一種銀杏葉提取物的制備方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種銀杏葉提取物的制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 銀杏葉是銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba)的葉,是當(dāng)今地球上最古老的樹種 之一。銀杏樹為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba.L.)又名公孫樹,為我國(guó)特產(chǎn)植物,銀 杏葉提取物(GRE)主要含黃酮和內(nèi)酯兩類活性成分,黃酮以山柰酚(kaempferal)、槲皮素 (quercetin)和異鼠李素(isorhamnetin)等戒類化合物為主,內(nèi)酯以白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯 A、B和C(gimkgolide A.B. C)為主。由于銀杏葉提取物在治療冠心病、腦血栓、腦缺血、腦 功能障礙、腦外傷后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氧自由基清除等方面的療效確切,目前已成為世 界醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)。
[0005] 舒血寧注射液是銀杏葉經(jīng)提取制成的滅菌水溶液。主要的化學(xué)成分包括總銀杏 酸、內(nèi)酯和黃酮等化合物。內(nèi)酯和黃酮是有效活性成分,總銀杏酸為有毒成分。目前,銀杏 葉提取物標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部。商務(wù)部中國(guó)醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)正式 對(duì)外發(fā)布的《銀杏葉提取物國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)》指出,國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示,總銀杏酸具有 細(xì)胞毒性、胚胎毒性、致敏性及致突變作用,被廣泛認(rèn)為是銀杏葉提取物及其制劑中的毒性 物質(zhì),WHO及多國(guó)藥典(包括現(xiàn)行版EP和USP)要求銀杏葉提取物中總銀杏酸的含量不得 大于5mg/kg,現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2015年版要求銀杏葉提取物中含總銀杏酸不得過10mg/kg, 舒血寧注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)總銀杏酸的限量已與國(guó)際接軌。控制總銀杏酸的含量即可 降低不良反應(yīng)的發(fā)生,提高產(chǎn)品安生性。總銀杏酸是公認(rèn)的致敏物質(zhì),總銀杏酸的去除,可 使舒血寧注射液產(chǎn)品質(zhì)量上升一個(gè)新臺(tái)階。
[0006] 中國(guó)專利200710098492. 2 (名稱:一種銀杏葉提取液/物的制備方法)公開了一 種銀杏葉提取液/物的制備方法。該發(fā)明采用乙醇加熱回流提取和大孔樹脂柱純化對(duì)銀杏 葉進(jìn)行處理,從而獲得銀杏葉提取液/物。該發(fā)明提供的技術(shù)方案雖然能夠制得符合質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)要求的銀杏葉提取液/物,但其所得銀杏葉提取液/物中仍然存在有銀杏酸,而且在大 孔樹脂柱純化過程中使用了高濃度的乙醇(60~80%),造成了資源的浪費(fèi)。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的目的在于,提供一種銀杏葉提取物的制備方法。
