專利名稱：抗卷旋桿菌的菌苗復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性和預(yù)防性的抗菌菌苗復(fù)合物，該復(fù)合物對(duì)幽門卷旋桿菌(也稱為幽門彎曲桿菌)(Helicobacter pylori)、肝卷旋桿菌(Helicobacter hepaticus)和冠狀卷旋桿菌(Helicobacter coronari)特異性抗原及非特異性抗原產(chǎn)生免疫作用，并確保免疫調(diào)節(jié)。
(MARSHALL BJ.WARREN Jr.，在患有胃炎和消化潰瘍病之人胃中尚未鑒定的彎曲芽孢桿菌(Unidentified curved bacilli in the stomach ofpatients with gastritis and peptic ulceration),Lancet 1984；i:1311-3)。
(MEGRAUD F.，幽門卷旋桿菌--粘液細(xì)菌的首害(chef de filedes bacteries du mucus),La Lettre de L′infectiologue 1993；8(supp1.4):151-9)。
眾所周知，在微生物學(xué)中，壁、膜或莢膜(組合或單獨(dú)的，溶解在培養(yǎng)介質(zhì)中的形式)表面上的抗原是糖蛋白、多肽或多糖性質(zhì)的。
與結(jié)合因素如蛋白多糖或多糖膜物質(zhì)、致病微生物的提取物之核糖體源中的核糖核酸(RNA)結(jié)合的菌苗可用于制備非細(xì)胞菌苗(參看Inf.and Immunity,1,574-82,1970和WO 94/22462)。
這些菌苗使用與特異性測(cè)定的微生物疾病相一致的特異性抗原。
然而，抗原作用實(shí)質(zhì)上與微生物細(xì)胞之間的(特別是核糖體)RNA水平有關(guān)。免疫活性細(xì)胞(CIC)直接使用RNA作為活性運(yùn)載體。
為制備本發(fā)明復(fù)合物，對(duì)于血清型卷旋桿菌細(xì)菌抗原，借助于優(yōu)選共價(jià)鍵的聯(lián)接，將核糖體RNA優(yōu)選偶聯(lián)在優(yōu)選于Ⅲ型膠原中存在的糖蛋白性質(zhì)的氨基酸序列上。在人類中，膠原幾乎是肌體的第三蛋白。Ⅲ型適合于氨基酸序列，并存在于皮膚、血管壁和消化道粘膜上皮中。
在本發(fā)明復(fù)合物中，我們穩(wěn)定并使用了細(xì)胞膜組分，即相同微生物中可以產(chǎn)生核糖體RNA的組織。該膜組分包含所有的肽多糖物質(zhì)，而且還已知為免疫佐劑。
除幽門卷旋桿菌、肝卷旋桿菌和冠狀卷旋桿菌外，膜組分--葡多糖或蛋白多糖--不同微生物中通過抽提核糖體來提供RNA的組織也是有益的，這些微生物是以其致免疫性(補(bǔ)充巨噬細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)免疫球蛋白的合成，特別是IgA的分泌(11S)，增加吞噬細(xì)胞，以及刺激附屬T細(xì)胞)而為人所熟知的。
其理由如下在完全由幽門卷旋桿菌、肝卷旋桿菌和冠狀卷旋桿菌誘發(fā)的病理情況下，肌體除產(chǎn)生特異性的體液應(yīng)答外，還在保護(hù)個(gè)體的過程中產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答以暫時(shí)緩和抗體的不足。
眾所周知，細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答在其原位不產(chǎn)生抗體，而只是形成致敏性且對(duì)所產(chǎn)生的抗原特異性的淋巴樣細(xì)胞。
T淋巴細(xì)胞通過其本身和/或細(xì)胞因子起作用，并且可觀察到炎性類型的應(yīng)答或者細(xì)胞毒性的應(yīng)答。
卷旋桿菌屬細(xì)菌的致病力取決于其侵占胃粘膜的能力、在胃液中的存活能力、盡管宿主中有免疫應(yīng)答但可在其中增殖的能力、以及產(chǎn)生通常非可逆性損傷(腺癌、胃淋巴瘤或MALT“與粘膜有關(guān)的淋巴樣組織”的淋巴瘤)的能力，[PARSONNET J幽門卷旋桿菌和胃癌(Helicobacter pylori andgastric cancer),Gastroenterol Clin North Am 1993,22:89-104；-WORTHERSPON AC,DOGLIONI C,DISS TC等人在根除幽門卷旋桿菌后與粘膜有關(guān)的淋巴樣組織型的主要低級(jí)B細(xì)胞胃淋巴瘤的消退(Regression of primary low-grade B-cell gastric lymphoma ofmucosa associated lymphoid tissue type after eradication of Helicobacterpylori),Lancet 1993,342:575-7；-MOHANDAS，幽門卷旋桿菌和淋巴瘤(Helicobacter pylori andlymphoma),N Eng J Med 1994,331:746-7]。
