專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫誘導(dǎo)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為癌癥的治療劑和/或預(yù)防劑等有用的新的免疫誘導(dǎo)劑。
背景技術(shù)：
癌癥是占全部死亡原因的第一位的疾病。目前，癌癥治療技術(shù)的主要形式是外科 手術(shù)治療，其與放射治療和化療法聯(lián)合實(shí)施。盡管近年來(lái)開(kāi)發(fā)了新的手術(shù)技術(shù)和發(fā)現(xiàn)了新 的抗癌劑，但是除了一些類(lèi)型的癌癥之外，癌癥治療的結(jié)果仍未改善。近年來(lái)，隨著分子 生物學(xué)和癌癥免疫學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定了對(duì)癌癥起反應(yīng)的細(xì)胞毒T細(xì)胞所識(shí)別的癌抗原 和編碼癌抗原的基因，并且對(duì)抗原特異性免疫療法的期望已經(jīng)上升(Tsuyoshi Akiyoshi, Gan to Kagaku Ryouhou (癌癥和化療法)，1997，第 24 卷，第 551-519 頁(yè)，Cancer and Chemotherapy Publishers Inc.,日本)。從減輕副作用的角度看，免疫療法需要被識(shí)別為靶抗原的癌細(xì)胞特異性肽、多肽 或蛋白質(zhì)的存在，以及其基本上不存在于正常細(xì)胞中。在1991年，Boon等人(路德維希癌 癥研究所，比利時(shí))通過(guò)cDNA表達(dá)克隆法，使用自身癌細(xì)胞系和癌癥反應(yīng)性T細(xì)胞，分離了 CD8+T 細(xì)胞識(shí)別的人黑素瘤抗原 MAGEl (Bruggen P.等人，Science, 254 1643-1647，1991)。 此后，報(bào)道了通過(guò)基因表達(dá)克隆法鑒定由抗體識(shí)別的腫瘤抗原的SEREX(通過(guò)重組表達(dá)克 隆法對(duì)抗原的血清學(xué)鑒定)方法，其中所述的抗體是應(yīng)答于癌癥患者身體中的自身癌癥而 產(chǎn)生的(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,92 :11810-11813,1995 ；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，698，396)。 一些癌抗原已經(jīng)通過(guò)此類(lèi)技術(shù)分離(Int. J. Cancer, 72 :965-971,1997 ；Cancer Res. ,58 1034-1041，1998 ；Int.J. Cancer,29 :652-658,1998 ；Int. J. Oncol.，14:703-708,1999 ； Cancer Res.，56 :4766-4772,1996 ；和 Hum. Mol. Genet. 6 :33-39,1997)。此外，已經(jīng)開(kāi)始了 靶向一些此類(lèi)抗原的癌癥免疫療法的臨床試驗(yàn)。如同人的情況，犬和貓已知患有多種腫瘤，如乳腺癌、白血病和淋巴瘤，并且腫瘤 在犬或貓疾病中在統(tǒng)計(jì)學(xué)上排名靠前。然而，目前沒(méi)有用于犬或貓癌癥的有效治療劑、預(yù)防 劑或診斷劑。大部分犬或貓主人不會(huì)注意到犬或貓腫瘤直至腫瘤變成晚期和增大。即便通 過(guò)外科手術(shù)除去腫瘤或施用人用藥物(例如，抗癌劑)，腫瘤經(jīng)常已經(jīng)無(wú)法治愈，并且動(dòng)物 經(jīng)常在治療后不久死亡。在這類(lèi)情況下，如果對(duì)犬或貓有效的治療劑、預(yù)防劑或診斷劑是可 獲得的，則可以預(yù)期其應(yīng)用于犬或貓癌癥。當(dāng)靜止的正常細(xì)胞被活化或發(fā)生細(xì)胞分裂時(shí)，胞質(zhì)和增殖相關(guān)蛋白I(CAPRIN-I) 表達(dá)。CAPRIN-I是已知與細(xì)胞中的RNA形成胞內(nèi)應(yīng)激顆粒并與調(diào)節(jié)mRNA運(yùn)輸和翻譯有關(guān) 的胞內(nèi)蛋白。CAPRIN-I也稱(chēng)作多種其他名稱(chēng)，并且其示例包括GPI錨定的膜蛋白1和膜組 分表面標(biāo)記1蛋白(MllSl)。CAPRIN-I具有傳達(dá)以下印象的名字它已知作為一種細(xì)胞膜 蛋白。此類(lèi)其他名字最初源自如下的一份報(bào)告=CAPRIN-I基因序列具有GPI結(jié)合區(qū)并且它 是在大腸衍生的細(xì)胞系中表達(dá)的膜蛋白(J. Biol. Chem. , 270 :20717-20723,1995) 0然而， 后來(lái)已知該報(bào)告中的CAPRIN-I基因序列是不正確的，并且在該基因序列中，單個(gè)核苷酸從 GenBank等中目前登記的CAPRIN-I基因序列中的缺失造成移碼，因而導(dǎo)致80個(gè)氨基酸從羧基末端缺失，并且因而所得的人為產(chǎn)物(74個(gè)氨基酸)是前述報(bào)告中所提及的GPI結(jié)合 區(qū)。此外，還已知該報(bào)告中所顯示的CAPRIN-I基因序列在5’側(cè)也具有錯(cuò)誤，并且53個(gè)氨基 酸殘基從氨基端缺失(J. Immunol.，172 =2389-2400,2004)。也已經(jīng)報(bào)道由GenBank等中目 前所登記CAPRIN-I基因序列編碼的蛋白質(zhì)不是細(xì)胞膜蛋白(J. Immunol. , 172 =2389-2400, 2004)?；贘. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995 對(duì) CAPRIN-I 是細(xì)胞膜蛋白的報(bào)告， 即，US 2008/0075722和WO 2005/100998描述了 CAPRIN-I作為名為MlISl的細(xì)胞膜蛋白可 以是癌癥療法的靶。然而，它們沒(méi)有在實(shí)施例中包括任何具體的描述。然而，如J. Immunol.， 172 =2389-2400,2004中所報(bào)道的那樣，從US 2008/0075722申請(qǐng)以來(lái)直到現(xiàn)在，通說(shuō)認(rèn) 為CAPRIN-I不表達(dá)在細(xì)胞表面。顯然基于不正確信息即CAPRIN-I是細(xì)胞膜蛋白的US 2008/0075722和WO 2005/100998的公開(kāi)內(nèi)容不應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)。 此外，不存在CAPRIN-I的表達(dá)水平在癌細(xì)胞(如乳腺癌細(xì)胞)中比正常細(xì)胞中高的報(bào)道。發(fā)明概述發(fā)明欲解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)用作癌癥治療劑和/或預(yù)防劑等的新多肽并提供這種多肽 作為免疫誘導(dǎo)劑的用途。用于解決該問(wèn)題的手段本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究并且隨后他們通過(guò)SEREX方法，使用犬睪丸組織 衍生的cDNA文庫(kù)和患有乳腺癌的犬的血清，獲得了編碼蛋白質(zhì)的cDNA，所述的蛋白質(zhì)與 從患癌活體獲得的血清中的抗體結(jié)合，并且使用此類(lèi)cDNA，他們制備了具有SEQ ID NO :6、 8、10、12和14所示氨基酸序列的犬CAPRIN-I多肽。使用所獲得基因的人同源基因，他們 也制備了具有SEQ ID NO :2和4所示氨基酸序列的人CAPRIN-I多肽。此外，他們發(fā)現(xiàn)此 類(lèi)CAPRIN-I多肽在乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌和結(jié)直腸癌中特異性表 達(dá)。進(jìn)一步地，他們發(fā)現(xiàn)施用此類(lèi)CAPRIN-I多肽至活體會(huì)導(dǎo)致活體中針對(duì)CAPRIN-I多肽 的免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和活體中表達(dá)CAPRIN-I基因的腫瘤的退縮。此外，他們發(fā)現(xiàn)針對(duì)此類(lèi) CAPRIN-I多肽的抗體會(huì)破壞表達(dá)CAPRIN-I基因的癌細(xì)胞并誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤作用。這導(dǎo)致 了本發(fā)明的完成。因此，本發(fā)明具有以下特征。(1)免疫誘導(dǎo)劑，包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多 肽具有免疫誘導(dǎo)活性并選自以下多肽(a)、(b)和(c)，所述的重組載體包含編碼此多肽的 多核苷酸并能夠在體內(nèi)表達(dá)此多肽(a)選自序列表中所列SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序 列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個(gè)氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。(2)根據(jù)⑴的免疫誘導(dǎo)劑，其中多肽(b)是與多肽(a)具有95%或更多序列同 一性的多肽。(3)根據(jù)⑴的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是選自序列表中所列 SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽或包含此多肽作為其部分序列的多肽。(4)根據(jù)(3)的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是包含選自序列表中 所列SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的多肽。(5)根據(jù)(3)的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是至少七個(gè)連續(xù)氨基 酸的多肽，所述的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸位于選自序列表中所列除SEQ ID NO :6和SEQ ID N0:18之外的SEQ ID NO :2至30中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的第41至400 位氨基酸殘基(aa)或第503至564位氨基酸殘基(aa)的區(qū)域中，或包含此多肽作為其部 分序列的多肽。(6)根據(jù)(5)的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是序列表中任一 SEQ ID NO 43至76所示氨基酸序列的多肽，或包含序列表中任一 SEQ ID NO 43至76所示氨 基酸序列作為其部分序列的8至12個(gè)氨基酸的多肽。(7)根據(jù)⑴至(6)任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其包含一種或多種此類(lèi)多肽作為有 效成分。(8)根據(jù)(7)的免疫誘導(dǎo)劑，其中多肽是抗原呈遞細(xì)胞的處理劑。(9)根據(jù)⑴至(7)任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其用于動(dòng)物癌癥的治療或預(yù)防中。(10)根據(jù)(9)的免疫誘導(dǎo)劑，其中癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、 食道癌或結(jié)直腸癌。(11)根據(jù)(9)的免疫誘導(dǎo)劑，其中動(dòng)物是人、犬或貓。(12)根據(jù)(1)至(11)任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其還包含免疫增強(qiáng)劑。(13)根據(jù)(1 的免疫誘導(dǎo)劑，其中免疫增強(qiáng)劑是選自由弗氏不完全佐劑、 Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18、干擾素α、干 擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少一種佐劑或細(xì)胞因子。(14)分離的抗原呈遞細(xì)胞，包含上述所提及的具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽和HLA分 子的復(fù)合體。(15)分離的T細(xì)胞，其選擇性地與上述所提及的具免疫誘導(dǎo)活性的多肽和HLA分 子的復(fù)合體結(jié)合。(16)用于誘導(dǎo)免疫的方法，包括向個(gè)體施用至少一種多肽或重組載體，所述的至 少一種多肽具有免疫誘導(dǎo)活性并選自以下多肽(a)至(c)，所述的重組載體包含編碼此多 肽的多核苷酸并能夠在體內(nèi)表達(dá)此多肽(a)選自序列表中所列SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序 列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個(gè)氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。發(fā)明的效果本發(fā)明提供了對(duì)癌癥的治療和/或預(yù)防等有用的新的免疫誘導(dǎo)劑。如下文實(shí)施例 中具體描述，向患癌動(dòng)物施用本發(fā)明中所用的多肽能夠在該患癌動(dòng)物的身體中誘導(dǎo)免疫細(xì) 胞，所述的免疫細(xì)胞進(jìn)一步能使現(xiàn)存的癌癥縮小或退縮。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示正常組織和腫瘤細(xì)胞系中編碼CAPRIN-I多肽的基因的表達(dá)模式。參考編號(hào)1代表編碼CAPRIN-I蛋白的基因的表達(dá)模式，并且參考編號(hào)2代表GAPDH基因的表達(dá) 模式。在圖2中，橫軸上的參考編號(hào)3至31分別代表了用SEQ ID NO 43至71的肽脈沖 的T2細(xì)胞刺激，HLA-A0201+⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。參考編號(hào)32代表有關(guān)SEQ ID Ν0:77的陰性對(duì)照肽(一種具有本發(fā)明范圍之外的序列的肽)的結(jié)果。在圖3中，橫軸上的參考編號(hào)33至37分別代表了用SEQ ID NO :72至76的肽脈沖 的JTK-LCL細(xì)胞刺激，HLA-A24+CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ的能力。參考編號(hào)38代表有關(guān)SEQ ID NO ,11的陰性對(duì)照的結(jié)果。在圖4中，橫軸上的參考編號(hào)39至67分別代表了用SEQ ID NO 43至71的肽刺 激的HLA-A0201+⑶8+Τ細(xì)胞對(duì)U-87MG細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。參考編號(hào)68代表用陰性對(duì)照肽 (SEQ ID NO 77)誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在圖5中，橫軸上的參考編號(hào)69至73分別代表了用SEQ ID NO ,12至76的肽刺 激的HLA-AM+CD8+T細(xì)胞對(duì)JTK-LCL細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。參考編號(hào)74代表用陰性對(duì)照肽 (SEQ ID NO 77)誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。用于實(shí)施發(fā)明的實(shí)施方案〈多肽〉本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑中所含作為有效成分的多肽包括選自以下多肽(a)、(b)和 (c)的一種或多種多肽(a)在具有選自序列表中所列SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨 基酸序列的多肽中的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸并具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性，由至少七個(gè)氨基酸組成并具有免疫 誘導(dǎo)活性的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列并具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指通過(guò)多個(gè)氨基酸之間的肽鍵形成的分子。該術(shù)語(yǔ)不 僅指由許多氨基酸構(gòu)成的多肽分子，還指由少量氨基酸構(gòu)成的低分子量分子(寡肽)和全 長(zhǎng)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多肽”也指SEQ IDNO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所 示的全長(zhǎng)序列的蛋白質(zhì)。