專利名稱：誘導(dǎo)對抗原的粘膜耐受的制作方法
誘導(dǎo)對抗原的粘膜耐受本發(fā)明涉及誘導(dǎo)對抗原的耐受，這通過粘膜(優(yōu)選經(jīng)口 )施用抗原 與產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物的組合來實現(xiàn)。更具體地，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)產(chǎn)生Foxp3+和/或IL-10和/或TGF-p的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞， 其能夠抑制不想要的針對抗原的免疫應(yīng)答，所述誘導(dǎo)通過經(jīng)口遞送所述 抗原與分泌免疫抑制細(xì)胞因子的微生物的組合來實現(xiàn)。技術(shù)領(lǐng)域免疫系統(tǒng)負(fù)有分辨自身和非自身的任務(wù)。沿呼吸道、胃腸道和泌尿 生殖道存在的粘膜免疫系統(tǒng)還負(fù)有與多種細(xì)菌和無害抗原共存的責(zé)任， 所述細(xì)菌和抗原為例如食物、空氣傳播的抗原或者共生菌群。粘膜免疫 系統(tǒng)的關(guān)鍵特征是能夠保持對這些抗原的耐受而同時保持有效抵御病 原體的能力。全身性引入抗原(無論通過注射還是損傷)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞 局部浸潤以及特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生。相反，在粘膜表面(例如胃腸 道和泌尿生殖道)引入的抗原全身性引發(fā)對針對這些抗原的免疫應(yīng)答的 主動抑制。通過經(jīng)胃腸道施用抗原來特異性誘導(dǎo)這些受調(diào)控的應(yīng)答稱為 經(jīng)口耐受。經(jīng)口施用抗原可導(dǎo)致全身性不應(yīng)答，這是對具有不理想副作 用的免疫抑制醫(yī)學(xué)發(fā)明(例如類固醇)的一種4艮有吸引力的替代方案。 本發(fā)明特別涉及通過重復(fù)接觸低劑量抗原而獲得低劑量耐受的領(lǐng)域。已 經(jīng)提出將經(jīng)粘膜進(jìn)行的耐受誘導(dǎo)用作針對自身免疫病、變應(yīng)性疾病和炎 性疾病的治療策略。
背景技術(shù)：
盡管經(jīng)口耐受首先描述于1911年，但是直到二十世紀(jì)70年代后期 研究人員才開始闡明其涉及的機(jī)制(Mayer和Shao， 2004a )。已經(jīng)提 出了用于開發(fā)經(jīng)口耐受的一些機(jī)制，范圍從抗特異性T細(xì)胞的清除、免 疫偏離以及豫導(dǎo)對Treg抑制的無反應(yīng)性(Mucida等，2005)。大多數(shù)研究人員贊同有兩種不同的獲得經(jīng)口耐受的方式單次抗原高劑量之后 獲得的高劑量耐受和通過重復(fù)接觸低劑量抗原而獲得的低劑量耐受，前 者是基于無反應(yīng)性和/或清除(Friedman和Weiner, 1994 )，后者由CD4+ T細(xì)胞(包括生產(chǎn)Foxp3+、 IL-10和/或TGF-p的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)免疫 應(yīng)答的主動抑制來介導(dǎo)。重要的是，已經(jīng)顯示粘膜耐受所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞介導(dǎo)旁觀者抑制(bystander suppression), 通過這一過禾呈，對一 種蛋白質(zhì)具有特異性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞抑制附近效應(yīng)細(xì)胞對另一種蛋白質(zhì) 的應(yīng)答。旁觀者抑制是抗原誘導(dǎo)的抑制的重要特征，因為誘導(dǎo)器官特異 性自身免疫的抗原庫大部分是未知的，并且它避免了表位擴(kuò)展(epitope spreading)現(xiàn)象。表位擴(kuò)展是自身免疫和變應(yīng)性疾病的并發(fā)癥，由此最 初的免疫應(yīng)答隨時間擴(kuò)展到包括對其它抗原的應(yīng)答。通過顯示Flt3L驅(qū)動DC擴(kuò)增(Viney等，1998 )和RANK-L介導(dǎo) 的DC活化(Williamson等，2002 )之后經(jīng)口耐受增強(qiáng)的研究，人們已 經(jīng)間接提及了樹突細(xì)胞在誘導(dǎo)經(jīng)口耐受中的作用。具體地，未成熟樹突 細(xì)胞可介導(dǎo)耐受，據(jù)推測是通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。另外，IL-10可調(diào) 節(jié)未成熟樹突細(xì)胞的功能并抑制其終末分化，擴(kuò)增參與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞的致耐受樹突細(xì)胞的局部存在(DeSmedt等，1997)。粘膜耐受的誘導(dǎo)已在多種變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病實驗?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行 了評價，但是來自人類試驗的臨床數(shù)據(jù)普遍令人失望。已經(jīng)進(jìn)行了多種 努力來遞送與免疫調(diào)節(jié)化合物組合或不組合的抗原，以實現(xiàn)經(jīng)口耐受， 但是在大多數(shù)情況下效果不顯著。在任何事件中，結(jié)果都不足以將所述 方法轉(zhuǎn)用到人類中。在所有這些實驗中的主要問題在于，沒有觀察到通 過誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞以及之后產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所導(dǎo)致的主 動抑制。只有當(dāng)觀察到上述情況，才可在人類中獲得對抗原免疫應(yīng)答的 真實和主動的抑制。靶向性且更高效地遞送用于治療和預(yù)防應(yīng)用的分子是制藥工業(yè)優(yōu) 先考慮的問題。有效的策略應(yīng)通過將分子集中到期望的作用部位來降低 所需劑量、提高安全性并改善療效。相比于注射，藥物和疫苗遞送的粘 膜途徑提供了多種物流方面和生物學(xué)方面的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)口遞送由于施用簡 單而特別具有吸引力。但是，胃腸降解以及低吸收水平通常使得這種肽 和蛋白質(zhì)藥物遞送途徑無效。替代性粘膜途徑(例如經(jīng)鼻、直腸、肺和眼途徑)也在研究中。粘膜遞送蛋白質(zhì)和肽疫苗抗原通常刺激弱免疫應(yīng) 答，并可誘導(dǎo)免疫耐受。IL-4、 TGF-p、 IL-10 (SIavin等，2001 )以及抗IL-12的粘膜遞送 都被猜測為增強(qiáng)耐受。白介素-10 (IL-10)在低劑量耐受的發(fā)生中起關(guān) 鍵作用(Slavin等，2001; Mauer等，2003)。已經(jīng)顯示，經(jīng)口使用低 劑量髓磷脂堿性蛋白和同時的經(jīng)口 IL-10處理小鼠降低了實驗性自身免 疫腦脊髓炎的嚴(yán)重程度和發(fā)病率，但是療效很低，遠(yuǎn)不足以對人類有效。 在這些實驗中，添加的IL-10量很高(1 fig至lOjig),而數(shù)據(jù)提示，施 用更高的劑量更為有效。盡管觀察到體外0.1 fig的IL-10對增殖、IL-12 和IFN-y分泌的抑制效應(yīng)，但是未觀察到O.lng的IL-10加MBP治療 對疾病有效果。已經(jīng)使用經(jīng)口施用IL-10與低劑量經(jīng)口髓磷脂少突膠質(zhì) 細(xì)胞糖蛋白(oligodendrocyte glycoprotein, MOG)的纟且合進(jìn)4亍了沖目同 的小鼠實驗，其導(dǎo)致MOG誘導(dǎo)的小鼠模型中復(fù)發(fā)降低。同樣，這時療 效低且IL-10添加量高，顯示使用較高劑量更為有效的數(shù)據(jù)。在兩個實 驗中，均沒有通過在人中有效的長期免疫耐受來主動抑制免疫應(yīng)答，或 者至少是不足的。具體地，因為斷定具有足以轉(zhuǎn)用至人體的真實療效時， 應(yīng)觀察到抗原特異性CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)，最終產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。只 有這樣的機(jī)制能夠在人中主動抑制免疫應(yīng)答。在所有前述例子中均沒有 觀察到CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)。人們通常認(rèn)同微生物菌群在經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用(Moreau 和Corthier, 1988; Gaboriau國Routhiau等，2003 )。 Di Giacinto等(2005 ) 提出，益生菌可誘導(dǎo)IL-10和IL-10依賴性的帶有TGF-(5的調(diào)節(jié)性細(xì)胞。 但是，此作用是如何產(chǎn)生的仍十分不清楚，并且簡單地在腸道中存在微 生物并不足夠(Rask等，2005)。另外，盡管益生菌可改善變態(tài)反應(yīng)和 哮喘的癥狀，但結(jié)果不總是明確的，僅使用益生菌不足以誘導(dǎo)可靠的經(jīng) 口耐受應(yīng)答。已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試以通過乳酸菌遞送低劑量抗原，以抑 制變應(yīng)性免疫應(yīng)答(Daniel等，2006)，其導(dǎo)致變應(yīng)原特異性IgE的減 少和變應(yīng)原特異性分泌性IgA應(yīng)答的增強(qiáng)。盡管在小鼠中實現(xiàn)了免疫平 衡從T輔助細(xì)胞2型應(yīng)答到主要為T輔助細(xì)胞-1型應(yīng)答的理想變化， 但是對游離變應(yīng)原的遞送沒有顯著改善。 一般地，這樣單獨(dú)遞送變應(yīng)原 的方法不足以在人中實現(xiàn)相同的結(jié)果。這是由于這些策略需要很長的間 隔治療期，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)不能實現(xiàn)，或者至少不足以建立調(diào)節(jié)性區(qū)室以實現(xiàn)真正、主動且長期的免疫耐受效應(yīng)。在另一個例子中，經(jīng) 口施用表達(dá)髓磷脂抗原的重組乳桿菌在小鼠模型中導(dǎo)致實驗性自身免疫腦脊髓炎的減少(Maassen等，2003)。但是，認(rèn)為所述療效低并且 不足以轉(zhuǎn)用于人體。具體地，因為斷定具有足以轉(zhuǎn)用至人體的真實療效 時，應(yīng)觀察到抗原特異性CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)，最終產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 只有這樣的機(jī)制能夠在人中主動抑制免疫應(yīng)答。在所有前述例子中均沒 有觀察到CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)。因此，本領(lǐng)域中有效誘導(dǎo)抗原耐受仍然是一個問題。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)將粘膜遞送抗原與粘膜遞送產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié) 化合物的微生物組合在一起可誘導(dǎo)穩(wěn)定的粘膜耐受應(yīng)答，優(yōu)選這樣的抗 原通過微生物表達(dá)，并且優(yōu)選這樣的粘膜遞送經(jīng)口進(jìn)行。我們觀察到， 相比于僅粘膜遞送表達(dá)抗原的微生物，粘膜遞送這樣的組合給予了對抗 原特異性免疫應(yīng)答明顯更好的抑制。甚至更令人驚奇的是，通過本發(fā)明 獲得的免疫抑制明顯比經(jīng)口遞送游離的免疫調(diào)節(jié)化合物(無論是否與經(jīng) 口遞送抗原組合)更加有效。我們已證實，與僅使用抗原或產(chǎn)生IL-10的乳酸乳球菌(/fl"/s) 的單一療法相比或者與使用與經(jīng)口施用游離IL-10組合的抗原相比，本 發(fā)明可誘導(dǎo)經(jīng)口耐受的效力高得多?？乖禺愋哉{(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體內(nèi)活 化顯著增強(qiáng)。這些細(xì)胞將免疫顯性耐受(dominant tolerance)傳遞給 免疫活性受者，并介導(dǎo)均勻的局外抑制。本發(fā)明的效力在自身免疫病和 變應(yīng)性疾病小鼠模型中以及治療劑的免疫失活的方面中得到了證明。發(fā)'勞詳迷在本公開內(nèi)容的全文中，通過加注的引用參考了多個出版物、專利 以及已公開的專利說明書。這些出版物、專利以及公開的專利說明書的 公開內(nèi)容通過參考并入本文，以更加完整的描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀 態(tài)。A.普通技術(shù)除非另外指明，本發(fā)明的實施將利用有機(jī)化學(xué)、藥學(xué)、分子生物學(xué) (包括重組技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們
在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中有完整描述，例如 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》第二版(Sambrook等,1989 ); ((Oligonucleotide Synthesis》(M. J. Gait編輯,1984 );《Animal Cell Culture》(R. I. Freshney編輯,1987);《Me仇ods in Enzymology》叢書 (Academic Press, Inc.); 《Handbook of Experimental Immunology》(D. M. Weir & C. C. Blackwell編輯)；《Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J. M. Miller & M. P. Calos編輯，1987);《Current Protocols in Molecular Biology》(F. M. Ausubel等編輯，1987和期刊)《Polymerase Chain Reaction》(Mullis等編輯,1994 )以及《Current Protocols in Immunology》(J. E. Coligan等編輯,1991 )。
B.定義
本文使用的一些術(shù)語可具有以下定義。如說明書和權(quán)利要求中所使 用的，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另有明確指明。例如術(shù)語 "細(xì)胞"包括多個細(xì)胞，包括其混合物。類似的，如本文所述將"化合物" 用于治療或藥物制備還涵蓋將一種或多種本發(fā)明化合物用于這樣的治 療或制備，除非上下文另有明確指明。
本文所使用的術(shù)語"包含"或"包括"意為組合物和方法包括所提及 的要素，但并不排除其它要素。"基本由......組成"在用于定義組合物和
方法時，意為排除任何對所述組合物具有重要意義的其他要素。因此， 如本文所定義的基本由要素組成的組合物不排除來自分離和純化方法 的痕量污染物以及可藥用載體，例如磷酸緩沖鹽水、防腐劑等。
"由......組成"意為排除多于痕量的其它成分要素以及用于施用本發(fā)
明組合物的重要方法步驟。
這些連接詞中的每一個所定義的實施方案都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第一個方面是用于誘導(dǎo)對抗原的免疫耐受的方法，其包括 組合進(jìn)行粘膜遞送所述抗原與粘膜遞送產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及將產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原組合用于制備用于粘膜遞送以誘導(dǎo)免疫耐受的藥物。
優(yōu)選地，所述免疫耐受在動物中誘導(dǎo)。所述動物是哺乳動物，優(yōu)選 選自小鼠、大鼠、豬、牛、綿羊、馬和人。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
優(yōu)選地，所述免疫耐受是粘膜耐受。
本文使用的/A^可以是任何粘膜，例如口粘膜、直腸粘膜、尿道粘 膜、陰道粘膜、眼粘膜、頰粘膜、肺粘膜以及鼻粘膜。本申請全文中使 用的/^^遽這包括遞送至所述粘膜?？谡衬みf送包括頰、舌下和牙齦遞
送途徑。因此，本發(fā)明涉及其中所述粘膜遞送選自以下的方法直腸遞 送、頰遞送、肺遞送、眼睛遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。優(yōu)選 地，所述粘膜遞送是經(jīng)口遞送，所述耐受是經(jīng)口耐受。
本申請全文中使用的祐處耐《是動物(包括人)經(jīng)粘膜途徑接觸抗 原之后所述動物中對所述抗原的特異性免疫應(yīng)答性的抑制。優(yōu)選地，所 述粘膜耐受是全身性耐受。后來的接觸所述抗原可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的每一種接觸，例如通過胃腸外注射、通過粘膜遞送、或者通過內(nèi) 源產(chǎn)生(例如自身抗原的情況下)的接觸。經(jīng)口考菱是動物(包括人) 通過經(jīng)口途徑接觸抗原之后所述動物中對所述抗原的特異性免疫應(yīng)答 性的抑制。效浙量經(jīng)口耐愛是通過低劑量抗原誘導(dǎo)的經(jīng)口耐受，其特征 為通過環(huán)磷酰胺敏感性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的主動免疫抑制，所述T細(xì) 胞可對未活化宿主(naiVe host)傳遞耐受性。^浙量經(jīng)口耐憂是通過 高劑量抗原誘導(dǎo)的經(jīng)口耐受，對環(huán)磷酰胺處理不敏感，并通過抗原特異 性T細(xì)胞的無反應(yīng)性和/或清除繼續(xù)誘導(dǎo)T細(xì)胞低應(yīng)答性?？墒褂脤Νh(huán) 礴酰胺敏感性的差異來區(qū)分低劑量和高劑量耐受(Strobel等，1983)。 優(yōu)選地，所述經(jīng)口耐受是如Mayer和Shao ( 2004b )所述的〗氐劑量經(jīng)口 耐受。
因此，本發(fā)明涉及本文所述的方法或用途，其中所述對免疫耐受的 誘導(dǎo)是所述誘導(dǎo)之前的至少1.5倍、優(yōu)選2倍、更優(yōu)選3倍或更多。或 者，所述抗原相對于所述誘導(dǎo)之前耐受至少1.5倍、2倍、3倍或更多。 所述對免疫耐受的誘導(dǎo)可通過本領(lǐng)域已知的方法測量。優(yōu)選地，所述對 免疫耐受的誘導(dǎo)可通過調(diào)節(jié)所述動物中細(xì)胞因子水平來測量。這樣，所 述調(diào)節(jié)可以是細(xì)胞因子水平的提高，例如所述細(xì)胞因子水平的提高為所述誘導(dǎo)之前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多?；蛘撸稣{(diào)節(jié)可以是具 體細(xì)胞因子水平的下降，例如所述細(xì)胞因子水平的下降為所述誘導(dǎo)之前 的至少1.5倍、2倍、3倍或更多。所述細(xì)胞因子可選自任何相關(guān)細(xì)胞因 子，優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子選自IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 TNF-ou 麗-Y、腿-a、 MCP國1、 TGF(5、 RANK-L和Flt3L。
抗原可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗原。本申請全文中使用的戎 ^優(yōu)選是在引入動物身體時激發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)，其中所述免疫應(yīng)答 可以是T細(xì)胞介導(dǎo)的和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答包括Thl 和/或Th2應(yīng)答。所述抗原可以是任何抗原，例如但不僅限于變應(yīng)原(包括 食物變應(yīng)原)、同種抗原、自體抗原(self antigen )、自身抗原(auto-antigen) 以及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療性分子或抗原。優(yōu)選地，所述抗原參與誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答相關(guān)疾病。甚至更優(yōu)選地，所述抗原參與誘導(dǎo)變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬 化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫 性重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物變態(tài)反應(yīng)、乳糜瀉或者移植物抗宿主病。
