專利名稱：用于在植物中誘導(dǎo)遺傳單性結(jié)實的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單性結(jié)實植物的方法，更具體地說，它是一種用于產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實的方法。
背景技術(shù)：
座果和發(fā)育通常取決于是否成功受精。在番茄和許多其它物種中，座果的一個主要限制因子是花粉的產(chǎn)生對中等高溫或者低溫以及不充足的濕度的高度敏感性(Picken 1984)。單性結(jié)實(結(jié)無籽果實的能力)能夠防止環(huán)境約束對果實產(chǎn)生的影響。因而，在許多產(chǎn)生果實的植物中，單性結(jié)實具有重大的經(jīng)濟意義。
單性結(jié)實可以在正常植物中進行人工誘導(dǎo)，或者可以作為遺傳性狀天然產(chǎn)生。遺傳單性結(jié)實可以是專性的或者兼性的。前者從來不形成種子。在兼性單性結(jié)實中，當環(huán)境條件對傳粉和受精來說不利時，將產(chǎn)生無籽果實。然而，當確實發(fā)生受精時，就形成有種子的果實，這可以使兼性單性結(jié)實植物進行繁殖性增殖。
在許多科學(xué)論文中討論了單性結(jié)實，例如Abad M,Monteiro AA(1989)在冬天溫和條件下植物生長素對生產(chǎn)溫室番茄的運用評論.Sci Hort 38:167-192。
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在番茄中，誘導(dǎo)單性結(jié)實最有效的處理是利用植物生長素，合成植物生長素或者植物生長素轉(zhuǎn)運抑制劑(由Ho和Hewitt 1986,Varga和Bruinsma 1986,Abad和Monteiro 1989綜述)。然而，由于植物生長素不得不單獨地運用于每一花束上，以避免應(yīng)用到整個植物中所引起的特有的副作用，因而這種處理十分費力。
植物生長素看來對遺傳(天然)單性結(jié)實的座果也起著重要的作用。例如，Gustafson(1939a,b)發(fā)現(xiàn)在單性結(jié)實的桔子，檸檬以及葡萄品種的子房中植物生長素濃度明顯地比在有種子的品種中要高。以類似的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，Nitsch(1970)提出，天然的單性結(jié)實與無籽品種在開花時建立座果所要求的激素濃度極限的能力有關(guān)。
在植物中控制植物生長素作用的幾個基因是本領(lǐng)域所熟知的。例如，一個這樣的基因是包含在毛根土壤桿菌農(nóng)桿氨酸型Ri-質(zhì)粒的TL-DNA中的rolB基因(Chilton等1982,Spano等1982,White等1982,Willmitzer等1982,Peterson等1989)。
單獨表達rolB基因的轉(zhuǎn)基因植物顯示出幾種植物生長素毒性綜合病癥特征；如葉片異常，增加的柱頭和花大小，花柱異長，以及在莖干上增加無定形根的形成(Schmulling等1988)。van Altvorst等(1992)描述了在轉(zhuǎn)基因番茄中不同rol基因的表型作用，然而，他們沒有報道當插入rolB基因時單性結(jié)實果實發(fā)育情況。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供一種用于在植物中產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實的改良的方法。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供了一種用于在植物中產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實的方法，該方法包括以下步驟提供一個包含DNA序列和啟動子的盒，該DNA序列在植物中編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用，該啟動子對在開花和果實早期發(fā)育之間的子房具有特異性并控制DNA序列，以及將該盒引入植物中。
優(yōu)選地，該方法也包括以下步驟篩選具有兼性或者專性單性結(jié)實特征的植物。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，所說的引入步驟包括以下步驟轉(zhuǎn)化植物材料，以及再生所轉(zhuǎn)化的植物。
依據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，植物材料包括種子產(chǎn)生的子葉。