編碼由如SEQ ID NO :2 至 30 當(dāng)中偶數(shù) SEQ ID 編號(hào)(S卩，SEQ ID NO :2、4、6…28 和30)所示氨基酸序列組成的各個(gè)蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列通過(guò)SEQ ID而1至四 當(dāng)中奇數(shù)SEQ ID編號(hào)(即，SEQ ID NO :1、3、5· . . 27和29)顯示。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“具有氨基酸序列”指由處于特定順序的氨基酸殘基組成的序 列。例如，術(shù)語(yǔ)“具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽”指具有SEQ ID NO 2所示氨基 酸序列即Met Pro Ser Ala Th r...(中略)...Gln Gln Val Asn的709個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度 的多肽。術(shù)語(yǔ)“具有SEQ IDNO :2所示氨基酸序列的多肽”有時(shí)縮寫(xiě)為“SEQ ID NO :2的多 肽”。這同樣適用于表述“具有核苷酸序列”。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“具有”與表述“由...組 成”是可交換的。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“免疫誘導(dǎo)活性”指體內(nèi)誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子(如干擾素或白細(xì) 胞介素)的免疫細(xì)胞的能力。多肽是否具有免疫誘導(dǎo)活性可以通過(guò)例如已知的ELISP0T測(cè)定法證實(shí)。具體而言，從活體獲得細(xì)胞如外周血單核細(xì)胞，其中對(duì)所述活體已經(jīng)施用待驗(yàn)定免疫誘導(dǎo)活性的 多肽，將此類(lèi)細(xì)胞在這種多肽存在下共培養(yǎng)并且來(lái)自所述細(xì)胞的細(xì)胞因子和/或趨化因子 (如IFN-Y或白細(xì)胞介素(IL))的產(chǎn)生量例如利用如下文實(shí)施例中所述的特異性抗體測(cè) 量。因此，可以驗(yàn)定所述細(xì)胞當(dāng)中免疫細(xì)胞的數(shù)目。這能夠評(píng)價(jià)免疫誘導(dǎo)活性。備選地，基于SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列而制 備的重組多肽可以施用至患癌的動(dòng)物，從而腫瘤可以因免疫誘導(dǎo)活性而退縮，如下文實(shí)施 例中描述。因此，免疫誘導(dǎo)活性可以評(píng)價(jià)為抑制表達(dá)由SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù) SEQ ID編號(hào)所示多肽的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力或縮小或消除癌組織(腫瘤)的能力(在下文， 這種能力稱(chēng)作“抗腫瘤活性”)。所述多肽的抗腫瘤活性可以通過(guò)例如實(shí)際施用此類(lèi)多肽至 患癌的活體并檢驗(yàn)?zāi)[瘤是否縮小予以確定，如下文實(shí)施例中具體描述。備選地，可以檢驗(yàn)受多肽刺激的T細(xì)胞(S卩，與呈遞該多肽的抗原呈遞細(xì)胞接觸的 T細(xì)胞)是否對(duì)體外腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性以評(píng)價(jià)該多肽的抗腫瘤活性?？梢酝ㄟ^(guò)在如 下文描述的液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)T細(xì)胞使其與抗原呈遞細(xì)胞接觸。細(xì)胞毒活性可以通過(guò)稱(chēng) 作例如ht. J. Cancer, 58 第317頁(yè)，1994中所述51Cr釋放測(cè)定法的已知技術(shù)驗(yàn)定。當(dāng)所述 多肽用于治療和/或預(yù)防癌癥，優(yōu)選使用抗腫瘤活性作為一項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫誘導(dǎo)活性，盡 管不特別地限制評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明公開(kāi)的序列表中所列SEQ ID NO :2至30當(dāng)中的偶數(shù)SEQ ID編號(hào)顯示的氨 基酸序列是CAPRIN-I多肽的氨基酸序列，其中通過(guò)SEREX方法，使用正常犬睪丸組織衍生 的cDNA文庫(kù)和患有乳腺癌的犬的血清，將所述的CAPRIN-I多肽作為與從患癌犬獲得的血 清中特異性存在的抗體結(jié)合的多肽、以及此多肽的人、牛、馬、小鼠和雞同源物而分離(見(jiàn) 下文實(shí)施例1)。上文所示的多肽(a)具有下述多肽中的至少7個(gè)和優(yōu)選至少8、9、10個(gè)或更多個(gè) 連續(xù)氨基酸并具有免疫誘導(dǎo)活性，所述多肽具有SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID 編號(hào)所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選地，這種多肽具有SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示的氨基酸序列。如本領(lǐng)域已知，至少約7個(gè)氨基酸殘基的多肽可以顯示出抗原 性。因此，具有SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的至少七個(gè) 連續(xù)氨基酸殘基的多肽可以顯示出抗原性和免疫原性。即，具有SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任 意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的多肽可以具有免疫誘導(dǎo) 活性并且該多肽可以用于制備本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑。基于在體內(nèi)針對(duì)抗原物質(zhì)所產(chǎn)生的抗 體是多克隆抗體的事實(shí)，氨基酸殘基數(shù)量大的多肽可以誘導(dǎo)類(lèi)型眾多的識(shí)別該抗原物質(zhì)上 多個(gè)位點(diǎn)的抗體，因而增強(qiáng)免疫誘導(dǎo)活性。因此，為了增強(qiáng)免疫誘導(dǎo)活性，氨基酸殘基的數(shù) 目可以?xún)?yōu)選地是至少30或更大，或50或更大，更優(yōu)選地至少100或更大，150或更大并且還 優(yōu)選地是至少200或更大或仍?xún)?yōu)選地是250或更大。作為通過(guò)施用癌抗原多肽誘導(dǎo)免疫的原理，已知多肽被摻入抗原呈遞細(xì)胞，所述 多肽由該細(xì)胞內(nèi)的肽酶降解成較小的片段(在下文，該片段可以稱(chēng)作“表位”)，此片段呈遞 在該細(xì)胞的表面上，細(xì)胞毒T細(xì)胞等識(shí)別該片段并選擇性地殺死該抗原呈遞細(xì)胞。呈遞在 抗原呈遞細(xì)胞表面上的多肽的大小是相對(duì)小的，并且就氨基酸數(shù)目而言，它是約7至30個(gè)。 因此，就抗原呈遞細(xì)胞上的呈遞而言，多肽(a)具有SEQ ID NO 2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列中約7至30個(gè)和優(yōu)選地約8至30個(gè)或9至30個(gè)連續(xù)氨基酸是足夠的。尺寸相對(duì)小的這種多肽可以直接呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上，無(wú)需摻入該抗原呈遞 細(xì)胞中。摻入抗原呈遞細(xì)胞中的多肽在隨機(jī)位置處被細(xì)胞中存在的肽酶切割，多種多肽片 段生成并且此類(lèi)多肽片段呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上。因此，如果使用大的多肽如由SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示的全長(zhǎng)序列，則通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞中的降解 作用天然地生成有效用于由抗原呈遞細(xì)胞所介導(dǎo)免疫誘導(dǎo)作用的多肽片段。因此，大尺寸 多肽可以?xún)?yōu)選地用于由抗原呈遞細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫誘導(dǎo)作用，并且氨基酸的數(shù)目可以是至 少30，更優(yōu)選地是至少100，還優(yōu)選地是至少200并且仍進(jìn)一步優(yōu)選地是至少250。另外，可以使用匹配媒介對(duì)本發(fā)明的多肽篩選作為可能表位的肽，其中所述的匹 配媒介可以檢索充當(dāng)對(duì)每種HLA類(lèi)型具有結(jié)合基序的可能表位的肽，如生物信息學(xué)與分子 分析選擇預(yù)測(cè) HLA 肽結(jié)合(HLA Peptide Bin ding Predictions of Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS))(http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_ bind/index, html)。具體地，優(yōu)選至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述的至少七個(gè)連續(xù)氨 基酸位于選自除SEQ ID NO :6和SEQ ID N0:18之外的SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù) SEQ ID編號(hào)所示的氨基酸序列中第41至400位氨基酸殘基(aa)或第503至564位氨基酸 殘基(aa)的區(qū)域中，或包含此多肽作為其部分序列的多肽。在SEQ ID NO :2的多肽中，由 任一 SEQ ID NO 43至76顯示的多肽是更優(yōu)選的。上文的多肽(b)通過(guò)替換、缺失、添加和/或插入少數(shù)(優(yōu)選地一個(gè)或幾個(gè))氨基 酸殘基從多肽(a)衍生，它與原始序列具有80%或更大、85%或更大、優(yōu)選地90%或更大、 更優(yōu)選地95 %或更大、還優(yōu)選地98 %或更大、99 %或更大或99. 5 %或更大的序列同一性并 且它具有免疫誘導(dǎo)活性。一般地，在蛋白質(zhì)抗原中，即使該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中少數(shù)(優(yōu) 選地一個(gè)或幾個(gè))氨基酸殘基被替換、缺失、添加或插入，本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的是所 得的蛋白質(zhì)有時(shí)具有基本上與原初蛋白質(zhì)相同的抗原性或免疫原性。因此，上文的多肽(b) 能夠顯示出免疫誘導(dǎo)活性并且它因此可以用于制備本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑。備選地，上文的 多肽(b)優(yōu)選地是具有下述氨基酸序列的多肽，所述的氨基酸序列從SEQ ID NO :2至30當(dāng) 中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示的氨基酸序列通過(guò)替換、缺失、添加和/或插入一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基衍生。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“幾個(gè)”指從2至10的整數(shù)，優(yōu)選地從2至6的整數(shù)并 且還優(yōu)選地從2至4的整數(shù)。就氨基酸序列或核苷酸序列而言，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“序列同一性”表示通過(guò)比 對(duì)2個(gè)待比較的氨基酸序列(或核苷酸序列)從而使匹配性氨基酸殘基(或核苷酸)的 數(shù)目最大化并將匹配的氨基酸殘基數(shù)目(匹配的核苷酸數(shù)目)除以氨基酸殘基總數(shù)(或 核苷酸總數(shù))所確定的百分?jǐn)?shù)(％ )。當(dāng)如上所述比對(duì)序列時(shí)，根據(jù)需要將空位適當(dāng)?shù)夭?入待比較的兩個(gè)序列之一或二者。這種序列比對(duì)可以采用熟知的程序，例如BLAST、FASTA 或 CLUSTALff(Karlin 和 Altschul, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 87 :2264-2268,1993 ； Altschul 等人，Nucleic Acids Res. ,25 :3389-3402,1997)實(shí)施。當(dāng)插入空位時(shí)，氨基酸殘 基總數(shù)(或核苷酸總數(shù))是通過(guò)指定某空位為一個(gè)氨基酸殘基(或一個(gè)核苷酸)所計(jì)數(shù)的 殘基數(shù)目(或核苷酸數(shù)目)。當(dāng)因此確定的氨基酸殘基總數(shù)(或核苷酸總數(shù))在待比較的 兩個(gè)序列之間不同時(shí)，通過(guò)將匹配的氨基酸殘基數(shù)目(匹配的核苷酸數(shù)目)除以較長(zhǎng)序列 的氨基酸殘基總數(shù)(或核苷酸總數(shù))確定同一性(％ )。
優(yōu)選的氨基酸替換是保守性氨基酸替換。構(gòu)成天然存在蛋白質(zhì)的20種氨基酸可 以分成具有相似特性的氨基酸組即具有低極性側(cè)鏈的中性氨基酸(Gly、lie、Val, Leu、 Ala、Met*ft~o)；具有親水側(cè)鏈的中性氨基酸(Asn、Gin、Thr、Ser、Tyr和Cys)；酸性氨基 酸(Asp和Glu)；堿性氨基酸(Arg、Lys和His)；和芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp和His)。已 知在此類(lèi)組內(nèi)的替換；即保守性替換，在許多情況下將不會(huì)改變多肽特性。因此，當(dāng)本發(fā)明 多肽(a)中的氨基酸殘基被替換時(shí)，可以在此類(lèi)組內(nèi)實(shí)施替換，從而維持免疫誘導(dǎo)活性的 可能性變大。然而，在本發(fā)明中，改變的多肽可以具有非保守性替換，條件是所得的多肽具 有與未改變多肽的免疫誘導(dǎo)活性等同或基本上等同的免疫誘導(dǎo)活性。多肽(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列并具有免疫誘導(dǎo)活性。具體地，多 肽(c)對(duì)應(yīng)于在多肽(a)或(b)的一個(gè)或兩個(gè)末端添加其他氨基酸或多肽并具有免疫誘導(dǎo) 活性的多肽。該多肽可以用于制備本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑。上文提及的多肽可以例如根據(jù)Fmoc (芴甲氧羰基)方法或tBoc (叔丁氧羰基) 方法(Japanese Biochemical Society (編著)，Seikagaku Jikken Kouza(生物化學(xué)實(shí) 驗(yàn)教禾呈)1，Tanpakushitsu no Kagaku(蛋白質(zhì)化學(xué))IV，Kagaku Shushoku to Peptide Gousei (化學(xué)修飾與肽合成)，fTokyo Kagaku Dojin，日本，1981)化學(xué)地合成。另外，多種 市售的肽合成儀可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)用來(lái)合成所述多肽。另外，已知的遺傳工程技術(shù)(例如， Sambrook 等人，Molecular Cloning，第 2 卷，Current Protocols in Molecular Biology, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；禾口 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology,第 3 卷，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons)可以用來(lái)制備編碼上述多肽的多核苷酸， 可以將所得的多肽摻入表達(dá)載體中并隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并且可以在這種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生 所述多肽以獲得靶多肽。通過(guò)已知的基因工程技術(shù)或使用市售核酸合成儀的常規(guī)技術(shù)，可以容易地制備編 碼上述多肽的多核苷酸。例如，可以通過(guò)開(kāi)展PCR，使用人染色體DNA或cDNA文庫(kù)作為模板 和所設(shè)計(jì)的旨在擴(kuò)增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的引物對(duì)制備具有SEQ ID N0:1的核苷 酸序列的DNA。