在注射期間如果免疫應(yīng)答不足，產(chǎn)生對(duì)吞噬細(xì)胞的抵抗性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋落，等等。。本發(fā)明菌苗復(fù)合物的組成本發(fā)明的復(fù)合物包括雙分子，該雙分子是通過將與靶相連之氨基酸的一個(gè)功能臂和相應(yīng)于所述功能臂之組成的描述密碼的RNA遺傳臂相偶聯(lián)而形成的。A、可使用的核糖體RNA是選自以下物質(zhì)的提取物或它們的混合物，但不僅限于以下物質(zhì)--幽門卷旋桿菌(或彎曲桿菌)、肝卷旋桿菌、冠狀卷旋桿菌
--肺炎克雷白氏桿菌--鏈球菌(肺炎或化膿)--金黃葡萄球菌--粘質(zhì)沙雷氏菌--大腸埃希氏桿菌--鼠傷寒沙門氏菌--棒狀桿菌(粒狀、小型棒狀和痤瘡)--分枝桿菌(結(jié)核、恥垢、龜)--Hemophilus influenzae--Ⅱ型肺炎球菌--齲齒羅氏菌--大腸桿菌--痢疾志賀氏菌--腸球菌--諾卡氏菌(星狀、巴西、玫瑰色、不透明、紅色)--卡爾默蒂和蓋蘭(Calmette和Guerin)桿菌。
RNA的重均分子量在5104-108道爾頓。
現(xiàn)已有多種制備RNA的工業(yè)方法。在此作為實(shí)例引述在Infect.andImmunity,1,574-82,1970中描述的方法將細(xì)菌搗碎，然后進(jìn)行分級(jí)沉淀，溶解核糖體蛋白，通過Pronase抽提沉淀出的RNA，最后用離子交換色譜純化。
如果RNA是通過酶法制得的，最后的純化過程可通過分子篩色譜來完成?？商貏e參考以下文獻(xiàn)-C.EHRESMAN(1972),Biochimie,54,901-H.KAGAWA(1972),J.Biochem.,(1972),827
-M.SANTER(1973),J.Bact.,116,1304-NOMURA(1974),Ribosomes,Ed.Cold Spring Harbor LaboratoryB、可使用的細(xì)菌細(xì)胞膜組分可以是以下物質(zhì)的提取物，但并不限于以下物質(zhì)1、對(duì)于莢膜多糖a、幽門卷旋桿菌和肝卷旋桿菌b、肺炎克雷白氏桿菌c、肺炎鏈球菌d、Hemophilus influenzaee、大腸埃希氏桿菌a、幽門卷旋桿菌和肝卷旋桿菌[HILLS BA，胃粘膜屏障幽門卷旋桿菌消化胃表面活性劑并使其失去保護(hù)的證據(jù)(Gastric mucosal barrier:evidence for Helicobacterpylori ingesting gastric surfactant and deriving protection from it),Gut,1993年5月，34(5):588-93；-GENTA RM,ROBASON GO,GRAHAM DY，同時(shí)觀察幽門卷旋桿菌和胃形態(tài)學(xué)新的染色(Simultaneous visualization of Helicobacterpylori and gastric morphology:a new stain),Human Pathology,1994年5月,25(3):221-6；-MAJEWSKI,S.I.和C.S GOODWIN,1988，幽門彎曲桿菌之基因組的限制性內(nèi)切酶分析與快速抽提法大量基因組變異的證據(jù)(Restriction endonuclease analysis of the genome of Campylobacter pyloriwith a rapid extraction method:evidence for considerable genomicvariation),J.Infect.Dis.,157:465-471
-GEIS,G.,LEYING,H.,SUERBAUM,S.,MAI,U.和OPFERKUCH,W.，鞭毛幽門彎曲桿菌的超結(jié)構(gòu)和化學(xué)分析(Ultrastructure and chemical analysis of Campylobacter pylori flagella)，J.Clin.Microbiol.,27:436-441,1989]b、肺炎克雷白氏桿菌[C.ERBING,L.KENNE,B.LINBERG,J.LONNGREN(1976),I型肺炎克雷白氏桿菌的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)研究(Structural studies of thecapsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae type I),Carbohydr.Res.,50(1976)115-20；-W.NIMMICH(1968)，克雷白氏桿菌之K.Angigen的分離和定性結(jié)構(gòu)分析(Zur Isolierung und qualitativen Bausteianalyse der K.AnhigenVon Klebsiellen),Med.Mikrobio.und Immunol.,154,117,131；-C.RICHARD(1973),500種克雷白氏桿菌源的抗原和生化研究(Etude antigenique et biochimique de 500 souches de Klebsiella),Ann.Biol.Clin.,1973]c、肺炎鏈球菌[F.KAUFFMANN和E.LUND(1954),Int.Bull.Bact.Nomencl.4,125-28；-FLETON和OTTINGER,J.of