-胡蘿卜素(維生素A)、維生素E、維生素C、硫胺素、維生素B12、膽堿、硒和鋅。
本文所用的術語“可溶性纖維”指能夠在結腸中發(fā)生顯著發(fā)酵作用、最終產生短鏈脂肪酸的纖維。適合的可溶性纖維實例包括未水解或水解的果膠、瓜爾膠、刺槐豆膠、黃原膠。對成年人來說，每天可溶性纖維的總量宜在3至30g范圍內。
可以如下所示將甘氨酸與一種或多種下列成分結合使用(ⅰ)ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)，如果需要的話混有ω-6 PUFA；(ⅱ)L-精氨酸或其他生理學上可接受的、與氧化氮的合成有關的化合物，或其混合物；和(ⅲ)一種核堿基(nucleobase)源。
其中優(yōu)選使用含有甘氨酸并結合精氨酸或其他生理學上可接受的、與聚胺的合成有關的化合物-例如鳥氨酸-的藥物或營養(yǎng)制劑。也優(yōu)選使用含有甘氨酸、精氨酸或鳥氨酸和ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)的藥物或營養(yǎng)制劑。
適用于與甘氨酸結合使用的核堿基源包括或由天然核堿基、核苷、核苷酸、RNA、DNA、其等價物和/或含有一種或多種這些化合物的混合物組成。
天然核堿基包括嘌呤類的腺嘌呤和鳥嘌呤，以及嘧啶類的胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。若核堿基源是游離核堿基的形式，優(yōu)選其為尿嘧啶。
天然核苷包括核糖核苷類的腺苷、鳥苷、尿苷和胞苷，和脫氧核糖核苷類的脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。
天然核苷酸包括天然核苷的磷酸酯，例如一磷酸腺苷(AMP)、一磷酸鳥苷(GMP)、一磷酸尿苷(UMP)、一磷酸胞苷(CMP)、一磷酸脫氧胸苷(dTMP)、一磷酸脫氧胞苷(dCMP)，和天然核苷的二磷酸酯與三磷酸酯，例如ADP與ATP。
精制過的核堿基源、例如酵母是優(yōu)選的。不過，可以使用其他來源，例如肉類等。核堿基源優(yōu)選為RNA。
因此，本發(fā)明提供了藥物或營養(yǎng)制劑，含有有效量的(a)甘氨酸((a)成分)，結合一種或多種選自如下的成分(b)ω-3 PUFA，如果需要的話，與ω-6 PUFA混合((b)成分)；(c)L-精氨酸或其他生理學上可接受的、與氧化氮的合成有關的化合物，或它們的混合物((c)成分)；和(d)一種核堿基源((d)成分)。
劑量應當使藥物或營養(yǎng)制劑有效預防和/或治療由大環(huán)內酯免疫抑制藥物誘發(fā)的腎毒性。
每單位劑量該藥物或營養(yǎng)制劑優(yōu)選含有1.5至80重量份的(a)成分并結合下列含量的一種或多種選自(b)至(d)的成分0.1至20重量份的(b)成分、3至40重量份的(c)成分和0.1至4.0重量份的(d)成分。特別優(yōu)選的每單位劑量含有1.5至80重量份的(a)成分并結合下列含量的一種或多種選自(b)至(d)的成分2至5重量份的(b)成分、7.5至20重量份的(c)成分和1.7至2.0重量份的(d)成分。
(a)成分至(d)成分的每日給藥量宜相應為1.5至80g的(a)成分，0.1至20g、優(yōu)選為2至5g的(b)成分，3至40g、優(yōu)選為7.5至20g的(c)成分，和0.1至4.0g、優(yōu)選為1.7至2.0g的(d)成分。
關于(d)成分，上述劑量是用來表示RNA、DNA、核苷或核苷酸的。對核堿基來說，一重量單位的核堿基被認為是相當于2.5至3.0重量單位的RNA、DNA、核苷或核苷酸。
如果所用的是含有甘氨酸并結合一種或多種上述(b)、(c)和(d)成分的藥物或營養(yǎng)制劑，那么該藥物或營養(yǎng)制劑宜在一單位劑量中含有(a)1.5至80重量份的甘氨酸，結合一種或多種選自如下的化合物(b)2至5重量份的ω-3多不飽和脂肪酸；(c)7.5至20重量份的L-精氨酸、L-鳥氨酸或甘油，或它們的混合物；和(d)1.7至2.0重量份的RNA。