[0009] 為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的:一種銀杏葉提取物的制備方 法,包括如下步驟: (1)取銀杏葉飲片粉碎,加入銀杏葉重量10倍(v/w)的60~75%乙醇浸泡2~3小 時(shí),60~70°C加熱回流提取2~3小時(shí),過濾,得藥渣和提取液; (2) 向步驟(1)所得藥渣中加入銀杏葉重量8倍(v/w)的60~75%乙醇,60~70°C加 熱回流提取1~2小時(shí),過濾,得藥渣和提取液; (3) 將步驟⑴和⑵所得提取液合并,當(dāng)溫度降至30~40°C時(shí),用20% NaOH溶液調(diào) 節(jié)pH至7. 9~8. 1,冷藏放置12~72小時(shí),過濾,濾液于60~70°C濃縮回收乙醇,并濃縮 至1~3g銀杏葉/mL,加純化水至銀杏葉重量的10倍(v/w),在溫度小于40°C時(shí)用HCl調(diào) pH至2. 0~3. 0,在10~15°C的條件下靜置2~8小時(shí),過濾至濾液澄清,所述濾液濃縮至 近紅外光譜儀在線檢測(cè)總黃酮醇苷含量大于5mg/mL,得濃縮物; ⑷①將步驟⑶所得濃縮物以I. 〇~I. 6BV/h的流速加入到大孔樹脂柱中,用1~ 3BV的純化水以1. 2~2. 5BV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱; ② 用2~4BV的10%的乙酸鈉溶液以I. 0~4. OBV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱; ③ 用純化水以I. 0~3. OBV/h的流速將大孔樹脂柱沖洗至中性; ④ 用1~3BV的25%乙醇以I. 0~3. OBV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱; ⑤ 用2~6BV的30~60%乙醇以I. 0~2. OBV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱,收集洗脫液, 得到銀杏葉提取物,所述銀杏葉提取物經(jīng)檢測(cè)不含總銀杏酸。
[0010] 作為優(yōu)選地,所述制備方法還包括以下步驟:將步驟(4)所得銀杏葉提取物過濾, 濾液于60~70°C濃縮回收乙醇至無醇味,并濃縮至4g銀杏葉/mL,再加入乙醇使含醇量達(dá) 到80%,用10%Na0H調(diào)pH至7. 9~8. 1,靜置12~36小時(shí),取上清液過濾,濾液濃縮回收乙 醇至無醇味,濃縮物加注射用水稀釋至總黃酮醇苷的含量為0. 90~I. 10mg/mL、銀杏內(nèi)酯A 的含量為〇. 06~0. 90mg/mL、銀杏內(nèi)酯B的含量為0. 04~0. 60mg/mL、銀杏內(nèi)酯C的含量 為0· 04~0· 50mg/mL,用HCl調(diào)pH至2. 0~3. 0,過濾,濾液灌裝于容器中,115°C、30分鐘 滅菌,冷凍,緩化,過濾,濾液用40%Na0H溶液調(diào)pH 5. 7~6. 0,混勻,待溫度下降至50 °C以 下,過濾,濾液灌裝于容器中,經(jīng)115°C、30分鐘滅菌。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地,在濃縮物加注射用水稀釋的過程中使用近紅外光譜儀進(jìn)行在線檢 測(cè)。
[0012] 優(yōu)選地,步驟(4)中大孔樹脂柱的洗脫液流出口安裝有近紅外光譜儀的樣品流通 池,所述洗脫液從樣品流通池流過而被近紅外光譜儀在線檢測(cè)。
[0013] 優(yōu)選地,步驟(4)中第⑤步為用5BV的40%乙醇以L 0~2. 0BV/h的流速?zèng)_洗大 孔樹脂柱,收集洗脫液,所得洗脫液經(jīng)檢測(cè)不含總銀杏酸。
[0014] 優(yōu)選地,步驟(3)中冷藏放置時(shí)間為24~48小時(shí)。
[0015] 優(yōu)選地,步驟(3)中所述過濾為采用3層中速濾紙過濾。
[0016] 優(yōu)選地,步驟(5)中所述過濾為采用0· 45~0· 80 μ m微孔濾膜過濾。
[0017] 本發(fā)明中所述濃縮為真空旋轉(zhuǎn)濃縮。
[0018] 作為優(yōu)選地,本發(fā)明中所述濃縮還可以為真空刮板濃縮。