Bacteriology,1942,43,94,105；-M.COLIN,M.D.MACLEOD等人，用特異性莢膜多糖的免疫作用防止肺炎球菌(Prevention of pneumococcal pneumoniae byimmunization with specific capsular polysaccharides),J.Exp.Med.,1945,82,445-65；-A.R.DOCHEZ和O.T.AVERY，生長期間肺炎球菌的特異性水溶性物質(zhì)的制備(The elaboration of specific soluble substance byPneumococcus during growth)(1971),J.Exp.Med.26,477-93；-WEST PHAL和LUDERITZ(1952),Z.Naturf,7B.148；-C.P.J.GLALDEMANS和H.P.TREFFERS，從肺炎雙球菌中制備莢膜多糖的改進(jìn)法(An improved preparation of the capsularpolysaccharide from Diplococcus pneumoniae),Carbohydr.Res.1976,4,181-84]。d、Hemophilus influenzae(聚核糖磷酸酯型的莢膜多糖)[P.ANDERSON等人(1972)，用聚核糖磷酸酯-B型Hemophilusinfluenzae莢膜抗原使人免疫(Immunization of humans with poly-ribosephosphate,the capsular antigen of Hemophilus influenzae type B),J.of Clin.Invest.，第51卷，1972,39-44；-P.ANDERSON等人(1977)，從B型Hemophilus influenzae的上清液中分離莢膜多糖(Isolation of the capsular polysaccharide fromsupematant of Hemophilus influenzae type B),Infect.And Immun.,1977,15(2),472-77]。e、大腸埃希氏桿菌[LUDERITZ等人(1977)，革蘭氏陰性菌的體壁和莢膜抗原(Somaticand capsular antigens of gram-negative bacteria),Compr.Biochem.26A,105-228；-BOYER H.W.和D.ROULLAND-DISSOIX(1969)，大腸埃希氏桿菌中DNA之限制和改性的補(bǔ)充分析(A complementation analysis ofthe restriction and modification of DAN in Escherichia coli),J.Mol.Biol.,41:459-472；-CASADABAN,M.和S.N.COHEN(1980)，大腸埃希氏桿菌中DNA融合和克隆的基因控制信號(hào)分析(Analysis of gene control signalsby DNA fusion and cloning in E.Coli),J.Mol.Biol.,138:179-207；LUGTENBERG,B.,J.Meijers,R.PETERS,P.Van der Hock和L.VanAlphen(1975)，大腸埃希氏桿菌K12之“主要外膜蛋白”電泳分解成4個(gè)帶(Electrophoretic resolution of the“major outer membraneprotein”of Escherichia coli K12 into four bands),FEEBS Lett.58:254-258]。
2、對(duì)于膜脂多糖(LPS)--棒狀桿菌(avidum、牛、白喉、產(chǎn)酶、馬、帶形、菜豆、faciens、flavidum、梭形、粒狀、栗色、增生、詭譎、液化、小型、微代謝、化膿、肥腫、干燥)，--以及革蘭氏弱性(gram-moins)菌-幽門卷旋桿菌、肝卷旋桿菌、冠狀卷旋桿菌-克雷白氏桿菌(肺炎和鼻硬結(jié))-鼠傷寒沙門氏菌-沙雷氏菌(海紅、corralina、印度、普利茅斯、kiluea)-腦膜炎奈瑟氏球菌-大腸埃希氏桿菌[GOODWIN C.S.“幽門卷旋桿菌其于1982年4月的培養(yǎng)物的10周年紀(jì)念(Helicobacter pylori:10thanniversary of its culture in April1982)”,Gut 1993,34:293-4；-C.ERBIN等人(1977)，克雷白氏桿菌LPS的結(jié)構(gòu)研究(Structuralstudies on the Klebsiella LPS),Carbohydr.Res.,56,377-81；-C.B.CASTOR等人(1971)，高純肺炎克雷白氏桿菌致熱LPS的特征(Characteristics of a highly purified pyrogenic LPS of Klebsiellapneumoniae),J.ofPharm.Sci.,60,(10),1578-80；-K.FUKUSHI(1964)，從腸桿菌中抽提和純化內(nèi)毒素所選方法和物質(zhì)的比較(Extraction and purification