專利名稱：N－保護(hù)d－脯氨酸衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能將用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一的N-保護(hù)脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源的新穎微生物。
式中R1是-(CH2)2-COOH、任意取代的C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，R2是氫或=O。這些微生物及其無(wú)細(xì)胞酶可用于N-保護(hù)環(huán)狀或脂族D-氨基酸衍生物和/或環(huán)狀或脂族L-氨基酸衍生物的新穎制備方法。
N-保護(hù)的環(huán)狀D-氨基酸衍生物(如N-保護(hù)的D-脯氨酸衍生物，如N-芐氧羰基-D-脯氨酸(N-Z-D-脯氨酸))是制備藥物的重要中間體(J.Org.Chem.,1994,59,7496-7498)。
至今，僅已知少數(shù)的酶例如可將N-Z-L-脯氨酸用作底物，并將其水解成L-脯氨酸。這些酶是從紅酵母菌屬(JP-A 01074987)、假單胞菌屬(JP-A 55 071 491；Kikuchi等，Biochim.Biophys.Acta,744(1983),180-188)或從產(chǎn)堿桿菌屬(JP-A 55 007 015)微生物中分離得到的。
所有這些酶較好與N-Z-L-脯氨酸的結(jié)構(gòu)相關(guān)底物(如與N-氯乙?；?L-脯氨酸)反應(yīng)，但與N-Z-L-脯氨酸只有低活性。因此，這些酶不適用于經(jīng)濟(jì)的方法，例如不適用于制備N-Z-D-脯氨酸。另一缺點(diǎn)是底物不是與定整個(gè)細(xì)胞反應(yīng)，而是與粗提取物或分離的酶進(jìn)行反應(yīng)，所以明顯增加了工業(yè)支出。
EP-A 0416 282揭示一種N-?；?L-脯氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶，例如它優(yōu)選N-乙?；?L-脯氨酸為底物，并用于得到L-脯氨酸。這種N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶是從睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)或反硝化產(chǎn)堿桿菌屬微生物中分離得到。這些微生物的缺點(diǎn)是它們不能將N-Z-L-脯氨酸用作唯一的氮源，并水解用作底物的N-Z-L-脯氨酸。
WO 95/10604揭示了用反硝化產(chǎn)堿桿菌屬微生物制備L-2-哌啶酸的微生物方法。這些微生物的缺點(diǎn)也是不能將相應(yīng)的N-?；?底物(N-?；?(DL)-2-哌啶酸)用作唯一的氮源。
本發(fā)明的目的是分離既可用于制備N-保護(hù)環(huán)狀或脂族D-氨基酸衍生物的簡(jiǎn)便工業(yè)可行的方法，又可用于制備環(huán)狀或脂族L-氨基酸衍生物的簡(jiǎn)便方法的微生物。同時(shí)，應(yīng)以良好的對(duì)映體純度分離相應(yīng)的產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的可用權(quán)利要求1中所述的微生物、權(quán)利要求5中所述的從這些微生物中分離得到的酶和按權(quán)利要求6、7、9和10所述的方法來(lái)達(dá)到。
本發(fā)明的微生物可用常規(guī)微生物學(xué)技術(shù)從土壤樣品、污泥或污水中分離得到。本發(fā)明分離這些微生物的方法是按常規(guī)的方法在含有用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一的N-保護(hù)脯氨酸衍生物
●為唯一碳和氮源或●為利用合適碳源的唯一氮源或●為利用合適氮源的唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些微生物。
然后從培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中方便地選擇那些將通式Ⅰ表示的N-保護(hù)L-脯氨酸衍生物為唯一氮源、唯一碳源或唯一碳和氮源的微生物。
在用通式Ⅰ表示的N-保護(hù)脯氨酸衍生物中的R1基團(tuán)是-(CH2)2-COOH、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基。R2基團(tuán)是氫或=O。
甲氧基、芴基甲氧基(fluorenylmethoxy)、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或異丁氧基可用作C1-4烷氧基。
取代或未取代的苯基或芐基(如4-甲氧基芐基或4-甲氧基苯基)可用作芳基。
下述的芳氧基定義為取代或未取代的苯氧基或芐氧基。芳氧基的實(shí)例是芐氧基、4-甲氧基芐氧基或4-硝基芐氧基。