本文使用的免疫應(yīng)答相關(guān)疾病是由身體對抗原不想要的免疫應(yīng)答造成 的疾病，其中所述抗原可以是異源抗原或自身抗原。免疫應(yīng)^^目關(guān)疾病包 括但不僅限于變應(yīng)性反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))、乳糜瀉、變應(yīng)性哞喘、 自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性曱狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化。免疫應(yīng)答相關(guān)疾病還包括不想 要的免M應(yīng)，例如移植物抗宿主病，或者藥物的免疫活化，例如針對非 內(nèi)源性因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應(yīng)性哞喘、食物變 態(tài)反應(yīng)、乳糜瀉、I型糖尿病和治療劑的免疫失活。因此應(yīng)該理解，免疫 應(yīng)答相關(guān)疾病包括但不僅限于變應(yīng)性反應(yīng)(包括食物變態(tài)反應(yīng))、乳糜瀉、 變應(yīng)性哞喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性曱狀腺炎、自身免疫性重 癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化。免疫應(yīng)答相關(guān)疾 病還包括不想要的免M應(yīng)，例如移植物抗宿主病，或者藥物的免疫活化， 例如針對非內(nèi)源性因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應(yīng)性哮 喘、食物變態(tài)反應(yīng)、乳糜瀉、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治療劑的免 疫失活。
在另一些實施方案中，通過抗原表達(dá);敞生物來遞送所述抗原。優(yōu)選地，通過分泌抗原或展示抗原的微生物來遞送所述抗原。因此，本發(fā)明涉及本 文所述的方法，其中所述抗原展示在所述抗原表達(dá)孩i生物的表面，或者其
中所述抗原被表達(dá)?？赏╥t^目同孩吏生物或者不同孩t生物遞送所述免疫調(diào)節(jié) 化合物和所述抗原。
綜上所述，應(yīng)該理解，本發(fā)明涉及本文所述的方法或用途，其中所述 方法或用途是治療性和/或預(yù)防性的。
必^^樹旨任何化學(xué)或生物學(xué)的化合物或復(fù)合物，包括簡單或復(fù)雜的有 機(jī)和無機(jī)分子、肽、擬肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、抗體、碳7jC化合物、 核酸或其衍生物。^瘦源f必合參是改變免疫系統(tǒng)功能的化合物。本文使
用的免疫調(diào)節(jié)化合物是誘導(dǎo)耐受的化合物；作為非限制性實例，耐受誘導(dǎo)
可以直接方式通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞例如Treg、 Trl或Th3或者通過將 Thl/Th2平衡向Thl偏移來獲得；或者可以間接方式通過活化未成熟樹突 細(xì)胞成耐受性樹突細(xì)胞和/或抑制誘導(dǎo)成熟樹突細(xì)胞表達(dá)"共刺激"因子的 Th2免疫應(yīng)答來獲得。免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的，包括但不僅限于細(xì)菌代謝物例如精胍菌素、真菌和鏈霉菌代謝物例如 他克莫司或環(huán)孢素、免疫抑制細(xì)胞因子例如IL-4、 IL-IO、 IFNa、 TGF卩 (作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的選擇性佐劑)、Flt3L、 TSLP和Rank-L (作為選毒 性致耐受DCi秀導(dǎo)物)、抗體和/或拮抗劑(例如抗CD40L、抗CD25、抗 CD20、抗IgE、抗CD3 )和蛋白質(zhì)、肽或融合蛋白(例如CTL-4 Ig或CTLA-4 激動劑融合蛋白)。
因此，所述免疫調(diào)節(jié)化合物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何免疫調(diào) 節(jié)化合物。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)化合物;UL疫抑制化合物，甚至更優(yōu)選 地，所述化合物AiL疫抑制細(xì)胞因子或抗體。優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞 因子是耐受增強(qiáng)細(xì)胞因子或抗體。免疫抑制細(xì)胞因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的，包括但不僅限于IL-4、 IL-IO、 IFN-a和TGFp (作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的選擇性佐劑)和Flt3L、 TSLP和Rank-L (作為選擇性致耐受DC誘導(dǎo) 物)。優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子選自IL-4、 IL-IO、 IFN-a和Flt3L。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明還涉及其功能同系物。功能同系物指具有 基4^目同或類似功能(至少對于意圖目的)但是結(jié)構(gòu)上可以不同的分子。 最優(yōu)選地，所述免疫抑制耐受增強(qiáng)細(xì)胞因子是IL-IO，或者其功能同系物。 優(yōu)選地，所述免疫抑制抗體選自抗IL-2、抗IL12、抗IL6和抗IFN-y。本文所使用的遽送是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何遞送方法，包括但 不限于待遞送化合物的包衣或無包衣藥物制劑、膠嚢、脂質(zhì)體、油體、包 含或帶有待遞送化合物的聚合物顆粒，或者分泌、展示或積累待遞送化合 物的微生物，任選地存在可增強(qiáng)粘膜遞送和/或粘膜纟聶入的化合物。
本文所述化合物或組合物可以以純化形式施用、與其它活性成分組合 或者與可藥用無毒賦形劑或載體組合。經(jīng)口組合物一般包含惰性稀釋載體 或者可食用載體。藥用相容性粘合劑和/或佐劑材料可作為 一部分包含在所 述組合物中。片劑、丸劑、膠嚢劑、錠劑等可含有任何以下成分或性質(zhì)類
似的化合物粘合劑例如微晶纖維素、黃芙膠或明膠；賦形劑例如淀粉或 乳糖，*劑例如褐藻酸、羧甲基淀粉鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤滑 劑例如硬脂酸鎂；助流劑例如膠體二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或 者芳香劑例如薄荷、7jc楊酸甲酯或者橙味劑。當(dāng)所述劑量單位形式A^嚢 劑時，除上述材料類型外它還可含有液體載體例如脂肪油。另外，劑量單 位形式可含有多種改變所述劑量單位物理形式的其它材料，例如糖包衣、 紫膠或腸溶劑(enteric agent )。另外，除了活性化合物之外，糖漿可含有 蔗糖作為甜味劑以及某些防腐劑、染料、著色劑以及芳香劑。應(yīng)理解，可 藥用載體的形式和特征由與它組合的活性成分的量、給藥途徑以及其它熟 知的變量來決定。所述載體必須是"可接受的"，即與所述制劑的其它成分 相容，并對受試者沒有毒性。
用于施用的替代制劑包括無菌的水性或非水性溶液劑、混懸劑和乳劑。 非水性溶劑的實例是二甲亞砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄 欖油)以及注射用有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。水性載體包括醇與水的混合 物、經(jīng)緩沖的介質(zhì)以及鹽7jc。靜脈內(nèi)載體包括流體和養(yǎng)分補(bǔ)充劑、電解質(zhì) 補(bǔ)充劑，例如基于^M^格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)的載體等。還可存在 防腐劑及其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。 多種液體制劑均有可能用于這些遞送方法，包括鹽水、醇、DMSO以4 于水的溶液。
優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子以低量表達(dá)，優(yōu)選地，在小鼠實驗情 況中為所施用的每劑細(xì)菌中O.ljig或更少，在人體疾病的情況中這些用 量要作相應(yīng)轉(zhuǎn)換。我們已證明，與僅使用抗原或產(chǎn)生IL-10的微生物如 乳酸乳球菌的單一療法相比，或者與使用與經(jīng)口施用游離IL-10組合的抗原相比，本發(fā)明能以高得多的效力誘導(dǎo)經(jīng)口耐受?？乖禺愋哉{(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體內(nèi)活化得到極大增強(qiáng)。這些細(xì)胞將顯性耐受傳遞給免疫活性 受者，并介導(dǎo)均勻的局外抑制。本發(fā)明的效力在自身免疫病和變應(yīng)性疾 病小鼠模型中以及治療劑免疫失活的情況中得到了證明。本文所使用的術(shù)語"治療"等包括改善或消除已發(fā)生的精神疾病或 病癥(已建立后)，或者緩解這些疾病或病癥的特征性癥狀。本文所使 用的這些術(shù)語還包含(取決于患者的狀態(tài))預(yù)防疾病或病癥或者其相關(guān) 癥狀的發(fā)生，包括在患所述疾病或病癥之前降低疾病或病癥或其相關(guān)的 癥狀的嚴(yán)重程度。這些在患病之前的預(yù)防或降低指對不在患該疾病或病 癥的給藥時間的患者施用本發(fā)明的化合物或組合物。"預(yù)防"也包括阻止 疾病或病癥或其相關(guān)癥狀的再發(fā)，或者其復(fù)發(fā)預(yù)防，例如在改善期之后。 應(yīng)該明確，精神病癥可以是身體不適的原因。在這一方面，術(shù)語"治療" 還包括預(yù)防身體疾病或病癥，或者改善或消除已發(fā)生的身體疾病或病癥 (已建立后)，或者緩解這些病癥的特征性癥狀。本文所使用的術(shù)語"藥劑"還包含術(shù)語"藥物"、"治療劑"、"劑"或在 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于表示具有治療或預(yù)防效果的制劑的其他術(shù)語。應(yīng)理解，本發(fā)明的化合物(即抗原和免疫調(diào)節(jié)分子)以治療有效量 遞送或表達(dá)。本文所使用的術(shù)語"治療有效量"意為當(dāng)根據(jù)期望的治療方 案施用時，將引發(fā)期望的治療或預(yù)防效果或應(yīng)答的本發(fā)明化合物或組合 物的量。優(yōu)選地，所述化合物或組合物以單位劑型提供，例如片劑、膠 嚢劑或者計量氣霧劑劑量，從而將單劑量施用于受試者，例如患者。在某些時候，本申請中所使用的^……逸合或逸合迷存意為在所述 粘膜水平上同時存在抗原和免疫調(diào)節(jié)化合物。它不意味著抗原和免疫調(diào) 節(jié)化合物總是必須同時都在粘膜水平上存在。因此，所述方法包括同時 施用抗原和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物，以及依次施用抗原和產(chǎn)生免 疫調(diào)節(jié)化合物的微生物，或其任意組合。在另一個實施方案中，所述抗原與所述產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生 物同時遞送或者依次遞送。一個優(yōu)選實施方案是同時施用抗原和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物。在此情況下，抗原和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物可包含在相同的 藥物制劑中，或者在一起使用的多于一個藥物制劑中。 一個優(yōu)選實施方 案是通過同時產(chǎn)生所述抗原和所述免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物來遞送。當(dāng)抗原和表達(dá)免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物或者同時包含這兩種要素 的組合物同時施用時，所述化合物或者活性成分可存在于單一藥物組合 物或制劑中?；蛘撸龌衔锘蚧钚猿煞衷诜珠_的藥物組合物或制劑中施用， 用于同時或分開應(yīng)用。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明抗原和表達(dá)免疫 調(diào)節(jié)分子的微生物的藥物組合物，還涉及這些藥物組合物的用途。在依次施用的情況下，可首先施用抗原或者產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)組合物的 微生物。在依次施用的情況下，施用之間相隔的時間或者抗原與產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)組合物的微生物之間的時間優(yōu)選不長于3個小時，更優(yōu)選不長于 2個小時，最優(yōu)選不長于l個小時。所述活性成分可每天施用l至6次，足以顯示出期望活性。這些日 劑量可以單劑量每天給予一次，或者可以以兩個或多個較小劑量在每天 中相同或不同的時間給予，總共給予特定的日劑量。優(yōu)選地，所述活性 成分每天施用 一次或兩次。還考慮了兩種活性成分在相同時間或者非常 接近的時間施用。或者， 一種化合物在早晨施用，另一種在這天的晚些 時候施用?；蛘咴诹硪环N情況下， 一種化合物每天施用兩次，另一種每 天施用一次，其時間在每天兩次給藥的其中一次時，或者是獨(dú)立的。優(yōu) 選地，兩種化合物同時施用，并作為混合物施用。在一個實施方案中， 第二種化合物與所述第一種化合物同時、分別或者依次施用。在本發(fā)明的所有方面中，可在臨床期望的時期內(nèi)對所述患者給予每 日維持劑量，例如從一天至數(shù)年(例如所述哺乳動物的余生)；例如從 約(2或3或5天，l或2周，或l個月)向上和/或例如長達(dá)約(5年、 l年、6個月、l個月、l周，或者3或5天)。典型的是施用每日維持 劑量約3至約5天，或者約l周至約l年。所述液體制劑的其它組分可 包括防腐劑、無機(jī)鹽、酸、堿、緩沖劑、營養(yǎng)物、維生素或者其它藥物。分泌免疫調(diào)節(jié)化合物和/或抗原的微生物可以以至少每天104菌落形成單位(colony forming unit, cfu )至1012cfu的劑量遞送，優(yōu)選為每天 106cfu至1012cfu,最優(yōu)選為每天109cfu至1012cfu。根據(jù)Steidler等 (Science 2000)描述的方法，例如109cfu分泌的免疫調(diào)節(jié)化合物為至 少1 ng至100 ng。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的ELISA，例如109cfu分 泌的免疫調(diào)節(jié)化合物是至少1 ng至100 ng;本領(lǐng)域技術(shù)人員可計算對 于任何其它c(diǎn)fu劑量的免疫調(diào)節(jié)化合物和/或抗原分泌范圍。抗原可以以誘導(dǎo)低劑量應(yīng)答的劑量遞送。優(yōu)選地，所述抗原以至少 每天10 fg至100 jig、優(yōu)選每天1 pg至100 jig、最優(yōu)選每天1 ng至100 Hg的劑量遞送。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物可以以至少每天IO fg至100嗎、優(yōu)選每 天1 pg至100 ng、最優(yōu)選每天1 ng至100 jig的劑量遞送。優(yōu)選地，所述化合物或組合物以單位劑型提供，例如片劑、溶液劑、 膠嚢劑或計量氣霧劑劑量，從而對受試者(例如患者)施用單劑量。根據(jù)給藥模式(例如經(jīng)口或任何上文描述的模式)，本領(lǐng)域技術(shù)人 員知道如何確定或計算施用于患者的實際劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解 根據(jù)患者、微生物、載體等對劑量進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的化合物還可采取可藥用鹽、水化物、溶劑化物或代謝物的 形式?？伤幱名}包括無機(jī)和有機(jī)酸的堿鹽，所述酸包括但不僅限于鹽酸、 氬溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、萘磺酸、 蘋果酸、乙酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、馬 來酸、水楊酸、苯曱酸、苯乙酸、扁桃酸等等。當(dāng)本發(fā)明化合物包含酸 性功能時(例如羧基)，那么所述羧基的合適的可藥用陽離子對是本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的，包括堿、堿土、銨、季銨陽離子等等。所述微生物可以是任何適于粘膜遞送的微生物，包括細(xì)菌、酵母或 真菌。優(yōu)選的，所述微生物是非病原性微生物，甚至更優(yōu)選所述微生物 是益生微生物。益生生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。益生生物包括但不 限于細(xì)菌例如乳桿菌(Lactobacillus sp.)、乳球菌(Lactococcus sp.)、 雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)以及酵母例如釀酒酵母布拉亞種 (iSflcc/mfwij^es cefev/siW認(rèn)6s/;ec/es Aow/an/// )。 優(yōu)選地,所述細(xì)菌是乳酸菌；甚至更優(yōu)選地，所述乳酸菌選自乳桿菌屬(i^"o^"7/Ms)、明串珠菌屬(丄e"COWO^ C )、片球菌屬 (i^力V COCCWS )、 乳球菌屬 ()、鏈球菌屬(iS^e/7,OCOCCWS )、 氣球菌屬(JefW0CCMS )、肉桿菌屬(CVif7^6fl"w7/附)、腸球菌屬(^EVi& coccws )、 酒球菌屬(Oe/IOCtfCC^ )、四聯(lián)球菌屬 (rmi^lOCOCCMS )、漫游球菌屬 (和魏斯氏菌屬(在一個更優(yōu)選的實施方案中， 所述微生物是乳酸乳球菌(Z^"MOCCMS/""/s )。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物是釀酒酵母。在一個優(yōu)選實施方案中，所述免疫抑制細(xì)胞因子與針對免疫誘導(dǎo)細(xì)胞因子的拮抗抗體(抗IL-2、抗IL-12和/或抗IFNy)和共刺激分子(例如 抗CD40L和抗CD3 )組合。或者，可遞送刺激產(chǎn)生所述免疫抑制細(xì)胞因 子的化合物，例如霍亂毒素B亞基；以及刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的分子， 例如ICOS和CTLA-4激動劑。如上所述，所述微生物優(yōu)選為非病原性微 生物，更優(yōu)選是益生微生物。益生生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但 不限于細(xì)菌例如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌，以及酵母例如釀酒酵母布拉 亞種。在一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一個優(yōu)選 實施方案中，所述孩史生物是釀酒酵母。最優(yōu)選地，所述益生孩i生物是乳酸 菌，因為已經(jīng)描述了通過乳酸菌將異源蛋白質(zhì)(即非乳酸菌蛋白質(zhì))遞送 進(jìn)粘膜，包括經(jīng)口遞送和陰道遞送(Steidler和Rottiers， 2006; Liu等， 2006 )，這使得這些乳酸菌對于抗原和免疫抑制化合物的遞送都非常適合。本發(fā)明的另一個方面是將產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原組合用 于制備治療免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的藥物的用途。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)化合 物;UL疫抑制細(xì)胞因子。優(yōu)選地，所述抗原通過分泌抗原的微生物遞送。 所述免疫調(diào)節(jié)化合物和所述抗原可通it^目同的微生物遞送，或者可以是不 同的微生物。優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子是抑制免疫、增強(qiáng)耐受的細(xì) 胞因子。抑制免疫、增強(qiáng)耐受的細(xì)胞因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括 但不限于IL-4、 IL-10、 IFNa和TGFp、 Flt3L和Rank-L。優(yōu)選地，所述 免疫抑制細(xì)胞因子選自IL-4、 IL-10、 IFNa和Flt3L。最優(yōu)選地，所述免 疫抑制細(xì)胞因子是IL-10或其功能同系物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述IL-12和/或抗IFNy)以及共刺激分子(例如抗CD40L和抗CD3 )組合。 優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子以低量表達(dá)，優(yōu)選在小鼠實驗性情況中為,-2、抗O.lng或更低，在人疾病的情況下這些量需要轉(zhuǎn)換。應(yīng)理解，本發(fā)明的化合物和組合物可用作營養(yǎng)品、功能性食品或醫(yī) 用食品，或者作為所述營養(yǎng)品、功能性食品或醫(yī)用食品的添加劑。另一 個實施方案提供了食品或飲料，優(yōu)選適于人類消費(fèi)，其由營養(yǎng)品和調(diào)味 劑組成，其中所述營養(yǎng)品由農(nóng)產(chǎn)品提取物組成。營養(yǎng)品(無論是液體提取物還是干燥組合物的形式)都是可食用的， 并且可直接被人食用，但是優(yōu)選以添加劑或營養(yǎng)補(bǔ)充劑的形式(例如在 健康食品店銷售的那種片劑)或者作為可食用固體中的成分對人類提 供，更優(yōu)選地以加工食品(例如谷類、面包、豆腐、曲奇、水淇淋、蛋糕、薯片、手巻面包(pretzel )、奶酪等)和可飲用液體(例如飲料， 如奶、蘇打水、運(yùn)動飲料和果汁)中的成分提供。因此，在一個實施方 案中，提供了通過將食品或飲料與有效增強(qiáng)所述食品或飲料營養(yǎng)價值的 量的營養(yǎng)品混合，以提高所述食品或飲料的營養(yǎng)價值的方法。另一個實施方案提供了提高食品或飲料營養(yǎng)價值的方法，包括將所 述食品或飲料與營養(yǎng)品混合，以產(chǎn)生營養(yǎng)提高的食品或飲料，其中所述 營養(yǎng)品以有效提高所述食品或飲料營養(yǎng)價值的量混合，其中所述營養(yǎng)品 由包含本發(fā)明抗原的來自農(nóng)作物的提取物組成，并且其中所述營養(yǎng)提高 的食品或飲料可另外包含調(diào)味劑。優(yōu)選的調(diào)味劑包括甜味劑，例如糖、 玉米糖漿、果糖、葡萄糖、麥芽葡萄糖(maltodextrose)、環(huán)已基氨基 磺酸鹽、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇和草本甜味劑例 如甜菊。本文所述的營養(yǎng)品旨在由于人消費(fèi)，因此獲得它們的方法優(yōu)選根據(jù) 良好生產(chǎn)規(guī)范(Good Manufacturing Practices, GMP)以及管理這些 方法的任何適用的政府法規(guī)來進(jìn)行。特別優(yōu)選的方法僅應(yīng)用天然來源的 溶劑。本文所述營養(yǎng)品優(yōu)選含有相對高水平的健康增強(qiáng)物質(zhì)。營養(yǎng)品可 與另一種營養(yǎng)品混合以增加它們的健康增強(qiáng)效果。與營養(yǎng)品相反，所謂的"醫(yī)療食品"并不意為被普通公眾使用，而且 不在商店或超市提供。醫(yī)療食品不是包含在健康膳食中、用于降低疾病 風(fēng)險的食品(例如降脂食品或低鹽食品)，也不是減肥產(chǎn)品。醫(yī)師在患 者有特殊營養(yǎng)需求時開出醫(yī)療食品的處方，以處理疾病或健康狀況，并 且所述患者處于醫(yī)師的持緣關(guān)注下。標(biāo)簽必須清楚的指出所述產(chǎn)品用于處理特定的疾病或病癥。醫(yī)療食品的一個例子是營養(yǎng)多樣化醫(yī)療食品， 其設(shè)計成為慢性炎性病癥的患者提供靶向性營養(yǎng)支持。此產(chǎn)品的活性化 合物為例如一種或多種本文所描述的化合物。功能性食品可涵蓋包含在 健康膳食中、用于降低疾病風(fēng)險的食品，例如降脂食品或低鹽食品，或 者減肥產(chǎn)品。因此，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明營養(yǎng)品的食品或飲料。