of endotoxin fromEnterobacteriaceae:a comparison of selected methods and sources),J.ofBacteriol.87,(2),391-400；-G.A.LIMJUCO，從B組腦膜炎奈瑟氏球菌中得到的LPS的化學(xué)組成的研究(Studies on the chemical composition of LPS from Neisseriameningifidis group B),J.of Gen.Microbiol.1978,104,187-91；-G.A.ADAMS(1976),用DMSO從革蘭氏陰性菌中抽提LPS(Extraction of LPS from gram-negative bacteria with DMSO),Canad.J.Biochem.,45,422-26；-K.G.JOHNSON(1976)，制備細(xì)菌LPS方法的改進(jìn)(Improvedtechniques for the preparation of bacterial LPS),Canad.J.Microbiol.,(22),29-34；-Y.B.KIM等人(1976)，從Salmonella mutans得到的生理活性的內(nèi)毒素(Biologically active endotoxins from Salmonella mutans),J.ofBacteriol.,94,(5),1320-26]。
3、對(duì)于膜蛋白-幽門卷旋桿菌-大腸埃希氏桿菌-粘質(zhì)沙雷氏菌-化膿鏈球菌-鼠傷寒沙門氏菌幽門卷旋桿菌、肝卷旋桿菌、冠狀卷旋桿菌
--GOBERT(B.),LABIGNE(A.),de KORWIN(J.D.),CONROY(M.C.),BENE(M.C.),FAURE(G.C.)，幽門卷旋桿菌的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction for Helicobacter pyroli),Rev.Esp.Enf.Digest.1980,78(suppl.1),4；-TOWBIN,H.,T.STAEHELIN和J.GORDON(1979)，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝基纖維素紙上方法及某些應(yīng)用(Electro-phoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulosesheets:procedure and some applications),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354。大腸埃希氏桿菌-S.F.STIRM等人(1976)，附著體，承載大腸埃希氏桿菌的表面抗原K88(Episome,carried surface antigen K88 of Escherichia coli),J.ofBacteriol.,93,(2),731-39；-S.J.BETZ等人(1977)，細(xì)菌LPS的富蛋白組分的化學(xué)和生理性質(zhì)(Chemical and biological properties of a protein rich fraction ofbacterial LPS),J.ofImmunol.,119,(4),1475-81。粘質(zhì)沙雷氏菌-W.WOBER(1971)，對(duì)從革蘭氏陰性菌得到的內(nèi)毒素的蛋白部分的研究，通過乙酸水解粘質(zhì)沙雷氏菌的內(nèi)毒素分離出的蛋白部分的特征(Studies on the protein moiety of endotoxin from gram-negativebacteria,characterisation of the protein-moieting isolated by acetic acidhydrolysis of endotoxin of Serratia marcescens)?；撴溓蚓?M.K.WITTNER(1977)，用A組鏈球菌M蛋白菌苗對(duì)鼠進(jìn)行同源和雜源保護(hù)(Homologous and heterologous protection of mice withgroup-A Streptococcal M protein vaccine)Infect.and Immun.,1977,15,(1),104-8。鼠傷寒沙門氏菌-N.KUUSI等人(1979)，用鼠的實(shí)驗(yàn)沙門氏病中的主外膜蛋白進(jìn)行免疫(Immunization with major outer membrane protein inexperimental salmonellosis of mice),Infect.and Immun.,1979,25,(3),857-62；-C.BARBER等人(1972)，鼠傷寒沙門氏菌蛋白在感染帶有天生病原體之鼠中的保護(hù)作用(The protective role of proteins fromSalmonella thyphimurium in infection of mice with their