專利名稱：銀杏提取物在藥物組合物制備中的應用,以及銀杏提取物用作美容性治療的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在將可從銀杏(Ginkgo biloba)獲得的提取物用于免疫調(diào)節(jié)領域。這些提取物對于治療、預防以及調(diào)節(jié)免疫紊亂的皮膚表現(xiàn)尤其有用。
銀杏是一種雌雄異株樹木，自然生存于遠東，它的葉子可以用于制備醫(yī)藥。
銀杏提取物已被提議用于改善以下疾病癥狀老年人的智力低下、間歇性跛行、管腔閉合性動脈病變和Rayaund氏??；在腎功能低下的病例中，也提倡使用它，銀杏苦內(nèi)酯族的成份更是與預期的活性密切相關。
出乎預料，本申請人發(fā)現(xiàn)從銀杏得到的這些提取物有免疫調(diào)節(jié)作用。因此，本發(fā)明的主題就是利用至少一種可以從銀杏提取的活性成份，制備一種通過局部途徑給藥有免疫調(diào)節(jié)活性的組合物。
免疫反應由復雜的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)，它參與維持身體總的良好的狀態(tài)。它們負責抵御外來物---尤其是病原物，或者抵御已經(jīng)過成瘤性轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
這種防御涉及抗原的外源性的識別，以及細胞或體液中介物的激活。它依賴于遺傳因素，通過組織主要相容性復合體起作用。
然而，有時，當這種反應太劇烈，或者是針對本質(zhì)上無害的環(huán)境抗原時，這種反應機制并不為人所需。器官和組織移植時，也是如此。另外，一些功能缺陷也造成宿主錯誤識別自身細胞，這些細胞被宿主自己的免疫系統(tǒng)所破壞，能引起廣泛的病理變化(比如播散性紅斑狼瘡、皮膚肌炎、風溫性關節(jié)炎，或者某些類型的爆發(fā)性肝炎)。
還有觀察報導，變態(tài)反應性病人中，大多數(shù)也有所謂的敏感性皮膚。總的說來，主訴這種皮膚的人越來越多。雖然它們的病因復雜，似乎總是牽涉到變態(tài)反應性或炎癥性因素。
敏感性皮膚的含義包括一系列表現(xiàn)，包括易反應性皮膚和不易耐受性皮膚。誘發(fā)因素包括環(huán)境的刺激，比如風，污染，氣溫變化，過硬的水，以及不合適的衛(wèi)生、美容或保健用品。這些現(xiàn)象或許還與明顯的緊張或情緒變化，食入某些食物或使用醫(yī)藥用品有關。另外，還有個人的素因性因素(尤其是神經(jīng)性或體液因素)，或一些家族性的素因性因素，這可以加強這些反應。
總之，這些個體感到皮膚不適，這可以有主觀或客觀的表現(xiàn)。皮膚容易有刺痛，發(fā)癢，鉆痛的感覺，也可能有熱，咬，燒灼的感覺。皮膚也容易發(fā)紅或脫屑。干燥，脂溢性皮炎，毛細血管病，水皰，水腫也不定性出現(xiàn)。
這種狀況可以表現(xiàn)在皮膚，粘膜或頭皮水平。后一種情況可能伴有頭屑或脫發(fā)。
如上提示，這種狀況總是包含變態(tài)反應性成份。另外，它可以發(fā)展成變態(tài)反應性皮膚疾病，例如特應性皮炎，濕疹或神經(jīng)性皮炎。
變態(tài)反應根據(jù)免疫反應的性質(zhì)可以分為四種類型。它們起因于免疫性炎癥機制。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，銀杏提取物有免疫調(diào)節(jié)活性。這可以用混合淋巴上皮細胞培養(yǎng)來證明。