優(yōu)選的藥物或營養(yǎng)制劑在一單位劑量中含有(a)1.5至80重量份的甘氨酸，結合(c)3至40重量份、優(yōu)選為7.5至20重量份的精氨酸或等量的一種或多種其他生理學上可接受的、與聚胺合成有關的化合物，或等量的精氨酸與該化合物的混合物。
更優(yōu)選地，本發(fā)明藥物或營養(yǎng)制劑含有(a)成分并結合(c)成分，其重量比為1∶2至4∶1，特別優(yōu)選的重量比為1∶1至2∶1。
進一步優(yōu)選的藥物或營養(yǎng)制劑在一單位劑量中含有(a)1.5至80重量份的甘氨酸，結合(b)0.1至20重量份、優(yōu)選為2至5重量份的ω-3 PUFA；和(c)3至40重量份、優(yōu)選為7.5至20重量份的精氨酸或等量的一種或多種其他生理學上可接受的、與聚胺合成有關的化合物，或等量的精氨酸與該化合物的混合物。
宜將ω-3 PUFA保護起來，以防止在制劑的貯藏過程中發(fā)生過氧化作用。
保護ω-3 PUFA在貯藏過程中不發(fā)生過氧化作用的生理學上可接受的方法是本領域所已知的。它們包括生理學上可接受的ω-3 PUFA的微囊包封和生理學上可接受的抗氧化劑的使用，其用量足以保護脂肪酸。
一個典型的適用作生理學上可接受的微囊包封劑實例是淀粉。微囊包封可以按照本身已知的方法進行。包封微囊可以按照本身已知的方法包衣，使用生理學上可接受的包衣劑，例如阿拉伯膠。
典型的適合于保護脂肪酸不發(fā)生過氧化作用的抗氧化劑實例包括維生素類抗氧化劑，例如維生素C、維生素E或其混合物。
抗氧化劑的加入量應當足以防止ω-3 PUFA的過氧化作用。該加入量能夠容易計算出來。一般來說，為方便起見，任何用來防止過氧化的抗氧化劑都過量使用。應理解的是，任何其他與ω-3 PUFA組合給藥的試劑的存在都需要對抗氧化劑的用量進行調整。
所用的ω-3 PUFA可以適合生理學供應ω-3 PUFA的形式，例如游離酸形式、甘油三酯形式、或生理學上可接受的ω-3 PUFA的天然來源形式使用。該天然來源包括亞麻子油和魚油，魚油例如油鯡油、鮭魚油、鯖魚油、金槍魚油、鱈魚肝油和鳀魚油。所述天然來源-特別是魚油-含有大量的ω-3脂肪酸。如果所用的ω-3 PUFA是甘油三酯的形式，那么所述甘油三酯可以含有其他生理學上可接受的脂肪酸的酯。優(yōu)選的ω-3 PUFA包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，它們?yōu)橛坞x酸形式、甘油三酯形式或具有高EPA和/或DHA含量的天然來源形式。
應當理解的是，ω-3 PUFA可以以高于如上所示的劑量給藥，而且該更高的劑量一般不會削弱所需效果或引起不希望的副作用。
特別適用作本發(fā)明制劑中(c)成分的化合物包括L-精氨酸、甘油或L-鳥氨酸，最優(yōu)選為L-精氨酸。所用(c)成分可以是游離形式、生理學上可接受的鹽形式、或小肽形式，其中鹽形式例如與磷酸、檸檬酸、酒石酸、富馬酸、己二酸或乳酸形成的鹽形式。優(yōu)選使用游離形式的L-精氨酸。
這里所用的術語小肽指具有2至6、優(yōu)選為2至4個氨基酸的肽。
正如已經說明過的，ω-3 PUFA宜以被保護的或未被保護以抗過氧化作用的魚油的形式給藥。該魚油還含有ω-6 PUFA。
ω-6 PUFA對免疫應答和抗外科手術感染也具有良好的效果。因此，本發(fā)明食物宜進一步含有ω-6 PUFA。
對本發(fā)明而言，ω-6 PUFA可以是游離酸形式或適合生理學供應ω-6PUFA的形式，例如甘油三酯的形式。按照本發(fā)明，特別適用的ω-6PUFA實例包括亞油酸和花生四烯酸，其中亞油酸是最優(yōu)選的。適合的ω-6 PUFA來源實例是本領域中已知的。它們包括魚油和植物油。具有高亞油酸含量的ω-6 PUFA來源實例是例如紅花油、向日葵油、豆油、棉油和玉米油。