naturalpathogen),Rev.Immunol.,36,77-81；-G.DELORD(1979)，包含在M-206鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)物的上清液中的接種抗原的研究(Etude d′un anfigene vaccinant contenudans le sumageant de culture de Salmonella thyphimurium,souche M-206),these de medecine de Lyon No.428,1979；-G.W.GOODMAN(1979)，新型B-淋巴細(xì)胞激活劑內(nèi)毒素蛋白的化學(xué)和物理性質(zhì)的特征(Characterization of the chemical andphysical properties of a novel B-lymphocyte activator endotoxin protein)，Infect.and Immun.,1979,24(3),685-96。
4、對(duì)于磷壁酸和脂磷壁酸鏈球菌、葡萄球菌和乳芽孢桿菌(革蘭氏陽性菌的表面是由通過磷酸二酯橋聯(lián)接的磷壁酸組成的，該磷壁酸是甘油的聚合物)。
以下文獻(xiàn)描述了制備方法-M.M.BURGER(1966)，磷壁酸抗原決定子，鏈分離，和它們?cè)诩?xì)胞壁上的位置(Teichoic acids:antigenic determinants,chainseparation.and their location in the cell wall),Microbiology 56,910-17；-K.W.KNOW(1973)，磷壁酸的免疫學(xué)性質(zhì)(Immunologicalproperties of teichoic acids),Bacteriol.Reviews,37,21,215-57；-G.A.MILLER(1976)，鏈球菌脂磷壁酸對(duì)鼠宿主應(yīng)答的作用(Effets of streptococcal lipoteichoic acid on host response in mice),Infect.and Immun.,1976,13,(5),1408-17；-A.J.WICHEN等人(1975)，脂磷壁酸新一類的細(xì)菌抗原(Lipoteichoic acids:a new class ofbacterial antigens),Science,187,1161-67。可行的不同劑量RNA*FISKE和SUBBAROW，磷的劑量,用于質(zhì)量控制的離子柱交換HPLC色譜(Dosage du phosphore.Chromatographie HPLC sur colonneechangeuse d′ions pour le controle qualitatif),J.Biol.Chem.(1926),66,375。蛋白*LOWRY(J.Biol.Chem.(1951),193,265-75)。己糖*T.A.SCOTT，蒽酮中的比色計(jì)劑量(Dosage colorimetr,al′anthrone),Anal.Chem.(1953),25,1956-61。己糖胺*L.A.ELSON(Biochem.J(1953),27,1824-28)。脂多糖
*J.JANDA和E.WORK(Febs Letters,1971,16(4),343-45)。C、其他免疫佐劑除膜組分外，還有-Ⅲ型膠原-氯化鈉。
所使用的Ⅲ型膠原具有如下特征a、接近如下序列的氨基酸序列(濃度以g/kg表示)-天冬氨酸AA 51.5-羥基脯氨酸 HP 107.0-蘇氨酸 TH 16.1-絲氨酸 SE 27.8-谷氨酸 AG 95.9-脯氨酸 PR 124.0-甘氨酸 GL 149.0-丙氨酸 AL 87.9-纈氨酸 VA 23.3-蛋氨酸 ME 7.5-異亮氨酸IL 14.4-亮氨酸 LE 27.8-酪氨酸 TY 6.7-苯丙氨酸PA 14.4-賴氨酸 LY 28.6-組氨酸 HI 5.5-精氨酸 AR 73.0
b、分析類型如下-顏色 黃白色-表觀密度 250g/l-含水量 6％-10％溶液的pH值 6.9-40℃(下的Engler濃度 2.5(溶液為17.75％)-原料比例 0.9％-灰量 2.2％-Fe+Cu+Ca的比例 462mg/kg-重金屬 通過電弧發(fā)射光譜沒有發(fā)現(xiàn)-元素分析 C 46.80％H 7.10％N 14.96％本發(fā)明復(fù)合物的組成涉及核糖體RNA或RNA片段、膜組分(例如肺炎克雷白氏桿菌的蛋白多糖)和Ⅲ型膠原，并添加有氯化鈉和抗炎藥，其可以不產(chǎn)生任何毒性的小劑量給藥，產(chǎn)生高水平的保護(hù)和治愈作用。
優(yōu)選制劑是上述組成的注射劑型，但也可使用與醫(yī)療應(yīng)用相配適的制劑和/或載體或添加劑。菌苗復(fù)合物的作用機(jī)理本發(fā)明的治療(菌苗)復(fù)合物類似于特異性菌苗(通過“惰性系統(tǒng)”，該系統(tǒng)的目的是增加重組亞單元的菌苗和由肽組成之菌苗的免疫遺傳力)，并且是具有淋巴因子特征的非特異性菌苗，其固定在巨噬細(xì)胞上，并在與卷旋桿菌面對(duì)面的免疫應(yīng)答中起到最重要的作用。[KAZI,J.I.,SINNIAH,R.,JAFFRAY,N.A.,ALAM,S.M.,ZAMAN,V.,ZUBERI,S.J.和KAZI,A.M.,在與幽門彎曲桿菌有關(guān)的慢性胃炎中的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答(Cellular and humoral immune responses in Campylobacterpylori-associated chronic gastritis),J.Pathol.159:231-237,1989]。