實際上，皮膚，尤其是上皮---Langerhans細胞的存在處，在免疫屏障中發(fā)揮著一定的作用。Langerhans細胞(LC)作為抗原呈遞細胞的功能的確定，以及角質(zhì)細胞可以產(chǎn)生因子參與免疫反應的事實，是皮膚免疫系統(tǒng)概念的起因。Langerhans細胞存在于外層，這要求它們負責制備抗原并將其呈遞給淋巴細胞?？乖蔬f涉及表達在Langerhans細胞表面的主要組織相容性抗原Ⅱ類分子(HLA-DR)與表達于CD4陽性的淋巴細胞表面的T受體之間的相互作用。致敏早期，Langerhans細胞在上皮內(nèi)抓取抗原，并將其轉(zhuǎn)化成免疫原性肽。通過Langerhans細胞表面的HLA-DR-免疫性肽復合物與CD4陽性淋巴細胞表面的T受體的相互作用，在神經(jīng)節(jié)實現(xiàn)抗原向T淋巴細胞的呈遞。
混合淋巴上皮細胞培養(yǎng)(MLECs)構成了一種模型。它通過測定在有和沒有受試物處理時，抗原呈遞同種異型上皮細胞誘導的淋巴細胞增生，使人們可以確定受試物改善皮膚的免疫平衡的的免疫調(diào)節(jié)活性。
抗變態(tài)反應的活性也在角質(zhì)細胞和巨嗜細胞得到證明。因為存在于皮膚，巨嗜細胞尤其具有優(yōu)勢，它們不僅調(diào)節(jié)炎癥反應，也通過它們呈遞抗原以及產(chǎn)生眾多細胞因子的能力調(diào)節(jié)著局部免疫。這些巨嗜細胞也參與與循環(huán)系統(tǒng)的通訊聯(lián)系，后者在需要的時候可以釋放不同類型的細胞(單核細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞)，這樣可以增加所述組織的特異和非特異的防御能力。
從銀杏提取的活性成份的活性評價是在人類角質(zhì)細胞和巨嗜細胞培養(yǎng)物上進行的，這些細胞先經(jīng)過刺激或經(jīng)IL-4處理---這可以誘導細胞表面的CD23受體----然后由IgE免疫復合物處理。這類刺激誘發(fā)過敏性炎癥(IgE)；它將細胞置于超氧反應(產(chǎn)生超氧負離子或NO自由基，其量可以從測定氮衍生物的產(chǎn)生來衡量)和免疫性炎癥反應(產(chǎn)生細胞因子，例如TNF-α)的環(huán)境下。
另外，從銀杏提取的活性成份對炎癥有局部的非特異作用，這也加強了這種免疫調(diào)節(jié)活性。
需要強調(diào)的是，根據(jù)本發(fā)明，這種(些)有用的活性成分作為銀杏提取物形式存在于組合物中的。多種銀杏提取物可能適合本發(fā)明。在這些提取物中，萜的濃度最好少于7％(w/w)。
實際上，銀杏有復雜的化學組成包括脂族醇、碳水化合物、甾體、氨基酸、多酚-例如毛地黃黃酮(luteolin)、櫟醇和更特異的從穗花杉雙黃酮衍生的雙黃酮(白果黃素(bilobetin)，銀杏黃素(ginkgetin))；它還包含銀杏酸和含倍半萜鏈的漆樹衍生物，從檸烯(limonene)衍生的萜類和有叔丁基的萜類(白果內(nèi)酯和銀杏苦內(nèi)酯)。
適于本發(fā)明的提取物中萜類衍生物含量應該少于干重大約3％w/w，最好少于1％w/w，少于0.05％w/w更好。
葉綠素，脂類，蠟，植物血凝素最好從所用提取物中基本除去。
提取物也基本上不含銀杏酸，雙黃酮類，或游離甙配基。
原花色素類濃度最好少于提取物干重的5％w/w。
根據(jù)本發(fā)明，可用的提取物雜甙黃酮(flavone heteroside)含量應大于干重的24％w/w，大于28％w/w更好，29-35％w/w更有利。
雜甙黃酮是糖基配基為黃酮醇的化合物，如櫟精、堪非醇或異鼠李黃素。它們是單糖，三糖尤其是四糖甙，它們的基本糖組成是葡萄糖和鼠李糖。它們主要以櫟精和堪非醇葡萄糖鼠李糖甙的香豆素酯形式存在。
尤其適于本發(fā)明的銀杏提取物應含水少于3％w/w，雜甙黃酮32±3％w/w，銀杏酸濃度少于10ppm，原花色素類少于5％w/w，以及萜類少于0.5％w/w。