類(lèi)似地，可以使用犬染色體DNA或cDNA文庫(kù)作為模板，制備具有SEQ ID NO 5的核苷酸序列的DNA。PCR條件可以適當(dāng)?shù)卮_定。例如，重復(fù)30次以下反應(yīng)循環(huán)在94°C 變性30秒、在55°C復(fù)性30秒至1分鐘并在72°C延伸2分鐘，使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(例 如，Taq聚合酶)和含Mg2+的PCR緩沖液，隨后該反應(yīng)在72°C持續(xù)7分鐘，但是反應(yīng)條件不 限于此。PCR 技術(shù)、條件等在例如 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology, 第 3 卷，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995，John Wiley & Sons (特別是第15章)中描述。另外，可以基于本發(fā)明序列表中SEQ ID NO :1至30所示的核苷酸序列和氨基酸序列的信息制備適當(dāng)?shù)奶结樆蛞?，并且人、犬??；蚱渌鹀DNA文庫(kù)可以用此類(lèi)探針或引物篩選，從而可以分離目的DNA。cDNA文庫(kù)優(yōu)選地 從表達(dá)SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示蛋白質(zhì)的細(xì)胞、器官或組織制備。 上文所述的方法(如探針或引物的制備、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、cDNA文庫(kù)的篩選和靶基因的克 隆)是本領(lǐng)域已知的。例如，此類(lèi)方法可以根據(jù)Sambrook等人，Molecular Cloning，第2 卷，CurrentProtocols in Molecular Biology, 1989), Ausubel 等人(如上文)中所述的 方法實(shí)施。編碼上述多肽(a)的DNA可以從由此獲得的DNA獲得。由于編碼每種氨基酸的密碼子是已知的，可以輕易地鑒定編碼特定氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，可 以輕易地鑒定編碼多肽(b)或(C)的多核苷酸的核苷酸序列，并且也可以使用市售核酸合 成儀，根據(jù)常規(guī)技術(shù)輕易地合成此類(lèi)多核苷酸。宿主細(xì)胞可以是任意細(xì)胞，條件是前述多肽可以在其中表達(dá)。宿主細(xì)胞包括但不 限于作為原核細(xì)胞的大腸桿菌細(xì)胞；和作為真核細(xì)胞的猴腎細(xì)胞(COS 1)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞系(HEK293)和胎小鼠皮膚細(xì)胞系(NIH3T3)等哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞、 出芽的酵母細(xì)胞、分裂的酵母細(xì)胞、家蠶細(xì)胞和爪蟾卵細(xì)胞。當(dāng)使用原核宿主細(xì)胞時(shí)，使用可以在原核細(xì)胞中復(fù)制的具有例如起點(diǎn)、啟動(dòng)子、核 糖體結(jié)合位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、終止子、耐藥基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的表達(dá)載體。大腸桿 菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pUC、pBluescriptII、pET表達(dá)系統(tǒng)和pGEX表達(dá)系統(tǒng)?？梢詫⒕幋a 上述多肽的DNA摻入這種表達(dá)載體，原核宿主細(xì)胞可以用此種載體轉(zhuǎn)化，并且可以培養(yǎng)所 得的轉(zhuǎn)化體。因此，可以在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。在這種情況下，這 種多肽可以與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白的形式表達(dá)。當(dāng)使用真核宿主細(xì)胞時(shí)，使用具有例如啟動(dòng)子、剪接區(qū)和聚腺苷酸添加位點(diǎn)的真 核細(xì)胞表達(dá)載體。此類(lèi)表達(dá)載體的實(shí)例包括pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK_CMV、 pBK-RSV、EBV, pRS、pcDNA3和pYES2載體。如上所述，可以將編碼上述多肽的DNA摻入這 種表達(dá)載體，真核宿主細(xì)胞可以用此種載體轉(zhuǎn)化，并且隨后可以培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體。因此， 可以在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。當(dāng)使用pIND/V5-His、pFLAG_CMV_2、 pEGFP-Nl、pEGFP-Cl或其他表達(dá)載體時(shí)，所述多肽可以帶有多種標(biāo)簽如His標(biāo)簽(例如， (His) 6至(His) 10)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或GFP的融合蛋白的形式表達(dá)。表達(dá)載體可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯 微注射法、病毒感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或與細(xì)胞膜透過(guò)性肽的結(jié)合導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。靶多肽可以通過(guò)聯(lián)合使用已知的分離技術(shù)從宿主細(xì)胞分離和純化。分離技術(shù)的 實(shí)例包括但不限于用變性劑如脲或表面活性劑處理法、超聲破碎法、酶消化法、鹽析或用溶 劑分級(jí)沉淀法、透析法、離心法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、SDS-PAGE、等點(diǎn)聚焦法、離子交換層析 法、疏水層析法、親和層析法和反相層析法。通過(guò)此類(lèi)方法獲得的一些多肽如上所述處于與任何其他蛋白質(zhì)融合的融合蛋白 形式。其實(shí)例包括與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或His標(biāo)簽的融合蛋白。融合蛋白形式的 此類(lèi)多肽作為多肽(c)處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的多肽被翻譯并且翻 譯的多肽有時(shí)在細(xì)胞中經(jīng)歷多種形式的修飾。此類(lèi)翻譯后修飾的多肽也處在本發(fā)明的范圍 內(nèi)，條件是此類(lèi)多肽具有免疫誘導(dǎo)活性。此類(lèi)翻譯后修飾的實(shí)例包括消除氨基端甲硫氨酸、 氨基端乙酰化、添加糖鏈、胞內(nèi)蛋白酶有限降解、十四烷酰化、異戊二烯化和磷酸化。<免疫誘導(dǎo)劑>如下文實(shí)施例中具體描述，向患癌活體施用具有免疫誘導(dǎo)活性的上述多肽能使現(xiàn) 存的腫瘤退縮。因此，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以用作癌癥的治療劑和/或預(yù)防劑。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”和“癌癥”指惡性贅生物并且這些術(shù)語(yǔ)彼此可互換地使用。在這種情況下，作為靶的癌癥是表達(dá)下述基因的那些癌癥，其中所述的基因編碼 包含SEQ ID NO :2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示的氨基酸序列或其由至少7個(gè)連續(xù)氨基酸組成的部分序列的多肽。優(yōu)選地，此類(lèi)癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌、淋巴 瘤、肥大細(xì)胞瘤、食道癌或結(jié)直腸癌。此類(lèi)具體癌癥中包括但不限于例如乳腺癌、組合型乳 腺癌、惡性混合性乳腺腫瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、胃腸淋巴瘤、消化 系統(tǒng)淋巴瘤和小細(xì)胞至中等細(xì)胞型淋巴瘤。靶動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，并且其實(shí)例包括哺乳動(dòng)物，包括靈長(zhǎng)類(lèi)、寵物動(dòng)物、家畜動(dòng)物 和競(jìng)技用動(dòng)物，特別優(yōu)選人、犬和貓。本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以口服地或腸胃外地施用至生物。優(yōu)選腸胃外施用，如肌 內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。當(dāng)這種免疫誘導(dǎo)劑用于癌癥治療目的時(shí)，該免疫誘導(dǎo)劑可 以施用至待治療腫瘤附近的局部淋巴結(jié)，從而改善如下文實(shí)施例中所述的抗腫瘤作用。劑 量可以是任何量，只要它對(duì)于免疫誘導(dǎo)有效即可。例如，當(dāng)該免疫誘導(dǎo)劑用于治療和/或預(yù) 防癌癥時(shí)，有效治療和/或預(yù)防癌癥的量是足夠的，并且該量可以根據(jù)例如動(dòng)物的體重、性 別(即，雄性或雌性)或癥狀改變。根據(jù)腫瘤大小、癥狀和其他條件適當(dāng)?shù)卮_定有效治療 和/或預(yù)防癌癥的量。通常，每日針對(duì)靶動(dòng)物的有效量是0. 0001 μ g至1，000 μ g和優(yōu)選地 0. 001 μ g至1，000 μ g，并且該免疫誘導(dǎo)劑可以單一劑量或多個(gè)劑量施用。優(yōu)選地，該免疫 誘導(dǎo)劑每隔幾日或幾個(gè)月以數(shù)個(gè)分立的劑量施用。如下文實(shí)施例中具體描述，本發(fā)明的免 疫誘導(dǎo)劑能夠使現(xiàn)存腫瘤退縮。因此，該免疫誘導(dǎo)劑可以對(duì)處于早期發(fā)展階段的數(shù)量少的 癌細(xì)胞顯示抗腫瘤作用。在癌癥發(fā)作前或在治療后使用該免疫誘導(dǎo)劑導(dǎo)致預(yù)防癌癥的發(fā)展 或復(fù)發(fā)。具體地，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑用于治療和預(yù)防癌癥。本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以由多肽組成，或它可以與適用于相關(guān)劑型的添加劑如可 藥用的載體、稀釋劑、賦形劑等充分混合。制劑方法和可以使用的添加劑是醫(yī)藥制劑領(lǐng)域熟 知的，并且可以使用任何方法和添加劑。添加劑的具體實(shí)例包括，但不限于稀釋劑，如生理 緩沖液；賦形劑，如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇和甘氨酸；粘合劑，如糖漿、明膠、 阿拉伯膠、山梨醇、聚氯乙烯和黃蓍膠；及潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、聚乙二醇、滑石和硅石。劑型 的實(shí)例包括經(jīng)口劑，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑和糖漿溶液劑，和腸胃外劑，如吸入劑、注 射劑、栓劑和液體劑。此類(lèi)制劑可以通過(guò)常見(jiàn)方法制備。本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以與能夠在體內(nèi)強(qiáng)化免疫應(yīng)答的免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合使用。免 疫增強(qiáng)劑可以摻入本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑，或者它可以作為與本發(fā)明免疫誘導(dǎo)劑聯(lián)合的另一 種組合物施用至患者。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“患者”指動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物，并且它優(yōu)選地是人、犬或貓。免疫增強(qiáng)劑的實(shí)例是佐劑。佐劑提供(在細(xì)胞外部或在巨噬細(xì)胞中的)抗原儲(chǔ) 備庫(kù)，它活化巨噬細(xì)胞，并且它刺激給定組織中的淋巴細(xì)胞。因此，佐劑可以強(qiáng)化免疫應(yīng)答 并增強(qiáng)抗腫瘤作用。因此，當(dāng)本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑用于治療和/或預(yù)防癌癥時(shí)，特別優(yōu)選 的是除作為有效成分的多肽之外，該免疫誘導(dǎo)劑還包含佐劑。多種類(lèi)型的佐劑是本領(lǐng)域熟 知的，并且可以使用任意的此類(lèi)佐劑。其具體實(shí)例包括MPL(SmithKline Beecham)；通過(guò) 純化和酸水解明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(Salmonella minnesota)Re 595的脂多糖所獲得的等 效物；QS21 (SmithKline Beecham)；從皂樹(shù)(Quillja saponaria)提取物中純化的純?cè)碥?QA-21 ；PCT 申請(qǐng)(W0 96/33739，SmithKlineBeecham)中公開(kāi)的 DQS21 ；QS-7，QS-17，QS-18 和 QS-Ll (So 等人，Molecules and Cells，1997，7 178-186)；弗氏不完全佐劑；弗氏完全 佐劑；維生素E ；Montanide ；明礬(alum) ；CpG寡核苷酸(例如，Kreig等人，Nature, 1995，374 =546-549)；聚肌胞和其衍生物(例如，聚ICLC)；和從生物可降解油如角鯊烯和/或生 育酚中制備的多種油包水乳液。特別優(yōu)選弗氏不完全佐劑、Montanide、聚I:C、其衍生物和 CpG寡核苷酸。與多肽混合的佐劑的比率一般是約1 10至10 1，優(yōu)選地約1 5至 5 1并且更優(yōu)選地約1 1。應(yīng)當(dāng)指出佐劑不限于上文例舉的那些佐劑，并且也可以在施 用本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑時(shí)使用本領(lǐng)域已知的其他佐劑(例如，Goding著，單克隆抗體原理 與實(shí)踐(Monoclonal Antibodies principles and Practice)，第 2 卷，1986)。用于制備 多肽和佐劑的混合物或乳液的方法是免疫領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。作為免疫增強(qiáng)劑，除前述佐劑之外，還可以使用刺激目的免疫應(yīng)答的因子。例如， 刺激淋巴細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的多種細(xì)胞因子可以作為免疫增強(qiáng)劑與本發(fā)明的免疫誘導(dǎo) 劑聯(lián)合使用?？梢詮?qiáng)化免疫應(yīng)答的許多細(xì)胞因子是本領(lǐng)域已知的。其實(shí)例包括但不限于已 知的強(qiáng)化疫苗的保護(hù)性作用的白細(xì)胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、IL-18、干擾素α、干擾素 β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體。此類(lèi)因子可以作為免疫增強(qiáng)劑使用，并且可以以與 本發(fā)明免疫誘導(dǎo)劑在一起的混合物形式或作為另一種組合物與本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑聯(lián)合 地施用至患者。<抗原呈遞細(xì)胞>另外，可以使上文提及的多肽在體外與抗原呈遞細(xì)胞接觸以呈遞此類(lèi)多肽至該抗 原呈遞細(xì)胞。具體地，多肽(a)至(c)可以作為抗原呈遞細(xì)胞的處理劑使用?？乖蔬f細(xì) 胞的實(shí)例包括樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且優(yōu)選地使用具有MHC I類(lèi)分子的樹(shù)突細(xì) 胞或B細(xì)胞。多種MHC I類(lèi)分子已經(jīng)被鑒定并熟知。人MHC分子稱(chēng)作“HLA”。HLA I類(lèi) 分子的實(shí)例包括 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C。具體實(shí)例包括 HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A0204、 HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-Al 1、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、 HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37, HLA-Cw0401 和 HLA_Cw0602。