特別優(yōu)選的用通式Ⅰ表示的N-保護(hù)脯氨酸衍生物是N-琥珀酰-L-脯氨酸(R1=-(CH2)2-COOH)、N-苯乙?；?L-脯氨酸(R1=苯甲基)、N-Z-L-脯氨酸(R1=芐氧基)、N-苯甲酰基-L-脯氨酸(R1=苯基)、N-異丁氧羰基-L-脯氨酸(R1=異丁氧基)和N-Z-L-焦谷氨酸(R1=芐氧基、R2=O)。
作為合適的碳源，微生物例如可將糖、糖醇或羧酸用作生長(zhǎng)底物，己糖(如葡萄糖、果糖)或戊糖可用作糖。二元羧酸或三元羧酸及它們的鹽(如檸檬酸或蘋(píng)果酸)可用作羧酸。甘油例如可用作糖醇。
這些微生物例如可將銨、硝酸鹽、脲或甘氨酸用作合適的氮源。
本專業(yè)領(lǐng)域中常規(guī)使用的培養(yǎng)基(如表1中所述的培養(yǎng)基)可用作選擇和培養(yǎng)基。較好使用表1中所述的培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)和選擇過(guò)程中，可方便地誘導(dǎo)微生物的活性酶。用通式Ⅰ表示的N-保護(hù)的脯氨酸衍生物或其L-異構(gòu)體可用作酶誘導(dǎo)物。
進(jìn)行培養(yǎng)和選擇的溫度通常為10-40℃，較好為20-35℃,pH通常為pH4-10，較好為pH5-9。
優(yōu)選的微生物是利用N-Z-L-脯氨酸的節(jié)細(xì)菌屬(第一種具有脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性的革蘭氏陽(yáng)性微生物)、土壤桿菌/根瘤菌屬、牙孢桿菌、假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬微生物。具體地說(shuō)，分離了節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、惡臭假單胞菌K32、皮氏產(chǎn)堿菌(Alcaligenes piechaudii)K4或木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)以及它們功能等同的變異體和突變體。按布達(dá)佩斯條約，微生物DSM 10329和10328于6.11.1995保藏在德意志微生物保藏中心(Mascheroderweg 1b,D38124 Braunschweig)。
“功能等同的變異體和突變體”是指具有與原微生物基本上相同的性質(zhì)和功能的微生物。這種變異體和突變體例如可用紫外輻射偶然產(chǎn)生。
木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)的分類說(shuō)明該菌株的性質(zhì)細(xì)胞形狀 桿菌寬度，微米 0.5-0.6長(zhǎng)度，微米 1.5-3.0能動(dòng)性 +鞭毛突出 周毛的革蘭氏反應(yīng) -被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny)+芽胞 -
氧化酶 +過(guò)氧化氫酶 +厭氧生長(zhǎng) -ADH(醇脫氫酶)+來(lái)源于NO3的NO2+反硝化作用 +脲酶 -明膠的水解 -Tween 80的水解 -由下列化合物產(chǎn)生的酸(OF試驗(yàn))葡萄糖需氧-木糖80-底物利用葡萄糖-果糖 -阿拉伯糖 -檸檬酸酯(鹽) +蘋(píng)果酸酯(鹽) +甘露糖醇 -節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)的分類說(shuō)明表征鑒定具有顯著桿菌-球菌生長(zhǎng)循環(huán)的革蘭氏陽(yáng)性不規(guī)則桿菌；嚴(yán)格需氧；在葡萄糖中沒(méi)有形成酸或氣體。能動(dòng)性 -芽胞 -過(guò)氧化氫酶 +細(xì)胞壁中的內(nèi)消旋-二氨基庚二酸無(wú)肽聚糖類型 A3α,L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala16SrDNA序列相似性用滋養(yǎng)節(jié)桿菌，分枝節(jié)桿菌和氧化節(jié)桿菌對(duì)變異性最大的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)的最大值為98.2％
土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30的分類說(shuō)明細(xì)胞形狀 多型桿菌寬度(微米)0.6-1.0長(zhǎng)度(微米)1.5-3.0革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶+芽胞 -氧化酶+過(guò)氧化氫酶+能動(dòng)性+厭氧生長(zhǎng) -由硝酸鹽產(chǎn)生的亞硝酸鹽-反硝化作用-脲酶 +明膠的水解-從如下物質(zhì)中產(chǎn)生酸L-阿拉伯糖+半乳糖-松三糖-巖藻糖+阿糖醇-甘露糖醇 -赤蘚醇-石蕊汁的堿化 +酮乳糖-16S rDNA的部分測(cè)序揭示與土壤桿菌屬和根瘤菌屬的樣本具有較大的相似性，約為96％。明確地將其確定為這些屬內(nèi)物種是不可能的。
單純桿菌K2的分類說(shuō)明細(xì)胞形狀桿菌寬度(微米) 0.8-1.0
長(zhǎng)度(微米) 3.0-5.0芽胞 -橢圓體 -圓形體 -孢子囊 -過(guò)氧化氫酶 +厭氧生長(zhǎng) -VP反應(yīng) n.g.