依據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，所說的轉(zhuǎn)化步驟包括以下步驟提供摻入所說的盒的質(zhì)粒，將質(zhì)粒引入根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumerfaciens)中，以及通過與包含質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)將質(zhì)粒摻入植物材料中。
依據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，在植物中編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用的DNA序列包括rolB基因的序列。
依據(jù)本發(fā)明進一步的優(yōu)選的實施方案，篩選步驟包括種植產(chǎn)生果實的植物，并且檢驗在允許受精條件下產(chǎn)生種子的果實。
依據(jù)本發(fā)明進一步的優(yōu)選的實施方案，篩選步驟包括種植產(chǎn)生果實的植物，并且檢驗在限制受精條件下產(chǎn)生種子的果實。
優(yōu)選地，該方法也包括以下步驟篩選具有兼性或者專性單性結(jié)實特征的植物。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案所說的番茄植物包括番茄植物的果實。
附圖描述結(jié)合下列附圖和表詳細描述后，本發(fā)明將得到更充分地理解和領(lǐng)悟，其中

圖1是在具有各種TPRP-F1啟動子序列的缺失的轉(zhuǎn)基因植物中GUS表達的圖表分析；在圖1中，a欄表明獨立轉(zhuǎn)化的數(shù)量。b攔描述用4MU.從定量熒光測量分析中所獲得的數(shù)據(jù)(++表明高熒光，+中高，+/-中低-無熒光)。c欄是以X-Gluc.組織化學(xué)測定為基礎(chǔ)(++表明在2小時內(nèi)所顯現(xiàn)的深色，+經(jīng)溫育一夜所顯現(xiàn)的深色，+/-經(jīng)溫育一夜所顯現(xiàn)的淺色，-經(jīng)溫育一夜未顯色)。d行將最小的-46 CaMV-35S啟動子安裝在GUS-ORF(開放讀框)的前面。在所有其它質(zhì)粒中，保持TPRP-F1啟動子的5＇UTR非翻譯區(qū)。
圖2是質(zhì)粒pSB171的構(gòu)建圖；將λG16的7Kbp HindⅢ片段插入到質(zhì)粒pBluescript SK+的HindⅢ位點中。
圖3是pSBN28的構(gòu)建圖；將pBS171的NsiⅠ片段插入到pBluescript的PstⅠ位點中。
圖4是質(zhì)粒pPSN33的構(gòu)建圖；將突變pTPRP-F1片段插入到pBluescript KS+的XbaⅠ和KpnⅠ位點中。
圖5是質(zhì)粒pBSrolB的構(gòu)建圖；將pUC19-B26的EcoRⅠ-HindⅢ片段連接到pBluescript SK+的相應(yīng)位點上。
圖6是質(zhì)粒pBSNrolB的構(gòu)建圖；將pBSrolB的KpnⅠ片段連接到pBSN33的KpnⅠ位點上。
圖7是質(zhì)粒pGB18的構(gòu)建圖，由pUC19的多克隆位點代替pGA492的多克隆位點。
圖8是質(zhì)粒pGB18rolB的構(gòu)建圖；將pBSNrolB的Xba-HindHⅢ片段連接到pGB18的相應(yīng)位點上。
表1顯示TPRP-F1基因組克隆的序列，該序列包括2643bp的啟動子區(qū)。早期未公開過從1-2483延伸的啟動子區(qū)序列。早期公開過從2484-4320延伸的序列(Salts等1992)。用黑體字母印刷的ATG密碼子(位置2644-2647)是TPRP-F1翻譯起始密碼子。下劃線的黑體字母G(位置2235)是轉(zhuǎn)錄起始位點(未發(fā)表過的數(shù)據(jù))。
表2顯示包含在二分質(zhì)粒pGB18rolB(圖7)中的TPRP-F1啟動子的序列。該序列符合表1中的101-2643。
表3顯示一個較短啟動子，該啟動子賦予子房和胚特異性(表1從943-2643)。
表4顯示來源于TPRP-F1啟動子序列的選擇性結(jié)合，該TPRP-F1啟動子賦予子房和胚特異性(融合到2079-2643的1-1728，表1)。
表5顯示包含在二分載體pGB18rolB(參見圖5)中的rolB基因的序列。Slightom等1986描述了該序列。用黑體字母指出翻譯起始密碼子(位置40)。
表6顯示各種具有轉(zhuǎn)基因植物(R0)的和它們子代(R1)的表型的種子。