[0019] 在本發(fā)明提供的制備方法中,使用了近紅外光譜儀對(duì)銀杏葉提取物進(jìn)行實(shí)時(shí)、多 組分的在線分析檢測(cè)。因近紅外光譜法檢測(cè)不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理,因此其不消耗樣品, 也不需要其它試劑,檢測(cè)過程中無污染,安全性好。近紅外光譜法實(shí)時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果,保證 了銀杏葉提取物制備過程的連續(xù)性,節(jié)約了時(shí)間。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明提供的技術(shù)方案其優(yōu)點(diǎn)在于:有效地去除了有害成分總銀 杏酸,降低了類過敏反應(yīng)的發(fā)生,提高了安全性;提高目標(biāo)成分純度,提高產(chǎn)品質(zhì)量;實(shí)現(xiàn) 了自動(dòng)在線檢測(cè)。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)闡述,所述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案進(jìn)行解釋和說明,而不是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行限制。
[0023] 實(shí)施例1 (1) 取銀杏葉飲片lkg,粉碎,過8目篩,加入銀杏葉重量10倍(v/w)的70%乙醇浸泡 2小時(shí),70°C加熱回流提取2小時(shí),采用3層中速濾紙過濾,得藥渣和取液; (2) 向步驟(1)所得藥渣中加入銀杏葉重量8倍(v/w)的70%乙醇,70°C加熱回流提取 2小時(shí),用3層中速濾紙過濾,得藥渣和提取液; (3) 將步驟⑴和⑵所得提取液合并,當(dāng)溫度降至30°C時(shí),用20% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至7. 9,用3層中速濾紙過濾,濾液于70°C真空旋轉(zhuǎn)濃縮回收乙醇,并濃縮至Ig銀杏葉/mL, 加純化水至銀杏葉重量的10倍(v/w),在35°C時(shí)用HCl調(diào)節(jié)pH至2. 0,在10~15°C的條 件下靜置2小時(shí),用3層中速濾紙過濾至濾液澄清,濾液于65°C真空旋轉(zhuǎn)濃縮至近紅外光譜 在線檢測(cè)總黃酮醇苷含量大于5mg/mL ; (4) 將步驟(3)中的濃縮物以I. 2BV/h的流速加入到大孔樹脂柱中,用IBV的純化水 以I. 3BV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱,收集洗脫液,記作樣1 ;用2BV的10%的乙酸鈉溶液以 1.0 BV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱,收集洗脫液,記作樣2 ;用純化水以1.0 BV/h的流速將大孔 樹脂柱沖洗至中性,收集洗脫液,記作樣3 ;用I. 5BV的25%乙醇以I. 2BV/h的流速?zèng)_洗大 孔樹脂柱,收集洗脫液,記作樣4 ;用6BV的30%乙醇以1.0 BV/h的流速?zèng)_洗大孔樹脂柱,收 集洗脫液,記作樣5。所述洗脫液經(jīng)近紅外光譜儀的樣品流通池進(jìn)入收集瓶中,紅外光譜儀 對(duì)流經(jīng)流通池的樣品進(jìn)行在線檢測(cè),所述樣5為低雜質(zhì)的銀杏葉提取物; (5) 將所述銀杏葉提取物用0. 80 μ m微孔濾膜過濾后,70°C真空旋轉(zhuǎn)濃縮回收乙醇至 無醇味,并濃縮至4g銀杏葉/mL,再加入乙醇使含醇量達(dá)到80%,用10%Na0H調(diào)pH至7. 9,靜 置24h,取上清液0. 65 μ m微孔濾膜過濾,濾液于65°C真空旋轉(zhuǎn)濃縮回收乙醇至無醇味,濃 縮物加注射用水稀釋至經(jīng)近紅外光譜儀在線檢測(cè):總黃酮醇苷含量為0. 90~I. 10mg/mL、 銀杏內(nèi)酯A的含量為0. 06~0. 90mg/mL、銀杏內(nèi)酯B的含量為0. 04~0. 60mg/mL、銀杏內(nèi) 酯C的含量為0· 04~0· 50mg/mL,用HCl調(diào)pH至2. 0,用0· 45 μ m微孔濾膜過濾后,灌裝于 適宜的容器中,115 °C、30分鐘滅菌,冷凍,緩化,用0. 45 μ m微孔濾膜過濾,濾液用40 % NaOH 溶液調(diào)PH至5. 7,混勻,待溫度下降至50°C以下,0. 45 μ m微孔濾膜過濾,灌裝于適宜容器 中,經(jīng)115°C、30分鐘滅菌。
[0024] 實(shí)施例2 (1) 取銀杏葉飲片lkg,