具有MHC I類(lèi)分子的樹(shù)突細(xì)胞或B細(xì)胞可以通過(guò)熟知的技術(shù)從外周血制備。例如， 用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)從骨髓、臍帶血或患者的外 周血誘導(dǎo)出樹(shù)突細(xì)胞，并且將腫瘤相關(guān)肽添加至培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，可以誘導(dǎo)出腫瘤特異性樹(shù) 突細(xì)胞。施用有效量的此類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)癌癥治療想要的應(yīng)答。可以使用的細(xì)胞的實(shí) 例包括由健康個(gè)體提供的骨髓和臍帶血以及患者的骨髓和外周血。當(dāng)使用患者自己的自 體細(xì)胞時(shí)，安全水平高，并且可以避免嚴(yán)重的副作用。外周血或骨髓可以是新鮮、低溫貯藏 或冷凍保存的樣品。外周血可以通過(guò)培養(yǎng)全血或通過(guò)培養(yǎng)分離的白細(xì)胞組分制備，而從效 率的觀點(diǎn)看，優(yōu)選后者。另外，單核細(xì)胞可以從白細(xì)胞組分分離。當(dāng)樣品從骨髓或臍帶血制 備時(shí)，可以培養(yǎng)構(gòu)成骨髓的全部細(xì)胞，或可以從中分離并培養(yǎng)單核細(xì)胞。外周血、其白細(xì)胞 組分和骨髓細(xì)胞包含衍生樹(shù)突細(xì)胞的單核細(xì)胞、造血干細(xì)胞、未成熟樹(shù)突細(xì)胞或CD4+細(xì)胞。 細(xì)胞因子可以是天然存在的或基因重組類(lèi)型的，并且不限制用于產(chǎn)生細(xì)胞因子的方法，條 件是其安全性及生理學(xué)活性已經(jīng)驗(yàn)證。優(yōu)選地，使用最小需要量的具有驗(yàn)證了醫(yī)學(xué)品質(zhì)的 樣品。不特別地限制所添加細(xì)胞因子的濃度，條件是樹(shù)突細(xì)胞被誘導(dǎo)即可。一般地，優(yōu)選大 約10至1，000ng/ml的細(xì)胞因子總濃度，并且進(jìn)一步優(yōu)選約20至500ng/ml。培養(yǎng)可以用通 常用于白細(xì)胞培養(yǎng)的熟知培養(yǎng)基進(jìn)行。不特別地限制培養(yǎng)溫度，條件是可以增殖白細(xì)胞即 可，并且人體溫度(即，大約37°C )是最優(yōu)選的。不特別地限制培養(yǎng)期間的氣體環(huán)境，條件是可以增殖白細(xì)胞即可。優(yōu)選伴有5% CO2的通氣。此外，不特別地限制培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間，條 件是必需數(shù)目的細(xì)胞被誘導(dǎo)即可。這通常是3日至2周。適當(dāng)?shù)膬x器可以用于細(xì)胞分離或 培養(yǎng)，并且優(yōu)選此類(lèi)儀器具有批準(zhǔn)的醫(yī)用安全性和穩(wěn)定及簡(jiǎn)單的操作性。特別地，細(xì)胞培養(yǎng) 裝置不限于常見(jiàn)的容器，如培養(yǎng)皿、燒瓶和培養(yǎng)瓶，并且也可以使用分層或多級(jí)容器、滾瓶 (rollerbottle)、轉(zhuǎn)瓶(spinner bottle)、袋式培養(yǎng)裝置、中空纖維柱等。上文提及的多肽可以通過(guò)熟知的技術(shù)與抗原呈遞細(xì)胞在體外接觸。例如，抗原呈 遞細(xì)胞可以培養(yǎng)于含有此類(lèi)多肽的培養(yǎng)液中。不特別地限制培養(yǎng)基中的肽濃度。通常，它 是約1至100 μ g/ml，并且優(yōu)選地是約5至20 μ g/ml。不特別地限制培養(yǎng)期間的細(xì)胞密度， 并且它通常是約IO3至IO7個(gè)細(xì)胞/ml并且優(yōu)選地是約5 X IO4至5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。優(yōu)選 在37C于5% CO2中根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)?？梢猿蔬f在抗原呈遞細(xì)胞表面上的肽長(zhǎng)度通 常是最大約30個(gè)氨基酸殘基。因此，當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞與多肽在體外接觸時(shí)，可以調(diào)節(jié)多肽 的長(zhǎng)度至約30個(gè)氨基酸殘基或更小，盡管不特別地限制其長(zhǎng)度。通過(guò)在所述多肽存在下培養(yǎng)抗原呈遞細(xì)胞，將肽摻入抗原呈遞細(xì)胞的MHC分子并 呈遞在其表面上。因此，含有多肽與MHC分子的復(fù)合體的分離的抗原呈遞細(xì)胞可以用此類(lèi) 多肽制備。此類(lèi)抗原呈遞細(xì)胞可以在體內(nèi)或體外呈遞所述多肽至T細(xì)胞、誘導(dǎo)對(duì)所述多肽 特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞并增殖此類(lèi)T細(xì)胞。如此制備的含有多肽與MHC分子的復(fù)合體的抗原呈遞細(xì)胞可以與T細(xì)胞在體外接 觸從而可以誘導(dǎo)或增殖對(duì)此類(lèi)多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞。這可以通過(guò)在液體培養(yǎng)基中將 抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞一起培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。例如，培養(yǎng)可以通過(guò)將抗原呈遞細(xì)胞懸浮于液體培 養(yǎng)基中、將所得懸浮液導(dǎo)入容器如微量平板的孔中并向其添加T細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。不特別地限 制共培養(yǎng)時(shí)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的混合比，并且就細(xì)胞計(jì)數(shù)而言，它通常是約1 1至 1 10并且優(yōu)選地是約1 5至1 20。也不特別地限制懸浮于液體培養(yǎng)基中的抗原呈 遞細(xì)胞的密度，并且它通常是約100個(gè)至IO7個(gè)細(xì)胞/ml并且優(yōu)選地是約IO4至IO6個(gè)細(xì)胞 /ml。共培養(yǎng)優(yōu)選地根據(jù)常規(guī)技術(shù)在37°C于5% CO2中進(jìn)行。不特別地限制培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間， 并且它通常是2日至3周并且優(yōu)選地是約4日至2周。優(yōu)選地，共培養(yǎng)在單一類(lèi)型或多種 類(lèi)型的白細(xì)胞介素如IL-2、IL-6、IL-7和IL-12存在下進(jìn)行。在這種情況下，IL-2或IL-7 的濃度通常是約5U/ml至20U/ml，IL-6的濃度通常是約500U/ml至2，000U/ml，并且IL-12 的濃度通常是約5ng/ml至20ng/ml，但是濃度不限于此。本文中所用的單位“U”表示活性 單位。共培養(yǎng)可以重復(fù)一次或幾次，伴以添加新鮮的抗原呈遞細(xì)胞。例如，培養(yǎng)上清液在共 培養(yǎng)后棄去，共培養(yǎng)進(jìn)一步伴隨添加新鮮抗原呈遞細(xì)胞的懸液進(jìn)行，并且這種操作可以重 復(fù)一次或幾次。共培養(yǎng)條件可以如上所述。對(duì)所述多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞通過(guò)共培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)和增殖。因此，與多肽和MHC 分子的復(fù)合體選擇性結(jié)合的分離的T細(xì)胞可以用上述多肽制備。如下文實(shí)施例中所述，編碼SEQ ID NO 2至30當(dāng)中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)的多肽 的基因在乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)。因此，認(rèn)為SEQ ID N0:2至 30當(dāng)中偶數(shù)SEQ ID編號(hào)的多肽在此類(lèi)癌細(xì)胞中以比正常細(xì)胞中顯著更大的量存在。當(dāng)癌 細(xì)胞中的一些多肽呈遞至癌細(xì)胞表面上的MHC分子并且如上所述制備的細(xì)胞毒T細(xì)胞施用 至活體時(shí)，使用其作為標(biāo)記，細(xì)胞毒T細(xì)胞可以破壞癌細(xì)胞。由于呈遞多肽的抗原呈遞細(xì)胞 能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)和增殖對(duì)所述多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞，施用所述抗原呈遞細(xì)胞至活體也可以破壞癌細(xì)胞。即，使用所述多肽制備的細(xì)胞毒T細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞也如本發(fā)明的免 疫誘導(dǎo)劑那樣用作癌癥的治療劑和/或預(yù)防劑。當(dāng)分離的抗原呈遞細(xì)胞或分離的T細(xì)胞施用至活體時(shí)，優(yōu)選此類(lèi)分離的細(xì)胞是從 接受治療的患者采樣的抗原呈遞細(xì)胞或T細(xì)胞用上述多肽(a)至(c)制備的，以避免在體 內(nèi)將此類(lèi)細(xì)胞識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)并攻擊此類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答。施用包含抗原呈遞細(xì)胞或分離的T細(xì)胞作為有效成分的癌癥治療劑和/或預(yù)防劑 的途徑優(yōu)選地是腸胃外途徑，如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。根據(jù)癥狀、施用目的和其他狀況適當(dāng) 地選擇劑量，并且通常，1至IO13個(gè)細(xì)胞和優(yōu)選地IO6至IO9個(gè)細(xì)胞用于施用，并且此類(lèi)細(xì)胞 優(yōu)選地每幾日或幾月施用一次。制劑可以例如是緩沖的生理鹽水溶液中的細(xì)胞懸液，并且 它可以聯(lián)合其他抗腫瘤藥或細(xì)胞因子使用。另外，可以添加醫(yī)用制劑領(lǐng)域中熟知的一種或 多種添加劑?！椿诨虻囊呙纭悼梢栽诎袆?dòng)物的身體內(nèi)表達(dá)編碼多肽(a)至(C)的多核苷酸，從而可以在身體內(nèi) 誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生或細(xì)胞毒T細(xì)胞，并且可以實(shí)現(xiàn)與通過(guò)多肽施用達(dá)到的那些作用等同的作 用。具體地，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以包含編碼多肽(a)至(c)的多核苷酸也可以包含能 夠在體內(nèi)表達(dá)這種多肽的重組載體作為有效成分。能夠表達(dá)抗原多肽的這種重組載體也稱(chēng) 作“基于基因的疫苗”。不特別地限制用于制備基于基因的疫苗的載體，條件是它可以在靶動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu) 選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)目的多肽即可。它可以是質(zhì)粒或病毒載體，并且可以使用基于 基因的疫苗領(lǐng)域中已知的任意載體。多核苷酸如編碼所述多肽的DNA或RNA可以根據(jù)如上 所述的常規(guī)技術(shù)輕易地制備。另外，所述多核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法摻入載體。優(yōu)選地，基于基因的疫苗以腸胃外方式施用(例如，肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi) 施用)，并且可以根據(jù)抗原類(lèi)型或其他條件適當(dāng)?shù)剡x擇劑量。就每公斤體重基于基因的疫苗 的重量而言，劑量通常是約0. 1 μ g至lOOmg，并且優(yōu)選地是約1 μ g至10mg。涉及使用病毒載體的方法的實(shí)例包括其中編碼上述多肽的多核苷酸摻入RNA病 毒或DNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊 髓灰質(zhì)炎病毒或辛德比斯病毒并用所述病毒感染靶動(dòng)物的方法。涉及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺 病毒、腺相關(guān)病毒或痘苗病毒的方法是特別優(yōu)選的。其他方法的實(shí)例包括其中將表達(dá)質(zhì)粒直接施用至肌肉中的方法(DNA疫苗法)、脂 質(zhì)體法、Lipofectin法、顯微注射法、磷酸鈣法和電穿孔法，特別優(yōu)選DNA疫苗法和脂質(zhì)體法。本文中所用的編碼多肽的基因?qū)嶋H上允許通過(guò)將該基因直接導(dǎo)入身體的體內(nèi)方 法或其中給定細(xì)胞采樣自靶動(dòng)物、將該基因?qū)腚x體的細(xì)胞并隨后將所述細(xì)胞返回身體的 離體(ex vivo)方法作為藥用產(chǎn)品發(fā)揮作用(Nikkei kience (科學(xué)美國(guó)人日文版)，1994 年 4 月，第 20-45 頁(yè)，日本；Gekkan Yakuji (the Pharmaceuticals Monthly)，1994，第 36 卷，第1期，第23-48頁(yè)，日本Jikken Igaku Zoukan (實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊)，1994，第12卷，第15 期，日本；以及其中引用的文獻(xiàn))。更優(yōu)選體內(nèi)方法。當(dāng)藥劑通過(guò)體內(nèi)方法施用時(shí)，該藥劑可以根據(jù)治療目的的疾病、癥狀和其他狀況 通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩绞┯?。例如，施用可以靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)實(shí)施。例如，當(dāng)藥劑通過(guò)體內(nèi)方法施用時(shí)，該藥劑可以處于液體劑的形式。通常，該藥劑處于含有編碼本發(fā)明肽的 DNA作為有效成分的注射制劑形式，并且可以根據(jù)需要添加常見(jiàn)載體。另外，包含該DNA的 脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(例如，仙臺(tái)病毒(HVJ)-脂質(zhì)體)可以處于脂質(zhì)體制劑的形式，如 混懸液、冷凍劑或通過(guò)離心法濃縮的冷凍劑。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列”不僅指由SEQID NO :1實(shí)際上 顯示的核苷酸序列，還指與之互補(bǔ)的序列。因此，術(shù)語(yǔ)“具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列 的多核苷酸”指具有SEQ ID NO :1實(shí)際上所示核苷酸序列的單鏈多核苷酸、包含與SEQ ID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列的單鏈多核苷酸、和由此類(lèi)單鏈多核苷酸組成的雙鏈多核苷酸。當(dāng) 制備編碼本文中所用多肽的多核苷酸時(shí)，會(huì)選擇適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄小１绢I(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)輕 易地選擇這種適當(dāng)?shù)男蛄小?br> 實(shí)施例在下文，參考實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明，不過(guò)本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于下文 的具體實(shí)施例。實(shí)施例1 通過(guò)SEREX方法獲得新的癌抗原蛋白(l)cDNA文庫(kù)的制備通過(guò)酸胍_+酚-氯仿方法從健康犬的睪丸組織提取總RNA，并且使用 Oligotex_dT30mRNA純化試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，根據(jù)該試劑盒中包含的說(shuō)明書(shū) 純化 poly (A) RNA。使用獲得的mRNA(5yg)合成犬睪丸cDNA噬菌體文庫(kù)。使用cDNA合成試劑盒、 ZAP-cDNA 合成試劑盒和 ZAP-cDNA GigapackIII GoldCloning 試劑盒(STRATAGENE)，根據(jù) 各試劑盒中所包含的各份說(shuō)明書(shū)制備cDNA噬菌體文庫(kù)。制備的cDNA噬菌體文庫(kù)的大小是 7. 73X 105pfu/mlo(2)使用血清篩選cDNA文庫(kù)使用上述制備的犬睪丸cDNA噬菌體文庫(kù)實(shí)施免疫篩選。