表7顯示在R2轉(zhuǎn)基因植物和親本系MP-1上發(fā)育的果實的特征分析。在P=0.05時欄中后跟普通字母的值沒有顯著性差異。
在表7中1)nP1=抽樣檢驗的植物數(shù)量，nFr=從給定數(shù)量的植物中抽樣檢驗的果實總數(shù)，果實是在1995年6月14-30日之間收集的。
2)抽樣檢驗的植物果實的總數(shù)(僅僅計數(shù)大于15mm的果實)。
3)用于在縱列描述的數(shù)據(jù)的F和P值，利用MacIntosh的GraphpadInstat 2.01程序包進行Anova檢驗，包括對所有縱列內(nèi)成對分析的Turkey檢驗。優(yōu)選的實施方案的詳細描述現(xiàn)在，參照在植物中產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實中所涉及的方法。用于產(chǎn)生的方法包括提供包含DNA序列和啟動子的盒，該DNA序列編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用，并且該啟動子對開花和果實早期發(fā)育之間子房具有特異性并控制DNA序列，將該盒引入植物中，以及篩選具有單性結(jié)實特征的植物。材料和方法細菌菌株和培養(yǎng)物大腸桿菌菌株DH5α(Raleigh等1989)適用于所有質(zhì)粒構(gòu)建步驟，以及菌株SM10(Simon等1983)適用于質(zhì)粒連接到根瘤土壤桿菌中。按照所建立的方法，完成PCR、DNA和RNA分析，以及重組質(zhì)粒的構(gòu)建(Ausubel等1987,Sambrook等1989)實施例1子房和早期果實特異性TPRP-F1啟動子的詳細分析在確定作為子房的和早期果實的特異性基因的TPRP-F1基因的特征后，并且在對基因編碼區(qū)進行測序(Salts等1991,1992)后，將TPRP-F1基因啟動子進行分離。稍后分離基因組克隆。表1描述了基因組克隆序列，該序列包含5＇延伸2643bp到翻譯起始密碼子上的推定啟動子區(qū)。以前發(fā)表了包含5＇的20bp到翻譯起始密碼子(位置2623，表1)編碼區(qū)的測序(Salts等1992)，而在1-2622之間延伸的序列(表1)沒有發(fā)表。
通過融合推定啟動子序列的各種缺失到報道基因uidA(GUS)上進行啟動子的初步功能性分析，并且在穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物中進行GUS表達分析(Jefferson等1987)。簡要報道了初步分析的結(jié)果(Carmi等1994)。啟動子延伸分析表明TPRP-F1基因的被轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物包含408bp的非翻譯前導(dǎo)序列。進行了TPRP-F1基因的啟動子區(qū)的詳細分析，該分析包括附加缺失以及檢驗GUS在更多的器官中和在額外的發(fā)育階段的表達。圖1總結(jié)了這個分析的結(jié)果。這個分析的主要發(fā)現(xiàn)是1．5＇延伸2542bp到翻譯起始密碼子的序列作為啟動子，在嵌合基因中將rolB基因融合到該啟動子上(也參見圖2-8)。以這個分析為基礎(chǔ)(參見圖1)，僅僅5＇延伸1701bp到翻譯起始密碼子的序列足夠驅(qū)動rolB基因在子房和發(fā)育的胚中的特異性表達(表2)。
2．這個分析的結(jié)果也表明，將5＇延伸564bp到翻譯起始密碼子的啟動子序列融合到5′延伸915-2643bp到翻譯起始密碼子序列，前者授予子房和早期果實以及發(fā)育的胚特異性(表3)。并且這條序列也可以用于驅(qū)動rolB特異地在果實中表達，該結(jié)果導(dǎo)致單性結(jié)實在其它器官和附加的發(fā)育期內(nèi)沒有副作用。嵌合基因TPRP-F1::rolB的構(gòu)建質(zhì)粒pSB171的構(gòu)建通過亞克隆基因組7kbpgλG16 HindⅢ片段到pBluescript SK+的HindⅢ位點中獲得重組質(zhì)粒pSB171(圖2)。質(zhì)粒pBSN28的構(gòu)建分離質(zhì)粒pSB171的NsiⅠ內(nèi)部片段，并且將該片段亞克隆到pBluescript的PstⅠ限制位點中(圖3)。質(zhì)粒pBSN33的構(gòu)建為了保證將rolB基因從它的天然翻譯起始密碼子翻譯，通過體外誘變?nèi)∠谫|(zhì)粒pBSN28中的TPRP-F1基因的翻譯起始密碼子利用pBSN28克隆作為模板，T7啟動子序列作為一個引物(3＇-5＇)以及第二個引物是下列序列5＇TGGTACCGGGCAATGAACAAAGTTCCA3＇制備一個包含具有突變起始密碼子的啟動子的PCR片段。