ω-6 PUFA的每日給藥量在1.5至5.0g范圍內一般足以獲得良好的效果。一單位劑量如上定義的藥物或營養(yǎng)制劑因此可以進一步含有1.5至5重量份的ω-6 PUFA。
除了(b)成分、(c)成分、(d)成分和ω-6 PUFA以外，向本發(fā)明食物中可以加入其他成分，并且這些其他成分可對甘氨酸的活性具有有益效果。該有利成分的一個實例為ω-9 PUFA。該脂肪酸混合物的一個優(yōu)選的天然來源為魚油。由于味道和其他原因，口服用藥形式的魚油優(yōu)選以包封的劑型使用。
如果本發(fā)明的營養(yǎng)制劑是打算用作食物補充劑的話，那么由它所供應的能量不應當過量，以避免不必要地抑制患者的食欲。補充劑所含有的能量來源量宜為供應150至1000千卡/天的量，優(yōu)選為250至500千卡/天。氮源、碳水化合物來源和類脂來源對每日總熱量的貢獻可以在較寬范圍內變化。對于作為補充劑的用途來說，可以以粉末或液體的形式給藥。
治療周期與用免疫抑制藥物的治療相符合。
食物補充劑的給藥形式宜為適合每天1至4次補充劑給藥的單位劑量形式。如果營養(yǎng)制劑含有能量來源，不供應超過1000千卡/天是適當的。除了該關于能量供應的限制以外，用于預防和/或治療由大環(huán)內酯免疫抑制藥物誘發(fā)的腎毒性的營養(yǎng)制劑可以并且適宜以如上所述的配方食物或食物補充劑形式供應。
典型的藥理學上可接受的口服給藥制劑形式(藥物)進一步含有藥理學上可接受的、適合加入該制劑中的稀釋劑、載體、維生素、香料、色素和/或其他熟練技術人員熟知的助劑，和任意性可有可無的一種大環(huán)內酯免疫抑制藥物。
本發(fā)明的食物和制劑可以按照本身已知的方法得到，例如混合各組分。
通過下列實施例進一步對本發(fā)明進行舉例說明，這些實施例不是要以任何方式限制所要求保護的發(fā)明的范圍。
實施例1動物和食物給重約200g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Sasco)飼喂人造粉化食物三天，食物含有5％甘氨酸和15％酪蛋白(甘氨酸)或20％酪蛋白(對照)，然后開始環(huán)孢菌素A治療。粉化食物的成分如表1所示。所有動物均按照制定的準則給以人道上的照管。在預飼喂階段后，每天用口管飼法給以環(huán)孢菌素A(25mg/kg，以2.5mg/ml溶于橄欖油中)或賦型劑，給藥約4周。研究了四組動物(對照、甘氨酸、環(huán)孢菌素+對照、環(huán)孢菌素+甘氨酸)，每組6-8只大鼠。每天測量動物體重和食物消耗量。
表1對照與甘氨酸食物的組成％成分 對照甘氨酸酪蛋白20.0 15.0甘氨酸0.0 5.0蔗糖 50.0 50.0玉米油5.0 5.0纖維素5.0 5.0礦物質混合物 3.5 3.5維生素混合物 1.0 1.0DL-蛋氨酸 0.3 0.3膽堿酒石酸氫鹽0.2 0.2玉米淀粉 15.0 15.0
腎小球濾過率與臨床化學將動物置于代謝籠中48-72小時后處死，收集24小時尿樣，并從尾靜脈取0.5ml血，用于血肌酸酐測量。處死當天，另從腔靜脈取1ml血，并用等體積的林格氏乳酸鹽溶液代替。用希格瑪試劑盒測量血清尿素(Coulombe,J.J.和L.Favreau.1963.“一種新的用于比色檢測尿素的簡單半微量法”，《臨床化學》9:102-108)和肌酸酐(Heinegard,D.和G.Tiderstrom.1973.“直接比色法檢測血清肌酸酐”，《臨床化學學報》43:305-310)以及尿肌酸酐，同時用酶學方法測量血清堿性磷酸酶(環(huán)孢菌素A治療約4周后收集血樣)。由肌酸酐在尿/血中之比計算腎小球濾過率(Laiken,N.D.和D.D.Fanestil.1985.《醫(yī)療實踐的生理學基礎中的濾過作用和血流量》，J.B.West，編輯，Williams&Wilkins，巴爾的摩/倫敦，461-471)，環(huán)孢菌素A治療約4周后收集尿樣。