具體地，宿主大腸桿菌細(xì) 胞(XLl-Blue MRF，)用噬菌體文庫(kù)感染，每塊NZY瓊脂糖平板(Φ90χ 15mm)產(chǎn)生2210個(gè) 克隆，在42°C培養(yǎng)3至4小時(shí)以形成噬斑，該平板以IPTG (異丙基- β -D-硫代半乳糖苷) 浸透的硝化纖維素膜(HybondC Extra :GE Healthcare Bio-Science)在 37°C覆蓋 4 小時(shí) 以誘導(dǎo)并表達(dá)蛋白質(zhì)，并且將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到該膜上。此后，將該膜回收，浸泡在含有0.5%脫 脂乳的TBSdOmM Tris-HCl, 150mM NaCl，pH 7.5)中并在4°C振搖過(guò)夜以封閉非特異性反 應(yīng)。使該濾膜與500倍稀釋的臨床患病犬血清在室溫反應(yīng)2至3小時(shí)。就臨床患病犬的血清而言，使用從患有乳腺癌的犬采樣的血清。血清樣品貯藏 在-80°c并緊鄰使用前預(yù)處理。血清樣品按以下方式預(yù)處理。具體而言，宿主大腸桿菌細(xì)胞 (XLl-BLue MRF’)用其中未導(dǎo)入外來(lái)基因的λ ZAP表達(dá)噬菌體感染，并且培養(yǎng)隨后在NZY平 板培養(yǎng)基上于37°C過(guò)夜實(shí)施。隨后，添加含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHCO3緩沖液(pH 8. 3) 至該平板，使該平板在4°C靜置15小時(shí)，并且回收上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取物。隨 后，使得回收的大腸桿菌/噬菌體提取物流經(jīng)NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，并將 衍生自大腸桿菌/噬菌體的蛋白質(zhì)固定在該柱上。使臨床患病犬的血清流經(jīng)固定有蛋白質(zhì) 的柱以與其反應(yīng)，并且從血清中除去已經(jīng)吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經(jīng)流過(guò)該柱的血清級(jí)分用含有0. 5%干脫脂乳的TBS稀釋500倍，并且所得物用作免疫篩選樣品。已經(jīng)轉(zhuǎn)印上如此處理的血清和上文所提及融合蛋白的膜用TBS-T(0.05%吐溫 20/TBS)洗滌4次，使得已經(jīng)用含有0. 5%干脫脂乳的TBS稀釋5000倍作為第二抗體的 山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的BETHYL Laboratories)與該膜在室溫反應(yīng) 1小時(shí)，檢測(cè)通過(guò)使用NBT/BCIP反應(yīng)溶液(Roche)的酶顯色反應(yīng)實(shí)施，從NZY瓊脂糖平板 (Φ90χ 15mm)取出與顯色陽(yáng)性的區(qū)域相對(duì)應(yīng)的菌落，并將取出的菌落溶解于500 μ 1 SM緩 沖液(IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠，pH 7.5)。重復(fù)第二和第三 篩選直至顯色陽(yáng)性菌落以與上文所述相同的方式再呈現(xiàn)單個(gè)菌落，并且分離5個(gè)陽(yáng)性克隆 作為篩選與血清中IgG反應(yīng)的30940個(gè)噬菌體克隆的結(jié)果。(3)分離的抗原基因的同源性搜索為了使以上述方式分離的5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行核苷酸序列分析，將噬菌體載體轉(zhuǎn)變 成質(zhì)粒載體。具體地，調(diào)節(jié)至OD6tltlL 0的宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)的200 μ 1溶液與 250 μ 1純化的噬菌體溶液和1 μ 1 ExAssist輔助噬菌體(STRATAGENE)混合，使所得物在 37°C反應(yīng)15分鐘，添加:3ml LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37°C進(jìn)行2. 5至3小時(shí)，此后立即將培養(yǎng)產(chǎn) 物在水浴中于70°C孵育20分鐘，所得物在4°C和IOOOXg離心15分鐘并且將上清液作為 噬菌粒溶液回收。隨后，調(diào)節(jié)至OD6tltlL 0的噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)的200 μ 1溶液與 10 μ 1純化的噬菌體溶液混合，使所得物在37°C反應(yīng)15分鐘，50 μ 1所得物鋪在含有氨芐青 霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)在37°C過(guò)夜進(jìn)行。挑取轉(zhuǎn)化的SOLR 的單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)，并 且使用QIAGEN質(zhì)粒小量制備試劑盒01IAGEN)純化具有目的插入物的質(zhì)粒DNA。使用SEQ ID NO :31的T3引物和SEQ ID NO :32的T7引物，通過(guò)引物步行法，對(duì)純 化的質(zhì)粒進(jìn)行插入物全長(zhǎng)序列的分析。通過(guò)序列分析獲得SEQ ID N0:5、7、9、ll和13所示 的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列及其氨基酸序列(SEQ ID N0:6、8、10、12和14) 來(lái)使用同源性搜索程序BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，開(kāi)展與已知基因 的同源性搜索。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得的5個(gè)基因均編碼CAPRIN-I。這五個(gè)基因之間的序列 同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)100%的核苷酸序列同一性和99%的氨基酸序列 同一性。所述基因與編碼人同源物的基因的序列同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi) 94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO 1和3顯示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO 2和4顯示。所獲得的犬基因與編碼牛同 源物的基因的序列同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)94%的核苷酸序列同一性和 97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO: 15顯示并且其氨基酸序 列由SEQ ID N0:16顯示。編碼人同源物的基因與編碼牛同源物的基因之間的序列同一性 如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)94%的核苷酸序列同一性和93%至97%的氨基酸序列 同一性。所獲得的犬基因與編碼馬同源物的基因的序列同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的 區(qū)域內(nèi)93%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。馬同源物的核苷酸序列由 SEQ ID N0:17顯示并且其氨基酸序列由SEQID N0:18顯示。編碼人同源物的基因與編碼 馬同源物的基因之間的序列同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)93%的核苷酸序列 同一性和96%的氨基酸序列同一性。所獲得的犬基因與編碼小鼠同源物的基因的序列同一 性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)87%至89%的核苷酸序列同一性和95%至97%的氨
17基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列由SEQ IDN0:19、21、23、25和27顯示并且其氨 基酸序列由SEQ ID NO :20、22、24、26和28顯示。編碼人同源物的基因與編碼小鼠同源物 的基因之間的序列同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)89%至91%的核苷酸序列同 一性和95%至96%的氨基酸序列同一性。所獲得的犬基因與編碼雞同源物的基因的序列 同一性如下在待翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)82%的核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列 同一性。雞同源物的核苷酸序列由SEQ IDNO :29顯示并且其氨基酸序列由SEQ ID NO 30 顯示。編碼人同源物的基因與編碼雞同源物的基因之間的序列同一性如下在待翻譯成蛋 白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)81%至82%的核苷酸序列同一性和86%的氨基酸序列同一性。(4)組織中的基因表達(dá)分析通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢驗(yàn)以上述方式在犬和人正常組織及多種細(xì)胞株中獲 得的基因的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄按照以下方式實(shí)施。具體地，使用TRIzoI試劑(Invitrogen)，按照 其中包含的方案從50至IOOmg組織樣品和各細(xì)胞株5至IOx IO6個(gè)細(xì)胞中提取總RNA。使 用針對(duì)RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用 提取的總RNA合成cDNA。使用對(duì)所獲得基因特異的引物(由SEQ ID NO 33和34顯示)，按 照以下方式實(shí)施PCR。具體地，將諸試劑(0. 25 μ 1通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄制備的樣品，2 μ M每種引物， 0. 2mM每種dNTP和0. 65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))與附帶的緩沖液混合 以調(diào)節(jié)至達(dá)到25 μ 1總體積。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進(jìn)行以下30個(gè)循 環(huán)反應(yīng)94°C 30秒，60°C 30秒和72°C 30秒。上述基因特異性引物用來(lái)擴(kuò)增由SEQ IDNO 5 顯示的核苷酸序列(即，犬CAPRIN-I基因)第206至632位核苷酸的區(qū)域和由SEQ ID NO 1顯示的核苷酸序列(即，人CAPRIN-I基因)第698至1124位核苷酸的區(qū)域。出于比較， 同時(shí)使用GAPDH特異性引物(如SEQ ID NO :35和36所顯示)。作為結(jié)果，在健康犬的睪 丸組織中觀察到強(qiáng)表達(dá)，并且在犬乳腺癌及腺癌組織中觀察到表達(dá)，如圖1中顯示。此外， 還檢測(cè)了所獲得基因的人同源物的表達(dá)，并且如同犬CAPRIN-I基因的情況那樣，在正常組 織的情況下，僅在睪丸中觀察到其表達(dá)。然而，在類(lèi)型多樣的癌細(xì)胞系如乳腺癌、腦腫瘤、白 血病、肺癌和食道癌細(xì)胞系中檢測(cè)到人同源物的表達(dá)，并且，尤其在許多乳腺癌細(xì)胞系中觀 察到其表達(dá)。所述結(jié)果說(shuō)明，在除睪丸組織之外的正常組織中觀察不到CAPRIN-I表達(dá)，然 而，CAPRIN-I在許多癌細(xì)胞中并且尤其在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。在圖1中，縱軸上的參考編號(hào)1顯示上文所鑒定基因的表達(dá)模式并且參考編號(hào)2 顯示對(duì)照GAPDH基因的表達(dá)模式。(5)免疫組織化學(xué)染色(5)-1 小鼠和犬正常組織中的CAPRIN-I表達(dá)小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/異氟烷麻 醉下放血，打開(kāi)腹腔，并將器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、 唾液腺、大腸、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉(zhuǎn)移至盛有PBS的 ΙΟ-cm平皿。所述器官在PBS中切開(kāi)并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在回流條件下固定過(guò)夜。棄去回流液，用PBS淋洗所述器官的組織表面，將含有10% 蔗糖的PBS溶液導(dǎo)入50-ml離心管，并將組織導(dǎo)入其中并且使用旋轉(zhuǎn)器在4°C振搖2小時(shí)。 將所得物轉(zhuǎn)移到含有20%蔗糖的PBS溶液中，使其在4°C靜置直至組織沉降，并且隨后將組 織轉(zhuǎn)移到含有30%蔗糖的PBS溶液中并使其在4°C靜置直至組織沉降。取出組織并使用手術(shù)刀切下必需的區(qū)域。隨后，將OCT化合物(Tissue Tek)施加至組織表面并隨后將組織 置于Cryomold上。在Cryomold置于干冰上并迅速冷凍后，使用冷凍切片機(jī)(LEICA)，將組 織切成厚度10 μ m至20 μ m，并且載玻片上的組織切片用電吹風(fēng)進(jìn)行30分鐘風(fēng)干以制備其 上具有組織切片的載玻片。隨后，將所述載玻片引入充滿(mǎn)PBS-T(含有0.05%吐溫20的生 理鹽水)的染色缸，將PBS-T每隔5分鐘替換為新鮮的PBS-T，并且該流程重復(fù)3次。使用 低塵擦拭紙(Kimwipes)擦掉切片周?chē)亩嘤嗨郑肈akopen(DAKO)圈定切片，將MOM小 鼠Ig封閉試劑(VECTASTAIN)置于小鼠組織上作為封閉液，將含有10%胎牛血清的PBS-T 溶液置于犬組織上作為封閉液，并且使這些切片置于保濕室中在室溫持續(xù)1小時(shí)。隨后，在 切片上施加用封閉液調(diào)節(jié)為10μ g/ml的包含針對(duì)CAPRIN-I的、與參考例1制備的癌細(xì)胞 表面反應(yīng)的具有SEQ ID NO :78的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :79的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗 體的溶液，并且使所得物在保濕室中于4°C靜置過(guò)夜。在載玻片用PBS-T持續(xù)10分鐘洗滌 3次后，添加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標(biāo)記的抗IgG抗體(VECTASTAIN)并隨后使 之在保濕室中于室溫靜置1小時(shí)。在載玻片用PBS-T持續(xù)10分鐘洗滌3次后，將抗生物 素蛋白-生物素ABC試劑(VECTASTAIN)施加在載玻片上并隨后使之在保濕室中于室溫靜 置5分鐘。在載玻片用PBS-T持續(xù)10分鐘洗滌3次后，將DAB顯色溶液(IOmg DAB+10 μ 1 30% Η202/0. 05Μ Tris-HCl，pH 7.6,50ml)施加在載玻片上并隨后使之在保濕室中于室溫 靜置30分鐘。載玻片用蒸餾水淋洗，將蘇木精試劑(DAKO)施加在載玻片上，并且使載玻片 在保濕室中于室溫靜置1分鐘，隨后用蒸餾水淋洗。載玻片依次地浸在70%、80%、90%、 95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過(guò)夜。取出載玻片，用 Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在唾液腺、腎、結(jié)腸和胃組織的 細(xì)胞內(nèi)觀察到弱的CAPRIN-I表達(dá)；然而在細(xì)胞的表面上觀察不到其表達(dá)，并且在從其他器 官衍生的組織中觀察不到表達(dá)。(5)-2 犬乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達(dá)使用已經(jīng)通過(guò)病理診斷法診斷為患有惡性乳腺癌的犬的108份冷凍乳腺癌組織 標(biāo)本來(lái)制備其上包含冷凍切片的載玻片并且使用針對(duì)CAPRIN-I的單克隆抗體以如上文所 述相同的方式實(shí)施免疫組織化學(xué)染色，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID N0:78的重鏈可 變區(qū)和SEQ ID NO 79的輕鏈可變區(qū)。作為結(jié)果，在108份標(biāo)本的100份(92. 5% )中觀察 到CAPRIN-I表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)CAPRIN-I表達(dá)在異型度高的癌細(xì)胞表面上是特別強(qiáng)烈的。(5)-3 人乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達(dá)對(duì)石蠟包埋的人乳腺癌組織陣列(BIOMAx)上的188份乳腺癌組織標(biāo)本實(shí)施免疫 組織化學(xué)染色。