最大溫度正生長(zhǎng)時(shí)溫度，℃ 40負(fù)生長(zhǎng)時(shí)溫度，℃ 45在pH為5.7培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)-NaCl 2％ +5％-7％-10％ -溶菌酶培養(yǎng)基 +由下列物質(zhì)產(chǎn)生酸(ASS)D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 -D-甘露糖醇 +D-果糖 +由果糖產(chǎn)生的氣體 -卵磷脂酶 -下列物質(zhì)的水解淀粉 +明膠 +酪蛋白 -Tween 80 +七葉苷 -利用下列物質(zhì)檸檬酸鹽 +丙酸鹽-由硝酸鹽產(chǎn)生的亞硝酸鹽+吲哚 -苯丙氨酸脫氨基酶 -精氨酸脫羥基酶-對(duì)細(xì)胞脂肪酸的分析確定它是芽胞桿菌屬。16S rDNA部分測(cè)序表明與單純芽胞桿菌的相似性為100％。
皮氏產(chǎn)堿菌K4的分類說(shuō)明細(xì)胞形狀 桿菌寬度，微米0.5-0.6長(zhǎng)度，微米1.0-2.5能動(dòng)性+鞭毛突出 周毛的革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶+過(guò)氧化氫酶+ADH -從硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽+反硝化作用-脲酶 +明膠的水解-底物利用葡萄糖-果糖 -阿拉伯糖 -己二酸酯(鹽) +癸酸酯(鹽)+檸檬酸酯(鹽)+蘋(píng)果酸酯(鹽)+甘露糖醇-庚二酸酯(鹽)+細(xì)胞脂肪酸的分布型是產(chǎn)堿桿菌屬特有的，16S rDNA的部分測(cè)序表明與皮氏產(chǎn)堿菌有99.3％的相似性。
惡臭假單胞菌K32的分類說(shuō)明細(xì)胞形狀 桿菌寬度(微米)0.8-0.9長(zhǎng)度(微米)1.5-4.0能動(dòng)性+鞭毛突出 極性＞1革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶+過(guò)氧化氫酶+厭氧生長(zhǎng) -色素?zé)晒庑缘哪撉嗨?ADH +來(lái)源于硝酸鹽的亞硝酸鹽-反硝化-脲酶 -明膠的水解-底物利用己二酸酯(或鹽)-檸檬酸酯(或鹽)+蘋(píng)果酸酯(或鹽)+
D-扁桃酸酯(或鹽) +苯基乙酸酯(或鹽) +D-酒石酸酯(或鹽) -D-葡萄糖 +海藻糖酶 -甘露糖醇 -苯甲酰甲酸酯(或鹽)-丙二醇+丁胺 +芐胺 +色胺 -乙酰胺+馬尿酸鹽(或酯)+細(xì)胞脂肪酸的分布型是惡臭假單胞菌屬特有的。
16S rDNA的部分測(cè)序表明與門(mén)多薩假單胞菌和產(chǎn)堿假單胞菌的相似性約為98％。與惡臭假單胞菌的相似性為97.4％。
然而，根據(jù)表型數(shù)據(jù)，這種菌株可毫無(wú)疑問(wèn)地確定為惡臭假單胞菌屬。
本發(fā)明的酶，N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶，例如可用常規(guī)的破裂法從上述微生物細(xì)胞中得到，這些酶較好從節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10329)中獲得。為此，例如可以使用超聲法、弗氏法或溶菌酶法。這些酶可用如下性質(zhì)表征N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶，它可用如下性質(zhì)表征a)底物專一性水解N-芐氧羰基-L-脯氨酸、N-苯甲?；?L-脯氨酸、N-異丁氧基羰基-L-脯氨酸、N-芐氧羰基-L-焦谷氨酸、N-芐氧羰基-DL-2-哌啶酸、N-芐氧羰基-L-丙氨酸。
b)pH最佳值pH最佳值為pH6.5±0.2c)溫度穩(wěn)定性在高達(dá)43℃和pH6.5條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，仍檢測(cè)不到活性的喪失。
d)溫度活性在50℃和pH6.5的條件下能檢測(cè)到良好的活性。
e)抑制劑的作用芐醇和N-芐氧羰基-D-脯氨酸具有抑制作用。
用通式Ⅱ表示的N-保護(hù)環(huán)狀D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅲ表示的環(huán)狀L-氨基酸衍生物的本發(fā)明制備方法
式中A與-N-和-CH一起構(gòu)成任意取代的4-、5-或6-元飽和雜環(huán)，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；是這樣進(jìn)行的在用通式Ⅳ表示的外消旋N-保護(hù)環(huán)狀氨基酸衍生物中
式中A與-N-和-CH以及R3具有上述的含義；N-保護(hù)的環(huán)狀L-氨基酸衍生物用上述的微生物或用它們的無(wú)細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化成環(huán)狀L-氨基酸衍生物(通式Ⅲ)，并加以選擇性地分離。在該生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除上述L-氨基酸衍生物外，還可分離得到的N-保護(hù)D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
用通式Ⅴ表示的N-保護(hù)脂族D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物的制備方法與相應(yīng)環(huán)狀氨基酸衍生物的方法相類似，
式中R3具有上述的含義，R4是氫、任意取代的直鏈烷基或ω-羥烷基，R5是氫或任意取代的直鏈烷基。用通式Ⅶ表示的外消旋N-保護(hù)脂族氨基酸衍生物用作該方法的原料。
式中R3、R4和R5具有上述的含義。
任意取代的飽和五元雜環(huán)的實(shí)例是脯氨酸、吡唑烷、咪唑啉、噁唑烷、異噁唑烷、噻唑烷、三唑烷。5-氧代脯氨酸(焦谷氨酸鹽)例如可用作取代的飽和五元雜環(huán)。
任意取代的飽和6元雜環(huán)的實(shí)例是哌嗪、2-甲基哌啶、嗎啉、十氫喹啉、十氫異喹啉、喹喔啉。氮雜環(huán)丁烷可用作四元任意取代的飽和雜環(huán)。
在下文中烷基定義為取代或未取代的C1-18烷基。C1-18烷基的實(shí)例包括甲基、氯甲基、羥甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、異丙基和硬脂基。下文中直鏈烷基定義為甲基、乙基、丙基或丁基。下文中ω-羥烷基定義為羥甲基、羥乙基、羥丙基或羥丁基。
下文中烷氧基定義為取代或未取代的C1-18烷氧基。C1-18烷氧基的實(shí)例包括甲氧基、芴甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、異丁氧基和硬脂氧基。