組織學處死當天，動物用戊巴比妥(50mg/1g)麻醉，打開腹部，主動脈插24 French靜脈內注射套管，使唇部靠近腎動脈支。用夾子夾住腎動脈支上方的主動脈，并結扎腎動脈支下方的主動脈，左腎用5ml生理鹽水漂洗，用在磷酸鹽緩沖鹽水中的4％多聚甲醛溶液灌注-固定。除去腎臟，切成0.5厚切片，置于10％福爾馬林中。進行Hemtoxyllin-曙紅切片，用顯微鏡分析。在5種不同的低倍視野(100X)中計數膨脹的小管，在高倍放大率(400X)下在5種不同的小管中計數壞死的細胞和浸潤的巨噬細胞，計算平均值±SEM。
嗜中性白細胞的定量在處死當天制備腔靜脈血樣的血涂片，用Wright Giemsa染料染色。在高倍放大率(400X)下對200個白細胞進行白細胞分類計數，計算百分率。
統(tǒng)計所有統(tǒng)計使用單向方差分析(ANOVA)，然后進行Bonferonnipost-hoc檢驗。研究前選擇p＜0.05來表示顯著性。
結果臨床化學與腎小球濾過率已知環(huán)孢菌素A升高血清尿素。實際上，本研究中尿素升高了70％(表2)。甘氨酸有使該升高最小化的趨勢，不過該作用在統(tǒng)計學上是不顯著的。環(huán)孢菌素A也升高堿性磷酸酶(表2)，甘氨酸有防止該升高的趨勢。對照組和甘氨酸治療組中血清肌酸酐在0.4-0.6mg/dl范圍內(

圖1)，但是環(huán)孢菌素A顯著地使該數值加倍。該升高被甘氨酸食物完全地防止了。數值為平均值±S.E.M.(方差分析P＜0.01；每組中n=5-6)。a，與對照組相比p＜0.05；b，與環(huán)孢菌素A組相比p＜0.05。
還已知環(huán)孢菌素A降低腎小球濾過率。本研究中，環(huán)孢菌素A組的值約為對照組或單用甘氨酸組的30％(圖2)。腎小球濾過率的降低也被食物中的甘氨酸完全防止了。含有總熱量1％的甘氨酸的食物已經足以產生該作用(結果沒有表示出來)。數值為平均值±S.E.M.(方差分析P＜0.01；每組中n=5-6)。a，與對照組相比p＜0.05；b，與環(huán)孢菌素A組相比p＜0.05。還注意到，尿量發(fā)生顯著改變(對照，9.1±1.6ml/24h；甘氨酸，6.7±0.8；環(huán)孢菌素A,14.4±2.3；甘氨酸+環(huán)孢菌素A,11.8±2.1)。
表2環(huán)孢菌素A與甘氨酸食物對血清尿素與堿性磷酸酶水平的影響尿素 堿性磷酸酶(Mg/dl) (UL)對照 21.8+1.8 46.5±4.4甘氨酸20.6±2.433.1±5.6環(huán)孢菌素A 34.9±3.7a65.9±12.6環(huán)孢菌素A+甘氨酸 31.2±0.6a47.7±8.8數值為平均值±S.E.M.；a，與對照組相比，方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗的p＜0.05(每組中n=5-6)。
組織學與白細胞顯然，隨著相關白細胞的浸潤，環(huán)孢菌素A導致近端小管溶脹和壞死，對此以前已有報道。這些作用被含甘氨酸食物完全地防止了。平均來說，環(huán)孢菌素A顯著升高近端細胞溶脹和壞死以及巨噬細胞浸潤(圖3、4)。每個載片在三個不同的低倍視野(放大率100x)中計數膨脹的近端小管(圖3圖片A)，并計算平均值±S.E.M.。每個載片在高倍(400x)下計數五個不同小管的壞死細胞(圖3圖片B)(平均值±S.E.M.，方差分析的*=p＜0.05)。圖4中，每個載片在高放大率(400x)下計數5個不同小管周圍的巨噬細胞，計數是由對治療不知曉的人員對hematoxyllin-曙紅染色切片作出的，并計算平均值±S.E.M.(方差分析的*=p＜0.05)。
而且，環(huán)孢菌素A治療的大鼠血涂片中嗜中性白細胞升高了幾乎3倍(圖5)。血涂片用Wright Giemsa染料染色，進行分類細胞計數(方差分析的*=p＜0.05)。
