發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)l-羥脯氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程，具體涉及微生物直接利用葡萄糖發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法。
【背景技術】
[0002]輕脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸輕基化后的產(chǎn)物，其分子式為C5H9NO3t3羥脯氨酸呈白色片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，微甜，熔點為274°C，易溶于水，微溶于乙醇。自然界中反式-4-羥基脯氨酸較為常見，反式-4-羥脯氨酸最早發(fā)現(xiàn)于動物膠原蛋白中。反式-4-羥脯氨酸廣泛應用于醫(yī)藥、化工、動物飼料、營養(yǎng)和美容業(yè)等方面。
[0003]目前，國內(nèi)外報道的生產(chǎn)羥脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法四種，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工業(yè)生產(chǎn)方法。但是，蛋白水解提取法需經(jīng)過強酸強堿處理，純化步驟長，而且羥脯氨酸提取率在4%-7 %，提取和原料成本高，不僅浪費大量原料，而且廢棄物污染嚴重，隨著目前環(huán)境壓力的增加和資源原料價格的上升，傳統(tǒng)的蛋白水解提取法正逐漸被市場淘汰。微生物發(fā)酵法正以其綠色環(huán)保的工藝、原料和成本低廉的優(yōu)勢迅速發(fā)展起來。
[0004]目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-羥脯氨酸的研究還處于實驗室階段，尚未形成成熟的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，而先進的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，尤其是菌種的固體培養(yǎng)及液體發(fā)酵培養(yǎng)方法、發(fā)酵液的提取方法、濃縮液的純化方法對于L-羥脯氨酸的發(fā)酵單位、收率、質(zhì)量、成本和三廢排放有著至關重要的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于:提供一種發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法，采用該方法工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸，有利于提高L-羥脯氨酸的發(fā)酵單位、收率、質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，避免三廢污染。
[0006]本發(fā)明的技術解決方案為:
[0007]發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法，步驟包括菌種固體培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取和純化:
[0008](I)菌種固體培養(yǎng):菌種固體培養(yǎng)基用2N的NaOH溶液調(diào)pH到7.0，分裝于1ml斜面試管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮紙，121°C滅菌15分鐘，取出冷卻到50?60°C后，于無菌室中加入10 %的AMP溶液，到AMP終濃度為50ppm，搖勻后傾斜30°放置，待凝固后置無菌室備用;在超凈工作臺用接種環(huán)劃一環(huán)菌種均勻涂布在試管或茄子瓶空白斜面上，放置37 ±1.0°〇的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?48小時，菌苔長好后直接上罐或放置O?5°C冰箱中備用；其中菌種來源于中科院天津工業(yè)生物技術研究所，菌株是一株Escherichia Coli K12W3110變種;菌種固體培養(yǎng)基由酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、AMP組成，其配方為酵母粉5g/L、蛋白胨1g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂20g/L、AMP50mg/L;其中濃度為10%的AMP溶液由氨芐西林溶解于蒸餾水中制得；
[0009](2)發(fā)酵培養(yǎng):首先是菌種在液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成熟的種子，然后移入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵代謝產(chǎn)生L-羥脯氨酸；其中液體種子培養(yǎng)基水溶液配方(g/L)為:葡萄糖40、酵母粉 7.5、硫酸銨 2.0、磷酸二氫鉀7.5、氯化鉀1.9、FeS04.7H20 0.28,MgSO4.7H200.32、微量元素(ppm):MnS04.H2O 0.5、CoCl2.6H2O 1.4、NiS(k.6H2O 1.2 ^ CuSO4.7H200.5,ZnSO4.7H20 0.6,VBi 20、消泡劑100、AMP 50，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)如下:葡萄糖
20、酵母粉5.0、硫酸銨 10、磷酸二氫鉀5.0、氯化鉀1.9、MgS(k.7H20 0.32,FeSO4.7H200.75、微量元素(ppm):MnS04.H2O I.0、CoCl2.6H2O 1.4、NiS(k.6H2O 1.4 ^ CuSO4.7H20