該人乳腺癌組織陣列在60°C處理3小時(shí)，將該陣列導(dǎo)入充滿(mǎn)二甲苯的染色 缸，將二甲苯每隔5分鐘替換為新鮮的二甲苯，并且該流程重復(fù)3次。隨后，重復(fù)相似流程， 使用乙醇和PBS-T替代二甲苯。人乳腺癌組織陣列導(dǎo)入用含有0. 05%吐溫20的IOmM檸檬 酸緩沖液(PH 6.0)充滿(mǎn)的染色缸，該陣列在125°C處理5分鐘，并且該陣列在室溫靜置至少 40分鐘。使用低塵擦拭紙(Kimwipes)擦掉切片周?chē)亩嘤嗨?，用Dakopen(DAKO)圈定切 片，并且向其逐滴添加足夠量的過(guò)氧化物酶阻斷劑(DAKO)。使該陣列在室溫靜置5分鐘后， 將該陣列導(dǎo)入充滿(mǎn)PBS-T的染色缸，將PBS-T每隔5分鐘替換為新鮮的PBS-T，并且該流程 重復(fù)3次。將含有10% FBS的PBS-T溶液施加在該陣列上作為封閉液，并且使該陣列置于 保濕室中在室溫持續(xù)1小時(shí)。隨后，在該陣列上施加用含有5% FBS PBS-T溶液調(diào)節(jié)以包含10 μ g/ml針對(duì)CAPRIN-I的單克隆抗體的溶液，并且使該陣列在保濕室中于4°C靜置過(guò)夜， 其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO 78的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 79的輕鏈可變區(qū)， 與參考例1制備的癌細(xì)胞表面反應(yīng)。在該陣列用PBS-T持續(xù)10分鐘洗滌3次后，將足夠量 的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO)逐滴添加至該陣列，并且隨后使陣列 在保濕室中于室溫靜置30分鐘。該陣列用PBS-T持續(xù)10分鐘洗滌3次后，在其上施加DAB 顯色液(DAKO)，使該陣列在室溫靜置約10分鐘，并且棄去顯色液。該陣列用PBS-T持續(xù)10 分鐘洗滌3次，用蒸餾水淋洗，依次地浸在70 %、80 %、90 %、95 %和100 %乙醇溶液中，每次 1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過(guò)夜。取出載玻片，用GlycergeI封片介質(zhì)(DAKO)封 片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在全部188份乳腺癌組織標(biāo)本的138份(73% )中觀察到強(qiáng) 烈的CAPRIN-I表達(dá)。(5)-4 人惡性腦腫瘤中的CAPRIN-I表達(dá)用針對(duì)CAPRIN-I的單克隆抗體以如上文(5)_3中相同的方式對(duì)石蠟包埋的人惡 性腦腫瘤組織陣列(BIOMAX)上的247份惡性腦腫瘤組織標(biāo)本實(shí)施免疫組織化學(xué)染色，其中 所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO :78的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :79的輕鏈可變區(qū)。作 為結(jié)果，在全部247份惡性腦腫瘤組織標(biāo)本的227份(92% )中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-I表達(dá)。(5)-5 人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中的CAPRIN-I表達(dá)用針對(duì)CAPRIN-I的單克隆抗體以如上文(5)_3中相同的方式對(duì)石蠟包埋的人乳 腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織陣列(BIOMAX)上的150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織標(biāo)本實(shí)施免 疫組織化學(xué)染色，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO: 78的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 79 的輕鏈可變區(qū)。作為結(jié)果，在全部150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織標(biāo)本的136份(90% ) 中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-I表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CAPRIN-I表達(dá)在轉(zhuǎn)移自乳腺癌的癌組織中是強(qiáng)烈的。參考例1 制備針對(duì)CAPRIN-I的單克隆抗體100 μ g在實(shí)施例2中制備的SEQ ID NO :2的抗原蛋白(人CAPRIN-1)與等量的 MPL+TDM佐劑(Sigma Corporation)混合，并且將該混合物用作每只小鼠的抗原溶液。該抗 原液腹膜內(nèi)地施用至6周齡的Balb/c小鼠(Japan SLC, Inc.)，并且每周施用該溶液多于 3次。將終末免疫3日后取出的脾臟夾在兩片無(wú)菌的載玻片之間、研磨，用PBS(-) (Nissui) 洗滌并以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，并且取出上清液。該流程重復(fù)3次以獲得脾臟細(xì)胞。 獲得的脾臟細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)以10 1混合，向其添加PEG溶液， 其中所述的PEG溶液通過(guò)將200 μ 1含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基與800 μ 1在37°C 加熱的PEG1500 (Boehringer)混合而制備，并且使所得物靜置5分鐘以進(jìn)行細(xì)胞融合。所 得物以1700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取出上清液，將細(xì)胞懸浮于150ml已經(jīng)添加2%等量HAT 溶液(Gibco)的含有15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)中，并且將100 μ 1 細(xì)胞懸液鋪種于15塊96孔平板(Nunc)的各孔中。培養(yǎng)在37°C于5% CO2中進(jìn)行7日以 獲得因脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。使用由所得雜交瘤產(chǎn)生的抗體對(duì)CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇雜 交瘤。將實(shí)施例2中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96 孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時(shí)。各孔用PBS-T洗滌3次，以每孔400 μ 1的量添加 0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma Corporation)，并且使該平板在室溫靜置3小時(shí)。移走該溶液，各孔用每孔400 μ 1的PBS-T洗滌3次，以每孔100 μ 1的量添加上文獲得的雜 交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時(shí)。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔 100 μ 1的量添加用PBS稀釋5，000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L)抗體(Invitrogen)，并 且使該平板在室溫靜置1小時(shí)。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ 1的量添加TMB 底物溶液(Thermo)，并且使該平板靜置15至30分鐘以進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每 孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，并且使用吸光度計(jì)測(cè)定在450nm和在595nm的 吸光度。作為結(jié)果，選出了產(chǎn)生具有高吸光度值的抗體的多株雜交瘤。將選出的雜交瘤以每孔0. 5個(gè)細(xì)胞的量添加至96孔平板并培養(yǎng)。1周后，在多個(gè) 孔內(nèi)觀察到一些雜交瘤形成單個(gè)集落。進(jìn)一步培養(yǎng)此類(lèi)孔中的細(xì)胞，并且使用從克隆的雜 交瘤產(chǎn)生的抗體對(duì)CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇雜交瘤。將實(shí)施例2中制備 的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C 靜置18小時(shí)。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔400 μ 1的量添加0. 5% BSA溶液，并且 使該平板在室溫靜置3小時(shí)。移走該溶液，各孔用每孔400 μ 1的PBS-T洗滌3次，以每孔 100 μ 1的量添加上文獲得的雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時(shí)。在各 孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ 1的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠 IgG(H+L)抗體(Invitrogen)，并且使該平板在室溫靜置1小時(shí)。在各孔用PBS-T洗滌3次 后，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且使該平板靜置15至30分鐘以進(jìn) 行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)，并且使用吸光 度計(jì)測(cè)定在450nm和在595nm的吸光度。作為結(jié)果，獲得了產(chǎn)生與CAPRIN-1蛋白顯示反應(yīng) 性的單克隆抗體的多個(gè)雜交瘤株，使用G蛋白載體純化雜交瘤的培養(yǎng)上清液以獲得150個(gè) 與CAPRIN-I蛋白結(jié)合的單克隆抗體。隨后，在上述單克隆抗體當(dāng)中選出與表達(dá)CAPRIN-I的乳腺癌細(xì)胞的表面具有反 應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在1. 5ml微量離心管中離心人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231V的 IO6個(gè)細(xì)胞，添加100μ 1上文制備的雜交瘤上清液至其中，并且使所得物在冰上靜置1小 時(shí)。在平板用PBS洗滌后，添加用含有0. 胎牛血清的PBS稀釋500倍的FITC標(biāo)記的山 羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)，并且使該平板在冰上靜置1小時(shí)。在平板用PBS洗滌后， 使用FACSCalibur (Becton Dickinson)測(cè)量熒光強(qiáng)度。另外，作為對(duì)照，實(shí)施除添加培養(yǎng)基 替代抗體之外的相同程序。作為結(jié)果，選出了 11個(gè)顯示比對(duì)照更強(qiáng)熒光強(qiáng)度的單克隆抗 體；即，選出了 11個(gè)與乳腺癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體之一的重鏈可 變區(qū)的序列由SEQID NO 78顯示，并且其輕鏈可變區(qū)的序列由SEQ ID NO 79顯示。實(shí)施例2 制備新的犬和人癌抗原蛋白(1)重組蛋白的制備使用實(shí)施例1中獲得的SEQ ID NO 5的基因以下文所述方式制備重組蛋白。試 劑(從實(shí)施例1中獲得的噬菌粒溶液制備并經(jīng)過(guò)序列分析的載體(1 μ 1)、0. 4 μ M含有NdeI 和KpnI限制性位點(diǎn)的兩種類(lèi)型的引物(SEQ IDN0:37和38)中每種引物、0. 2mM dNTP禾口 1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd·))與附帶的緩沖液混合以調(diào)節(jié)至達(dá) 到總體積50 μ 1。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)98°C 10秒和 680C 1.5分鐘的反應(yīng)。使用上述兩種引物來(lái)擴(kuò)增編碼SEQ ID NO :6的全長(zhǎng)氨基酸序列的區(qū) 域。在實(shí)施PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約1. 4kbp的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI 限制性酶處理已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了匹配于目的序列的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得 物，并且將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌表達(dá)載體(pET30b， Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21(DE3)中并用ImM IPTG誘導(dǎo)以在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。另外，使用SEQ ID NO :7的基因以下文所述方式制備犬同源基因的重組蛋白。試 劑(通過(guò)RT-PCR在實(shí)施例1中所制備的組織或細(xì)胞cDNA當(dāng)中證實(shí)其表達(dá)的cDNA(l μ 1)、 0.4μ M含有NdeI和KpnI限制性位點(diǎn)的兩種類(lèi)型的引物(SEQ ID NO 39和40)中每種引物、 0. 2mM dNTP和 1. 25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))與附帶的緩沖液混 合以調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進(jìn)行30個(gè)循環(huán) 980C 10秒和68°C 2. 5分鐘的反應(yīng)。使用上述兩種引物來(lái)擴(kuò)增編碼SEQ ID NO 8的全長(zhǎng)氨 基酸序列的區(qū)域。在實(shí)施PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick 凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約2. 2kbp的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI 限制性酶處理已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了匹配于目的序列的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得 物，并且將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌表達(dá)載體(pET30b， Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21(DE3)中并用ImM IPTG誘導(dǎo)以在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。使用SEQ ID NO 1的基因以下文所述方式制備人同源基因的重組蛋白。試劑(通 過(guò)RT-PCR在實(shí)施例1中所制備的組織或細(xì)胞cDNA當(dāng)中證實(shí)其表達(dá)的cDNA(l μ 1)、0. 4 μ M 含有SacI和XhoI限制性位點(diǎn)的兩種類(lèi)型的引物(SEQ ID NO :41和42)中每種引物、0. 2mM dNTP和1. 25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))與附帶的緩沖液混合以調(diào) 節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)98°C 10 秒和68°C 2. 5分鐘的反應(yīng)。使用上述兩種引物來(lái)擴(kuò)增編碼SEQ ID NO 2的全長(zhǎng)氨基酸序 列的區(qū)域。在實(shí)施PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提 取試劑盒(QIAGEN)純化約2. Ikbp的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用SacI和XhoI 限制性酶處理已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了匹配于目的序列的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得 物，并且將目的基因序列插入用SacI和XhoI限制性酶處理的大腸桿菌表達(dá)載體(pET30a， Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21(DE3)中并用ImM IPTG誘導(dǎo)以在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。