從1974-75(A.S.和G.P.YOUMANS)以來，一直認(rèn)為對(duì)RNA免疫應(yīng)答的抑制作用可通過各種不同的抑制劑來實(shí)現(xiàn)。
YOUMANS僅針對(duì)一種細(xì)菌源(結(jié)核分枝桿菌)進(jìn)行了研究，其中“寄生現(xiàn)象”僅是在細(xì)胞內(nèi)有。
VENNEMAN等人在1972年認(rèn)為，真正的抗原能夠結(jié)合在RNA上，而其起到佐劑的作用。將它們和核糖體RNA一起接種在小鼠上，所述RNA是在65℃下用苯酚抽提腦膜炎沙門氏菌之核糖體得到的。接種30天后，證實(shí)動(dòng)物得到的保護(hù)比活微生物源菌苗(減活)更好。
普遍認(rèn)為保護(hù)水平與注射的RNA量有關(guān)。
例如，肺炎鏈球菌提取物核糖體RNA誘導(dǎo)體液性質(zhì)的保護(hù)作用，而肺炎克雷白氏桿菌提取物核糖體RNA可誘導(dǎo)細(xì)胞性質(zhì)的保護(hù)作用。。
體內(nèi)注射在小鼠和豚鼠中的混合物可起到蜂窩狀巨噬細(xì)胞的作用。
給藥溶血范圍的酸性磷酸酶直接與小鼠脾細(xì)胞接觸后，該“暫時(shí)”的作用重新恢復(fù)。
用本發(fā)明治療和菌苗復(fù)合物進(jìn)行的治療在期間可產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫刺激作用，以及對(duì)幽門卷旋桿菌非常明顯的特異性和非特異性作用。病人的肌體被激動(dòng)以“排斥被感染的細(xì)胞”。通過被同時(shí)激發(fā)的PMN(多形核白細(xì)胞)和單核細(xì)胞的作用，還可得到痊愈。。
該治療機(jī)理可借助于由上述佐劑(膜蛋白多糖、Ⅲ型膠原、氯化鈉的組合)調(diào)理的(非特異性細(xì)菌核糖體)RNA產(chǎn)生天然無性繁殖系。
該無性繁殖系誘導(dǎo)對(duì)抗遺傳型抗體的免疫作用，并對(duì)與細(xì)菌有關(guān)聯(lián)的位置產(chǎn)生抗體。為減小或抑制炎性反應(yīng)，在用本發(fā)明菌苗復(fù)合物治療時(shí)需要通過I.V.或I.M.途徑使用磷酸二鈉形式的類皮質(zhì)體液(例如倍他米松型)，其劑量為20-60mg。
該作用還伴隨著內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生，以及N.K.細(xì)胞的活化。
本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)菌苗復(fù)合物的目的是誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，并通常可產(chǎn)生防止或至少降低(有可能降低至只有自動(dòng)防御)進(jìn)入至肌體中的感染物質(zhì)的增殖的作用。
-PRUUL,H.,LEE,P.C.,GOODWIN,C.S.和MACDONALD.,P.J.，幽門彎曲桿菌與人免疫防御機(jī)制的相互作用(Interaction ofCampylobacter pyloridis with human immune defence mechanisms),J.Med.Microbiol.,23:233-238,1987；-RATHBONE,B.J.,WYATT.J.I.,WORSLEY,B.W.,SHIRES,S.E.,TREJDOSIEWICZ,L-K.,HEATLEY,R.V.和LOSOWSKY,M.S.，在非潰瘍性消化不良中對(duì)胃幽門彎曲桿菌的系統(tǒng)和局部抗體應(yīng)答(Systemicand local antibody response to gastric Campylobacter pyloridis in non-ulcerdyspepsia)Gut 27:642-647,1986；-STACEY,A.R.,HAWTIN,P.R.和NEWELL,D.G.，對(duì)幽門卷旋桿菌消化的局部免疫應(yīng)答(Local immune responses to Helicobacter pyloriingections)。以及Malgertheimer,P.和Ditschuneit,H.(Eds.)幽門卷旋桿菌、胃炎和消化潰瘍(Helicobacter pylori,Gastritis and PepticUlcer),Spnnger Verlang,Berlin-Heidelberg,1990，第162-166頁。
另外，本發(fā)明治療復(fù)合物的創(chuàng)造性在于，通過發(fā)揮后感染作用減輕或消除“抑制性細(xì)胞”的存在，通過防御性細(xì)胞和/或體液應(yīng)答產(chǎn)生抗?jié)兎磻?yīng)。這是對(duì)Kist和Coll于1993年提出的病癥的治療應(yīng)答。。
并可防止感染的復(fù)發(fā)。