因此，本發(fā)明涉及將分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原組合用于
制備用于誘導(dǎo)免疫耐受或用于治療免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的藥物、醫(yī)療食品 或營養(yǎng)品中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及組合物在制備和/或生產(chǎn)用于
治療、預(yù)防和/或緩解涉及免疫應(yīng)答疾病的疾病或病癥的藥物、醫(yī)療食 品或營養(yǎng)品中的用途，其特征在于所述組合物至少包含分泌免疫調(diào)節(jié)化 合物的微生物以及抗原。
在另一個方面，本發(fā)明涉及至少分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物以及 抗原用于治療、預(yù)防和/或緩解涉及免疫應(yīng)答疾病的疾病或病癥的用途。 因此，本發(fā)明還涉及用于在有此需要的動物中治療免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的 方法，包括組合進(jìn)行粘膜遞送抗原與粘膜遞送分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微 生物。
在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含分泌免疫調(diào)節(jié)化 合物的微生物與抗原的組合。優(yōu)選地，所述組合物是藥物組合物。優(yōu)選 地，所述抗原是變應(yīng)原、同種抗原、自體抗原或自身抗原。更優(yōu)選地， 所述抗原參與誘導(dǎo)變應(yīng)性譯喘、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、自身免疫性 葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、食物變態(tài)反應(yīng)或乳糜瀉。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗原是治療性
抗原，優(yōu)選抗CD3。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗原通it^達(dá)抗原的微生物遞送。 在此情況下，所述抗原可展示在所述抗原表達(dá)微生物的表面，或者它可,皮 所述微生物分泌。優(yōu)選地，所述組合物以噴霧劑、膠嚢劑、氣霧劑、錠劑、 大丸劑、片劑、嚢劑、液體劑、混懸劑、乳劑或者糖錠劑存在，優(yōu)選為單 位劑型，例如片劑、膠嚢劑或者計量氣霧劑劑量。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物 中的免疫調(diào)節(jié)化合物AiL疫抑制化合物或抗體。在一個優(yōu)選實施方案中， 所述免疫抑制化合物是耐受增強(qiáng)細(xì)胞因子或者耐受增強(qiáng)抗體，最優(yōu)選地， 它選自IL畫4、 IL國IO、 IFN-a、 Flt3L、 TGF卩和RANK-L。在另一個優(yōu)選實 施方案中，所述免疫抑制化合物AiL疫抑制抗體，其選自抗IL-2、抗IL-12和抗IFN-y。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明組合物中分泌免疫調(diào)節(jié)化合 物的微生物是益生微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明組合物中分 泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物是細(xì)菌或酵母，優(yōu)選地，所述細(xì)菌是乳酸菌， 更優(yōu)選它是選自以下的乳酸菌乳桿菌、明串珠菌、片球菌、乳球菌、 鏈球菌、氣球菌、肉桿菌、腸球菌、酒球菌、四聯(lián)球菌、漫游球菌和魏 斯氏菌，最優(yōu)選地，所述乳球菌是乳酸乳球菌。優(yōu)選地，所述酵母是釀 酒酵母。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物中所述抗原和所述免疫調(diào)節(jié)化合物由同 一微生物表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物還包含佐劑、可藥用栽體和/或 賦形劑。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物還包含刺激產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子的化 合物，優(yōu)選地，所述刺激產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子的化合物是霍亂毒素B 亞基。優(yōu)選地，在本發(fā)明組合物中，所述抗原和/或所述分泌免疫調(diào)節(jié) 化合物的微生物以至少10 fg至100 mg的劑量存在。
在最后一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防和/或緩解涉及 免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的疾病或病癥的藥物、營養(yǎng)品或醫(yī)療食品，其至少包 含分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原的組合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案做出多種改變 和修飾，并且可以產(chǎn)生這樣的改變和修飾而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思。因此， 所附權(quán)利要求旨在覆蓋落入本發(fā)明實質(zhì)構(gòu)思和范圍內(nèi)的所有這些等同 變化。
另外，在本發(fā)明化合物的描述中所使用的所有術(shù)語均具有本領(lǐng)域熟 知的含義。


圖1.在對Balb/c小鼠經(jīng)口喂飼GM乳酸乳球菌或卵白蛋白(OVA) 之后，胭窩及腹股溝淋巴結(jié)(PLN/ILN)中的增殖性免疫應(yīng)答。在用弗 氏完全佐劑中的OVA皮下攻擊小鼠(第0天)后11天測量OVA特異 性的增殖性應(yīng)答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32 天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第 -7天、第-4天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌懸液。LL-pT: LL-pTlNX (載體對照)和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA:分泌卵白蛋白 的乳酸乳球菌菌林和 LL-pTlNX 的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA+LL-mlL10: LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌 株的混合細(xì)菌懸液。陽性對照l在第-7天接受20mgOVA。陽性對照2 在乳酸乳球菌喂飼的同一天接受1 ng OVA。所顯示的結(jié)果是來自一組4 只小鼠的合并細(xì)胞的一式三份培養(yǎng)物的平均卩H]-胸苷摻入(士SD)，以 cpm計。
圖2.對Balb/c小鼠經(jīng)口喂飼GM乳酸乳球菌或OVA之后，MLN 和PLN/ILN中的細(xì)胞因子應(yīng)答。評價對照小鼠和艱飼GM乳酸乳球菌 或OVA的小鼠中IL12p70 ( a )、 TNF-a ( b )、 IFN-y ( c )、 MCP畫1 ( d )、 IL-10 (e)和IL-6 (f)的分泌。在體外用300 ng/mlOVA再刺激之后， l吏用小鼠炎癥試劑盒，由CBA (BD Bioscience)測試MLN (A)和 PLN/ILN (B)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中細(xì)胞因子的存在情況。所顯 示的結(jié)果是來自 一組4只小鼠的合并細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
圖3.對Balb/c小鼠經(jīng)口喂飼GM乳酸乳球菌或OVA之后， PLN/ILN中OVA特異性的增殖性CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答。在用弗氏完全佐 劑中的OVA皮下攻擊小鼠(第0天)后11天測量OVA特異性的增殖 性應(yīng)答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第 -28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第-7天、 第-4天至第-l天接受混合的乳酸乳球菌懸液。LL-pT: LL-pTlNX(載 體對照)和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA:分泌卵白蛋白的乳 酸乳球菌菌林和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA+LL-mlL10: LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌林的混合細(xì)菌懸液。陽 性對照1在第-7天接受20 mg OVA。陽性對照2在乳酸乳球菌喂飼的同 一天接受l ng OVA。所顯示的結(jié)果是來自一組4只小鼠的合并細(xì)胞的 一式三份培養(yǎng)物的平均卩H-胸苷摻入(士SD)，以cpm計。
實施例
實施例A:在經(jīng)口施用分泌卵白蛋白的乳酸乳球菌與原位遞送IL-10 組合之后誘導(dǎo)對所述卵白蛋白的耐受。
該實施例的材料和方法
細(xì)菌和質(zhì)粒在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于GM17 培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17(Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌林的保藏懸液均在-20。C下保存于GM17中的50%甘油中。 對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋500倍，在30'C孵育。 它們在16小時內(nèi)達(dá)到每毫升2xl(^個菌落形成單位(CFU)的飽和濃 度。在此研究中始終使用混合細(xì)菌懸液。因此，通過離心收獲必須混合 的細(xì)菌，將兩種細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀均在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍 (Schotte，等，2000)。對于治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100 pl 此懸液。
編碼原雞(G"〃ms g"〃"s)卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank(登 錄號AY223553)。從雞子宮中分離總RNA，并使用25jd體積中的2ng 總RNA、 2 nM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands )、 0.01 mM DTT ( Sigma-Aldrich， Zwijndrecht, The Netherlands), 0.5 mM dNTP (Invitrogen， Merelbeke， Belgium )、 20 U Rnasin ( Promega Incorporation Benelux )和100 U superscript II逆 轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列條件，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)擴(kuò)增OVAcDNA片段94°C2分鐘，然后是94。C45秒、62'C30 秒和72'C90秒的30個循環(huán)，使用下列正向和反向引物
5'- ggctccatcggtgcagcaagcatggaatt-3'和 5'隱actagttaaggggaaacacatctgccaaagaagagaa-3'。
將擴(kuò)增的片段與紅霉素抗性pTINX載體中乳球菌Pl啟動子下游的
Usp45分泌信號融合。用攜帶OVA cDNA和IL-10的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的 MG1363菌林命名為分泌OVA的乳酸乳球菌(LL-OVA )以及LL-IL10。 乳酸乳球菌-pTlNX (含有空載體pTINX的MG1363 )作為對照 (LL-pTINX )。
動參
7周齡的雌性Balb/c小鼠獲得自Charles River Laboratories (Italy )。它們在SPF條件下飼養(yǎng)，以標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼料和自來水隨意進(jìn) 行飼養(yǎng)。該動物研究得到根特大學(xué)分子生物醫(yī)學(xué)研究系倫理委員會的批 準(zhǔn)。遂口/^f^滲導(dǎo)和伊斧
小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第-28 天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-ll天至第-7天、第-4 天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌懸液。LL-pT: LL-pTlNX(載體對 照)和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA:分泌卵白蛋白的乳酸乳 球菌菌林和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液；LL-OVA+LL-mlL10: LL-OVA 和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌株的混合細(xì)菌懸液。該研究中包 含經(jīng)口耐受誘導(dǎo)的兩個陽性對照。陽性對照l在第-7天接受100nlBM9 培養(yǎng)基中的20 mg卵白蛋白。陽性對照2在乳酸乳球菌喂飼的同一天接 受100nlBM9培養(yǎng)基中的1 jig卵白蛋白。小鼠通過導(dǎo)管胃內(nèi)接受喂飼。 對照小鼠不進(jìn)行經(jīng)口處理。在第0天，用在含有100ng結(jié)核分枝桿菌(Af. ,"6wc"/^/s)H37RA(Difco)的完全弗氏佐劑中1:1乳化的lOO^ig OVA 皮下免疫小鼠。免疫11天后，收集腸系膜'淋巴結(jié)(mesenteric lymph node, MLN )和胭窩及腹股溝淋巴結(jié)(popliteal lymph node, PLN/inguinal lymph node, ILN )，評估所述細(xì)胞的OVA特異性增殖和 細(xì)胞因子產(chǎn)生。
制備引流胭窩及腹股溝淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然 后單獨(dú)或者與11、 33、 100或300ng/ml OVA—起以2乂105個細(xì)胞重懸 于200^1含10%胎牛血清(FCS)、 10U/ml青霉素、10ng/ml鏈霉素、2 mM L-glutamax、 0.4 mM丙酮酸鈉的RPMI-1640 ( RPMI完全)中重 懸所述細(xì)胞。所述細(xì)胞在37。C下在5% C02加濕的培養(yǎng)箱中的U形底 96孔組織培養(yǎng)板(Becton Dickinson )中培養(yǎng)90小時。通過在培養(yǎng)的最 后18個小時添加lnCi/孔的[SH]-胸苷來評估增殖。在玻璃纖維過濾器 (Perkin Elmer)上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
CZM ^/么時r勿應(yīng)在沐斧W OE4掙弄^增瘇
使用CD4+ T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec )，從來自PLN/ILN 的全細(xì)胞制備物中純化CD4+ T細(xì)胞。將2xl()S個CD4+ T細(xì)胞與作為 抗原呈遞細(xì)胞載有OVA的絲裂霉素C處理脾細(xì)胞一起培養(yǎng)于200 jil的RPMI完全培養(yǎng)基中，CD4+ T細(xì)胞與APC的比例為1/3、 1/1、 1/0.3、 1/0.1和1/0。所述細(xì)胞在37。C下在5% C02加濕的培養(yǎng)箱中的U形底 96孔組織培養(yǎng)板(Becton Dickinson )中培養(yǎng)90小時。通過在培養(yǎng)的最 后18個小時添加lnCi/孔的^H-胸苷來評估增殖。在玻璃纖維過濾器 (Perkin Elmer)上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
掙并^勿應(yīng)^子ZJ^
制備來自腸系膜淋巴結(jié)(MLN)和引流胭窩及腹股溝淋巴結(jié)的淋巴 結(jié)細(xì)胞，以2xl()6細(xì)胞/ml重懸，將100 nl等分試樣與300 ng/ml OVA 一起在U型底96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)72小時。上清液保存于-20。C直 至使用小鼠炎癥試劑盒(BD Bioscience )通過流式細(xì)胞珠測定來定量細(xì) 胞因子水平。
實施例A1: LL-IL10顯著增強(qiáng)LL-Ova的耐受誘導(dǎo)能力。為了研究 經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在連續(xù)5天(在第-46天至第-42天、第-39天至第-35 天、第-32天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第 -11天至第-7天以及第-4天至第-1天)中對小鼠經(jīng)口飼喂GM乳酸乳球 菌[LL-pt: LL-pTlNX[全](-載體對照)和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液； LL-OVA:分泌OVA的乳酸乳球菌和LL-pTlNX的混合細(xì)菌懸液； LL-OVA+LL-mlL10:分泌OVA的乳酸乳球侖和分泌小鼠IL-10的乳酸 乳球菌的混合細(xì)菌懸液6次，或者在第-7天飼喂20mg的OVA單劑量 [P曰性對照11，或者在乳酸乳球菌喂飼的同一天飼喂l ng OVA的多次劑 量[陽性對照2。對照小鼠不進(jìn)行經(jīng)口處理。在第0天，用完全弗氏佐 劑中的OVA皮下免疫小鼠，在第11天評估PLN/ILN細(xì)胞的OVA特異 性增殖。LL-IL-10的加入顯著增強(qiáng)了針對OVA的耐受誘導(dǎo)，因為 PLN/ILN細(xì)胞的 OVA特異性增殖性應(yīng)答(圖 1 )在 LL-OVA[全+LL-mlL-10組中比對照和LL-ova組顯著降低。