實施例2腸內組合物下列組合物中，MM代表“礦物質混合物”，SM代表“微量元素混合物”，VM代表“維生素混合物”。這三種混合物的組成如下MM組分 g/100g麥芽糖糊精34.40檸檬酸K/磷酸K 34.60二檸檬酸鎂8.20氯化鈣8.00檸檬酸鈉/氯化鈉 9.00檸檬酸3.50酒石酸膽堿2.30
SM組分 g/100g麥芽糖糊精47.79鉬-酵母 18.00鉻-酵母 9.20硫酸鋅7.00硒-酵母 7.00硫酸鐵(Ⅱ)6.92葡糖酸銅(Ⅱ) 2.24硫酸錳(Ⅱ)1.12氟化鈉0.70碘化鉀0.03VM組分 g/100g麥芽糖糊精43.44抗壞血酸鈉35.00維生素E-Ac.50％ 16.00煙酰胺1.55乙酸維生素A 1.20D-泛酸Ca 0.98維生素K11％ 0.71維生素B120.1％ 0.30維生素D30.28維生素B60.20維生素B10.17維生素B20.15葉酸 0.02生物素0.01含有甘氨酸的組合物Ⅰ組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精12.28酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00類脂棕櫚油2.33向日葵油 0.26乳化劑Nathin E0.13100.00含有甘氨酸的組合物Ⅱ組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精10.10酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00MM2.00SM0.05VM0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油2.33向日葵油 0.26乳化劑Nathin E0.13100.00含有甘氨酸和精氨酸的組合物組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精8.93酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00精氨酸1.17MM2.00SM0.05VM0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油2.36向日葵油 0.23乳化劑Nathin E0.13100.00含有甘氨酸和魚油(ω-3脂肪酸)的組合物組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精10.10酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00MM2.00SM0.05VM0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油1.32向日葵油 0.23乳化劑Nathin E0.13魚油EPAX 3000 TG 1.04100.00含有甘氨酸和RNA的組合物組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精9.96酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00酵母提取物RNA 0.14MM2.00SM0.05VM0.10β-胡蘿卜素 0.03棕櫚油2.33向日葵油 0.26乳化劑Nathin E0.13100.00含有甘氨酸、精氨酸和魚油(ω-3脂肪酸)的組合物組分 g/100g水77.40麥芽糖糊精8.93酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸3.00精氨酸1.17MM2.00SM 0.05VM 0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油 