-BORODY T.,ANDREWS P.,MANCUSO N.,JANKIEWICZ E.,BRANDL S.，根除4年后幽門卷旋桿菌重新感染(Helicobacter pylorireinfection 4 years post-eradication),Lancet 1992,339:1295；-BELL GD,POWELL KU,BURRIDGE SM,HARRISON G,RAMEH B,WEIL J.等人，明顯地成功根除幽門卷旋桿菌感染后重新感染或復(fù)發(fā)對(duì)十二指腸潰瘍病患者治療的暗示(Reinfection orrecudescence after apparently successful eradication of Helicobacter pyloriinfection:Implications for treatment of patients with duodenal ulcerdisease),Q J Med 1993,86:375-382。
總之，本發(fā)明的治療復(fù)合物通過產(chǎn)生RNA分子而起到操縱進(jìn)程的作用，該RNA分子阻斷幽門卷旋桿菌的感染并增強(qiáng)免疫防御。。
另一方面，已觀察到在所進(jìn)行的各種不同的臨床實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的復(fù)合物能夠非常成功地代替通常需要三重治療的常規(guī)治療法，其中有顯著的細(xì)菌耐受性。菌苗復(fù)合物的給藥方法本發(fā)明菌苗復(fù)合物可通過口服或非胃腸道途徑給藥*或直接靜脈注射*或緩慢灌注*或皮下注射*或透皮途徑(24小時(shí))這些不同的方法都已實(shí)驗(yàn)成功。
每日劑量或給藥頻率大部分取決于病人的狀況。超劑量不會(huì)產(chǎn)生任何危險(xiǎn)，這是因?yàn)閺?fù)合物沒有毒性。靜脈途徑給藥可使用1周-1個(gè)月的時(shí)間，治療時(shí)每周的每天包括緩慢灌注500ml包含以下物質(zhì)的溶液-0.9％氯化鈉-40μg膜糖組分(肺炎克雷白氏桿菌的蛋白多糖)-30μg以下物質(zhì)的RNA(核糖體)*幽門卷旋桿菌 7μg*肺炎雙球菌7μg*化膿鏈球菌(A12) 7μg*肺炎克雷白氏桿菌 7μg*Hemophilus influenzae 2μg
-10μg所述的Ⅲ型膠原-8mg倍他米松磷酸二鈉(或者2ml注射溶液)對(duì)于可走動(dòng)的患者，緩慢I.V.灌注的治療可用皮下注射來代替，每個(gè)注射溶液包括-40μg膜糖組分(肺炎克雷白氏桿菌的蛋白多糖)-30μg以下物質(zhì)的RNA(核糖體)*幽門卷旋桿菌 7μg*肺炎雙球菌 7μg*化膿鏈球菌(A12)7μg*肺炎克雷白氏桿菌 7μg*Hemophilus influenzae 2μg-10μg所述的Ⅲ型膠原-0.5ml的0.9％氯化鈉-4mg倍他米松磷酸二鈉(或者1ml注射溶液)該治療可持續(xù)幾周。口服途徑給藥每日2片，只在早晨空腹吞服1次，每片包括-400μg膜糖組分(肺炎克雷白氏桿菌的蛋白多糖)-300μg以下物質(zhì)的RNA(核糖體)*幽門卷旋桿菌 70μg*肺炎雙球菌70μg*化膿鏈球菌(A12) 70μg*肺炎克雷白氏桿菌 70μg*Hemophilus influenzae 20μg
-100mg所述的Ⅲ型膠原-2mg倍他米松磷酸二鈉該治療在1個(gè)月中每日給藥2片，然后在3個(gè)月的期間中重復(fù)每日給藥2片的療程每月1周。透皮途徑紿藥粘性透皮給藥系統(tǒng)包括儲(chǔ)藥部分和可透過的膜，該膜使活性成分連續(xù)地透過至皮膚，并以恒定的速率到達(dá)血液循環(huán)中。
該裝置可固定在健康、干燥且少毛的皮膚表面上(例如腹部或胸部的側(cè)皮)。
其包括-聚合物粘合劑-粘合劑的基體聚乙烯-聚硅酯保護(hù)過濾器其內(nèi)含物與片劑的相同，且其劑量與口服給藥的相同(每貼含2片的量)。
以下實(shí)施例不是限制性的，而是用于詳細(xì)說明本發(fā)明治療菌苗復(fù)合物的作用。實(shí)施例1Robert G.先生，64歲，由于上腹部痛而住院，胃灼熱且腹部疼痛，并伴有排泄問題，交替的腹瀉和便秘。消化道內(nèi)窺鏡通過賁門開口檢查了胃-食管回流的病理狀況，其已形成了食管炎和食管底部的消化潰瘍。
用脲酶的快速測(cè)試進(jìn)行了活組織檢查。該解剖病理學(xué)的檢查和組織培養(yǎng)都證實(shí)了幽門卷旋桿菌的存在。
進(jìn)行了常規(guī)治療(抑制分泌藥和二種抗生素)。臨床上三重治療都沒有治愈。
在治療后的六周，以13C標(biāo)記的尿素進(jìn)行的根除檢查呼吸測(cè)試是陽性的，得出細(xì)菌已增殖的結(jié)論。
以皮下注射液的形式用本發(fā)明的菌苗復(fù)合物進(jìn)行了治療。
1個(gè)月后，臨床上觀察到愈合，以13C標(biāo)記的尿素進(jìn)行的呼吸測(cè)試是陰性的。
6個(gè)月后，以13C標(biāo)記的尿素進(jìn)行新檢查呼吸測(cè)試和內(nèi)窺鏡檢查，表明已得到愈合。