可以將上述的相同基團(tuán)用作任意取代的芳基或芳氧基。
特別優(yōu)選的N-保護(hù)環(huán)狀或脂族氨基酸衍生物(通式Ⅳ或Ⅶ的原料)是N-Z-脯氨酸(R3=芐氧基)、N-叔丁氧羰基脯氨酸(R3=叔丁氧基)、N-乙?；彼?R3=甲基)、N-琥珀酰脯氨酸(R3=-(CH2)2-COOH)、N-苯乙?；彼?R3=芐基)、N-苯甲?；彼?R3=苯基)、N-氯乙?；彼?R3=氯甲基)、N-異丁氧羰基脯氨酸(R3=異丁氧基)、N-Z-2-哌啶酸(R3=芐氧基；6元飽和雜環(huán)=2-甲基哌啶)、N-Z-丙氨酸(R3=芐氧基、R4=甲基、R5=氫)、N-Z-絲氨酸(R3=芐氧基，R4=羥乙基，R5=氫)N-Z-焦谷氨酸(R3=芐氧基、五元飽和取代雜環(huán)=5-氧代脯氨酸)和N-Z-肌氨酸(R3=芐氧基，R5=甲基)。
原則上已知制備外消旋N-保護(hù)環(huán)狀或脂族氨基酸及其衍生物的方法。在制備時(shí)，根據(jù)EP-A 0 057 092用已知的方法將相應(yīng)的L-氨基酸外消旋化，然后再根據(jù)Grassmann & Wuensch(Chem.Ber.91(1958),462-465)用已知的方法與相應(yīng)的N-保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)。
一種由相應(yīng)L-氨基酸為原料，在水介質(zhì)中進(jìn)行外消旋化和引入保護(hù)基，而不分離外消旋氨基酸的制備N-保護(hù)環(huán)狀或脂族氨基酸的方法是未知的。
原則上，可以利用所有將外消旋型或其光學(xué)活性異構(gòu)體的N-保護(hù)脯氨酸衍生物用作唯一氮源、唯一碳源或唯一碳和氮源的微生物的生物轉(zhuǎn)化是可能的。同樣適合的是從這些微生物中分離得到的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶。對(duì)該方法特別適合的是上述節(jié)細(xì)菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、牙孢桿菌屬或假單胞菌屬微生物，具體為土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、節(jié)細(xì)菌屬HSZ5、木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17、惡臭假單胞菌K32或皮氏產(chǎn)堿菌K4以及它們功能等同的變異體和突變體。
通過(guò)用靜止細(xì)胞(不再需要碳和能源的非生長(zhǎng)細(xì)胞)或生長(zhǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)微生物可進(jìn)行上述的生物轉(zhuǎn)化。該生物轉(zhuǎn)化較好用靜止細(xì)胞進(jìn)行。
這種生物轉(zhuǎn)化可使用常規(guī)的介質(zhì)，如低摩爾濃度磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液或表1中所述的介質(zhì)。這種生物轉(zhuǎn)化較好在表1中所述的介質(zhì)中進(jìn)行。
通過(guò)一次加入或連續(xù)加入N-保護(hù)的氨基酸衍生物，使它的濃度不超過(guò)50％重量，較好不超過(guò)20％重量，可方便地進(jìn)行這種生物轉(zhuǎn)化。
介質(zhì)的pH可以為3-12，較好為5-9。生物轉(zhuǎn)化的溫度宜為10-70℃，較好為20-50℃。
在本發(fā)明的方法中，N-保護(hù)的環(huán)狀或脂族氨基酸衍生物完全轉(zhuǎn)化為環(huán)狀或脂族L-氨基酸衍生物。在本發(fā)明方法中，高產(chǎn)率地得到高對(duì)映體純度的N-保護(hù)D-氨基酸衍生物(對(duì)映體過(guò)量超過(guò)98％)，然后進(jìn)行分離。
用本發(fā)明方法制得的N-保護(hù)D-氨基酸衍生物和/或L-氨基酸衍生物可用常規(guī)的后處理方法(如萃取)進(jìn)行分離。
實(shí)施例1選擇利用N-Z-L-脯氨酸的微生物首先制備能滿足許多微生物生長(zhǎng)要求的小型培養(yǎng)基(表1)表1小型培養(yǎng)基Na2SO40.1克/升Na2HPO4.2H2O 2.5克/升KH2PO41.0克/升NaCl3.0克/升MgCl2.6H2O0.4克/升CaCl2.2H2O14.5毫克/升FeCl3.6H2O0.8毫克/升微量元素溶液1.0毫升/升維生素溶液 1.0毫升/升pH 7.0加入果糖(5克/升)作為碳源。為濃集能選擇性水解N-Z-L-脯氨酸的微生物，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入N-Z-L-脯氨酸(5克/升)作為唯一的氮源。然后用采自不同地方的土壤試樣移植各種批料，并加以培養(yǎng)(30℃,120轉(zhuǎn)/分)，直到可檢測(cè)到明顯可見(jiàn)的生長(zhǎng)為止。然后將這種培養(yǎng)物的等分試樣移植到相同體積的新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到出現(xiàn)明顯的混濁為止。將這過(guò)程重復(fù)三次。然后在固體培養(yǎng)基(組成與液體培養(yǎng)基相同，但僅加入20克/升的瓊脂)上分離濃集的微生物。按此方法，得到約30種能將N-Z-L-脯氨酸用作唯一氮源的不同細(xì)菌分離物。
實(shí)施例2培養(yǎng)所選擇的微生物在上述的培養(yǎng)基中復(fù)制用實(shí)施例1中所述方法制得的分離物。用離心分離法收集具有足夠細(xì)胞密度(OD6502.0)的所有培養(yǎng)物。用0.85％NaCl將沉淀的細(xì)胞重新懸浮和洗滌。在氯化鈉溶液中重新懸浮后，用靜止細(xì)胞檢測(cè)水解N-Z-L-脯氨酸的能力。為此，在緩沖溶液(50mM三羥甲基氨基甲烷/HCl,pH7.0)中用N-Z-L-脯氨酸(5克/升)培養(yǎng)(30℃)適當(dāng)量的細(xì)胞。在不同的時(shí)間移取等分試樣，用薄層色譜檢測(cè)由N-Z-脯氨酸釋放出脯氨酸。許多分離物具有這種水解活性，特別是兩種菌株HSZ5和HSZ17，德意志微生物保藏中心將其鑒定為節(jié)細(xì)菌屬和木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種。