1.0、ZnS04.7H20 1.2、消泡劑200、AMP 50;其中成熟種子的培養(yǎng)包括以下步驟:①空罐滅菌:0.15-0.20MPa，保壓30分鐘;②實罐滅菌:液體種子培養(yǎng)基投入種子罐，4T種子罐配2.4T液體種子培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.0，關閉罐蓋，夾套加熱至90°C，直接蒸汽加熱到121°C，0.1MPa壓力保溫10分鐘;③冷卻:滅菌完畢冷卻降溫至36°C待接種;④接種:采用壓差法將菌液接入罐內(nèi)，接種溫度36°C，pH7.0?9.0，壓力0.1MPa，打開接種口防護蓋，用浸泡過95%乙醇的棉花圈套住接種口，點燃棉花圈，將內(nèi)含由固體培養(yǎng)菌種培養(yǎng)收集得來的菌液的接種瓶移至點燃棉花圈接種口旁，旋開接種瓶針頭保護塞，迅速將接種瓶針頭插入接種口，緩緩打開罐上排氣閥，調(diào)壓0.05?0.1MPa，接種量I瓶，接種結(jié)束后，用浸過75%乙醇的棉花球放置在接種口上，撥出接種針頭，旋上接種口防護蓋，開始培養(yǎng)；⑤培養(yǎng):培養(yǎng)溫度36°C、罐壓0.03MPa、風量0.2?1.2VVM、pH6.5、攪拌轉(zhuǎn)速200?600rpm、溶氧20%以上、培養(yǎng)時間8?24小時、OD6qq達到10?20、最終葡萄糖含量小于10g/L;其中發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟:①空罐滅菌:0.15-0.17MPa壓力、溫度128°C滅菌30分鐘;②實罐滅菌:發(fā)酵培養(yǎng)基投入罐中，30T罐加22T培養(yǎng)基，關閉罐蓋，夾套預熱到95?105°C，直接蒸汽加熱到121°C，壓力0.1MPa，保溫10分鐘，冷卻降溫至35°C，調(diào)pH到6.5，備接種;③接種:采用壓差法將種子液壓入罐內(nèi)培養(yǎng);④培養(yǎng):培養(yǎng)溫度35°C，罐壓0.03MPa，風量0.5?1.2VVM，pH6.5，攪拌轉(zhuǎn)速60?300rpm，發(fā)酵結(jié)束時羥脯氨酸生成濃度在30?90g/L、糖濃度S 2.0 % ;⑤發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至80°C，立即降溫至40°C，用壓縮空氣壓至發(fā)酵液貯罐；
[0010](3)發(fā)酵液提取:依次包括以下步驟:首先發(fā)酵液微濾，儲罐中的發(fā)酵液用栗打入加熱罐中，加熱并保溫40土5°C，開啟膜過濾器對發(fā)酵液進行過濾，微濾溫度35?45°C，微濾壓力0.30Ma，微濾流速80?100L/m2/h，膜孔徑0.05?I.0um，膜厚度10?150um;然后，微濾后的濾液進一步超濾，超濾溫度40?50°C，超濾壓力1.010^，超濾流速30?35171112/11，膜孔徑0.015?0.1um，膜厚度150?250um，非對稱性膜;最后，超濾后的提純液進一步納濾得濃縮液，納濾溫度45?55°C，納濾壓力0.5?3.5MPa，納濾流速2.5?4.5L/m2/h，膜孔徑I?5nm，膜厚度100?300um，非對稱性膜；
[0011](4)純化:依次包括粗結(jié)晶和精制過程，其中，粗結(jié)晶過程為:①將濃縮液打入結(jié)晶罐中，迅速攪拌降溫至O?10°C，5土 3°C靜止結(jié)晶4小時;②將粗品離心甩干，冰水淋洗，60°C熱循環(huán)干燥箱干燥6小時，控制水份S 5 %，即得粗品；精制過程為:①在攪拌下將粗品加入20倍重量的60°C純水中，升溫至75°C完全溶解;②按粗品重量的10%加入769活性碳，在75°C脫色15分鐘，過濾;③脫色液經(jīng)冷盤管降溫至O?10°C，按體積比15%加入濃度80%的工業(yè)醋酸，攪拌有大量晶體析出后停攪拌，5±3°C保溫結(jié)晶4小時，結(jié)晶結(jié)束時母液濃度2?3g/L;④將結(jié)晶液轉(zhuǎn)入離心機離心，冰水淋洗，濕粉進雙錐干燥器80°C真空干燥4?6小時得L-羥脯氨酸精品。
[0012]本發(fā)明采用生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸，經(jīng)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液提取和純化工序，有利于提高L-羥脯氨酸的發(fā)酵單位、收率、質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，避免三廢污染。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體的實施例，進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0014]例I
[0015]1、菌種固體培養(yǎng):菌種固體培養(yǎng)基用2N的NaOH溶液調(diào)pH到7.0，分裝于1ml斜面試管，加塞包牛皮紙，121°C滅菌15分鐘，取出冷卻到50°C后于無菌室中加入10%的AMP溶液5ul，搖勻后傾斜30°放置，待凝固后置無菌室備用；在超凈工作臺用接種環(huán)劃一環(huán)菌種均勻涂布在試管斜面上，放置37± 1.0°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，菌苔長好后直接種母瓶;其中菌種來源于中科院天津工業(yè)生物技術研究所，菌株是一株Escherichia Coli K12W3110變種;菌種固體培養(yǎng)基由酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、AMP組成，其配方為酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂20g/L、AMP50mg/L。其中濃度為10%的AMP溶液由氨芐西林溶解于蒸餾水中制得。
[0016]2、發(fā)酵培養(yǎng):首先菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到成熟的種子，然后移入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵代謝產(chǎn)生L-羥脯氨酸;其中液體種子培養(yǎng)基水溶液配方(g/L)為:葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸銨2.0、磷酸二氫鉀7.5、氯化鉀1.9、？&04.7H20 0.28,MgSO4.7H20 0.32、微量元素(ppm):MnS04.H2O 0.5、CoC12.6H2O 1.4^NiSO4.6H2O 1.2^CuSO4.7H20 0.5、ZnS〇4.7H20 0.6,VBi 20、消泡劑100、AMP 50。其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)如下:葡萄糖20、酵母粉
5.0、硫酸銨 10、磷酸二氫鉀 5.0、氯化鉀 1.9、MgS04.7H20 0.32,FeSO4.7H20 0.75、微量元^ (ppm): MnSO4.H2O I.0、CoCl2.6H2O 1.4、NiS(k.6H2O 1.4 ^ CuSO4.7H20 1.0^ZnSO4.7H20 1.2、消泡劑200、AMP 50 ；其中成熟種子的培養(yǎng)包括以下步驟:①空罐滅菌:0.15MPa，保壓30分鐘；②實罐滅菌:液體種子培養(yǎng)基投入罐，4T種子罐配2.4T種