實施例A2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與應(yīng)答于Ova的促炎癥細(xì)胞因 子產(chǎn)生降低相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(實施例1)對小鼠經(jīng)口喂飼GM 乳酸乳球菌或OVA，然后用弗氏完全佐劑中的OVA皮下免疫小鼠。免 疫11天后，使用小鼠炎癥試劑盒通過流式細(xì)胞珠測定來定量MLN和PLN/ILN中應(yīng)答于OVA的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在MLN中，與觀察到這些 促炎癥細(xì)胞因子強(qiáng)烈產(chǎn)生的LL-ova組相比，LL-ova+LL-mlL-10組中促 炎癥細(xì)胞因子IL-12、 TNF-ou IFN-y和IL-6的產(chǎn)生檢測不到，或者顯著 降低(圖2A )。在PLN中，與LL-ova組相比，LL-ova+LI-mIL-10組中 促炎癥細(xì)胞因子TNF-a、 IFN-y、 MCP-1和IL-6的產(chǎn)生顯著降低，在此 組中，TNF-ou MCP-1和IL-6的水平低于對照組中所觀察到的水平(圖 2B )。
實施例A3: LL-IL10通過CD4+T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。 為了評估經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)是否通過CD4+[全T細(xì)胞介導(dǎo)，在MLN和 PLN/ILN中研究了 OVA特異性的增殖性CD4T細(xì)胞應(yīng)答。因此，在如 上所述的日子(實施例1)對小鼠經(jīng)口喂飼GM乳酸乳球菌或OVA。在 第0天用弗氏完全佐劑中的OVA皮下免疫小鼠，11天后從MLN和 PLN/ILN中純化CD4 T細(xì)胞，然后在載有OVA的絲裂霉素C處理的 脾細(xì)胞存在下培養(yǎng)。相比于LL-ova組和對照組，在LL-ova+LL-mIL-10 組中OVA特異性CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低(圖3 )。
實施例B:在經(jīng)口施用分泌凝血因子VIII和因子IX的乳酸乳球菌 與原位遞送的IL-10組合之后誘導(dǎo)對所述因子的耐受。
引言
多種治療性(重組)蛋白質(zhì)，例如干擾素、因子VIII/IX和抗體 (Remicade)在長治療時期中以高劑量施用。但是，與其應(yīng)用相關(guān)的并 發(fā)癥是發(fā)生蛋白質(zhì)特異性免疫應(yīng)答，例如抗體。這些抗體(Ab)(也稱 為抑制劑)使得所述治療性蛋白質(zhì)有效性降低。實例包括形成以下物質(zhì) 的抑制劑血友病中的因子VIII/IX、接受慢性腎衰竭治療的患者中的 促紅細(xì)胞生成素(Epo)，以及接受多發(fā)性硬化治療的患者中的IFN-p。 本文中，我們證明了經(jīng)口遞送因子VIII (以及因子IX)與產(chǎn)生IL-10 的乳酸乳球菌的組合通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制了 所述因子抑制劑的生成。
該實施例的材料和方法
勿霧和/^"在在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于GM17 培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17(Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌林的保藏懸液均在-20。C下保存于GM17中的50%甘油中。 對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在30'C孵育。 它們在16小時內(nèi)達(dá)到每亳升2xl(^個菌落形成單位(CFU)的飽和濃 度。在此研究中始終使用混合細(xì)菌懸液。因此，通過離心收獲必須混合 的細(xì)菌，將兩種細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀均在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍(Schotte, Steidler等，2000 )。對于治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100^1此懸 液。
擴(kuò)增人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段(代表FVIII和FIX特異 性的CD4+ T細(xì)胞表位)，與紅霉素抗性pTINX載體中乳球菌Pl啟動 子下游的Usp45分泌信號融合。
用攜帶小鼠IL-10、 FVIII(和/或表位片段)、FIX(和/或表位片段) 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌林命名為分泌IL10的乳酸乳球菌LL-IL10、 LL-FVIII、 LL-FIX。 LL-pTlNX (含有空載體pTINX的MG1363 )作 為對照。
FVIII和FIX的定量
使用前述(Chuah等，2003 )的人FVIII和FIX特異性酶聯(lián)免疫吸 附測定(ELISA )對來自LL-FVIII和LL-IX的FVIII或FIX進(jìn)行測定。 還通過Western印跡分析以及COATest和aPTT測定對所述重組蛋白 進(jìn)行分析，如(Chuah等，2003; VandenDriessche等，1999 )所述。 通過自動化Edman降解來確定此蛋白質(zhì)的NH2端。因為FVIII和FIX 在肝臟中正常表達(dá)，在其中它們經(jīng)受了廣泛的翻譯后修飾，所以從改造 乳酸乳球菌中產(chǎn)生的所述凝血因子可能是無生物活性。但是，這些翻譯 后差異可能對這些乳酸乳球菌產(chǎn)生的重組蛋白誘導(dǎo)免疫耐受的能力沒 有影響。事實上，大多數(shù)迄今已詳細(xì)表征的抑制劑通常識別氨基酸殘基 (Villard等，2003)，而不是糖基化部分。
動#
在實驗室中育種血友病A或B小鼠，所述小鼠通過在ES細(xì)胞中使用同
29源重組敲除小鼠的FVIII或FIX基因來獲得，如(Bi等，1995和Wang 等，1997)所述。當(dāng)在CFA存在下使用純化的重組FVIII或FIX抗原 攻擊這些小鼠時，這些受者小鼠產(chǎn)生中和抗體(Mingozzi等，2003)。 可使用Bethesda測定或抗FVIII/抗FIX特異性ELISA隨時間監(jiān)測抑制 劑狀態(tài)。用FVIII或FIX (+CFA)攻擊的受者小鼠通常在抗原攻擊后 2-3周后產(chǎn)生抑制劑。
作為陰性對照、與LL-IL10或IL-10蛋白(1或10 ng)組合或者不組 合地使4-6周齡小鼠接受LL-FVIII、 LL-FIX或LL-pTlNX或LL-OVA (無關(guān)抗原)。作為耐受誘導(dǎo)的陽性對照，我們用由肝細(xì)胞特異性啟動 子表達(dá)FIX的腺相關(guān)病毒載體(AAV)注射小鼠。受者動物產(chǎn)生FIX 特異性免疫耐受，其阻止其后的FIX+CFA攻擊誘導(dǎo)抗FIX的抗體。
在預(yù)防性情況中，使用胃導(dǎo)管將LL-FVIII、 LL-FIX單獨(dú)或者與 LL-IL10或IL10 —起對血友病A或B小鼠經(jīng)口施用，其中使用不同的 治療間隔和劑量。然后用純化的重組FVIII或FIX抗原在CFA存在下 攻擊這些受者小鼠(Mingozzi等，2003)。對照動物接觸LL-pTlNX和 LL-OVA。通過眶后取血收集血漿。使用Bethesda測定(Kasper等， 1975 )或者使用改良的抗FVIII或抗FIX特異性ELISA (VandenDriessche等，1999)以不同時間間隔評估抗FVIII或FIX抗 體的產(chǎn)生。
在治療性情況中，首先用FVIII或FIX免疫血友病A或B小鼠， 如(Mingozzi等，2003 )所述。可使用Bethesda測定或抗FVIII/抗FIX 特異性ELISA隨時間監(jiān)測抑制劑狀態(tài)。然后，使用不同的處理間隔和 劑量，用單獨(dú)或者與LL-IL10或IL10 —起的LL-FVIII、 LL-FIX對低 或高抑制劑效價的小鼠進(jìn)行處理，并隨時間測定抑制劑效價。通過用無 關(guān)抗原(破傷風(fēng)毒素或Ova)攻擊接受單獨(dú)或與LL-IL10 —起的 LL-FVIII、 LL-FIX的小鼠來評估可能的免疫耐受的特異性。作為陽性 對照，小鼠經(jīng)口接觸純化的FVIII或FIX。
*應(yīng)潛#、 ；^崖和勿應(yīng)萄f豸定通過使細(xì)胞穿過70 jim細(xì)胞濾器(Becton/Dickinson Labware)來 制備脾和淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液。通過與紅細(xì)胞裂解緩沖液孵育從脾細(xì)胞 懸液中除去紅細(xì)胞。
總脾細(xì)胞群的增殖測定，將2xl()S個細(xì)胞培養(yǎng)在96孔U形底培養(yǎng) 板中，其中是總體積200 fil的單獨(dú)的或者帶有純化FVIII或FIX的完 全培養(yǎng)基，其帶有或不帶抗IL-10或抗TGF-p中和單克隆抗體。以1 至100 fig/ml的濃度加入FVIII和FIX。以1、 0.1和0.01 fig/ml加入所 述中和抗體。對于CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25—T細(xì)胞群的增殖測定，將 0.2xl()5個CD4+ T細(xì)胞或CD4+CD25- T細(xì)胞與1乂105個經(jīng)輻射的CD4' 細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞)以及FVIII或FIX ( 0或100 fig/ml ) —起培 養(yǎng)于96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 jil的帶有或不帶中和抗體的完全 培養(yǎng)基中。在37°C 5。/。C02加濕培養(yǎng)箱中72小時之后，通過加入lpCi/ 孔的[3印-胸苷來評估增殖。16-18小時后在玻璃纖維過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA )上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測定胸苦摻入。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)的第24、 48和72小時收集用于不同增 殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，冷凍于-20。C直至進(jìn)行細(xì)胞因子測定。 寸吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行定量。
謬^r源，活^繼定
為了測試小鼠中對抗體形成的主動抑制，將分離自不同實驗性乳酸 乳球菌治療組的脾細(xì)胞、珠純化的CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞或 CD4+CD25+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移(adoptively transfer)到幼稚C3H/HeJ小 鼠中。使用未處理小鼠作為對照。對于全脾細(xì)胞、去除亞群的脾細(xì)胞或 者正選擇的CD4+ T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞，所 轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)是107。過繼轉(zhuǎn)移36小時后，受者小鼠(每個實驗組n=4-5) 皮下注射cFA中的5 fig hF.IX。免疫后2.5周測量血漿中的抗hF.IXIgG 效價。
實施例Bl: LL-IL10在血友病A或B小鼠中顯著增強(qiáng)LL-FVIII 和LL-IX的耐受誘導(dǎo)能力。為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(其發(fā)遂'，況)經(jīng)口喂飼小鼠。
LL-IL10的添加顯著增強(qiáng)了對FVIII和FIX的耐受i秀導(dǎo)，因為相比于對 照和LL-FVIII/IX組，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10組中脾細(xì)胞的因子 特異性增殖應(yīng)答顯著降低。
實施例B2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與應(yīng)答于所述因子的FVIII和FIX 特異性效價和IFN-y降低以及更多的IL10和TGF-p產(chǎn)生相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(,發(fā)遂'，況)經(jīng)口喂祠小鼠。 如上所述定量在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中應(yīng)答于所述因子的FVIII和FIX特異性 抗體以及細(xì)胞因子產(chǎn)生。相比于對照和LL-FVIII/IX組，在 LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10組中，抑制劑形成和促炎癥細(xì)胞因子IFN-y 的產(chǎn)生顯著下降，免疫抑制細(xì)胞因子IL-10和TGF-p顯著增加。
實施例B3: LL-IL10通過CD4+T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。
為了評估CD4十T細(xì)胞是否介導(dǎo)經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在脾細(xì)胞和淋巴 結(jié)中研究了因子特異性的增殖性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。因此，如上所述(^ 發(fā)#/,兆)經(jīng)口喂飼小鼠，如鈿^凝#， ；^遂;^勿應(yīng)^f溯〖定中所述測 定因子特異性的CD4+ T細(xì)胞增殖。相比于對照和LL-FVIII/IX組，在 LL-FVIII/FIX+LL-mlL-10組中，因子特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降 低。
實施例B4:IL-10在加強(qiáng)經(jīng)口耐受上的效力低于LL-IL10
為了評估LL-IL10是否與IL10 —樣有效，如上所述(^發(fā)遂橫況) 經(jīng)口喂飼小鼠。在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研究因子特異性的增殖性CD4T細(xì)胞 應(yīng)答。相比于LL-FVIII/IX+IL-10組，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10組 中，因子特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。
實施例B5: LL-FVIII/FIX - LL-IL10組合治療后抗原i秀導(dǎo)的T調(diào) 節(jié)性細(xì)胞可在體內(nèi)傳遞保護(hù)免于形成抑制劑
為了測試在經(jīng)口耐受方案處理的小鼠中抗體形成的主動抑制，我們
如上所述(謬力r源，活但溯〖定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同治療組的脾細(xì)胞。相
比于對照和LL-FVIII/IX組，在LL-FVIII/FIX+LL-mlL-10組中，抗因 子IgG的形成顯著降低，表明在我們的組合經(jīng)口耐受方案中調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞的活化。
實施例C:在經(jīng)口施用分泌變應(yīng)原(Derpl)的乳酸乳球菌與原 位遞送的IL-10的組合之后對所述變應(yīng)原耐受的誘導(dǎo)
引言
變應(yīng)性哞喘是氣道的慢性炎性疾病。它的特征是可逆的呼吸道阻 塞、變應(yīng)原特異性免疫球蛋白E的血清水平升高、粘液分泌過多以及對 支氣管刺激的氣道高應(yīng)答性(airway hyperresponsiveness, AHR)。接 觸患者已經(jīng)致敏的變應(yīng)原(例如樹、草以及野草的花粉、灰塵和塵螨、 真菌、動物毛屑)使其癥狀惡化。2型T輔助(Th2)淋巴細(xì)胞在所述 疾病的起始、發(fā)展和持續(xù)中起重要作用。目前的數(shù)據(jù)表明，Th2對變應(yīng) 原的應(yīng)答通常被調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制。另外，此亞群的抑制在變應(yīng)性個體 中降低。本文中，我們證明經(jīng)口遞送變應(yīng)原與產(chǎn)生IL-10的乳酸乳球菌 的組合通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制哞喘樣應(yīng)答。
該實施例的材料和方法
模擬人類疾病的兩個變應(yīng)性哞喘的小鼠模型是Ova變應(yīng)原;漠型和 人源化SCID模型。
Ova變應(yīng)原模型
用OVA氣霧劑通過吸入攻擊OVA致敏小鼠，導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子 依賴型嗜酸性粒細(xì)胞增多性氣道炎癥、支氣管高反應(yīng)性以及IgE產(chǎn)生， 這些發(fā)現(xiàn)具有高度的人變應(yīng)性哮喘特征(Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy 24:73; Kips等1996, Am J Respir Crit Care Med 153:535; Brusselle等1995， Am J Respir Cell Mol Biol 12:254 )。
勿蓊
在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于 GM17培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI )。所有菌林的保藏懸液均在-20'C下保存于GM17中的50% 甘油中。對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在 3(TC孵育。它們在16小時內(nèi)達(dá)到每毫升2xl(f個菌落形成單位(CFU)的飽和濃度。通過離心收獲細(xì)菌，并在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍。對于 治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100jil此懸液。
復(fù)在
編碼原雞(G"〃"s )卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank
(登錄號AY223553 )。從雞子宮中分離總RNA，并使用25jil體積中的
2 fig總RNA、 2 nM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux,
Leiden， The Netherlands )、0.01 mM DTT( Sigma-Aldrich, Zwijndrecht，
The Netherlands )、 0.5 mM dNTP (Invitrogen, Merelbeke， Belgium )、
20 U Rnasin ( Promega Incorporation Benelux )和100 U superscript II
逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列條件，通過聚合酶鏈?zhǔn)?br> 反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增OVA cDNA片段94。C2分鐘，然后是94。C45秒、
62'C30秒和72'C卯秒的30個循環(huán)，4吏用下列正向和反向引物 5'-GGCTCCATCGGTGCAGCMGCATGGAATT-3'和
5'-AGTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGM-3'。
將擴(kuò)增的片段與紅霉素抗性的pTlNX載體中乳球菌Pl啟動子下游的 Usp45分泌信號融合。
用攜帶小鼠IL-10和OVA cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌林命名 為LL-IL10和LL-OVA。 LL-pTlNX (含有空載體pTlNX的MG1363 ) 作為對照。
OKJ定量
使用自行開發(fā)的OVA特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定 來自LL-OVA的OVA。還通過Western印跡分析評估所述重組蛋白的 產(chǎn)生。
OVA變應(yīng)原模型