黑體字母指出在啟動子序列3′產(chǎn)生一個新KpnⅠ位點的突變序列。將PCR產(chǎn)物用KpnⅠ和XbaⅠ消化，并且連接到產(chǎn)生質(zhì)粒pBSN33的pBluescript上(圖4)。質(zhì)粒pBSNrolB的構(gòu)建pUC19-B26(由J.Schell提供)含有按照Slighton等(1986)的核苷酸9814和11324之間的序列。表5中給出了包含在這個質(zhì)粒中的rolB序列。分離這個質(zhì)粒的EcoRⅠ-HindⅢ片段，并且將它克隆到質(zhì)粒pBluescript的EcoRⅠ/HindⅢ-限制性切割位點中形成pBSrolB(圖5)。
分離pBSrolB的KpnⅠ片段，并且將它亞克隆到pBSN33的KpnⅠ位點中，同時通過限制酶分析確定具有以正確定向插入的rolB基因的克隆。將這個質(zhì)粒命名為pBSNrolB(圖6)。二分質(zhì)粒pGB18rolB的構(gòu)建分離質(zhì)粒pUC18的EcoRⅠ-HindⅢ多位點接頭，并且將它亞克隆到質(zhì)粒pGA492的EcoRⅠ/HindⅢ-限制性切割位點(An1986)，形成質(zhì)粒pGB18(圖7)。分離pBSNrolB的XbaⅠ-BamHⅠ片段，并且將它亞克隆到質(zhì)粒pGB18的XbaⅠ/BamHⅠ限制切割位點中，形成質(zhì)粒pGB18rolB(圖8)。在番茄中通過子房的TPRP-F1::rolB基因的特異性表達誘導(dǎo)單性結(jié)實植物轉(zhuǎn)化通過由10日齡的籽苗產(chǎn)生的子葉與根瘤土壤桿菌菌株EAH105進行共培養(yǎng)，將二分載體pGB18rolB轉(zhuǎn)化到分生番茄繁育系MP-1中(Hood等1993)。本質(zhì)上，除了在注入子葉上之前，將“過夜”細菌培養(yǎng)物懸浮在液體MS(Murashige和Skoog1962)培養(yǎng)基中，以及用0.5mg/L頭孢噻虧代替羧芐青霉素外，采用McCormick(1991)描述的方案。將從它們再生的子葉和小植株在100mg/L的卡那霉素存在下繁殖，直到生根為止。將再生的植物種植在變硬的泥煤沉淀(Jiffy-7,a/s Jiffy Products，挪威)中(1-2周)，然后轉(zhuǎn)移到防蟲的溫室或者網(wǎng)室中。
為了選擇轉(zhuǎn)化的子代，將無菌種子在選擇性培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基，3％蔗糖和100mg/L卡那霉素)上萌芽，其中僅僅讓轉(zhuǎn)基因籽苗發(fā)育出須根系。
轉(zhuǎn)基因植物的描述從繁育系MP-1再生三種單性結(jié)實的原代(Ro)轉(zhuǎn)基因植物MPB-4,MPB-12和MPB-13，以及MPB-19。通過PCR分析，利用選擇性標記基因nptⅡ的引物，并且通過Southern分析，利用rolB基因的KpnⅠ片段作為探針來確定Ro植物的轉(zhuǎn)化。
Southern分析表明MPB-4 Ro植物包含至少四個嵌合基因的插入片段，而MPB-12和MPB-13都包含兩個串聯(lián)拷貝。通過MPB-12和MPB-13的R1和R2的Southern分析確定插入的串聯(lián)模式。Ro植物的表型表6中總結(jié)了六種Ro植物的某些表型特征。
1．Ro植物的營養(yǎng)生長習(xí)性在把Ro植物移植到罐的時候，它們產(chǎn)生的營養(yǎng)生長習(xí)性與親本栽培品種MP-1沒有明顯的不同。
2．Ro植物的繁殖發(fā)育所有的Ro植物發(fā)育出多花。植物MPB-4的花表現(xiàn)出發(fā)育的典型“單性結(jié)實”方式也就是說，相對于花發(fā)育來說子房很早就開始擴大，當時花瓣仍然完全關(guān)閉，花瓣沒有枯萎并且仍然附著在發(fā)育果實的基部直到被生長的果實碰掉為止。通過熒光素二乙酸酯的活體染色(Widholm1972)和花粉萌發(fā)試驗(Brewbaker和Kwack 1963)，MPB-4花粉是不能存活的。
MPB-13-Ro植物的花表現(xiàn)出單性結(jié)實樣發(fā)育的中等方式(子房的早期擴大以及花瓣延遲萎蔫)，花粉仍能生存。MPB-12-Ro花表現(xiàn)出更溫和的單性結(jié)實表型；它們的子房輕微地擴大并且花瓣延遲萎蔫。它們的花粉是能存活的。