實(shí)施例3節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)的生長(zhǎng)和酶活性用不同的碳源(N-Z-L-脯氨酸用作氮源)或氮源(果糖用作碳源)培育節(jié)細(xì)菌屬HSZ5。將碳源加至5克/升，氮源加至2克/升。為了誘導(dǎo)所需的酶活性，如有必要，再加入1克/升的N-Z-L-脯氨酸。在試驗(yàn)的碳源中，僅利用了果糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇。在所有其它情況下，N-Z-L-脯氨酸用作碳源。酶活性僅在很小程度上取決于所用的碳源。相反，利用了所有試驗(yàn)的氮源，但在某些情況下明顯降低了酶活性(表2)表2用各種碳源(A)或氮源(B)培養(yǎng)時(shí)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的生長(zhǎng)和酶活性A)碳源 細(xì)胞密度[OD650] 相對(duì)活性[％]果糖 12.0 100葡萄糖 15.0 150蔗糖 12.4 148甘油 3.7183甘露糖醇 11.2 154檸檬酸鹽 2.7106蘋(píng)果酸鹽 3.9124乙酸鹽 3.5144N-Z-L-脯氨酸 2.8109B)氮源細(xì)胞密度[OD650] 相對(duì)活性[％]銨 8.4 22硝酸鹽 7.6 6脲 7.8 12甘氨酸 8.0 17L-谷氨酸9.6 43L-脯氨酸10.864實(shí)施例4N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)物將果糖(5克/升)用作碳源，將L-谷氨酸鹽(2克/升)用作氮源，在小型培養(yǎng)基(實(shí)施例1)中生長(zhǎng)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5。再加入N-Z-L-脯氨酸、N-Z-DL-脯氨酸、N-Z-D-脯氨酸、N-Z-肌氨酸、N-Z-二乙胺、N-Z-甘氨酸、L-苯丙氨酰胺、苯甲酰胺、N-乙?；?L-脯氨酸、N-乙?；拾彼?、乙酰胺(在所有情況下為1克/升)或明膠(5克/升)。每種情況下，收集細(xì)胞后，用靜止細(xì)胞測(cè)試對(duì)N-Z-L-脯氨酸和N-Z-D-脯氨酸的酶活性(按實(shí)施例2所述的方法)。用高壓液相色譜分析檢定脯氨酸的結(jié)果表明，僅N-Z-L-脯氨酸和N-Z-DL-脯氨酸誘導(dǎo)了所需的酶活性。在這兩種情況下，僅N-Z-L-脯氨酸被接受為底物，即在這兩種情況下酶的選擇性是高的。
實(shí)施例5制備N-Z-L-脯氨酸a)將果糖(5克/升)用作碳源，將N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作氮源，在小型培養(yǎng)基(實(shí)施例1)中生長(zhǎng)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5。按上述的方法收集和洗滌細(xì)胞。在30℃、pH停滯(pH7.0)和攪拌下用N-Z-DL-脯氨酸(50克/升)培養(yǎng)靜止細(xì)胞(OD650=30)。在不同的時(shí)間，取等分試樣，用高壓液相色譜(HPLC)監(jiān)測(cè)N-Z-L-脯氨酸和N-Z-D-脯氨酸的濃度(見(jiàn)

圖1)。60分鐘后，N-Z-L-脯氨酸幾乎完全水解，而N-Z-D-脯氨酸在溶液中沒(méi)有變化。因此，溶液中的N-Z-D-脯氨酸是高光學(xué)純度的(對(duì)映體過(guò)量＞99％)。
b)在Chemap發(fā)酵罐(工作體積為2升)中，在將葡萄糖(30克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的小型培養(yǎng)基(參見(jiàn)實(shí)施例1)中，于30℃時(shí)將節(jié)細(xì)菌屬HSZ5生長(zhǎng)到細(xì)胞密度OD650＞35。然后為了誘導(dǎo)酶活性，加入少量的N-Z-DL-脯氨酸(5克/升)，將此混合物再培養(yǎng)一段時(shí)間。最后在20小時(shí)內(nèi)再連續(xù)加入145克N-Z-DL-脯氨酸，然后將此混合物再培養(yǎng)5小時(shí)。用離心分離法除去細(xì)胞。然后用鹽酸將培養(yǎng)基液體調(diào)節(jié)到pH＜3，用乙酸丁酯萃取得到在這些條件幾乎不溶于水的N-Z-脯氨酸。將兩相分離后得到L-脯氨酸的水溶液和N-Z-脯氨酸的有機(jī)溶液。將有機(jī)相真空濃縮后，將所得的N-Z-脯氨酸溶解在乙酸乙酯中，加入己烷結(jié)晶。分離得到41.4克N-Z-脯氨酸結(jié)晶(理論產(chǎn)率的53.4％)，用1H-NMR和熔點(diǎn)測(cè)量(75.3℃)確定其同一性和純度。它有極好的光學(xué)純度(根據(jù)高壓液相色譜的分析結(jié)果，對(duì)映體過(guò)量＞99.5％，乙酸中c=1時(shí)，[α]4=60.0)。1H-NMR(400MHz,CD3OD)；ppm7.35(m,5H)；5.1(m,2H)；4.3(m,1H)；3.6-3.4(m,2H)；2.3-2.2(m,1H)；2.1-1.9(m,3H)c)在一個(gè)發(fā)酵罐(標(biāo)稱體積為20升)中，在將葡萄糖(20克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的6升小型培養(yǎng)基(參見(jiàn)實(shí)施例1)中，將節(jié)細(xì)菌屬HSZ5生長(zhǎng)到細(xì)胞密度OD650＞30。然后為了誘導(dǎo)酶活性，加入112克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液，將此混合物再培養(yǎng)1小時(shí)。然后通過(guò)排掉不需要的量將培養(yǎng)物的體積減少到4升。然后在5.5小時(shí)內(nèi)向此含有誘導(dǎo)細(xì)胞的4升培養(yǎng)物中再連續(xù)加入709克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。將此混合物再培養(yǎng)17.5小時(shí)。在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，pH保持在7.5-8.5。完成反應(yīng)后，得到4077克細(xì)胞懸浮液。從中用超過(guò)濾法除去細(xì)胞，按6a)中所述的方法對(duì)培養(yǎng)基液體的等分試樣(1000克)進(jìn)行后處理。分離得到31.24克N-Z-D-脯氨酸結(jié)晶(理論產(chǎn)率的85.0％)。它有極好的純度(滴定含量=99.6％)和光學(xué)純度(根據(jù)高壓液相色譜的分析結(jié)果，對(duì)映體過(guò)量＞99.5％，乙酸中c=2時(shí)，[α]4=60.2)。