1年后，已痊愈。實(shí)施例2Serge Y.先生，48歲，為B型竇性胃炎。用Ⅳ劑型的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物治療(以前的治療僅是包敷胃部)。連續(xù)治療后15天，臨床上得到愈合。1年后檢查(以13C標(biāo)記的尿素進(jìn)行的呼吸測(cè)試)為陰性。實(shí)施例3Pierre K.先生，內(nèi)窺鏡檢查證實(shí)為十二指腸潰瘍(以及活組織檢查，脲酶測(cè)試，ELISA測(cè)試)。
也進(jìn)行口服給藥的治療。3周后，臨床上得到愈合。
6周后，以13C標(biāo)記的尿素進(jìn)行的呼吸檢查證實(shí)根除。
6月后，沒有任何復(fù)發(fā)跡象，而且Elisa測(cè)試表明抗體濃度不明顯(小于50％)。實(shí)施例4Sarah L.女士，為與B型胃炎有關(guān)的十二指腸潰瘍。
發(fā)現(xiàn)在同胞中存在胃癌。檢測(cè)結(jié)果表明所有測(cè)試方法的結(jié)果都是陽性的培養(yǎng)、組織學(xué)、病毒基因組擴(kuò)增(PCR)、脲酶測(cè)試。
然后開始1周的靜脈治療和6個(gè)月的皮下給藥治療。
將其高度危險(xiǎn)性通知家屬，在第3個(gè)月進(jìn)行內(nèi)窺鏡和活組織檢查PCR、細(xì)胞學(xué)、培養(yǎng)、CLO測(cè)試，結(jié)果都是陰性的。
第6個(gè)月，呼吸測(cè)試(13C)證實(shí)臨床痊愈。
權(quán)利要求
1.特異性治療免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，其包括雙分子，該雙分子是通過將連接在靶上的氨基酸的功能臂與相應(yīng)于所述功能臂組成的描述密碼的RNA的遺傳臂相偶聯(lián)而構(gòu)成的，以及糖肽和/或脂多糖的細(xì)菌膜組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，所述核糖核酸(RNA)源自于核糖體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，所述核糖體核糖核酸是選自以下物質(zhì)的提取物幽門卷旋桿菌、肝卷旋桿菌、冠狀卷旋桿菌、彎曲桿菌、或它們的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，所述氨基酸是膠原氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，所述膠原氨基酸選自于天冬氨酸、羥基脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其通過產(chǎn)生抗體以及內(nèi)源性干擾素，用于治療卷旋桿菌細(xì)菌引發(fā)的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其顯著地避免消化道的原病理狀況的復(fù)發(fā)，用作遺傳型抗菌抗體的抗遺傳型菌苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其用于防止抗生素等的常規(guī)治療中的細(xì)菌耐受性。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的特異性抗卷旋桿菌的免疫調(diào)節(jié)及菌苗復(fù)合物，其特征在于，其為與主要為類皮質(zhì)體液的抗炎藥、抗生素、抑制分泌藥(質(zhì)子泵抑制劑、奧美拉唑型或抗H2藥)同時(shí)給藥的形式，或另外產(chǎn)生制菌作用、殺菌作用或溶菌作用，以根除通過細(xì)菌因素(產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞毒素、炎癥介導(dǎo)因子白介素I、腫瘤壞死因子α)或宿主因素產(chǎn)生致病作用的卷旋桿菌。
10.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其特征在于，其成型為以不同途徑給藥的劑型灌注、靜脈注射、皮下注射、透皮裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療菌苗復(fù)合物,該復(fù)合物對(duì)卷旋桿菌具有特異性和非特異性,并通過免疫調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)肌體的自然防御。該藥物還可用于防止疾病復(fù)發(fā),特別是防止對(duì)常規(guī)治療的耐受性。該藥物基本上包括按預(yù)定比例的RNA、微生物的選擇性膜組分、特別的氨基酸序列、氯化鈉和甾體抗炎藥,還可同時(shí)給藥抗生素和抑制分泌的藥物。所述藥物特別適合于治療由卷旋桿菌引起的消化道疾病(竇性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、食管炎、肝炎),并防止胃癌和變性感染MALT(與粘膜有關(guān)的淋巴樣組織)淋巴瘤以及直接或間接與卷旋桿菌感染有關(guān)的冠狀疾病。
文檔編號(hào)A61K39/116GK1211924SQ9719260
公開日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月26日
發(fā)明者費(fèi)爾南·納爾拜·托羅西安 申請(qǐng)人:費(fèi)爾南·納爾拜·托羅西安