3．Ro植物的無籽和果實特征如表6中所總結(jié)的，植物MPB-4是完全無籽的，并且在大多數(shù)果實中，與親本栽培品種或者非單性結(jié)實轉(zhuǎn)基因植物的果實相比，囊柱相當大。在大多數(shù)MPB-4果實中，室腔內(nèi)充滿了果漿，僅僅在極少數(shù)中果漿不完全充滿。大多數(shù)果實包含4-5個子房室，而在相同的生長條件下，MP-1果實通常由3-4個子房室組成。不能從MPB-4獲得有籽果實，即使采用親本系MP-1的花粉給非常嫩的花芽進行人工傳粉。這種雌性不育性明顯地是因為在花芽發(fā)育的早期子房的迅速擴大，這導(dǎo)致花柱管的閉合或者松開阻止了受精。于是，人們認為植物PMB-4是專性單性結(jié)實植物。這種不定植物通過扦插保持繁殖。
植物MPB-12和MPB-13表現(xiàn)為兼性單性結(jié)實。它們的無籽果實充滿果漿，并且包含4個或者更多個子房室。在大多數(shù)MPB-13果實和某些MPB-12果實中，囊軸比親本系果實的稍大一些。在一些MPB-13果實中果漿是淡綠色的，尤其是在高溫下發(fā)育的果實。對于植物生長素誘導(dǎo)的果實也報道了這種現(xiàn)象(Abad和Monteiro1989)。在MPB-12和MPB-13的無籽果實中沒有觀察到對植物生長素誘導(dǎo)的單性結(jié)實果實的典型扁化作用。
在夏天很高溫度下發(fā)育的MPB-12-Ro的無籽果實中，具有典型的畸形趨勢；果實橢圓而非圓形，稍微平坦，以及偶爾向橫切面壓縮(“花生樣”外觀)。R1植物的表型1．R1植物的營養(yǎng)生長習(xí)性大多數(shù)PMB-12-R1的Kanr籽苗和所有KanrMPB-13-R1植物成為向下卷的寬子葉的特征。此現(xiàn)象的嚴重程度隨各種植物而變化。某些MPB-13-R1籽苗的根系比參照植物發(fā)育更多。發(fā)育的植物沒有表現(xiàn)出植物生長素相關(guān)畸形(如葉片偏上性，莖干卷曲或者不定根發(fā)育)。
2．R1植物的繁殖發(fā)育各種KanrMPB-12-R1植物的花具有正常的外形和發(fā)育方式，除了缺乏花瓣的萎蔫(它仍然附著在發(fā)育的果實基部)之外，與MPB-12-Ro花的表型類似。KanrMPB-13-R1植物的花表現(xiàn)出“單性結(jié)實”發(fā)育的不同程度(子房的早期擴大以及花瓣萎蔫延遲)，并且花粉是能存活的。
3．在R1植物中無籽和果實特征如表6所限定的，大多數(shù)在各種KanrMPB-12-R1植物上發(fā)育的果實是無籽的并且充滿了果漿。偶爾，發(fā)育的有籽果實與親本栽培品種相比，它們大多數(shù)包含的種子明顯地較少，并且種子的平均重量和大小比MP-1果實的明顯地更高。有籽果實的頻率在不同R1植物中發(fā)生變化。果實不是鼓起的；一些果實是稍微平坦的橢圓形。沒有觀察到橫向壓縮的形狀，很明顯這是因為果實沒有在異常高的溫度下發(fā)育。大多數(shù)不同的MPB-13-R1植物的果實具有規(guī)則形狀，無籽，并且充滿了果漿。極少的有籽果實發(fā)育，以及它們大多數(shù)包含比MP-1更少的種子。R2植物的表型1．R2植物的營養(yǎng)生長習(xí)性在MPB-12和MPB-13的KanrR2籽苗中也觀察到寬子葉現(xiàn)象。發(fā)育的植物具有正常生長習(xí)性。
2．在R2植物中無籽和果實特征檢驗MPB-12和MPB-13轉(zhuǎn)化體的R2子代發(fā)育的果實的幾個果實指數(shù)。這些植物生長在允許傳粉的環(huán)境條件下。由于在各種由普通的R1植物所衍生的R2植物中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別，因而以從R2代的兩種或者三種植物所收集的信息為基礎(chǔ)進行數(shù)據(jù)分析(表7)。
關(guān)于果實的平均重量，每個果實的子房室數(shù)目，或者Brix值，轉(zhuǎn)基因果實與參照果實沒有明顯的不同(P＜0.05)。然而，即使在轉(zhuǎn)基因植物中通過振動花來進行傳粉，所有轉(zhuǎn)基因植物的果實也比參照植物具有明顯更少的種子(P＜0.001)。在相同轉(zhuǎn)基因植物上發(fā)育的不同果實中，種子數(shù)目變化從零到每個果實30-50粒，這反映在這些轉(zhuǎn)基因植物中單性結(jié)實的兼性性質(zhì)(表7)。
在親本系MP-1中，種子數(shù)量和果實重量之間具有一種明顯的正相關(guān)(r2=0.386,P=0.023,n=14)。然而，在轉(zhuǎn)基因植物中，種子數(shù)量的高度明顯減少不會伴隨果實重量的減少。果實重量/種子數(shù)量的回歸對于MPB-12.5-R2(n=23),r2=0.0279,P=0.446，對于MPB-13.3-R2(n=15),r2=0.0086,P=0.7419，以及對于MPB-13.4-R2(n=7),r2=0.1115,P=0.4642是無關(guān)緊要的。這一事實表明轉(zhuǎn)基因的表達完全彌補了種子對果實重量的貢獻。