本發(fā)明涉及利用從銀杏提取的至少一種活性成份，來制備一種能夠預防，治療和/或改善以上所述的敏感性皮膚反應的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，本發(fā)明涉及利用從銀杏提取的如上所述活性成份，制備組合物來治療或預防以下疾病群的某一種狀態(tài)特應性皮炎，白斑，牛皮癬，多形性紅斑，神經(jīng)性皮炎，干皮病，紅斑痤瘡，蕁麻疹，天皰瘡，紅斑狼瘡，皮炎，良性夏季光照性皮炎和濕疹。
與本發(fā)明相應，通過調(diào)節(jié)劑量，銀杏提取物可以用來調(diào)節(jié)特定的免疫機制。
這樣，可以建議用它們來治療AIDS伴發(fā)的皮膚狀況；例如Kaposi病，它通常表現(xiàn)為四種臨床形式(據(jù)推測皰疹類病毒感染是致病因素)，目前對它的認識是主要由炎性細胞組成的增生物。
本發(fā)明的組合物中，銀杏提取物最好占0.0001-10％w/w，0.01-2％w/w之間更好。
提取物可以這樣在組合物中使用，也可預先與磷脂混合使用。脂質(zhì)體或Phytosome載體可以提高它們的生物利用度。
本發(fā)明的另一個主題是提供一種超反應性皮膚的美容處理的方法。其特征在于通過局部途徑使用從銀杏提取的一種以上的活性成份。
本發(fā)明的組合物最終加入美容學上和皮膚病學上可以接受的賦形劑成形。本行業(yè)的專業(yè)人士熟知這些賦形劑。
下面這些例子用來說明本發(fā)明。
在這些例子中，對這些圖將有說明。
圖不同濃度銀杏提取物下淋巴上皮細胞的增生例一1．材料和方法產(chǎn)品下列產(chǎn)品在研究中使用過IL-4購自Immugenex(Los Angles，加州)，采用10ng/ml；單克隆IgE購自Stallergene(Fresnes，法國)；抗IgE購自Nordic(Tilburg，荷蘭)。
角質(zhì)細胞培養(yǎng)原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)物來源于新生兒包皮，用不含小牛血清的培養(yǎng)液在體外保持增生。融合的培養(yǎng)物用胰酶消化后，以105細胞/ml/孔的密度，用新培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入24孔板。細胞表面的IgE受體(CD23)用免疫標記法確證。
巨嗜細胞培養(yǎng)巨嗜細胞從正常(非變態(tài)反應者)供體的外周血獲得。單核細胞用Ficoll梯度分離，回收淋巴細胞環(huán)，洗滌三次，然后培養(yǎng)細胞，讓巨嗜細胞細胞貼壁。培養(yǎng)一小時后，回收細胞，以106細胞/ml/孔培養(yǎng)。在IL-4刺激前，用免疫標記法確證細胞表面的IgE受體(CD23)。
細胞活化細胞先用IL-4活化以誘導CD23，然后用含IgE的免疫復合物刺激3-5天，再回收各種上清液。氮衍生物用Griess分析，TNF分析采用購自Medgenix(Fleurus，比利時)的分析試劑盒。
2．結(jié)果銀杏提取物對IL-4刺激的角質(zhì)細胞和巨嗜細胞的作用將干銀杏葉用乙酮-水混合物在真空下反復抽提，通過多次去除溶劑合葉綠素、脂類、蠟、植物血凝素和一些特定物質(zhì)，然后得到一種稱為H-37的提取物。
它以細粉末形式存在，規(guī)格如下-殘留溶劑·乙醇＜3％·丙酮＜0.1％·丁醇＜0.1％·乙酸乙酯＜0.1％-硫酸鹽灰分 ＜1.5％-水含量 ＜3％-原花色素 ＜5％-萜類 ＜0.5％-銀杏酸 ＜10ppm-重金屬 ＜20ppm-雜甙黃酮 32±3％它可在PEG400中溶解6％w/w，可在90％乙醇中溶解4％w/v。
細胞用10ng/ml的IL-4刺激48小時，以誘導其表面的IgE低親合力受體(CD23)。培養(yǎng)期末，30-80％的角質(zhì)細胞和巨嗜細胞表達CD23。個體變異不反映這些個體的變應狀態(tài)的差別。不管什么情況，在誘導期，受試物不調(diào)節(jié)CD23的誘導。少于5％的降低觀察不到(n=8)。