BALB/c小鼠(6畫8周齡)購自Charles River Laboratories( Calco, Italy )。在無特異性病原的條件下保持所述小鼠。腹膜內(nèi)注射2 mg氫氧化鋁(alum)中的2 pg OVA (V級； Sigma-Aldrich )來免疫小鼠。10天間隔后重復(fù)這一A疫(在第0天和 笫10天)。對照小鼠接受鹽水注射而不是OVA/alum溶液。免疫后7天， 致敏小鼠吸入溶解于PBS的3%OVA霧化溶液10分鐘。OVA吸入連續(xù) 進(jìn)行3天(第18、 19和20天)。對照小鼠在與實驗組相同的條件下僅 吸入PBS。
滲導(dǎo)經(jīng)口耐憂
小鼠接受單獨(dú)的或與IL-10 (1或10ng)或LL-IL10組合的 LL-OVA、單獨(dú)的LL-IL10、單獨(dú)的IL-10 (1或lOpg )、 LL-pTlNX或
水(無喂飼對照)。在豫膠遂橫沈:r，小鼠在第一次腹膜內(nèi)免疫之前使
用2個不同的方案喂飼。喂飼方案l和2由4和6個循環(huán)的每日施用5
天所組成，分別間隔兩天的非施用期。作為經(jīng)口耐受誘導(dǎo)的陽性對照，
從第一次免疫前10天至2天每隔一天(總共5次喂飼)通過胃導(dǎo)管以 降低支氣管嗜酸性粒細(xì)胞增多以及呼吸道過度反應(yīng)性的lmg (低劑量) 或30 mg (高劑量)的OVA喂飼小鼠，高劑量喂飼比低劑量喂飼更為 有效。
在治療性情況下，用與預(yù)防性背景所述相同的乳酸乳球菌每天喂 飼小鼠，只是從第一次免疫開始時至免疫后8天。
作為經(jīng)口耐受誘導(dǎo)的陽性對照，用30mg的OVA喂飼小鼠。
呼吸道葛及^但64iW J的承i/定
最終吸入(第21天)后第24小時，通過乙酰甲膽堿"i秀導(dǎo)的氣流 阻塞來評估氣道的高反應(yīng)性。所述小鼠接觸霧狀生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical) 2.5分鐘，然后是遞增劑量(1-30 mg/ml)的霧狀乙酰 甲膽堿。噴霧作用后，這些小鼠被置于全身體積描記器中2.5分鐘，使 用Biosystem XA WBP系統(tǒng)(Buxco Electronics)測定增強(qiáng)的4亭頓 (enhanced pause, Penh )。 "Penh"代表肺氣流阻塞，用下式進(jìn)行計算 Penh=((Te-Tr)/(TrxPEF/PIF))，其中Penl^增強(qiáng)的停頓(無量綱)，Te= 呼氣時間(秒)，Tr-松弛時間(秒)，PEF-峰值呼出氣流(毫升/秒)，
35PIF二峰值吸入氣流(亳升/秒)。平均約每5秒測定Penh,對累計值求 平均數(shù)作為每個時間點(diǎn)的Penh值。氣道高反應(yīng)性表示為PC200Mch (200%刺激性濃度的乙酰曱膽堿)，乙酰甲膽堿的濃度是基線Penh值 的兩倍。
^浙爻氣資單,g滲遂濕(^wic/^fl/veo/ar/tfv嘆e/ZwzV/， A4ZJ^
在測量氣道高反應(yīng)性之后，獲得支氣管肺泡灌洗樣品。通過腹膜 內(nèi)注射100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪來麻醉小鼠，然后用0.5 ml的鹽水灌洗肺四次。離心灌洗液，將細(xì)胞重懸于含1%BSA的1 ml 鹽水中。使用血細(xì)胞計數(shù)器對總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。通過在300 rpm離心 所述懸液5分鐘制備細(xì)胞離心樣品(Cytospin sample )。為了清楚地區(qū) 分嗜酸性粒細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞，應(yīng)用了三種不同的染料Diff-Quick, May-Grtinwald-Giemsa和Hansel (伊紅)染料?；跇?biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)， 通過光學(xué)顯微鏡區(qū)分出至少300個白細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的說明，通過流 式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)來測定 BALF中IL-13、 IL-4和IL-5的水平。
W/量j&招姊和OE4 #弄^
在第21天，在麻醉情況下從后眶竇中獲得血樣。血樣完全凝結(jié)后， 離心，收集血清保存于-80。C待用。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用成對Ab( BD Pharmingen )通過ELISA測定總IgE。為了測量血清中的OVA特異性 IgE、 IgGl和IgG2a，用2ng/ml OVA包4皮微量滴定板(Maxisorp, Nunc, VWR International, Haasrode, Belgium),然后，用PBS中0.1%酪蛋 白封閉孔，之后將平板與含有0.1%酪蛋白和0.05%吐溫20的PBS中 (PBS-CT) 1:10至1:20480稀釋的小鼠血清樣品一起孵育，其中還含 有山羊抗小鼠IgG2a-HRP[Southern Biotechnology Associates ( SBA )， Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen, Belgium, 1: 5000稀釋]、山羊抗 小鼠IgGl國HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP ( SBA， 1: 5000稀釋)。洗滌 之后，將底物[3,3，，5，5，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑，Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem， Belgium]加到每個孑L中。最后，通 過向孔中加入1mh2s04來中止反應(yīng)。在450 nm讀取吸光度。ELISA 結(jié)果以效價來表示，它是OD45。仍高于計算截止值的最高稀釋度的倒數(shù)。 截止值計算為5只非免疫小鼠的平均OD45。加3倍SD。^"逸織對逸織穸發(fā)查
獲得支氣管肺泡灌流液樣品之后，用生理鹽水灌注肺，然后從小
鼠中摘除。將肺用中性緩沖的曱醛固定，并包埋在石蠟中。用H&E或 過珙酸-希夫(periodic acid-Schiff, PAS)染色切片(3 fim厚)。用四 級得分(O，無炎癥；1，輕微/輕度；2,中度；和3，重度)評價肺中 組織學(xué)變化，所述評分是基于以下所見的分布和強(qiáng)度l)上皮脫落或 支氣管上皮細(xì)胞核的波動，2)杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，3)炎癥細(xì)胞從管浸 潤到支氣管和支氣管周間質(zhì)的粘膜和粘膜下區(qū)域，以及4)平滑肌細(xì)胞 層的肥大和增厚。
>^于#浙單#勿應(yīng)厲f和趟/么^ f差^斌這^ 7 C7
用生理鹽水灌注后摘除肺，根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用ISOGEN (Nippon Gene)提取總RNA。使用寡聚(dT ) 15引物(Promega)和 Superscript II RNase H-逆轉(zhuǎn)錄斷Invitrogen Life Technologies )在42°C 下將總RNA (lOjig)逆轉(zhuǎn)錄2小時。為了保證每個樣品中含有相同的 cDNA量，首先使用(5-肌動蛋白特異性引物測定每個樣品中的p-肌動蛋 白cDNA濃度。以合適的循環(huán)數(shù)擴(kuò)增這些樣品，以使PCR產(chǎn)物的量保 持在擴(kuò)增曲線的線性部分。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，通過 溴化乙錠染色顯影。使用下列特異性引物組測定IL-13、嗜酸性粒細(xì)胞 活化趨化因子(eotaxin)、 IL-IO、 IFN-y和TGF-卩的水平。
P-肌動蛋白的有義引物5'-ACGACATGGAGAAGATCTGG-3'，和 反義引物5'-TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3'。
IL-13的有義引物5'隱TC丌GCTTGCGTTGGTGGTCTCGC-3',和 反義引物5'-GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3'。
嗜酸性津立細(xì)胞活化趨4匕因子的有義引物5'-GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3'和 反義引物5'-CACTTGTTCTTGGGGTCAGC-3'。
IL-10的有義引物5'-TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3',和 反義引物5'-GCATAGMGCATACATGATG-3'。
IFN-y的有義引物5'-CATAGATGTGGMGAAMGA-3',和反義引物5'- TTGCTGAAGAAGGTAGTMT-3'。
TGF-P的有義引物5'-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3',，和 反義引物5'-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3'。
勿應(yīng)潛#、，崖和勿應(yīng)萄f抓定
在最終吸入(第21天)后一天，通過使細(xì)胞穿過70 nm細(xì)胞濾 器(Becton/Dickinson Labware)來制備脾和淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液。通 過與紅細(xì)胞裂解緩沖液孵育從脾細(xì)胞懸液中除去紅細(xì)胞。分別使用 CD4+ T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)或CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)和MACS柱 (midiMACS; Miltenyi Biotec )富集CD4+ T細(xì)胞和CD4CD25 T細(xì) 胞。
大量脾細(xì)胞和LN細(xì)胞群的增殖測定，將2xl()S個細(xì)胞單獨(dú)或與 純化OVA—起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 nl的有或沒有抗 IL-10或抗TGF-j5中和單克隆抗體的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。OVA以1 至100 ng/ml的^度加入。中和抗體以1、 0.1和0.01 ng/ml加入。對于 CD4+ T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞群的增殖測定，將2xl05個細(xì)胞的 CD4+ T細(xì)胞或CD4+CD25— T細(xì)胞與載有1 mg/ml OVA的經(jīng)絲裂霉素處 理的脾細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞) 一起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體 積200 jil的有或沒有中和抗體的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，CD4+ T 細(xì)胞或CD4+CD25- T細(xì)胞/APC的比例是1/1、 1/0.3、 1/0.1、 1/0.03、 1/0。 在37。C5Y。C02加濕培養(yǎng)箱中72小時之后，通過加入lnCi/孔的pH-胸 苷來評估增殖。18小時后在玻璃纖維過濾器(PerkinElmer， Boston, USA)上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上 測定胸苷摻入。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)的第24、 48和72小時收集用于不同 增殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，冷凍于-80。C直至進(jìn)行細(xì)胞因子測定。 寸吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View， CA， USA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行定量。
體力r謬，承'勝刺定在最終吸入(第21天)后一天，在37。C下用0.1%膠原酶 (Sigma-Aldrich )消化所處理小鼠的脾20分鐘。在一些實驗中，制備 全脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，并與Con A ( 2ng/ml; Sigma-Aldrich )—起培 養(yǎng)48小時。收集細(xì)胞，將107個細(xì)胞靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移至幼稚BALB/c 小鼠。對于負(fù)選擇，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用生物素化的抗小鼠CD4、 CD8、 CDllc、 CD19和CDllb mAb (BD Pharmingen)的磁珠(MACS; Miltenyi Biotec )從全脾細(xì)胞中去除CD4+, CD8+, CDllc+, CD19+,或 CDllb+細(xì)胞。通過流式細(xì)胞水除測去除的效率(>99%)。使用CD4+細(xì)胞 分離試劑盒純化CD4+、 CD4+CD25-細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的"^兌明^^用調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞分離試劑盒。使用流式細(xì)胞術(shù)檢查正選擇細(xì)胞的純度。對于細(xì) 胞移植實驗，恰在其第一次OVA/alum免疫之前或第二次免疫之后將細(xì) 胞從尾靜脈轉(zhuǎn)移進(jìn)BALB/c小鼠。對于全脾細(xì)胞、去除亞群的脾細(xì)胞或 者正選擇的CD4+細(xì)胞和CD4+CD25-細(xì)胞，所轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)是107。
在人源化SCID(hu-SCID)模型中(如Duez等，2000; Hammad等, 2000所述)
在此模型中，可研究對屋塵螨(house dust mite， HDM)變應(yīng)原Der p 1的變應(yīng)性免疫應(yīng)答。這種使用來自HDM變應(yīng)性患者的PBMC ^^內(nèi) 注射重建、然后接觸HDM氣霧劑的hu-SCID小鼠產(chǎn)生人IgE、產(chǎn)生由活 化T細(xì)胞和DC組成的肺滲入物，并表現(xiàn)出應(yīng)答于支氣管收縮劑的AHR (Pestel等1994, J Immunol, 153:3804; Duez等,Am J Respir Crit Care Med, vol 161, ppp 200-206， 2000 )。
^麥
在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于 GM17培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌林的保藏懸液均在-20'C下保存于GM17中的50% 甘油中。對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在 3(TC孵育。它們在16小時內(nèi)達(dá)到每亳升2xl(^個菌落形成單位(CFU) 的飽和濃度。通過離心收獲細(xì)菌，并在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍。對于 治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100jil此懸液。
微Der p 1 ( 222個氨基酸殘基的球形糖蛋白)是來自屋塵螨 (Dermatophagoides pteronyssinus ) (Dpt)的一種主要變應(yīng)原。合成具有 最佳乳酸乳球菌密碼子使用的編碼Der p 1蛋白的DNA序列，擴(kuò)增并與 紅霉素抗性pTINX載體中乳球菌PI啟動子下游的Usp45分泌信號融 合。用攜帶小鼠ILIO、 Derpl、 Der p 1氨基酸52-71和Der p 1氨基 酸117-133 cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌林命名為LL-ILIO、 LL-Derpl、 LL- Derplaa52-71和LL-Derplaall7-133。 LL-pTlNX (含 有空載體pTINX的MG1363 )作為對照。
J的定量
使用自行開發(fā)的Der p 1特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來 測定來自LL-Derpl的Der p 1。還通過Western印跡分析評估所述重組 蛋白的產(chǎn)生。
血液收集自對屋塵螨敏感或不敏感的供體。變應(yīng)性患者表現(xiàn)屋塵螨 致敏的通常特征。針對屋塵螨(Dpt)變應(yīng)原(Stallerg6nes， Fresnes, France ) 的皮膚點(diǎn)刺試驗(直徑dO mm )為陽性，所有患者均具有血清特異性IgE 抗體?？侷gE濃度大于150 IU/ml (150-1600 IU/ml )。測試健康餘沐作為 陰性對照(總IgE水平低于150 IU/ml，并且它們對于常見吸入變應(yīng)原的 皮膚點(diǎn)刺試驗為陰性)。
人/ 辟楊應(yīng)斧/務(wù)參
離心(120xg, 15分鐘)獲得富集血小板的血漿，將其棄去。然后 在RPMI1640中稀釋血細(xì)胞(Life Technologies, Paisley, Scotland)(體積/ 體積)，在Ficoll梯度(Pharmacia, Uppsala, Sweden )上分層。離心(400xg, 30分鐘)后，收集界面處的PBMC，轉(zhuǎn)移前在無菌RPMI培養(yǎng)基中洗三 次。
小葳
C.B.-17 SCID小鼠(6-8周齡)保持在特定動物設(shè)施中的具有無菌墊 層的隔離裝置中。通過ELISA定期檢查SCID群體中小鼠血清免疫球蛋白的缺乏。
//v^血卓個裙勿應(yīng)脊移迷XC7i)i^MC^"-SC7D V、處
細(xì)胞轉(zhuǎn)移時，SCID小鼠為6-8周齡。所述小鼠通過用23號針J^ 內(nèi)注射400jil RPMI中來自變應(yīng)性患者或健康供體的10xl06個單核細(xì)胞來 進(jìn)行重建。在同一天，它們接受，內(nèi)注射2反應(yīng)指標(biāo)(index reactivity) [IRl單位的Dpt。細(xì)胞重建后四天，連續(xù)四天(第0天至第4天)使SCID 小鼠每天接觸含100 IR單位Dpt (100 IR單位等同于Dpt提取物中所含 的約200ng蛋白質(zhì))變應(yīng)原氣霧劑。對照組不接觸Dpt。氣道應(yīng)答測定前 一天(第35天和第60天)，使hu-SCID小鼠接觸另 一個100 IR單位Dpt 溶液的氣霧劑。
錄贈況
小鼠接受組合或未組合LL-IL10或IL-10蛋白(1或10ng )的組 成表達(dá)Der p 1或無關(guān)抗原(OVA)(作為陰性對照)的乳酸乳球菌。 經(jīng)改造的乳酸乳球菌使用胃導(dǎo)管經(jīng)口施用給SCID小鼠，其中使用開始 于PBMC重建后一天不同的治療間隔和劑量。通過測量人血清IgE抗 體、分析肺浸潤、測量AHR以及分析BALF中的細(xì)胞群和細(xì)胞因子產(chǎn) 生來評估對經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)。另外，通過分析增殖性T細(xì)胞對Der p 1 的應(yīng)答來評估對耐受的誘導(dǎo)。
氣道^吝6!fiT及J ^#估
如Duez等2000所述，在第35天或第60天測量氣道應(yīng)答(表達(dá)為 造成肺阻力增加50%的卡巴^激發(fā)劑量)。
乂姊謬使
移^LA細(xì)胞后數(shù)天，在醚麻醉的情況下從后眶竇對小鼠:^。通過 兩位點(diǎn)免疫放射觀'J定'法(two-site immuno-radiometric method) 4吏用兩種 不同的￡鏈特異小生小鼠mAb( Immunotech International, Luminy, France) 研究總?cè)薎gE。在一式兩份的測定中至少使用20nl血清。所述方法的靈 敏度允許檢測0.1 IUiml ( 0.24 ng/ml )。
通過EL1SA定量針對Dpt變應(yīng)原的特異性IgE Ab。筒言之，在4°C下用0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中的Dpt變應(yīng)原(pH9.6)過夜包被 塑料管(Maxisorb Startube， Nunc, Denmark),在室溫用0.1M PBS 中的1%BSA (pH 7.4)使所述塑料管飽和2小時。洗滌后，管在室溫 下與含有BSA (1% )和吐溫(0.01% )的PBS中稀釋的Hu-SCID小鼠 血清孵育2小時，然后在4'C過夜。徹底洗滌之后，加入HRP標(biāo)記的 抗人IgE Ab。洗滌之后，將底物3，3，，5，5，四甲基聯(lián)苯胺(TMB )底物 試劑，Pharmingen， Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium加到 每個孔中。最后，向孔中加入1MH2S04中止反應(yīng)。在450 nm讀取吸 光度值。
肺的組織學(xué)檢測
在第35天切除肺，在多聚甲醛中固定，加工用于石蠟包埋。對石蠟 組織切片染色以檢測人CD45+細(xì)胞，之后通過如Duez等2000所述的組織 學(xué)得分對小鼠肺切片上的人細(xì)胞進(jìn)行定量。
為Vf4l氣f^^滲遂^ (^4Z^V
如OVA變應(yīng)原模型所述分析BALF。
雄絲、增妙勿應(yīng)肝縱..