d)在一個(gè)450升發(fā)酵罐中，在將葡萄糖(13克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的250千克小型培養(yǎng)基(參見(jiàn)實(shí)施例1)中，將節(jié)細(xì)菌屬HSZ5生長(zhǎng)到所需的細(xì)胞密度(OD650約為25)。然后為了誘導(dǎo)酶活性，加入4千克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。培養(yǎng)1小時(shí)后，溶液的pH慢慢增高(pH=7.5-8.5)，然后在pH停滯的條件下以20千克/小時(shí)的速度再加入67千克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。然后將此混合物再培養(yǎng)20小時(shí)。由于反應(yīng)快(最大速率約為12克N-Z-L-脯氨酸被水解/升×小時(shí))，培養(yǎng)后8小時(shí)，反應(yīng)已基本上完成(對(duì)映體過(guò)量＞98％)。用超離心法從320千克最后所得的培養(yǎng)物中除去細(xì)胞，按6a)中所述的方法對(duì)無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基液體的等分試樣(1444克)進(jìn)行后處理。分離得到50.0克N-Z-D-脯氨酸結(jié)晶(理論產(chǎn)率為83.2％)，其純度非常好(滴定含量＞99％)，光學(xué)純度非常高(根據(jù)高壓液體色譜分析，對(duì)映體過(guò)量＞99％)。圖1N-Z-L-脯氨酸被節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的靜止細(xì)胞酶水解。
實(shí)施例6L-脯氨酸的外消旋化將500毫摩爾L-脯氨酸溶解在125毫升的4N NaOH(500毫摩爾)。然后在一個(gè)高壓容器中將此溶液加熱到160℃，在此溫度保持6小時(shí)，壓力最高達(dá)到4.5巴。溶液冷卻后，用比旋([α]5=-1.5)可以表明脯氨酸已基本上完成外消旋化。當(dāng)僅用0.15摩爾當(dāng)量的NaOH進(jìn)行外消旋化時(shí)，得到類似的結(jié)果。然而，反應(yīng)時(shí)間要增加到16小時(shí)。
實(shí)施例7制備N-Z-(DL)-脯氨酸將100.0克DL-脯氨酸溶解在217毫升4N NaCl中。在恒溫(5-10℃)和pH停滯(pH=11.5-12.0)條件下將氯甲酸芐酯(Z-Cl)滴加到該溶液中。共加入158.1克氯甲酸芐酯，再加入251.2克4NNaOH。為保持反應(yīng)混合物的可攪拌能力，還加入150毫升的蒸餾水。然后用濃鹽酸(76毫升)將該混合物酸化到pH=2.4，共用584毫升乙酸丁酯萃取。按類似于實(shí)施例6中所述的方法，將有機(jī)相中所含的N-Z-DL-脯氨酸結(jié)晶。結(jié)果，得到187.4克N-Z-DL-脯氨酸(理論產(chǎn)率的86.5％)。
實(shí)施例8制備N-Z-(DL)-脯氨酸(單釜反應(yīng))將80.0克L-脯氨酸溶解在174毫升4N NaOH。然后在一個(gè)高壓容器中將此溶液加熱到160℃，在此溫度保持6小時(shí)，壓力最高達(dá)到4.4巴。溶液冷卻后，用比旋([α]5=-0.6)可以確定脯氨酸已基本上完成外消旋化。然后在恒溫(4℃)和pH停滯(pH=11.5-12.0)條件下將氯甲酸芐酯(Z-Cl)滴加到該溶液中。共加入124.5克氯甲酸芐酯，再加入203.7克4N NaOH。為保持反應(yīng)混合物的可攪拌能力，還加入50毫升的蒸餾水。然后用加入4.7克濃鹽酸中和該混合物。加入200毫升乙酸丁酯后，用67.4克濃鹽酸將水相的pH最后調(diào)節(jié)到2.0。分離水相，共用200毫升乙酸丁酯多次萃取。合并有機(jī)相，并按類似于實(shí)施例6中所述的方法，使N-Z-DL-脯氨酸結(jié)晶。結(jié)果，得到151.3克N-Z-DL-脯氨酸(理論產(chǎn)率的87.3％)。
實(shí)施例9表征節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶a)N-酰基-L-脯氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶的pH最佳值在把果糖(5克/升)和N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作碳源或氮源的如表1所示的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(30℃,120轉(zhuǎn)/分)。達(dá)到所需的細(xì)胞密度后，用離心法收集細(xì)胞，放在氯化鈉溶液(0.9％)中洗滌，最后重新懸浮在氯化鈉溶液中。在保持所有其它參數(shù)的條件下(30℃,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650=15-20)，測(cè)定酶活性與pH的關(guān)系。該批料在pH=7.0時(shí)的結(jié)果用作100％值。圖2節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性與pH的關(guān)系。
本實(shí)施例得到一個(gè)常規(guī)的最佳曲線，其最佳pH范圍為6.4-6.6。pH=5.0和pH=8.5處，不再測(cè)出酶活性。
b)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性與溫度的關(guān)系按9a)中所述的方法制備具有N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞。這次測(cè)定酶活性隨溫度的變化。所有的其它參數(shù)保持不變(pH6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650=20-25)。將該批料在30℃時(shí)的結(jié)果用作100％值。圖3節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性與溫度的關(guān)系
酶活性基本上以S形曲線增加。即使在50℃時(shí)，仍能測(cè)得良好的活性。這表明這種酶具有好的穩(wěn)定性。
c)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性與溫度的關(guān)系按9a)所述的方法制備具有N-Z-L-脯氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞。為測(cè)定該酶的穩(wěn)定性，在不同的溫度下培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液的等分試樣(攪拌，pH=6.5,OD650～40-50)。在不同的時(shí)間提取試樣，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(30℃,pH=6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650-15-20)分析各試樣的剩余N-酰基-L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性。觀察到如下結(jié)果●高達(dá)43℃時(shí)，至少在6小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)到完整的活性●在43-53℃溫度間，開(kāi)始時(shí)酶活性穩(wěn)定增加，但隨后活性稍微減少，結(jié)果在5-6小時(shí)后，仍有約80％初始酶活性。