表1在10mg/ml H37存在下，IL-4刺激誘導不同細胞的CD23表達
*細胞在有或無10ng/ml IL-4以及有無不同的產(chǎn)物下刺激48小時，ND=未檢測到。
CD23被IgE免疫復合物結(jié)合，誘導許多介質(zhì)和細胞因子(尤其是TNF)以及氧代謝產(chǎn)物，如含氮衍生物產(chǎn)生。這種刺激在體外重建了變態(tài)反應型炎癥反應。
獲得的結(jié)果在以下兩個表格作一總結(jié)。
表2AIgE免疫復合物±10mg/ml H37刺激后的氮衍生物產(chǎn)量(NO2-μM)
*括號中是未經(jīng)IgE免疫復合物刺激的細胞的測值。
H37產(chǎn)品對IgE免疫復合物刺激的巨嗜細胞和角質(zhì)細胞氮衍生物的產(chǎn)生有抑制作用。
表2BIgE免疫復合物±10mg/ml H37刺激后TNF(pg/ml)的產(chǎn)量
*括號中是未經(jīng)IgE免疫復合物刺激的細胞的測值，ND=未測到。
H37產(chǎn)品輕微降低IgE免疫復合物刺激的巨嗜細胞和角質(zhì)細胞TNF的產(chǎn)生。
因此看起來，H37有變態(tài)反應性抗炎活性。這個特征非常重要，因為炎癥，尤其是變態(tài)反應性炎癥的嚴重程度取決于這些細胞氧代謝不平衡程度。尤其是，這種不平衡決定了，至少部分決定了與這些反應相關的免疫現(xiàn)象的調(diào)節(jié)。對特定的變態(tài)反應和細胞因子的產(chǎn)生就是如此。
例二H37對同種異型混合淋巴上皮細胞培養(yǎng)(MLEC)(向T淋巴細胞呈遞抗原)的作用研究混合淋巴上皮細胞培養(yǎng)(MLEC)的原理與混合淋巴細胞培養(yǎng)相同，唯一的區(qū)別是刺激細胞群是全上皮細胞(角質(zhì)細胞，Langerhans細胞及其他細胞)。因為這種共培養(yǎng)使評價Langerhans細胞向T淋巴細胞呈遞抗原的能力成為可能，它對于檢測分子或強刺激調(diào)節(jié)皮膚免疫反應的能力尤其有用。
簡言之，多批作為對照的全上皮細胞，和多批上皮細胞與淋巴細胞培養(yǎng)；在共培養(yǎng)時，用外源分子處理；然后上皮細胞誘導的淋巴細胞增生。用這個方法可以監(jiān)測淋巴細胞上皮細胞共培養(yǎng)時，Langerhans細胞的免疫功能和外源分子對其的調(diào)節(jié)。
這個研究在同種異型(T淋巴細胞和上皮細胞來源于不同的供體)的情況下，用從乳房成形手術獲得的新鮮全上皮細胞來進行的。
程序這個研究是用從2-3個不同供體的上皮細胞來完成的。
上皮細胞與同種異型的T淋巴細胞在96孔板共培養(yǎng)全上皮細胞的數(shù)目和T淋巴細胞相同(105上皮細胞-105T淋巴細胞)。
共培養(yǎng)共耗時6天，氚標胸苷在培養(yǎng)結(jié)束前18小時(第5天)摻入。
通過測定用氚標胸苷的摻入來測定淋巴細胞的增生(將培養(yǎng)板粉碎來進行放射性活性測定)。
在上皮細胞和同種異型T淋巴細胞共培養(yǎng)時，加入外源分子(提取物H37或環(huán)孢菌素)。
-用待測分子處理的樣品通過少量逐漸增加(四倍終濃度)的待測分子溶液得到的含待測分子濃度逐漸增高的上皮細胞和同種異型T淋巴細胞的共培養(yǎng)物。對于可溶于水的H37，儲存液用水配制，以此加入培養(yǎng)液；對于可溶于DMSO的環(huán)孢菌素，儲存液用DMSO配制，然后用子液加入培養(yǎng)液。
在培養(yǎng)孔中有少量的DMSO(作為對照的DMSO和環(huán)孢菌素組中DMSO終濃度均為0.1％)。