通過使細(xì)胞穿過70 jim細(xì)胞濾器(Becton/Dickinson Labware ) 制備脾的單細(xì)胞懸液。通過與紅細(xì)胞裂解緩沖液孵育從脾細(xì)胞懸液中除
去紅細(xì)胞。分別4吏用CD4+ T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany )或人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec， Germany)和MACS柱(midiMACS; Miltenyi Biotec)富集CD4屮T 細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞。
大量脾細(xì)胞的增殖測定，將2xl()S個細(xì)胞單獨(dú)或與純化Derp 1 — 起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 fil的有或沒有抗IL-10或抗 TGF-p中和單克隆抗體的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。Der p 1以1至100 Hg/ml的濃度加入。中和抗體以1、 0.1和0.01 ng/ml加入。對于CD4+ T 細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞群的增殖測定，將2xl05個細(xì)胞的CD4+ T細(xì) 胞或CD4+CD25- T細(xì)胞與載有1 mg/ml Der p 1的經(jīng)絲裂霉素處理的人 PBMC —起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 jd的有或沒有中和抗體的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，CD4+ T細(xì)胞或CD4+CD25- T細(xì)胞/APC 的比例是1/1、 1/0.3、 1/0.1、 1/0.03、 1/0。在37。C5o/oC02加濕培養(yǎng)箱中 72小時之后，通過加入lnCi/孔的^H-胸苷來評估增殖。18小時后在玻 璃纖維過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA)上收集DNA結(jié)合的放 射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測定胸苷摻入。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)的第24、 48和72小時收集用于不同 增殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，冷凍于-80。C直至進(jìn)行細(xì)胞因子測定。 4吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA， USA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行定量。
實施例CI: LL-IL10分別在OVA和譯喘的huSCID小鼠模型中 顯著增強(qiáng)LL-OVA和LL-Der p 1的耐受i秀導(dǎo)能力。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(,發(fā)遂'，況)經(jīng)口喂飼小鼠。 LL-IL10的添加顯著增強(qiáng)對OVA/Derpl的耐受i秀導(dǎo)，因為相比于對照 和LL-OVA/Derpl組，在LL-OVA/Derpl+LL-mIL-10組中脾細(xì)胞的變 應(yīng)原特異性的增殖應(yīng)答顯著降低。
實施例C2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與應(yīng)答于所述變應(yīng)原的AHR、 嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、血清IgE水平的降低和IL-13、 IL-4和IL-5細(xì)胞因子 的產(chǎn)生降低相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(,發(fā)遂橫況)經(jīng)口喂飼小鼠。如上 所述測定應(yīng)答于所述因子的AHR、嗜酸性粒細(xì)胞BALF浸潤、IgE效價以 及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。相比于對照和LL-OVA/Derpl組，在 LL-OVA/Derpl+LL-mIL-10組中，AHR、嗜酸性粒細(xì)胞BALF浸潤、IgE 效價顯著降低，并且IL-13、 IL-4和IL-5顯著減少。
實施例C3: LL-IL10通過CD4+ T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。
為了評估〔04+ T細(xì)胞是否介導(dǎo)經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研 究了變應(yīng)原特異性的增殖性CD4T細(xì)胞應(yīng)答。因此，如上所述(《發(fā)^橫 況)經(jīng)口喂飼小鼠，如勿應(yīng)潛#、增孩和細(xì)應(yīng)廚f溯〖定中所述測定所述 變應(yīng)原特異性的CD4+T細(xì)胞增殖。相比于對照和LL-OVA/Derpl組，在 LL-OVA/Derpl+LL-mIL-10組中，所述變應(yīng)原特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答 顯著降低。實施例C4:相比LL-ILIO， IL-10在加強(qiáng)經(jīng)口耐受上有效性較低
為了評估LL-IL10是否與IL10 —樣有效，如上所述(義^l^無績況)經(jīng) 口喂飼小鼠。在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研究變應(yīng)原特異性的增殖性CD4 T細(xì)胞 應(yīng)答。相比于LL-OVA/Derpl+IL-10組，在LL-OVA/Derpl+LL-mIL-10 組中，變應(yīng)原特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。
實施例C5: LL-OVA - LL-IL10組合治療后抗原資導(dǎo)的T調(diào)節(jié)性細(xì) 胞可在體內(nèi)傳遞對哞喘樣應(yīng)答的保護(hù)
為了測試在經(jīng)口耐受方案處理的小鼠中對譯喘樣應(yīng)答的主動抑制，我們?nèi)?br> 上所述(傳^r謬,譯^溯(定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同治療組的脾細(xì)胞。相比
于對照和LL-OVA組，在LL-OVA+LL-mIL-10組中哞喘樣應(yīng)答顯著降 低，表明在我們的組合經(jīng)口耐受方案中的調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞的活化。
實施例D:在經(jīng)口施用分泌a麥醇溶蛋白的乳酸乳球菌與原位遞送 IL-10的組合后誘導(dǎo)對所述變應(yīng)原的耐受
引言
乳糜瀉也稱為口炎性腹瀉或者翁灘敏感性腸病，是由于對含有M 的特定食用谷物的免疫應(yīng)答而發(fā)生的一種慢性炎性疾病。乳糜瀉是復(fù)雜的 多基因疾病，與編碼人白細(xì)胞抗原變體HLA-DQ2或HLA-DQ8的基因密 切相關(guān)。乳糜瀉的發(fā)病機(jī)制中最重要方面之一是l型T輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答 的活化。這在表達(dá)HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈遞細(xì)胞將毒性免疫肽呈遞 給CD4(+)T細(xì)胞時發(fā)生。兩類M蛋白(麥醇溶蛋白和麥谷蛋白)都含有 結(jié)合DQ2和DQ8的肽。 一般公認(rèn)，免疫應(yīng)答(例如麩質(zhì)特異性T細(xì)胞產(chǎn)
生IFN-y)觸發(fā)乳糜瀉患者小腸中粘膜的破壞。因此，在乳糜瀉患者的腸 內(nèi)活化有害的免疫T細(xì)胞應(yīng)答看來是該疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。
本文中，我們證明經(jīng)口遞送麥醇溶蛋白與產(chǎn)生IL-10的乳酸乳球菌 的組合通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制麥醇溶蛋白特異性 免疫應(yīng)答。
本實施例的材料和方法 *霧在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于 GM17培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI )。所有菌林的保藏懸液均在-20'C下保存于GM17中的50% 甘油中。對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在 3(TC孵育。它們在16小時內(nèi)達(dá)到每毫升2xl(^個菌落形成單位(CFU) 的飽和濃度。通過離心收獲細(xì)菌，并在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍。對于 治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100nl此懸液。
絲
合成具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，擴(kuò)增并與紅霉 素抗性的pTlNX載體中乳球菌Pl啟動子下游的Usp45分泌信號融合， 所述DNA序列編碼a-麥醇溶蛋白(基于小麥(7HftV^w AJ133612 )、 HLA-DQ8 (對應(yīng)于UniProtKB/TrEMBL登記號Q9M4L6的 203-220殘基，序列QYPSGQGSFQPSQQNPQA )和HLA誦DQ8脫酰胺基 形式(對應(yīng)于UniProtKB/TrEMBL登記號Q9M4L6的203-220殘基，序 列QYPSGEGSFQPSQENPQA)的麥醇溶蛋白。
使用帶有小鼠IL-10、 a-麥醇溶蛋白、HLA-DQ8和HLA-DQ8脫酰 胺基形式的MG1363質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌梯^命名為LL-IL10、 LL-HLA/DQ8、 LL-HLA/DQ8d。 LL-pTlNX (含有空載體pTlNX的MG1363 )作為對照。
H丄^-Z)^ 希Z)^W時定量
使用自行開發(fā)的ELISA測定來自LL-HLA/DQ8、 LL-HLA/DQ8d 的HLA-DQ8和HLA-DQ8d。還通過Western印跡分析評估重組蛋白的產(chǎn) 生。
小鼠
HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠(Senger等2003 )在特定的無病原條件下采 取無M喂飼進(jìn)行維持，在8-14周齡時使用。通過足墊內(nèi)注射50 filCFA (Difco; BD)中的50jig粗制^M^ ( Sigma-Aldrich)來免疫小鼠。
誘導(dǎo)經(jīng)口耐受
對于致耐受實驗，使用不同的治療間隔和劑量，在免疫之前和之后施用LL-HLA/DQ8、單獨(dú)的或與IL-10 (1或lOpg)或LL-IL10組合的 LL-HLA/DQ8d、單獨(dú)的LL-ILIO、單獨(dú)的IL-10 (1或IO照)、LL-pTlNX 或水(無喂飼對照)。作為經(jīng)口耐受誘導(dǎo)的陽性對照，在免疫(第0天)前 第_7、 -6、 -5、 -4天用保存溶液溶于水中的50 mg劑量麥醇溶蛋白或重組cx-麥醇溶蛋白喂飼小鼠。
A淨(jìng)差攀溶f
以10 mg/ml將粗制麥醇溶蛋白(Sigma-Aldrich)重懸于甲醇，然 后以1 [ig/ml的濃度稀釋到無水乙醇中。將100 nl 1 ng/ml的麥醇溶蛋白乙 醇溶液置于Immulon 2板的每個孑L中(Fisher Scientific International Inc.),然后使其在通風(fēng)罩中干燥。接著在37'C下用4%BSA/PBS將板封閉 2小時。用lxPBS、 0.05%吐溫20洗滌板。將樣品血清以1:200、 1:400和 1:800稀釋到0.1% BSA/PBS中，37。C孵育1小時。檢測抗體是生物素化 大鼠抗小鼠IgA (來自Accurate Chemical & Scientific Corp.)以及生物素 化抗小鼠IgG (來自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。 酶綴 合物是鏈霉抗生物素蛋白-HRP,底物是TMB。
雄潛#、增錄勿淑:f縱
通過1吏細(xì)胞穿過70 nm細(xì)胞濾器(Becton/Dickinson Labware ) 制備脾和縱隔淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液。通過與紅細(xì)胞裂解緩沖液孵育從脾 細(xì)胞懸液中除去紅細(xì)胞。分別4吏用CD4+ T細(xì)胞分離試劑盒(MUtenyi Biotec， Germany)或CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)和MACS柱(midiMACS; Miltenyi Biotec)富集 CD4+ T細(xì)胞和CD4+CD25 T細(xì)胞。
大量脾細(xì)胞和LN群的增殖測定，將2xl()S個細(xì)胞單獨(dú)或與粗制 麥醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d —起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總 體積200 nl的有或沒有抗IL-10或抗TGF-p中和單克隆抗體的完全培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)?？乖?至100 ng/ml的濃度加入。中和抗體以1、 0.1和0.01 jig/ml加入。對于CD4+ T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞群的增 殖測定，將2xl()5個細(xì)胞的CD4+ T細(xì)胞或CD4+CD25- T細(xì)胞與載有1 mg/ml粗制麥醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d的經(jīng)絲裂霉素處理的脾 細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞) 一起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 nl的有或沒有中和抗體的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，CD4+ T細(xì)胞或 CD4+CD25 T細(xì)胞/APC的比例是1/1、 1/0.3、 1/0.1、 1/0.03、 1/0。在 37。C5。/oC02加濕培養(yǎng)箱中72小時之后，通過加入lnCi/孔的["H-胸苷 來評估增殖。18小時后在玻璃纖維過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA) 上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測定胸 苷摻入。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)的第24、 48和72小時收集用于不同 增殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，冷凍于-80'C直至進(jìn)行細(xì)胞因子測定。 4吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA， USA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行定量。
實施例Dl: LL-IL10顯著增強(qiáng)LL-HLA/DQ8d的耐受誘導(dǎo)能力。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(滲爭經(jīng)口耐愛)經(jīng)口喂飼小鼠。 LL-IL10的添加顯著增強(qiáng)對HLA-DQ8d的耐受誘導(dǎo)，因為相比于對照 和LL-HLA-DQ8d組，在LL國HLA-DQ8d+LL國mlL-10組中脾細(xì)胞的變 應(yīng)原特異性的增殖應(yīng)答顯著降低。
實施例D2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與應(yīng)答于所述變應(yīng)原的INF-y產(chǎn) 生降低相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(滲,經(jīng)口耐愛)經(jīng)口喂飼小鼠。如 上所述(勿應(yīng)潛#、增遂和勿應(yīng)萄f溯〖定)定量應(yīng)答于HLA-DQ8d的細(xì) 胞因子產(chǎn)生。相比于對照和 LL-HLA-DQ8d 組，在 LL-HLA-DQ8d+LL-mIL-10組中，脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中促炎癥細(xì)胞因子 INF-Y的產(chǎn)生顯著減少。
實施例D3: LL-IL10通過CD4+ T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。
為了評估〔04+ T細(xì)胞是否介導(dǎo)經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研
究了 DQ8特異性的增殖性CD4 T細(xì)胞應(yīng)答。因此，如上所述(
況)經(jīng)口喂飼小鼠，如勿應(yīng)潛#、增遂和勿應(yīng)^子鄭定中所述測定DQ8
特異性的CD4+ T細(xì)胞增殖。相比于對照和LL-HLA/DQ8d組，在
LL-HLA/DQ8d+LL-mIL-10組中，DQ8特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。實施例D4:相比LL-ILIO, IL-10在加強(qiáng)經(jīng)口耐受上有效性較低
為了評估LL-IL10是否與IL10 —樣有效，如上所述(謬導(dǎo)經(jīng)口耐浸) 經(jīng)口喂飼小鼠。在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研究DQ8特異性的增殖性CD4 T細(xì) 胞應(yīng)答。 相比于 LL-HLA/DQ8d+IL-10 組， 在 LL-HLA/DQ8d+LL-mlL畫10組中，DQ8特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著 降低。
實施例E:在經(jīng)口施用分泌BLG食物變應(yīng)原的乳酸乳球菌與原位遞 送IL-IO的組合之后誘導(dǎo)對所述變應(yīng)原的耐受。
引言
食物變態(tài)反應(yīng)是一種影響約2%至5%人群的疾病。在人類中，升高 的IgE抗體以及存在產(chǎn)生IL-4的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的提示了 Th2偏 向性機(jī)制。
本文中，我們證明經(jīng)口施用食物變應(yīng)原與產(chǎn)生IL-10的乳酸乳球菌的組合 通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制變應(yīng)原特異性免疫應(yīng)答。
本實施例的材料和方法
在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于 GM17培養(yǎng)基中,即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌林的保藏懸液均在-20。C下保存于GM17中的50% 甘油中。對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在 30'C孵育。它們在16小時內(nèi)達(dá)到每亳升2xl(^個菌落形成單位(CFU) 的飽和濃度。通過離心收獲細(xì)菌，并在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍。對于 治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100nl此懸液。
擴(kuò)增牛P-乳球蛋白cDNA并與紅霉素抗性的pTlNX載體中乳球菌Pl 啟動子下游的Usp45分泌信號融合。
使用帶有小鼠IL-10或BLG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌林命名為LL-IL10 和LL-BLG。 LL-pTlNX (含有空載體pTlNX的MG1363 )作為對照。
爭/ -#乙^蛋冷^丄G^辨定量使用自行開發(fā)的BLG特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA )和Western 印跡分析來自LL-BLG的BLG。
實驗性情況
用于研究乳酸乳球菌保護(hù)性作用的食物變態(tài)反應(yīng)小鼠模型是食物誘 導(dǎo)IgE型應(yīng)答的小鼠模型，如Frossard等(J Allergy Clin Immunol 113: 958-964, 2004)所述。小鼠接受組合或未組合LL-IL10或重組IL-10 (1 或IO照)的LL-BLG或作為陰性對照的無關(guān)抗原(OVA )。作為陽性對照， 小鼠在飲用水中接受高劑量的BLG,以防止用BLG經(jīng)口攻擊時產(chǎn)生的變 應(yīng)性反應(yīng)。
在預(yù)防性情況中，使用不同的治療間隔和劑量，用胃導(dǎo)管對小鼠經(jīng) 口施用經(jīng)改造的產(chǎn)生BLG的乳酸乳球菌。然后，在霍亂毒素存在下，使 用純化的BLG抗原經(jīng)口攻擊這些受者小鼠。對照動物接觸用對照載體改 造得到的不表達(dá)BLG (而是表達(dá)OVA)乳酸乳球菌。通過分析胃內(nèi)抗原 攻擊后的過敏反應(yīng)、測量血清和糞便中BLG特異性IgGl、 IgG2a和IgE 效價，測定脾和PP中抗體分泌細(xì)胞的數(shù)目，分析MLN、 PP和脾中的T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生來評估耐受誘導(dǎo)。
為了研究針對BLG的免疫耐受誘導(dǎo)是否可被IL-10增強(qiáng)，將 LL-BLG和LL-IL10 —起施用于小鼠。