(2)重組蛋白的純化表達(dá)上文所獲得的SEQ ID NO :1、5或7的基因的重組大腸桿菌細(xì)胞在含有30 μ g/ ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)直至在600nm的吸光度變成大約0. 7，添加異丙 基- β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，并且培養(yǎng)在37°C進(jìn)行4小時(shí)。此后，將細(xì)胞以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘和收獲。將細(xì)胞沉淀懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，所得 物以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心額外的10分鐘，并隨后洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中并在冰上超聲破碎。超聲破碎的大腸桿菌 細(xì)胞的溶液以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，所得的上清液稱(chēng)為可溶性級(jí)分，并且沉淀稱(chēng)為不 溶性級(jí)分。將可溶性級(jí)分添加至根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備的鎳螯合柱(載體=Chelateing Sepharose FastFlow (GE Health Care)；柱體積5ml ；平衡緩沖液50mM 鹽酸緩沖液 pH 8. 0)。用10個(gè)柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH 8. 0)和含有20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖 液(pH 8. 0)洗去未吸附的級(jí)分，隨后立即用6個(gè)床體積的含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩 沖液(pH 8.0)洗脫。用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗脫的級(jí)分添加 至強(qiáng)陰離子交換柱(載體:Q Sepharose Fast Flow(GE Health Care)；柱體積:5ml ；20mM 磷酸鹽緩沖液(PH 8.0)作為平衡緩沖液)，在所述級(jí)分中已通過(guò)考馬斯染色法證實(shí)了目的 蛋白的洗脫。用10個(gè)柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)和含有200mM氯化鈉的20mM 磷酸鹽緩沖液(PH7. 0)洗去未吸附的級(jí)分，隨后立即用5個(gè)床體積的含有400mM氯化鈉的 20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗脫。獲得了各自包含SEQ ID NO :2、6和8所示氨基酸序列 的蛋白質(zhì)的純化級(jí)分并隨后將它們指定為用于施用試驗(yàn)的材料。通過(guò)上述方法獲得的純化樣品的部分(200 μ 1)分散到Iml的反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl2, pH 7.4)中，添加 2μ1 腸激酶(Novagen)，使所得物在室溫 靜置過(guò)夜，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，切除His標(biāo)簽，并且使用腸激酶切割捕獲試劑盒(Novagen)，根 據(jù)隨附的說(shuō)明書(shū)實(shí)施純化。隨后，通過(guò)使用Nanos印IOK Omega(Pall)的超濾法，對(duì)1.2ml 由上述方法獲得的純化樣品進(jìn)行磷酸鹽緩沖的生理鹽水(Nissui)的緩沖液置換，通過(guò)HT Tuffryn Acrodisc (孔徑0. 22 μ m, Pall)實(shí)施除菌過(guò)濾，并且所得物用于以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3 施用重組蛋白至患癌犬的試驗(yàn)(1)抗腫瘤評(píng)價(jià)對(duì)表皮上具有腫瘤的患癌犬(乳腺癌)進(jìn)行上文所純化重組蛋白的抗腫瘤作用的 評(píng)價(jià)。以上述方式純化的具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的重組多肽(lOOyg， 0.5ml)與相等量的弗氏不完全佐劑(Wako Pure Chemicallndustries, Ltd.)混合以制備 癌癥治療劑。所得藥劑作為初始施用及此后3日和7日總共3次施用至腫瘤附近的局部淋 巴結(jié)。作為結(jié)果，施用癌癥治療劑時(shí)大小約86mm3的腫瘤在初始施用后10日、20日和30日 分別縮小至55mm3、30mm3和20mm3。0. 5ml具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重組多肽與0. 5ml弗氏不完全佐劑的 混合物以與上文所述相同的方式總共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外，100μ g犬 白細(xì)胞介素12與該藥劑一起同時(shí)施用。作為結(jié)果，施用癌癥治療劑時(shí)大小約123mm3的腫 瘤在初始施用該癌癥治療劑后45日徹底退縮。另外，0.5ml具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的重組多肽與0. 5ml弗氏不完全 佐劑的混合物以與上文所述相同的方式總共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外， IOOyg犬白細(xì)胞介素12與該藥劑一起同時(shí)施用。作為結(jié)果，施用癌癥治療劑時(shí)大小約 96mm3的腫瘤在初始施用該癌癥治療劑后27日徹底退縮。
(2)免疫誘導(dǎo)能力的評(píng)價(jià)在施用前和初始施用后10日和30日獲得臨床患病的犬的血液樣本，其中具有SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的重組多肽已經(jīng)在上文(1)中進(jìn)行 的施用試驗(yàn)中施用至所述犬；根據(jù)常規(guī)技術(shù)分離外周血單核細(xì)胞；并且使用所述外周血單 核細(xì)胞，通過(guò)IFN γ的ELISpot測(cè)定法評(píng)價(jià)該重組蛋白的免疫誘導(dǎo)能力。以 100μ 1/孔的量添加 70 % 乙醇至 96 孔平板(MultiScreen-IP，MAIPS4510， Millipore)，該平板靜置5分鐘，吸棄乙醇，該平板用滅菌水洗滌，以300 μ 1/孔的量添加 200mM碳酸氫鈉(pH 8. 2)，該平板靜置5分鐘，吸棄碳酸氫鈉，并且洗滌該平板。隨后，將添 加至200mM碳酸氫鈉的抗犬干擾素γ單克隆抗體(克隆142529，MAB781，R&D)以0. 5 μ g/ 孔的量添加至該平板，在37°C實(shí)施過(guò)夜孵育，并且第一抗體固定化。在吸棄溶液中的第一 抗體后，以300 μ 1/孔的量添加封閉液(1% BSA-5%蔗糖-200mM碳酸氫鈉，pH 8. 2)，并且 在4°C實(shí)施過(guò)夜孵育以封閉該平板。在吸棄封閉液后，以300 μ 1/孔的量添加含有10%胎 牛血清的RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)，該平板靜置5分鐘，并且吸棄培養(yǎng)基。此后，以5Χ IO5 個(gè)細(xì)胞/孔的量添加懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中的犬外周血單核細(xì)胞至該 平板，以10 μ 1/孔的量添加施用所使用的犬衍生多肽或人衍生多肽至該平板，并且培養(yǎng)在 37°C于5% CO2下進(jìn)行24小時(shí)，旨在從外周血單核細(xì)胞當(dāng)中的免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素Y。在 進(jìn)行培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)基，并且各孔用洗液(0. 吐溫，20-200mM碳酸氫鈉，pH 8. 2)洗滌6 次。以100 μ 1/孔的量添加用封閉液稀釋1，000倍的兔抗犬多克隆抗體至該平板并隨后在 4°C孵育過(guò)夜。在各孔用上述洗液洗滌3次后，以100 μ 1/孔的量添加用封閉液稀釋1，000 倍的HRP-標(biāo)記的抗兔抗體至該平板，并且使反應(yīng)在37°C進(jìn)行2小時(shí)。在各孔用上述洗液洗 滌3次后，借助Konica immunostain(Konica)顯現(xiàn)顏色，并且所述孔用水洗滌以終止反應(yīng)。 在反應(yīng)終止后，將膜干燥，并且使用KS Elispot (Carl Zeiss)計(jì)數(shù)顯色的點(diǎn)的數(shù)目。作為 結(jié)果，在多肽施用前的臨床患病犬的外周血單核細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到顯色點(diǎn)。然而，在施用多 肽后的情況下，在施用后10日和30日從已經(jīng)施用具有SEQID NO :6所示氨基酸序列的重組 多肽的臨床患病犬獲得的外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到13個(gè)和82個(gè)點(diǎn)。另外，在已經(jīng)施用具 有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的重組多肽的臨床患病犬的情況下，在施用后10日和30 日的外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到53個(gè)和189個(gè)點(diǎn)。另外，在已經(jīng)施用具有SEQ IDNO 8所示 氨基酸序列的重組多肽的臨床患病犬的情況下，在施用后10日和30日的外周血單核細(xì)胞 中檢測(cè)到32個(gè)和117個(gè)點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明，應(yīng)答于已經(jīng)施用的重組蛋白而特異性產(chǎn)生干擾素Y的免疫細(xì)胞 在已經(jīng)施用該重組多肽的臨床患病犬中被誘導(dǎo)。所述結(jié)果還說(shuō)明，此類(lèi)免疫細(xì)胞發(fā)揮中心 作用的免疫反應(yīng)產(chǎn)生上文(1)中所述的抗腫瘤作用。實(shí)施例4 =DNA疫苗的抗腫瘤作用使用SEQ ID NO 19的基因按以下方式制備重組質(zhì)粒。試劑(按照與實(shí)施例1⑷ 中相同的方式從其中已經(jīng)觀察到CAPRIN-I表達(dá)的小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞系(CT26，購(gòu)自ATCC) 提取的cDNA(lμl)、0.4μM兩種類(lèi)型的引物(SEQ ID NO :80和81)中每種引物、0. 2mM dNTP 和1.25U PrimeSTARHS聚合酶)與附帶的緩沖液混合以調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50 μ 1。使用 ThermalCycler,使所得物進(jìn)行以下30個(gè)循環(huán)的PCR :98°C 10秒，55°C 15秒和72°C 4分鐘。 使用上述兩種引物來(lái)擴(kuò)增編碼SEQ ID NO :20的全長(zhǎng)氨基酸序列的區(qū)域。在實(shí)施PCR后，擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒純化約2，IOObp的 DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，分析片段的序列，并且獲得具有與目的序列匹配的擴(kuò)增基因片段 的質(zhì)粒。該質(zhì)粒用EcoRI限制性酶處理，所得物用QIAquick凝膠提取試劑盒純化，并將 目的基因序列插入根據(jù)常規(guī)技術(shù)用EcoRI限制性酶處理的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pcDNA3. 1， Invitrogen)。將50 μ g 金粒子(Bio Rad)、100 μ 1 精胺(SIGMA)和 100 μ 1 的 IM CaCl2 添加至 上文制備的100 μ g質(zhì)粒DNA，通過(guò)渦旋混合器攪拌混合物，并且使所得物在室溫靜置10分 鐘(下文稱(chēng)作“金-DNA粒子”)。在混合物以3，000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘后，棄去上清液， 并且粒子用100%乙醇洗滌3次。添加100%乙醇(6ml)至金-DNA粒子，通過(guò)渦旋混合器 徹底攪拌所得物，并且將金-DNA粒子導(dǎo)入Tefzel Tubing (Bio Rad)并沉淀在壁上。將附 著有金-DNA粒子的Tefzel Tubing中的乙醇進(jìn)行風(fēng)干并且將干燥的管狀物切割成適合于 基因槍?xiě)?yīng)用的長(zhǎng)度。CT26細(xì)胞以IO6個(gè)細(xì)胞/小鼠的量皮下地植入20只BalbA^jHll (JapanSLC，Inc.) 的背部區(qū)并且生長(zhǎng)成大約7mm直徑的腫瘤。此后，將上文制備的管狀物固定在基因槍上， 使用純氦氣以400psi壓力經(jīng)皮施用至剃毛小鼠的腹腔(接種的質(zhì)粒DNA的量是2 μ g/小 鼠)，并且評(píng)價(jià)抗腫瘤作用。作為結(jié)果，腫瘤在已經(jīng)施用不包含CAPRIN-I基因的空質(zhì)粒的10只對(duì)照小鼠中變 大并且這10只小鼠在腫瘤移植后63日全部死亡。然而，在已經(jīng)施用了包含插入其中的 CAPRIN-I基因的質(zhì)粒的10只小鼠中，腫瘤在腫瘤移植后25日完全退縮，并且全部小鼠在腫 瘤移植后63日仍存活，此時(shí)全部對(duì)照小鼠死亡。實(shí)施例5 誘導(dǎo)肽表位反應(yīng)性⑶8+T細(xì)胞(1) HLA-A0201結(jié)合肽基序和HLA-A24結(jié)合肽基序的預(yù)測(cè)人CAPRIN-I多肽的氨基酸序列信息從GenBank獲得。為了預(yù)測(cè)HLA-A0201結(jié)合 肽基序和HLA-A24結(jié)合肽基序，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)程序，使用已知的BIMAS軟件(在http // bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/可獲得)分析人CAPRIN-1多肽的氨基酸序列，選 出了預(yù)測(cè)能夠與HLA-A0201分子結(jié)合的由SEQ ID NO 43至SEQ ID NO 71顯示的29種肽 和預(yù)測(cè)能夠與HLA-A24分子結(jié)合的由SEQ ID NO 72至SEQ ID NO 76顯示的5種肽。(2)誘導(dǎo)肽表位反應(yīng)性⑶8+T細(xì)胞外周血從HLA-A0201陽(yáng)性健康個(gè)體分離，覆以淋巴細(xì)胞分離介質(zhì) (OrganonpTeknika, Durham, NC)并以1，500轉(zhuǎn)/分鐘在室溫離心20分鐘。將含有PBMC的 級(jí)分回收并在冷的磷酸鹽緩沖液中洗滌3次(或多次)以獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。使 獲得的PBMC懸浮于20ml的AIM-V培養(yǎng)基(Life Technologies)中并在37°C于5% CO2 T 黏附至培養(yǎng)瓶(Falcon) 2小時(shí)。未貼壁的細(xì)胞用于T細(xì)胞制備并且貼壁的細(xì)胞用于樹(shù)突細(xì) 胞制備。貼壁的細(xì)胞在AIM-V 培養(yǎng)基中在 IL-4(1, 000U/ml)和 GM-CSF (1，000U/ml)存在 下培養(yǎng)。6日后，將該培養(yǎng)基交換為已經(jīng)添加了 IL-4(l，000U/ml)、GM-CSF(l，000U/ml)、 IL-6(1,000U/ml, Genzyme, Cambridge, ΜΑ)、IL-I β (10ng/ml, Genzyme, Cambridge, ΜΑ)禾口