陰性對照如下-未處理的單獨T淋巴細胞(對照EC)-未處理的單獨上皮細胞(對照PBMC)其它對照單獨上皮細胞，用DMSO(環(huán)孢菌素的溶劑)處理；單獨T淋巴細胞，用DMSO(環(huán)孢菌素的溶劑)處理；單獨上皮細胞，用最高濃度的分子處理；單獨T淋巴細胞，用最高濃度的分子處理；陽性對照如下-上皮細胞+同種異型T淋巴細胞(EC=對照PBMC)-上皮細胞+用0.1％的DMSO(環(huán)孢菌素的溶劑)處理的T淋巴細胞標準品為環(huán)孢菌素(Cyclo)106M。
產(chǎn)品H37用以下濃度10.03％20.01％30.001％40.0001％結(jié)果初步實驗顯示，H37產(chǎn)品，用到0.03％的濃度，對淋巴細胞和上皮細胞均未顯示細胞毒性。
MLEC結(jié)果顯示在附頁的圖中。
下面的符號代表PBMC 單獨T淋巴細胞EC 單獨全上皮細胞同種異型PBMC+EC全上皮細胞和T淋巴細胞結(jié)果以氚標胸苷摻入百分比(％)來表示。100％相當于EC+PBMC系統(tǒng)(全上皮細胞加同種異型血T淋巴細胞)無任何產(chǎn)品(對照)添加時氚標胸苷摻入的水平。
此處說明的實驗顯示的是，全上皮細胞存在時，T淋巴細胞增生(以氚標胸苷的摻入代替)。淋巴細胞增生的放大與所用的上皮細胞有關，它在每次實驗中是不同的。這個誘導的增生代表了制備的全上皮細胞中Langerhans細胞向T淋巴細胞呈遞抗原的能力。
環(huán)孢菌素，這個已知的免疫調(diào)節(jié)劑，抑制淋巴細胞增生(抑制70％)。
產(chǎn)品H37在濃度1(0.03％)和濃度2(0.01％)時在MLEC實驗中，對淋巴細胞增生有明顯的抑制作用。
這些結(jié)果顯示，在體外MLEC實驗證明，H37有免疫調(diào)節(jié)活性。
權利要求
1．至少一種可從銀杏提取的活性成份在制備一種通過局部途徑給藥有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物的應用。
2．權利要求1所述至少一種可從銀杏提取的活性成份的應用，其特征在于該組合物目的是預防或治療免疫依賴性的皮膚反應。
3．權利要求1或權利要求2所述的應用，其特征在于活性成份以銀杏葉提取物的形式存在于組合物中。
4．權利要求3所述的應用，其特征在于銀杏提取物的萜類含量少于干重的3％w/w。
5．權利要求3和權利要求4所述的應用，其特征在于銀杏提取物雜甙雙黃酮的含量多于干重的24％w/w。
6．權利要求1到權利要求4所述的應用，其特征在于該組合物的目的是治療或預防皮膚和粘膜的不耐受和/或變態(tài)反應。
7．權利要求1到權利要求6所述的應用，其特征在于該組合物的目的是治療和預防以下疾病群的某一種狀態(tài)特應性皮炎，白斑，牛皮癬，多形性紅斑，神經(jīng)性皮炎，干皮病，紅斑痤瘡，蕁麻疹，天皰瘡，紅斑狼瘡，皮炎，良性夏季光照性皮炎和濕疹，以及AIDS相關的皮膚表現(xiàn)。
8．權利要求7所述的應用，其特征在于銀杏提取物在該組合物中的濃度在0.0001％到10％w/w之間。
9．權利要求3到權利要求8所述的應用，其特征在于銀杏提取物在該組合物中的濃度在0.01％到2％w/w之間。
10．美容性治療高反應性皮膚的方法，其特征在于經(jīng)局部途徑使用至少一種從銀杏提取的活性成份。
11．權利要求10所述的方法，其特征在于用銀杏提取物與皮膚可接受的賦形劑結(jié)合制成一種可通過局部途徑給藥的皮膚美容組合物。
全文摘要
該發(fā)明是關于從銀杏提取物得到的最少一種活性成分來制備一種有免疫調(diào)節(jié)活性的組合物。該發(fā)明也關于敏感性皮膚的美容處理。
文檔編號A61K8/97GK1211925SQ97192462
公開日1999年3月24日 申請日期1997年10月21日 優(yōu)先權日1996年10月22日
發(fā)明者D·卡斯特利, L·弗里特奧, G·里斯 申請人:Roc公司