5丄G ^經(jīng)口致敏
在第0、 7、 14和21天，通過胃內(nèi)填飼使用0.2 mol/LNaHC03中20 mg BLG ( Sigma)和lOjig CTX (購自List Biological Laboratories )攻擊 4至5周齡雌性C3H/HeOuJ小鼠(Charles River )。陽性對照組(耐受小 鼠)4周中在飲用水中隨意接受0.8mg/mlBLG。給出的蛋白質(zhì)總量(22.4 mg)與致敏小鼠中給出的BLG總量相似。為了證明致耐受過程還持久活 化外周免疫系統(tǒng)，而不僅是活化粘膜免疫系統(tǒng)，在第28和42天對一組耐 受的小鼠兩次注射吸附于1 mg氫氧化鋁的80fig BLG。
在第28天，通過胃內(nèi)填飼使用0.4 ml 0.2 mol的NaHC03中的100
49mg BLG攻擊所有小鼠。觀察過lt^應(yīng)并使用反應(yīng)得分進(jìn)行分級(0無反 應(yīng)至3重;^應(yīng)或死亡)，所述反應(yīng)得分在別處有詳細(xì)描述(Frosssard等， 2001 )。攻擊前和填飼后30分鐘，通過紅外在耳朵處測定體核溫度。處死 動物，通過心臟穿刺收集血液到含有EDTA的管中，獲得血漿以用于通過 商品ELISA試劑盒(Immunotech， Marseille, France)進(jìn)行組胺測定。
勿應(yīng)潛#、 ^^癥和^^萄子承y定
如Frossard等(2004)所述制備脾、縱隔淋巴結(jié)和PP的單細(xì)胞 懸液。分別使用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec， Germany) 或CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec， Germany) 和MACS柱(midiMACS; Miltenyi Biotec )富集CD4+ T細(xì)胞和 CD4+CD25 T細(xì)胞。
大量脾細(xì)胞和LN群的增殖測定，將2xl05個細(xì)胞單獨(dú)或與純化BLG 一 起，在9,6孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 nl的有或沒有抗IL-10或抗 TGF-p中和單克隆抗體的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。BLG以1至100 Hg/ml的濃度加入。中和抗體以1、 0.1和0.01 ng/ml加入。對于CD4+ T 細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞群的增殖測定，將2xl()5個細(xì)胞的CD4+ T細(xì) 胞或CD4+CD25- T細(xì)胞與載有1 mg/ml BLG的經(jīng)絲裂霉素處理的脾細(xì) 胞(作為抗原呈遞細(xì)胞) 一起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 nl 的有或沒有中和抗體的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，CD4+ T細(xì)胞或 CD4+CD25 T細(xì)胞/APC的比例是1/1、 1/0.3、 1/0.1、 1/0.03、 1/0。在 37。C5。/。C02加濕培養(yǎng)箱中72小時之后，通過加入lnCi/孔的fH-胸苷 來評估增殖。18小時后在玻璃纖維過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA) 上收集DNA結(jié)合的放射性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測定胸 苷摻入。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)的第24、 48和72小時收集用于不同 增殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，冷凍于-80。C直至進(jìn)行細(xì)胞因子測定。 4吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行定量。
體/^r錄，活^溯〖定
為了測試小鼠中對抗體形成的主動抑制，將分離自不同實驗性乳
0酸乳球菌治療組的脾細(xì)胞、珠純化的CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞 或CD4+CD25+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移(adoptively transfer )到幼稚C3H/HeouJ 小鼠中。使用未處理小鼠作為對照。對于全脾細(xì)胞、去除亞群的脾細(xì)胞 或者正選擇的CD4+細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞，所 轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)是107。如果涉及Treg，那么接下來用BLG抗原對這些 小鼠的攻擊應(yīng)抑制誘導(dǎo)針對BLG的體液免疫應(yīng)答以及過敏反應(yīng)。
5丄G掙并^j&清;^湊便戎謬^雜哀^^鮮定
在第0、 7、 14、 21和28天^C靜Ji^jfc獲得血清。在相同時間獲 得糞便，并以0.1mg/ml重懸于PBS加補(bǔ)充了 1: 1000胃酶抑素(Fluka) 的1%FCS (Lifetechnologies)。 ；W^分散所述樣品并渦旋2分鐘，然后在 4。C下以14000 rpm進(jìn)行兩次20分鐘的離心。
通過修改自Adel-Patient等(2000， J. Immunol Methods)的方法 測定血清和糞便的BLG特異性IgE、 IgGl、 IgG2a和/或IgA抗體水平。 簡言之，在室溫下用250 ng/孔的鏈霉抗生物素蛋白(Fluka)包被MaxiSorp 微量滴定板(Nunc) 18小時，然后用300nl聚乙烯吡咯烷酮K25 (Fluka) 溶液處理過夜。將1微克生物素化BLG孵育3小時，在0.5ng/ml山羊抗 小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgGl或抗小鼠IgG2a過氧化物酶標(biāo)記的抗體 (Southern Biotechnologies)存在下， 一式兩份地加入PBS加10%馬血清 中稀釋的血清(對于IgGl是l:6666和l:2222,對于IgG2a是l:666和1:222， 對于IgE是1:66和1:22)或糞便(1:3、 1:10和1:33)，保持2小時。對于 IgE測量，加入單克隆大鼠抗小鼠IgE抗體(克隆R35-72, BD Pharmingen),然后加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗大鼠抗體(Caltag )。在4卯nm 處測定吸光度。結(jié)果以任意單位表示，使用來自BLG加氫氧化鋁免疫的 小鼠的合并血清作為參照血清。
通過ELISPOT測量抗原特異性抗體的產(chǎn)生 從腸道上機(jī)械剪下派伊爾氏淋巴結(jié)(Peyer，s patch, PP ),將其在補(bǔ)充有5 mmol EDTA (Life Technologies)的HBSS培養(yǎng)基中孵育30分鐘。類似地， 輕輕粉碎派伊爾氏淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，穿過70 nm尼龍濾膜進(jìn)行過濾。 脾細(xì)胞在Tris緩沖的NH4C1中預(yù)孵育5分鐘，以除去紅細(xì)胞。在Percoll 60%/66%梯度下(Amersham)分離淋巴細(xì)胞。對于BLG特異性IgGl、 IgG2a和IgA抗體的測量，在37'C下用鏈 霉抗生物素蛋白過夜包被ELISPOT板(Millipore),然后加入1 ng生物 素化BLG保持3小時。將在Percoll 60%/66%梯度下分離的淋巴細(xì)胞以兩 個不同濃度(1和2xl06)重懸于Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基中，所述 培養(yǎng)基中補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺、慶大霉素、多粘菌素B和 5%FCS，在37。C保持24小時，然后在4。C下與抗IgA、抗IgGl和抗IgG2a 抗體(Southern Biotechnology) —起過夜孵育。以100 pl/孔加入^^畫乙 基-呼唑，保持10分鐘，然后通過使用KS ELISPOT 4.2.1軟件(Zeiss ) 對點(diǎn)進(jìn)行自動計數(shù)，表達(dá)為每106個細(xì)胞中的細(xì)胞形成單位(cell-forming unit, CFU)。
實施例El: LL-IL10在食物變態(tài)反應(yīng)小鼠模型中顯著增強(qiáng) LL-BLG的耐受誘導(dǎo)能力。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(^發(fā)##況)經(jīng)口喂祠小鼠。 LL-IL10的添加顯著增強(qiáng)對BLG的耐受i秀導(dǎo)，因為相比于對照和 LL-BLG組，在LL-BLG+LL-mIL-10組中脾細(xì)胞的變應(yīng)原特異性的增 殖應(yīng)答顯著降低。
實施例E2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與應(yīng)答于所述變應(yīng)原的BLG特 異性抗體應(yīng)答降低和IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生降低相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(,發(fā)^'，況)經(jīng)口喂飼小鼠。如上 所述測定應(yīng)答于所述因子的BLG特異性抗體應(yīng)答和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。相 比于對照和LL-BLG組，在LL-BLG+LL-mIL-10組中，BLG特異性抗 體水平和IL-4顯著降低。
實施例E3: LL-IL10通過CD4+T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。
為了評估〔04+ T細(xì)胞是否介導(dǎo)經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研 究了變應(yīng)原特異性的增殖性CD4 T細(xì)胞應(yīng)答。因此，如上所述( 況)經(jīng)口喂飼小鼠，如勿應(yīng)潛#、增孩和勿應(yīng)^f浙定中所述測定所述 變應(yīng)原特異性的CD4+ T細(xì)胞增殖。相比于對照和LL-BLG組，在 LL-BLG+LL-mIL-10組中，變應(yīng)原特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。
實施例E4:相比LL-IL10， IL-10在加強(qiáng)經(jīng)口耐受上有效性較低
52為了評估LL-IL10是否與IL10 —樣有效，如上所述(其J^勝'，況)經(jīng) 口喂飼小鼠。在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研究變應(yīng)原特異性的增殖性CD4 T細(xì)胞 應(yīng)答。相比于LL-BLG+IL-10組，在LL-BLG+LL-mIL-10組中，變應(yīng) 原特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。
實施例E5: LL-BLG - LL-IL10組合治療后抗原"i秀導(dǎo)的T調(diào)節(jié)性細(xì) 胞可在體內(nèi)傳遞對哮喘樣應(yīng)答的保護(hù)
為了測試在經(jīng)口耐受方案處理的小鼠中對哮喘樣應(yīng)答的主動抑制，我們?nèi)?上所述(沐^r錄，承'勝溯〖定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同治療組的脾細(xì)胞。相比 于對照和LL-BLG組，在LL-BLG+LL-mIL-10組中譯喘樣應(yīng)答顯著降 低，表明在我們的組合經(jīng)口耐受方案中的調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞的活化。
實施例F:在經(jīng)口施用分泌胰島素的乳酸乳球菌與原位遞送IL-10 的組合之后誘導(dǎo)對胰島素的耐受。
簡介
自身免疫的特征為自發(fā)的炎性性組織損傷，以及喪失自身抗原耐受 所導(dǎo)致的生理功能的破壞。它與免疫系統(tǒng)的部分過^A應(yīng)有關(guān)，其特征為 T輔助(Th)細(xì)胞的過剩。難以對易感因素(例如易感基因和環(huán)境因素) 施加影響，因此最近開發(fā)免疫療法的嘗試均著眼于通過清除病原效應(yīng)細(xì)胞 和/或增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來重建二者之間的功能平衡。胰島P細(xì)胞的自 身免疫破壞是I型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus， T1D )的主要原因。 這種破壞與對一些(5細(xì)胞自i抗原的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答有關(guān)，這兩種應(yīng) 答引起臨床發(fā)病。
在本文中，我們證明經(jīng)口遞送自身抗原與產(chǎn)生IL-IO的乳酸乳桿菌的組合 通過誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來抑制糖尿病特異性免疫應(yīng)答。
本實施例的材料和方法
在本研究中始終使用乳酸乳球菌菌林MG1363。細(xì)菌培養(yǎng)于 GM17培養(yǎng)基中，即補(bǔ)充了 0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI )。所有菌林的保藏懸液均在-20。C下保存于GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，將保藏懸液在新鮮GM17中稀釋200倍，在 30'C孵育。它們在16小時內(nèi)達(dá)到每亳升2xl(^個菌落形成單位(CFU) 的飽和濃度。通過離心收獲細(xì)菌，并在BM9培養(yǎng)基中濃縮10倍。對于 治療，每只小鼠通過胃內(nèi)導(dǎo)管接受100jU此懸液。
合成具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，擴(kuò)增并與紅霉素抗性 的pTlNX載體中乳球菌Pl啟動子下游的Usp45分泌信號融合，所述 DNA序列編碼人胰島素原II B24-C36肽(hpllp )、豬胰島素和免疫顯 性肽InsB9—23 (B9-23在許多物種人、大鼠和小鼠之間基本相同)。
使用帶有小鼠IL-IO、 hpllp、胰島素、InsB9_23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363 菌林命名為LL-ILIO、 LL-hpIIp、 LL國胰島素、LL-InsB9 23。 LL-pTlNX (含有空載體pTINX的MG1363 )作為對照。使用抗原特異性ELISA和 Western印跡分析測定這些蛋白質(zhì)的表達(dá)。
小薦
非肥胖雌性及雄性糖尿病(NOD)小鼠和NOD-重度聯(lián)合免疫缺陷 (severe combined immunodeficient ， SCID ) ( Balb/c背景)小鼠購自 Jackson Laboratory, Balb/c野生型(WT)小鼠購自Charles River Italy。 在特定的無病原中央動物設(shè)施中保持小鼠。按照制度規(guī)定處理和使用小 鼠。
微錄況
在預(yù)防性情況下，從21天齡(斷奶)開始對NOD小鼠經(jīng)口施用單 獨(dú)的或與LL-IL10或重組小鼠IL-10 (I-IO照) 一起的LL-hpIIp、 LL-胰 島素、LL-InsB9_23經(jīng)口施用給NOD小鼠，并且使用最佳喂飼方案或者直 至100日齡(當(dāng)大部分小鼠發(fā)生糖尿病時)。另外，LL-pTlNX作為陰性 對照經(jīng)口施用。對于陽性(致耐受)對照組，在2或4周中每周三次對3 周齡NOD小鼠經(jīng)口使用0.8mg人胰島素。糖尿病的發(fā)生通過每周三次連 續(xù)監(jiān)測尿糖水平來確定，在糖尿的情況下監(jiān)測血糖水平。在12-23周以及 在實驗的結(jié)束時(35周)收集胰腺，用蘇木精/伊紅對連續(xù)切片進(jìn)行染色， 以對單個核細(xì)胞的浸潤進(jìn)行評分，或者通過免疫組化來分析T細(xì)胞浸潤。 在治療性情況下，對顯示穩(wěn)定糖尿和高血糖的糖尿病NOD雌性小鼠(12-23 周)經(jīng)口施用單獨(dú)的或與LL-IL10或重組小鼠IL-10 —起的LL-hpIIp、LL-胰島素、LL-InsB9-23。另夕卜，LL-pTlNX作為陰性對照經(jīng)口施用。對 于陽性(致耐受)對照組，如Bresson等2006所述治療糖尿病NOD小鼠。 完4H^轉(zhuǎn)定義為糖尿消失以及血糖恢復(fù)正常。
在使用特異性自身抗原再次攻擊所述NOD小鼠之后，通過將T細(xì)胞過繼 轉(zhuǎn)移進(jìn)NOD SCID小鼠來分析耐受誘導(dǎo)的確切機(jī)制。
潛尿病種發(fā)抓'
葡萄糖監(jiān)測使用Diastix (Miles)測定尿糖，通過使用血糖監(jiān)測系 統(tǒng)OneTouch Ultra (LifeScan Inc.)的血糖測定進(jìn)行確認(rèn)。糖尿病定義為 2個連續(xù)血糖值高于250 mg/dl。
胰島炎通過C02窒息處死小鼠，胰腺在10。/。甲醛中固定過夜，包 埋在石蠟中，使用蘇木精和伊紅對連續(xù)5nm切片進(jìn)行染色。通過顯^L鏡對 10-15個胰島/小鼠中的細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行如下分級來確定胰島炎得分(平 均值士SD): 0，無胰島浸潤的可見體征；1，周圍胰島浸潤；2, <50%浸潤； 3, >50%浸潤。
^瘦逸織必夢
為了檢測胰腺p細(xì)胞中胰島素、CD4和CD8的表達(dá)，對水凍組織切 片使用第一抗體(豚鼠抗豬胰島素，來自Dako[稀釋度1: 300],抗CD4 RM4.5和抗CD8alHC，來自BD Biosciences [稀釋度1: 50)，如Christen 等2004所述。
耕微縱
制備脾臟、腸系膜LN (MLN)和PLN的單細(xì)胞懸液?？偲⒓?xì)胞群 的增殖測定，將2xl()S個細(xì)胞單獨(dú)或與分級濃度(1-100照/ml)的純化 人胰島素或者對CD4 T細(xì)胞(InsB9_23， H-2"g限制性)或CD8 T細(xì)胞 (InsB15_23, Kd限制性)具有特異性的肽(Sigma ) —起，在96孔U形 底培養(yǎng)板中總體積200 fil的有或沒有抗IL-10或抗TGF-p中和單克隆 抗體的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。中和抗體以1、 0.1和0.01 ng/ml加入。 對于總CD3+T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞 群的增殖測定，將0.2xl()5個細(xì)胞的T細(xì)胞與載有胰島素或GAD65或 對CD4+或CD8+T細(xì)胞具有特異性的肽的lxl()S個經(jīng)輻射的WT Balb/c小鼠脾細(xì)胞一起，在96孔U形底培養(yǎng)板中總體積200 nl的有或沒有中 和抗體的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在37。C5。/。C02加濕培養(yǎng)箱中72小時之后， 通過加入lnCi/孔的^H-胸苷來評估增殖。16至18小時后在玻璃纖維 過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA)上收集DNA結(jié)合的放射性， 在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer )上測定胸苷摻入。通過使用CD3+、 CD4+ 或CD8+分離試劑盒(MACS; Milteny Biotec, Auburn, CA)的磁珠 分離，通過負(fù)選擇從PLN或脾臟中純化T細(xì)胞。使用CD4+T細(xì)胞作 為總細(xì)胞，或者使用CD25+分離試劑盒(Milteny Biotec),通過MACS 進(jìn)一步分成CD25+或CD25_。通過流式細(xì)胞分析確定細(xì)胞群的純度 ( >卯％ )。
對于細(xì)胞因子測量，在培養(yǎng)72小時后收集用于不同增殖測定(抗 原特異性刺激)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，冷凍于-8(TC直至進(jìn)行細(xì)胞因子 測定。4吏用小鼠炎癥流式細(xì)胞珠測定(BD Biosciences, Mountain View, CA,USA)定量細(xì)胞因子產(chǎn)生。培養(yǎng)純化的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞 或CD8+ T細(xì)胞并使用抗CD3/抗CD28混合物(每個1 ng/ml)刺激24 小時，或者它們作為對照而不進(jìn)行刺激。收獲上清液，使用FCAP陣列 軟件(BD Biosciences),使用BD FACSArray Bioanalyzer上的BDTM 流式細(xì)胞珠陣列Flex Set分析IL-IO、 IL-4、 IL-5和IFNy的產(chǎn)生。使用 Quantikine試劑盒(R&D Systems )，使用捕獲ELISA實驗測定TGF-p。
體外T細(xì)胞增殖抑制測定
將分離自近期糖尿病雌性NOD (8-12周)的2xl04個純化的總脾 CD4+CD25- T細(xì)胞與多種數(shù)量的分離自不同實驗組的脾、MLN或PLN的 CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞群一起共培養(yǎng)，所述培 養(yǎng)中存在2xl04個來自WT Balb/c小鼠的已清除T細(xì)胞的脾細(xì)胞，所述脾 細(xì)胞經(jīng)過輻射，并載有胰島素或肽。在37。C 5%<:02加濕培養(yǎng)箱中72小 時之后，通過加入lnCi/孔的[SH-胸苷來評估增殖。16-18小時后在玻 璃纖維過濾器(Perkin Elmer, Boston, USA)上收集DNA結(jié)合的放射 性，在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer )上測定胸普摻入。