所有無籽果實都充滿果漿。轉(zhuǎn)基因果實的果漿的顏色并非總是象參照那樣紅；在許多果實中，它更多的是帶有綠顏色痕跡的橙黃色。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到，本發(fā)明不受上文所特別顯示的和描述的限制。更確切地說，本發(fā)明的范圍僅僅由所附權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1．一種用于在植物中產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實的方法，該方法包括以下步驟提供一個包含DNA序列和啟動子的盒，該DNA序列在植物中編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用，以及該啟動子在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性，并且該啟動子控制DNA序列；將盒引入植物中，
2．按照權(quán)利要求1的方法，該方法也包括以下步驟篩選兼性或者專性單性結(jié)實特征的植物。
3．按照權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的方法，其中所說的引入步驟包括以下步驟轉(zhuǎn)化植物材料；并且再生所轉(zhuǎn)化的植物。
4．按照權(quán)利要求3的方法，其中所說的植物材料包括種子所產(chǎn)生的子葉。
5．按照權(quán)利要求3的方法，其中所說的轉(zhuǎn)化步驟包括以下步驟提供摻入所說的盒的質(zhì)粒；將質(zhì)粒引入根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumerfaciens)；并且通過與包含質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌進行共培養(yǎng)將質(zhì)粒摻入植物材料中。
6．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在植物中編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用的DNA序列包括rolB基因的序列。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性的啟動子包含在表1所限定的序列。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性的啟動子包含在表2所限定的序列。
9．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性的啟動子包含在表3所限定的序列。
10．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性的啟動子包含在表4所限定的序列。
11．按照權(quán)利要求2的方法，其中所說的篩選步驟包括種植產(chǎn)生果實的植物；并且測定在允許受精的條件和/或者限制受精的條件下產(chǎn)生種子的果實。
12．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的植物是番茄植物。
13．一種權(quán)利要求1的方法所產(chǎn)生的番茄植物。
14．權(quán)利要求1的方法所產(chǎn)生的植物的番茄植物的果實。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于在植物中產(chǎn)生遺傳單性結(jié)實的改進方法,該方法包括以下步驟:提供一個盒,該盒包括在植物中編碼調(diào)節(jié)植物生長素作用的DNA序列(如rolB基因的序列)和在開花和果實早期發(fā)育之間對子房具有特異性的啟動子,該啟動子控制DNA序列;將該盒引入植物中。優(yōu)選地,通過植物材料(包括種子產(chǎn)生的子葉)的轉(zhuǎn)化引入所說的DNA,以及再生所轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選方法的步驟也包括篩選兼性或者專性單性結(jié)實特征的植物。
文檔編號C12N15/82GK1213405SQ97193072
公開日1999年4月7日 申請日期1997年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者R·巴格, Y·薩勒特 申請人:以色列國農(nóng)業(yè)部