●更高的溫度使酶失去活性(60℃時(shí)2小時(shí)后剩余50％活性或在65℃時(shí)1小時(shí)后完全失去活性)。
d)產(chǎn)物對(duì)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性的抑制作用按9a)所述的方法制備具有N-Z-L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞。用不同濃度的水解N-Z-L-脯氨酸時(shí)所得產(chǎn)物(L-脯氨酸、N-Z-D-脯氨酸、芐醇)將細(xì)胞懸浮液的等分試樣培養(yǎng)30分鐘(30℃,pH6.4)然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下(30℃,pH=6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650～15-20)測(cè)定各批料的酶活性。這里將在不加入一種產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)的批料的結(jié)果用作100％值。
圖4節(jié)細(xì)菌屬HSZ5的N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶活性與產(chǎn)物濃度的關(guān)系。
由圖中可見(jiàn)，即使在高濃度下，L-脯氨酸也根本沒(méi)有抑制酶活性。相反，N-Z-D-脯氨酸和芐醇隨著濃度的增加使酶活性迅速降低。雖然N-Z-D-脯氨酸似乎起競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的作用(隨濃度增加抑制呈線性增高)，但芐醇以非競(jìng)爭(zhēng)方式起到抑制作用(在極限濃度上有活性)。
實(shí)施例10具有N-?；?L-脯氨酸?；D(zhuǎn)移酶的各種菌株的底物譜a)在把各種N-保護(hù)氨基酸用作唯一氮源的條件下生長(zhǎng)在把果糖(5克/升)用作唯一碳源的如表1所述的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5、木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、皮氏產(chǎn)堿菌K4和惡臭假單胞菌K32。在每種情況下加入不同的N-保護(hù)氨基酸作為唯一的氮源(5克/升)。當(dāng)細(xì)胞密度OD650＞0.5時(shí)，該批料評(píng)定為正的。
表3在把各種N-保護(hù)氨基酸用作唯一氮源的條件下各種菌株的生長(zhǎng)
b)各種N-保護(hù)氨基酸的酶水解在把果糖(5克/升)和N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作碳源或氮源的如表1所述的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)節(jié)細(xì)菌屬HSZ5、木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、皮氏產(chǎn)堿菌K4和惡臭假單胞菌K32。達(dá)到所需的細(xì)胞密度后，用離心法收集細(xì)胞，放在氯化鈉溶液(0.9％)中洗滌。在測(cè)試所有菌株的所需酶活性后，將細(xì)胞重新懸浮在100 mM磷酸鉀緩沖液中(pH7.0)。加入各種N-保護(hù)氨基酸(最后濃度為100mM)后，在搖動(dòng)和30℃條件下培養(yǎng)各批料，在合適的間隔取出試樣。然后分析這些用于水解所用底物的試樣。
表4用含不同N-?；?L-脯氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶的菌株的完整細(xì)胞酶水解不同的N-保護(hù)氨基酸
與保藏微生物有關(guān)的證明(PCT13款至) <
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PCT/RO/134表(1992年7月)
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權(quán)利要求
1．微生物，其特征在于它們能將用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一的N-保護(hù)脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源，
式中R1是-(CH2)2-COOH、任意取代的C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，R2是氫或=O。
2．如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于它們能將用通式Ⅰ表示的N-保護(hù)L-脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源。
3．如權(quán)利要求1或2所述的微生物，其特征在于它們是節(jié)細(xì)菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、牙孢桿菌、假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬微生物。
4．如權(quán)利要求1-3中至少一項(xiàng)所述的微生物，其特征在于它們是節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)、木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、惡臭假單胞菌K32或皮氏產(chǎn)堿菌K4以及它們功能等同的變異體和突變體。