體外細(xì)胞毒性測定
所使用的淋巴母細(xì)胞靶標(biāo)是來自BALB/c小鼠的Con A活化的脾細(xì)胞。在37。C下，用100 nCi 51Cr ( Amersham International ， Buckinghamshire, U.K)將106個耙細(xì)胞標(biāo)記卯分鐘，洗滌三次，然后 在37。C下與1 ng/ml肽(InsB仏23或無關(guān)肽) 一起孵育1小時。洗滌靼 細(xì)胞兩次，并以104個細(xì)胞/孔接種。以不同的效應(yīng)子:耙標(biāo)比例(E:T) 將分離自脾、MLN或PLN的CD8+ T細(xì)胞一式三份加入每個孔中。將 平板以500 rpm離心2分鐘，并在37t:孵育4小時。孵育后，收集上 清液以測定51Cr釋放[裂解％=10(^ (測試 cpm-自發(fā)cpm) / (總cpm畫 自發(fā)cpm)。對于間接殺傷測定，在與效應(yīng)子一起孵育前，先將〔08+ T細(xì)胞與5 ng/ml抗CD3抗體(克隆145-2C11, Pharmingen ) —起孵 育。
糖尿病的過繼轉(zhuǎn)移
對8-10周齡的NOD-SCID小鼠靜脈注射2xl(f個或腹膜內(nèi)注射 5乂106個分離自糖尿病雌性NOD小鼠(6周、12周和18周)的脾細(xì)胞， 所述脾細(xì)胞與分離自不同實驗乳酸乳球菌治療組的分級數(shù)量的珠純化 CD3+T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD4+CD25 T細(xì)胞或 CD4+CD25+T細(xì)胞組合，或者不進(jìn)行組合。使用未治療小鼠作為對照。糖 尿病的發(fā)生通過每周三次連續(xù)監(jiān)測血糖水平來確定。
實施例Fl: LL-IL10在非肥胖糖尿病小鼠中顯著增強(qiáng)LL-hpIIp、 LL-胰島素、LL-InsB9.23的耐受誘導(dǎo)能力。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(姿發(fā)遂^況)經(jīng)口喂飼小鼠。 LL-IL10的添加顯著增強(qiáng)對自身抗原的耐受i秀導(dǎo)，因為相比于對照和 LL-hpIIp/胰島素/InsB9—23組，在LL匪hpIIp/胰島素/InsB9.23+LL隱mlL畫10 組中脾細(xì)胞的自身抗原特異性的增殖應(yīng)答顯著降低。
實施例F2: LL-IL10加強(qiáng)經(jīng)口耐受與胰島炎減少、(5細(xì)胞破壞率降 低和脾細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生提高相關(guān)。
為了研究經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，如上所述(其發(fā)遂'，況)經(jīng)口喂飼小鼠。如上 所述測定應(yīng)答于所述自身抗原的胰島炎存在情況、p細(xì)胞破壞率和細(xì)胞因 子產(chǎn)生。組織學(xué)分析顯示，相比于對照和LL-hpIIp/胰島素/InsB9-23組， 在LL-hpIIp/胰島素/InsB9.23+LL-mlL-10組中胰^炎和p細(xì)胞破壞的7jC 平顯著降低，IL-10產(chǎn)生提高。實施例F3: LL-IL10通過CD4+ T細(xì)胞增強(qiáng)經(jīng)口耐受。
為了評估〔04+ T細(xì)胞是否介導(dǎo)經(jīng)口耐受的誘導(dǎo)，在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研 究了自身抗原特異性的增殖性CD4 T細(xì)胞應(yīng)答。因此，如上所述( 橫況)經(jīng)口喂飼小鼠，接著如所述(雄斧增座W;C)測定所述自身抗原特 異性的CD4+ T細(xì)胞增殖。相比于對照和LL-hpIIp/胰島素/InsB9.23組， 在LL-hpIIp/胰島素/InsB9-23+LL-mlL-10組中，自^抗原特異性的CD4 T 細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。
實施例F4:相比LL-ILIO， IL-10在加強(qiáng)經(jīng)口耐受上有效性較低
為了評估LL-IL10是否與IL10 —樣有效，如上所述(《^!^勝'，況)經(jīng) 口喂飼小鼠。在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中研究自身抗原特異性的增殖性CD4 T細(xì) 胞應(yīng)答。相比于LL-hpIIp/胰島素/InsB9-23+IL-10組，在LL-hpIIp/胰島 素/InsB9-23+LL-mlL-10組中，自身抗原特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答顯著降 低。
實施例F5: LL-InsB簡-LL-IL10組合治療后NOD小鼠中的自 身攻擊性CD8+應(yīng)答被抑制
為了測試我們的組合方法是否誘導(dǎo)能通過旁觀者機(jī)制調(diào)節(jié)糖尿病的抑制 性CD4+ T細(xì)胞，我們分析了對自身攻擊性CD8+ T細(xì)胞的影響。組合治 療后，抗原特異性自身攻擊性CD8+細(xì)胞的百分比和/或活性顯著降低。
實施例F6: LL-InsB15-23 - LL-IL10組合治療后抗原i秀導(dǎo)的T調(diào)節(jié) 性細(xì)胞可在體內(nèi)傳遞對糖尿病樣應(yīng)答的保護(hù)
為了測試在經(jīng)口耐受方案處理的小鼠中對糖尿病樣應(yīng)答的主動抑制，我們 如上所述(潛t尿病^i^逖^^移)過繼轉(zhuǎn)移來自不同治療組的脾細(xì)胞。相比 于對照和LL-hpIIp/InsB923組，在LL-hpIIp/InsB9 23+LL-mIL-10組中 糖尿病樣應(yīng)答顯著降低，表明在我們的組合經(jīng)口耐受方案中調(diào)節(jié)性 CD4+T細(xì)胞的活化。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原的組合用于制備在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫耐受或治療免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的藥物、醫(yī)療食品或營養(yǎng)品的用途。
2. 組合物用于制備在哺乳動物中治療、預(yù)防和/或緩解涉及免疫應(yīng)答相 關(guān)疾病的疾病或病癥或者誘導(dǎo)免疫耐受的藥物、醫(yī)療食品或營養(yǎng)品的用 途，其特征為所述組合物至少包含分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物以及抗 原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、 狗、貓、牛、馬、豬和人。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的用途，其中所述對免疫耐受的誘導(dǎo) 是所述誘導(dǎo)前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的用途，其中所述對免疫耐受的誘導(dǎo) 是通過所述哺乳動物中細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)來衡量。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的用途，其中所述調(diào)節(jié)是細(xì)胞因子水 平的提高，其中所述細(xì)胞因子選自IL-IO、 TGF-p、 IL-4和IFNa。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述細(xì)胞因子水平的提高是所述誘導(dǎo) 前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述調(diào)節(jié)是細(xì)胞因子水平的降低，其 中所述細(xì)胞因子選自IFN-y、 IL國2、 IL-5、 IL曙6、 IL-12、 IL-13和TNF-a、 MCP-1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述細(xì)胞因子水平的降低是所述誘導(dǎo)前 的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的用途，其中所述抗原激發(fā)T細(xì)胞介 導(dǎo)和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的用途，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答是Thl免疫應(yīng)答。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的用途，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答是Th2免疫應(yīng)答。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的用途，其中所述抗原是變應(yīng)原、同 種抗原、自身抗原或自體抗原。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的用途，其中所述抗原參與誘導(dǎo)變應(yīng) 性哮喘、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲 狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物變態(tài)反應(yīng)或乳糜 瀉。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的用途，其中所述抗原是治療性抗原， 優(yōu)選為抗CD3。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的用途，其中所述抗原通過表達(dá)抗原 的微生物進(jìn)行遞送。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述抗原展示于所述表達(dá)抗原的微生 物的表面。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述抗原被分泌出來。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的用途，其中所述方法是治療性的。
20 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的用途，其中所述方法是預(yù)防性的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項的用途，其中所述粘膜遞送選自直腸 遞送、口腔遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項的用途，其中所述抗原和/或所述表 達(dá)免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物通過噴霧劑、膠嚢劑、氣霧劑、錠劑、大丸 劑、片劑、嚢劑、液體劑、混懸劑、乳劑或糖錠劑遞送。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項的用途，其中所述抗原和所述表達(dá)免 疫調(diào)節(jié)化合物的微生物以單位劑型遞送，例如片劑、膠嚢劑或計量氣霧 劑劑量。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項的用途，其中所述抗原與所述表達(dá)免 疫調(diào)節(jié)化合物的微生物同時或依次遞送。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物是 免疫抑制化合物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述免疫抑制化合物是耐受增強(qiáng)細(xì)胞 因子或耐受增強(qiáng)抗體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項的用途，其中所述免疫抑制化合物是 免疫抑制細(xì)胞因子或抗體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述免疫抑制細(xì)胞因子選自IL-4、 ILIO、 IFN-(x、 Flt3L、 TGF(3和RANK-L。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述免疫抑制抗體選自抗IL-2、抗 IL12和抗IFN-y。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的用途，其中所述微生物是細(xì)菌或酵 母。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中所述細(xì)菌是乳酸菌。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述乳酸菌選自乳桿菌屬(L"""6""Y/ms )、明串珠菌屬(丄et1ccm0s"c )、片球菌屬(i^rftV coccMS )、乳球菌(丄a"OC0CCWS)、鏈球菌屬(ift邵^KWCMS )、 氣球菌屬 (JeWCOCCWS )、肉桿菌屬(CVlfVI06flC,c/m附)、腸球菌屬(^Vl&WCOCCMS )、酒球菌屬()、四聯(lián)球菌屬()、漫游球菌屬 (和魏斯氏菌屬(附/se〃fl)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述乳球菌是乳酸乳球菌。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中所述酵母是釀酒酵母。
35. 根據(jù)權(quán)利要求30至34中任一項的用途，其中所述微生物是益生微 生物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物被 分泌出來。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物展 示于微生物表面。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項的用途，其中所述抗原和所述免疫調(diào) 節(jié)化合物被相同微生物表達(dá)。
39. 根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物還包含佐劑、可藥用載體和/或賦形劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求1至39中、任一項，用途，其中所述抗原和/或所述分 物。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40的用途，其中所述刺激產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子的化 合物是霍亂毒素B亞基。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1至41中任一項的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物遞送至少1天，優(yōu)選至少1周，更優(yōu)選至少 1個月或1年。
43. 根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項的用途，其中所述抗原和所述分泌免 疫調(diào)節(jié)化合物的微生物至少每天遞送一次，優(yōu)選每天遞送二次。
44. 根據(jù)權(quán)利要求1至43中任一項的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物以至少10飛克至100亳克/天的劑量遞送。
45. —種組合物，其包含分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物與抗原的組合。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45或46的組合物，其中所述抗原是變應(yīng)原、同種抗 原、自身抗原或自體抗原。
48. 根據(jù)權(quán)利要求45至47中任一項的組合物，其中所述抗原參與誘導(dǎo) 變應(yīng)性哞喘、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫 性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物變態(tài)反應(yīng)或 乳糜瀉。
49. 根據(jù)權(quán)利要求45至47中任一項的組合物，其中所述抗原是治療性 抗原，優(yōu)選抗CD3。
50. 根據(jù)權(quán)利要求45至49中任一項的組合物，其中所述抗原通過表達(dá)抗原的微生物進(jìn)行遞送。
51. 根據(jù)權(quán)利要求45至50中任一項的組合物，其中所述抗原展示于所 述表達(dá)抗原的微生物的表面。
52. 根據(jù)權(quán)利要求45至50中任一項的組合物，其中所述抗原被分泌出 來。
53. 根據(jù)權(quán)利要求45至52中任一項的組合物，其中所述抗原和/或所述 表達(dá)免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物存在于噴霧劑、膠嚢劑、氣霧劑、錠劑、 大丸劑、片劑、嚢劑、液體劑、混懸劑、乳劑或糖錠劑中。
54. 根據(jù)權(quán)利要求45至53中任一項的組合物，其中所述抗原和所述表 達(dá)免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物存在于單位劑型中，例如片劑、膠嚢劑或計 量氣霧劑劑量。
55. 根據(jù)權(quán)利要求45至54中任一項的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合 物是免疫抑制化合物或抗體。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中所述免疫抑制化合物是耐受增強(qiáng)細(xì) 胞因子或耐受增強(qiáng)抗體。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中所述免疫抑制化合物是選自IL-4、 IL-IO、 IFN-a、 Flt3L、 TGF卩和RANK-L的細(xì)胞因子。
58. 根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中所述免疫抑制抗體選自抗IL-2、 抗IL12和抗IFN畫y。
59. 根據(jù)權(quán)利要求45至58中任一項的組合物，其中所述微生物是益生 微生物。
60. 根據(jù)權(quán)利要求45至59中任一項的組合物，其中所述微生物是細(xì)菌 或酵母。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60的組合物，其中所述細(xì)菌是乳酸菌。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61的組合物，其中所述乳酸菌選自乳桿菌屬(丄fl"o6w7/ws1 )、明串珠菌屬(Z^wcwios似c )、片球菌屬(尸e力V cocc"s )、 乳球菌屬()、鏈球菌屬(iS^67^C0Ccns1 )、 氣球菌屬(^4m co"ws )、肉軒菌屬(C"f7io6tf"m.w附)、腸球菌屬(五/i^woccws1 )、 酒球菌屬(OefiococcMS )、四聯(lián)球菌屬(rm^M0coccws)屬、漫游球菌 屬(H^ococcms)和魏斯氏菌屬(附/5^〃fl)。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62的組合物，其中所述乳球菌是乳酸乳球菌。
64. 根據(jù)權(quán)利要求60的組合物，其中所述酵母是釀酒酵母。
65. 根據(jù)權(quán)利要求45至64中任一項的組合物，其中所述抗原和所述免 疫調(diào)節(jié)化合物被相同微生物表達(dá)。
66. 根據(jù)權(quán)利要求45至65中任一項的組合物，其還包含佐劑、可藥用 載體和/或賦形劑。
67. 根據(jù)權(quán)利要求45至66中任一項的組合物，其還包含刺激產(chǎn)生免疫 抑制細(xì)胞因子的化合物。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67的組合物，其中所述刺激產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子的 化合物是霍亂毒素B亞基。
69. 根據(jù)權(quán)利要求45至68中任一項的組合物，其中所述抗原和/或所述 分泌免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物以至少10飛克至100毫克的劑量存在。
70. 用于在動物中誘導(dǎo)對抗原的免疫耐受的方法，其包括組合進(jìn)行粘膜 遞送所述抗原與粘膜遞送表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子的微生物。
71. 用于在-有此需,的哺乳動物中治療，疫，答相關(guān)疾病的方法，其包
72. 用于治療、預(yù)防和/或緩解涉及免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的疾病或病癥或者 用于誘導(dǎo)免疫耐受的藥物、營養(yǎng)品或醫(yī)療食品，其至少包含抗原與分泌 免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)對抗原的耐受，這通過粘膜(優(yōu)選經(jīng)口)施用抗原與產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)化合物的微生物的組合來實現(xiàn)。更具體地，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)產(chǎn)生Foxp3⁺和/或IL-10和/或TGF-β的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其能夠抑制不想要的針對抗原的免疫應(yīng)答，所述誘導(dǎo)通過經(jīng)口遞送所述抗原與分泌免疫抑制細(xì)胞因子的微生物的組合來實現(xiàn)。
文檔編號A61K35/74GK101316611SQ200680044662
公開日2008年12月3日 申請日期2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日
發(fā)明者彼得·羅捷斯, 維爾勒·斯內(nèi)克 申請人:阿克托杰尼斯有限公司