1.32向日葵油 0.23乳化劑Nathin E 0.13魚油EPAX 3000 TG 1.04100.00含有甘氨酸、精氨酸和RNA的組合物組分 g/100g水 77.40麥芽糖糊精 8.79酪蛋白酸Na/Ca4.60甘氨酸 3.00精氨酸 1.17酵母提取物RNA0.14MM 2.00SM 0.05VM 0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油 2.33向日葵油 0.26乳化劑Nathin E 0.13100.00含有甘氨酸、RNA和魚油(ω-3脂肪酸)的組合物組分g/100g水 77.40麥芽糖糊精 9.96酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸 3.00酵母提取物RNA 0.14MM 2.00SM 0.05VM 0.10β-胡蘿卜素 0.03類脂棕櫚油 1.32向日葵油0.23乳化劑Nathin E 0.13魚油EPAX 3000 TG1.04100.00含有甘氨酸、精氨酸、RNA和魚油(ω-3脂肪酸)的組合物組分g/100g水 77.40麥芽糖糊精 8.79酪蛋白酸Na/Ca 4.60甘氨酸 3.00精氨酸 1.17酵母提取物RNA 0.14MM 2.00SM 0.05VM 0.10β-胡蘿卜素 0.03
類脂棕櫚油1.32向日葵油 0.23乳化劑Nathin E0.13魚油EPAX 3000 TG 1.04100.00已如上所述，魚油是ω-3 PUFA的天然來源，而向日葵油是ω-6PUFA的天然來源。
權利要求
1．甘氨酸在制備用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的藥物或營養(yǎng)制劑中的用途。
2．根據權利要求1的用途，其中該藥物或營養(yǎng)制劑進一步含有一種成分(c)，該成分由L-精氨酸或其他生理學上可接受的、與氧化氮合成有關的化合物、或其混合物組成。
3．根據權利要求1或2的用途，其中該營養(yǎng)制劑是一種食物補充劑。
4．根據權利要求3的用途，其中該食物補充劑基本上由甘氨酸和一種碳水化合物來源組成。
5．根據權利要求4的用途，其中該食物補充劑進一步含有一種蛋白質來源。
6．根據權利要求1或2的用途，其中該營養(yǎng)制劑是一種全配方食物。
7．根據權利要求1或2的用途，其中該藥物進一步含有一種環(huán)孢菌素或子囊霉素。
8．一種藥物或營養(yǎng)制劑，含有治療有效量的一種環(huán)孢菌素或子囊霉素并結合有甘氨酸，甘氨酸的含量對抑制和/或改善由所述環(huán)孢菌素或子囊霉素誘發(fā)的腎功能障礙有效，其中甘氨酸和任意性可有可無的L-精氨酸或L-鳥氨酸是所述藥物或營養(yǎng)制劑中唯一的游離氨基酸。
9．一種用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的方法，該方法包括在用一種環(huán)孢菌素或子囊霉素治療之前、同時或之后對人或其他哺乳動物給予一種含有甘氨酸的藥物或營養(yǎng)制劑，甘氨酸的含量能有效抑制和/或改善腎功能障礙。
10．一種含有甘氨酸的藥物或營養(yǎng)制劑，用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙。
全文摘要
本發(fā)明提供了甘氨酸在制備用于預防和/或治療由環(huán)孢菌素類或子囊霉素類誘發(fā)的腎功能障礙的藥物或營養(yǎng)制劑中的用途。
文檔編號A61K38/00GK1226827SQ97196901
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月29日 優(yōu)先權日1996年7月30日
發(fā)明者H·施內德 申請人:諾瓦提斯營養(yǎng)股份公司