5．N-?；?L-脯氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于它具有如下性質(zhì)a)底物專一性水解N-芐氧羰基-L-脯氨酸、N-苯甲?；?L-脯氨酸、N-異丁氧基羰基-L-脯氨酸、N-芐氧羰基-L-焦谷氨酸、N-芐氧羰基-DL-2-哌啶酸、N-芐氧羰基-L-丙氨酸，b)pH最佳值pH最佳值為pH6.5±0.2c)溫度穩(wěn)定性在高達(dá)43℃和pH6.5條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，仍檢測(cè)不到活性的喪失。d)溫度活性在50℃和pH6.5的條件下能檢測(cè)到良好的活性。e)抑制劑的作用芐醇和N-芐氧羰基-D-脯氨酸具有抑制作用。
6．用通式Ⅱ表示的N-保護(hù)環(huán)狀D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅲ表示的環(huán)狀L-氨基酸衍生物的制備方法，
式中A與-N-和-CH一起構(gòu)成任意取代的4-、5-或6-元飽和雜環(huán)，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；其特征在于它是在用通式Ⅳ表示的外消旋N-保護(hù)環(huán)狀氨基酸衍生物中
式中A與-N-和-CH以及R3具有上述的含義；N-保護(hù)的環(huán)狀L-氨基酸衍生物用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的微生物或用權(quán)利要求5所述的無(wú)細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化成環(huán)狀L-氨基酸衍生物(通式Ⅲ)，并加以選擇性地分離，在該生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除所述環(huán)狀L-氨基酸衍生物外，還可得到可選擇性分離的N-保護(hù)環(huán)狀D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
7．用通式Ⅴ表示的N-保護(hù)脂族D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物的制備方法，
式中R3具有上述的含義，R4是氫、任意取代的直鏈烷基或ω-羥烷基，R5是氫或任意取代的直鏈烷基，其特征在于它是在用通式Ⅶ表示的外消旋N-保護(hù)脂族氨基酸衍生物中
式中R3、R4和R5具有上述的含義；N-保護(hù)的脂族L-氨基酸衍生物用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的微生物或用權(quán)利要求5所述的無(wú)細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化成脂族L-氨基酸衍生物(通式Ⅵ)，并加以選擇性地分離，在該生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除所述脂族L-氨基酸衍生物外，還可得到可選擇性分離的N-保護(hù)脂族D-氨基酸衍生物(通式Ⅴ)。
8．如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的生物轉(zhuǎn)化用節(jié)細(xì)菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、牙孢桿菌、假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬微生物進(jìn)行。
9．用通式Ⅱ表示的N-保護(hù)環(huán)狀D-氨基酸衍生物的制備方法，
式中A與-N-和-CH一起是任意取代的4-、5-或6-元飽和雜環(huán)，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；其特征在于將用通式Ⅲ表示的環(huán)狀L-氨基酸衍生物
式中A與-N-和-CH一起具有上述的含義，被外消旋成相應(yīng)的環(huán)狀氨基酸衍生物，它被轉(zhuǎn)化成用通式Ⅳ表示的N-保護(hù)環(huán)狀氨基酸衍生物，
式中A與-N-和-CH一起以及R3具有上述的含義，在后者中，N-保護(hù)的L-氨基酸衍生物用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的微生物或用權(quán)利要求5所述的無(wú)細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化成環(huán)狀L-氨基酸衍生物，并加以選擇性地分離，在該生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除所述環(huán)狀L-氨基酸衍生物外，還可分離得到N-保護(hù)環(huán)狀D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
10．用通式Ⅴ表示的N-保護(hù)脂族D-氨基酸衍生物的制備方法，
式中R3、R4和R5具有上述的含義；其特征在于將用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物
式中R4具有上述的含義，被外消旋成相應(yīng)的脂族氨基酸衍生物，它被轉(zhuǎn)化成用通式Ⅶ表示的N-保護(hù)脂族氨基酸衍生物，
式中R3、R4和R5具有上述的含義，在后者中，N-保護(hù)的脂族L-氨基酸衍生物是用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的微生物或用權(quán)利要求5所述的無(wú)細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化成脂族L-氨基酸衍生物，并加以選擇性地分離，在該生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，除所述脂族L-氨基酸衍生物外，還可分離得到N-保護(hù)D-氨基酸衍生物(通式Ⅴ)。
11．如權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)在水介質(zhì)中進(jìn)行，而且不分離外消旋的氨基酸衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及能將用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一的N－保護(hù)脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源的新穎微生物。式中R
文檔編號(hào)C12P13/00GK1213400SQ97192958
公開(kāi)日1999年4月7日 申請(qǐng)日期1997年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月13日
發(fā)明者M·紹特, D·韋內(nèi)茨, F·亨岑, D·施米特哈爾特, G·普法芬, O·韋爾比茨基 申請(qǐng)人:隆薩股份公司