25TNF- α (10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的另一種 AIM-V 培養(yǎng)基，培養(yǎng)進(jìn)行額外 2 日，并 且使用所獲得的未貼壁細(xì)胞群體作為樹(shù)突細(xì)胞。將制備的樹(shù)突細(xì)胞以細(xì)胞密度IX IO6個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于AIM-V培養(yǎng)基中，以 10yg/ml向該培養(yǎng)基添加上文(1)中所選擇的預(yù)測(cè)能夠與HLA-A0201分子結(jié)合的由SEQ ID N0:43至SEQ ID NO :71顯示的肽，并且培養(yǎng)在37°C于5% CO2下使用96孔平板進(jìn)行4小時(shí)。 在進(jìn)行培養(yǎng)后，所述細(xì)胞用X射線(xiàn)(3，OOOrad)照射，用AIM-V培養(yǎng)基洗滌，懸浮于含有10% 人 AB 血清(Nabi，Miami, FL)、IL-6(1, 000U/ml)和 IL-12 (10ng/ml，Genzyme, Cambridge, MA)的AIM-V培養(yǎng)基中并以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至24孔平板。另外，以IX IO6個(gè) 細(xì)胞/孔的量添加制備的T細(xì)胞群體并將其在37°C于5% CO2下培養(yǎng)。7日后棄去培養(yǎng)上 清液，用以上述方式獲得的肽處理并隨后用X射線(xiàn)照射的樹(shù)突細(xì)胞懸浮于含有10%人AB血 清(Nabi, Miami, FL)、IL_7(10U/ml，Genzyme, Cambridge, MA)和 IL_2(10U/ml，Genzyme, Cambridge, ΜΑ)的AIM-V培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度1 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)，將所述細(xì)胞以Ix IO5 個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至24孔平板并且再度進(jìn)行培養(yǎng)。在此流程每隔7日重復(fù)一次，重復(fù)4 至6次后，回收刺激的T細(xì)胞并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)⑶8+T細(xì)胞誘導(dǎo)。就預(yù)測(cè)能夠與HLA-A24分子結(jié)合的SEQ ID NO 72至SEQ ID NO 76的肽而言，使 用從HLA-A24陽(yáng)性健康個(gè)體的外周血中誘導(dǎo)的樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞群體，也按照與上文所述 相同的方式嘗試了誘導(dǎo)肽表位反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，使用具有本發(fā)明范圍之外的序列(SEQ ID NO 77)的肽。實(shí)施例6 細(xì)胞毒T細(xì)胞抗原表位的確定(1)產(chǎn)生IFN-γ的能力為了研究實(shí)施例5(2)中誘導(dǎo)的T細(xì)胞中觀察到增殖的T細(xì)胞分別對(duì)肽表位的特 異性，將5X IO3個(gè)T細(xì)胞添加至5xl04個(gè)預(yù)計(jì)能夠與HLA-A0201分子結(jié)合的各肽脈沖的、表 達(dá) HLA-A0201 分子的 T2 細(xì)胞(Salter RD 等人，Immunogenetics, 21 :235_246，1985，T2 細(xì) 胞購(gòu)自ATCC)(所述各肽以10 μ g/ml添加至AIM-V培養(yǎng)基并且在37°C于5% CO2下培養(yǎng)4 小時(shí))，并且所得物在96孔平板上于含有10%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。 培養(yǎng)后收集上清液并且通過(guò)ELISA測(cè)量所產(chǎn)生IFN-γ的量。作為結(jié)果，在從其中使用了以 肽SEQ ID N0:43至SEQ ID NO :71脈沖的T2細(xì)胞的孔中獲得的培養(yǎng)上清液中比從其中不 使用以肽脈沖的T2細(xì)胞的孔中獲得的培養(yǎng)上清液中更多地觀察到IFN-Y產(chǎn)生(圖2)。所 述結(jié)果說(shuō)明，上述肽是能夠特異性刺激HLA-A0201+⑶8+T細(xì)胞增殖以誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的T 細(xì)胞表位肽。以與上文所述相同的方式，按照以下方式研究了實(shí)施例5(2)中使用肽SEQ ID NO 72至SEQ ID NO :76所誘導(dǎo)的肽表位反應(yīng)性⑶8+Τ細(xì)胞對(duì)所述肽表位的特異性。具體地， 針對(duì)肽脈沖的、表達(dá)HLA-A24分子的JTK-LCL細(xì)胞(JTK-LCL細(xì)胞購(gòu)自日本RIKEN)，通過(guò) ELISA測(cè)量T細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生水平。作為結(jié)果，在從其中使用了以肽SEQ ID NO :72至 SEQ ID NO 76脈沖的JTK-LCL細(xì)胞的孔中獲得的培養(yǎng)上清液中比從其中不使用以肽脈沖 的JTK-LCL細(xì)胞的孔中獲得的培養(yǎng)上清液中更多地觀察到IFN- Y產(chǎn)生(圖3)。所述結(jié)果 說(shuō)明，SEQ ID Ν0:72至SEQ ID NO :76的肽是能夠特異性刺激HLA-A24+CD8+T細(xì)胞增殖以誘 導(dǎo)IFN- γ產(chǎn)生的T細(xì)胞表位肽。(2)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
隨后，研究了本文中所用SEQ ID NO 43至SEQ ID NO 71的肽是否呈遞在表達(dá)人 CAPRIN-I多肽的HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞的HLA-A0201分子上和用所述肽刺激的⑶8+T細(xì)胞是 否能夠破壞表達(dá)人CAPRIN-I多肽的HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞。將經(jīng)證實(shí)表達(dá)人CAPRIN-I多肽 的IO6個(gè)U-87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)收集于50_ml離心管，添加100 μ Ci鉻-51 并且在37°C孵育2小時(shí)。此后，所述細(xì)胞用含有10%胎牛血清(下文稱(chēng)作“FBS”，Gibco) 的RPMI培養(yǎng)基(Gibco)洗滌3次并以IO3個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至96孔V形底平板。另夕卜， 添加用所述肽刺激過(guò)的懸浮于含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中的5 X IO4個(gè)HLA-A0201+的 肽表位反應(yīng)性⑶8+T細(xì)胞并且培養(yǎng)在37°C于5% CO2下進(jìn)行4小時(shí)。在培養(yǎng)后，測(cè)量培養(yǎng)上 清液中從破壞的腫瘤細(xì)胞釋放的鉻-51的量以確定肽刺激的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。作 為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肽刺激的HLA-A0201+⑶8+T細(xì)胞具有針對(duì)U-87MG細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(圖4)。 相反，用陰性對(duì)照肽(SEQ IDN0:77)誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒活性。因此，發(fā)現(xiàn)本文 中所用的肽(即，SEQ ID NO 43至SEQ ID NO 71的肽)被呈遞在表達(dá)人CAPRIN-1多肽的 HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞的HLA-A0201分子上。另外，也發(fā)現(xiàn)所述肽能夠誘導(dǎo)可破壞此類(lèi)腫瘤 細(xì)胞的CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞。隨后，以如上文所述的相同方式研究了本文中所用SEQ ID NO 72至SEQ ID NO 76的肽是否呈遞在表達(dá)人CAPRIN-I多肽的HLA-A24+腫瘤細(xì)胞的HLA-A24分子上和用所述 肽刺激的⑶8+T細(xì)胞是否能夠破壞表達(dá)人CAPRIN-I多肽的HLA-A24+腫瘤細(xì)胞。將鉻-51 摻入表達(dá)人CAPRIN-I多肽的HLA-A24+JTK-LCL細(xì)胞，添加HLA-A24+和肽表位反應(yīng)性CD8+T 細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，并且測(cè)量培養(yǎng)上清液中從破壞的細(xì)胞釋放的鉻-51的量。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 用SEQ ID NO -J2至SEQ ID NO 76的肽刺激的HLA-A24+CD8+T細(xì)胞具有針對(duì)JTK-LCL細(xì)胞 的細(xì)胞毒活性(圖5)。因此，發(fā)現(xiàn)SEQ ID N0:72至SEQ ID NO :76的肽被呈遞在表達(dá)人 CAPRIN-I多肽的HLA-A24+細(xì)胞的HLA-A24分子上并且發(fā)現(xiàn)所述肽能夠誘導(dǎo)能破壞此類(lèi)細(xì) 胞的⑶8+細(xì)胞毒T細(xì)胞。用陰性對(duì)照肽(SEQ ID NO 77)誘導(dǎo)的⑶8+T細(xì)胞不展示細(xì)胞毒 活性。為確定細(xì)胞毒活性，用本文中所用肽刺激和誘導(dǎo)的5X IO4個(gè)CD8+T細(xì)胞與其中已 經(jīng)摻入鉻-51的IO3個(gè)U-87MG或JTK-LCL細(xì)胞混合，培養(yǎng)4小時(shí)，并且測(cè)量在培養(yǎng)后釋放 入培養(yǎng)基的鉻-51的量。本文中所用的細(xì)胞毒活性意指根據(jù)以下計(jì)算式*確定的CD8+T細(xì) 胞針對(duì)U-87MG細(xì)胞或JTK-LCL細(xì)胞(即，靶細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。式* 細(xì)胞毒活性(％ )=添加⑶8+T細(xì)胞時(shí)從U-87MG或JTK-LCL細(xì)胞釋放的 鉻-51的量/添加IN鹽酸時(shí)從靶細(xì)胞釋放的鉻-51的量X 100工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明工業(yè)地用于治療和預(yù)防癌癥的目的。本說(shuō)明書(shū)包括日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?008-202065的說(shuō)明書(shū)和/或附圖的全部或部分公 開(kāi)內(nèi)容，其中本申請(qǐng)對(duì)所述的日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)栆髢?yōu)先權(quán)。本文中引用的全部出版物、專(zhuān)利 和專(zhuān)利申請(qǐng)也通過(guò)引用的方式完整并入本文中。序列表獨(dú)立文本SEQ ID NO :31 :T3 引物SEQ ID NO :32 :Τ7 引物SEQ ID NO 33 至 34 引物
SEQ ID NO 35 至 36 =GAPDH 引物SEQ ID NO 37 至 42 和 80 至 81 引物
權(quán)利要求
1.免疫誘導(dǎo)劑，其包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多肽 具有免疫誘導(dǎo)活性并選自以下多肽(a)、(b)和(c)，所述的重組載體包含編碼所述多肽的 多核苷酸并能夠在體內(nèi)表達(dá)所述多肽(a)選自序列表中所列SEQID NO :2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的 至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個(gè)氫基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中多肽(b)是與多肽(a)具有95%或更多序 列同一性的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是選自序列表中 所列SEQ ID NO :2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的 多肽或包含所述多肽作為其部分序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是包含選自序列 表中所列SEQ ID NO 2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是至少七個(gè)連續(xù) 氨基酸的多肽，所述的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸位于選自序列表中所列除SEQ ID NO :6和SEQ ID N0:18之外的SEQ ID NO :2至30中任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的第41至 400位或第503至564位氨基酸殘基的區(qū)域中，或包含所述多肽作為其部分序列的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是序列表中任一 SEQ ID NO :43至76所示氨基酸序列的多肽，或包含序列表中任一 SEQ ID NO :43至76所 示氨基酸序列作為其部分序列的8至12個(gè)氨基酸的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其包含一種或多種所述多肽作為有 效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中多肽是抗原呈遞細(xì)胞的處理劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其用于動(dòng)物癌癥的治療或預(yù)防中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、 肺癌、食道癌或結(jié)直腸癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中動(dòng)物是人、犬或貓。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其還包含免疫增強(qiáng)劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中免疫增強(qiáng)劑是選自由弗氏不完全佐劑、 Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18、干擾素α、干 擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少一種佐劑或細(xì)胞因子。
14.分離的抗原呈遞細(xì)胞，包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的具有免疫誘導(dǎo)活性的多 肽和HLA分子的復(fù)合體。
15.分離的T細(xì)胞，其選擇性地與權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的具免疫誘導(dǎo)活性的多 肽和HLA分子的復(fù)合體結(jié)合。
16.用于誘導(dǎo)免疫的方法，包括向個(gè)體施用至少一種多肽或重組載體，所述的至少一種 多肽具有免疫誘導(dǎo)活性并選自以下多肽(a)至(c)，所述的重組載體包含編碼所述多肽的 多核苷酸并能夠在體內(nèi)表達(dá)所述多肽(a)選自序列表中所列SEQID NO :2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的 至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個(gè)氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫誘導(dǎo)劑，其包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多肽具有免疫誘導(dǎo)活性并選自以下多肽(a)、(b)和(c)(a)選自序列表中所列SEQ ID NO2至30的任意偶數(shù)SEQ ID編號(hào)所示氨基酸序列的至少七個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90％或更多序列同一性的至少七個(gè)氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽；所述的重組載體包含編碼所述多肽的多核苷酸并能夠在體內(nèi)表達(dá)所述多肽。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102112146SQ20098013031
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者岡野文義, 齋藤孝則, 清水正樹(shù) 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社