一種純種發(fā)酵制備六神曲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域和中藥材生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種采用單一菌株一一產(chǎn) 黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)純種發(fā)酵制備中藥六神曲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 六神曲（Medicated Leaven Massa)又名神曲、六曲，是常用的消食類藥物之一，是 由青蒿、蒼耳草、辣寥自然汁拌以苦杏仁粉、赤小豆粉、麥麩及面粉，按比例混合，在適宜條 件下發(fā)酵而成，是傳統(tǒng)發(fā)酵曲劑中應用最廣泛的一種。六神曲味甘、辛，性溫，歸脾、胃經(jīng)；具 有消食健胃、和中止瀉之功效。
[0003] 傳統(tǒng)制備六神曲的工藝是在自然條件下，在特定的季節(jié)，利用天然存在的微生物 菌種進行發(fā)酵，由于全國各地發(fā)酵環(huán)境不同，發(fā)酵季節(jié)時令的差異，造成不同產(chǎn)地產(chǎn)品或相 同產(chǎn)地不同批次的產(chǎn)品差異較大，或者引入雜菌如黃曲霉毒素，而嚴重影響六神曲的使用 安全。因此，規(guī)范六神曲發(fā)酵方法具有重要意義。
[0004] 本課題組先期從傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的六神曲中分離得到有效的發(fā)酵菌株，并首次對其 進行了微生物學鑒定，確定為：產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)，并將其應用于純 種發(fā)酵制備六神曲的中藥材生產(chǎn)中。此方法減少了雜菌污染，產(chǎn)品工藝可控、質(zhì)量可控，操 作簡單，六神曲療效得以保證，為規(guī)范六神曲發(fā)酵工藝提供科學依據(jù)，并且在生產(chǎn)中提高經(jīng) 濟效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供一種六神曲純種發(fā)酵的菌株，為：產(chǎn)黃青霉菌 (Penicillium chrysogenum)〇
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供一種采用純種發(fā)酵制備六神曲的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是提供一種以產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)為發(fā)酵 菌種，純種發(fā)酵制備六神曲的方法。
[0008] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明提供的適用于純種發(fā)酵制備六神曲的產(chǎn)黃青霉菌菌株來源于以下方法：
[0010] 1、采用平板劃線法和菌絲頂端純化法從傳統(tǒng)發(fā)酵六神曲分離得到3株真菌， 使用生物顯微鏡進行顯微形態(tài)學鑒定，DNA測序進行分子生物學鑒定，確定3株真菌分 別為曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)，青霉屬真菌產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)以及枝抱屬真菌枝抱霉菌（Cladosporium cladosporioides) 〇
[0011] 真菌的鑒定
[0012] 采用真菌鑒定通用引物ITS4與ITS5,對六神曲中分離的真菌基因組DNA進行序列 擴增。
[0013] 50 μ L反應體系如下：
[0014]
[0015] 循環(huán)參數(shù)設定：
[0016] 95°(：預變性5!1^11，95°(：變性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸11^11，30個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin。
[0017] 反應結(jié)束后，取擴增后產(chǎn)物5 μ L，經(jīng)電場強度為5V/cm，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電 泳時間1小時，在紫外燈下檢測目的條帶與預期是否相符。
[0018] 將PCR擴增出來的目的基因片斷測序，所測得序列提交至NCBI，與Gene Bank數(shù) 據(jù)庫中已知基因序列進行Blast對比，選取相似性大于99%，且種屬地位明確的序列，應用 Clustal XI. 83進行多序列對比，同時使用軟件MEGA5. 0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。此菌有鑒定意義 的序列是 FJ176474. 1、JF440603. UAM948960. 1 以及 JF834167. 1，其中與 JF834167. 1 同源 性最高（Blast 的 Max ident 為 100% )。
[0019]
[0020] 此外，微生物鑒定委托中國科學院微生物研究所進行進一步檢驗鑒定，并出具鑒 定報告，報告編號：（2013)微檢字第240號，鑒定結(jié)論為：在本實驗室條件下，根據(jù)送檢結(jié)果 的培養(yǎng)特征、顯微特征以及rRNA基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，送檢菌種（菌株編號：SQ2) 的鑒定結(jié)果為：產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)。
[0021] 2、以單一菌株發(fā)酵替代六神曲原有自然發(fā)酵，觀察發(fā)酵后的氣味及外觀性狀，其 中產(chǎn)黃青霉菌發(fā)酵的六神曲氣味純香，表面黃衣出現(xiàn)與傳統(tǒng)發(fā)酵一致；枝孢霉菌發(fā)酵六神 曲產(chǎn)生霉腐氣味，曲塊表面暗灰褐色與傳統(tǒng)發(fā)酵差別大，推測枝孢霉菌為六神曲發(fā)酵中產(chǎn) 生的雜菌，而產(chǎn)黃青霉菌為適合六神曲純種發(fā)酵的有效菌種。
[0022] 3、考察產(chǎn)黃青霉菌發(fā)酵六神曲95%乙醇提取物對8種腸道致病菌的抑制作用，結(jié) 果表明，產(chǎn)黃青霉菌六神曲提取物對腸道致病菌具有顯著抑制作用。通過ELISA試劑盒檢 測米曲霉菌及產(chǎn)黃青霉菌六神曲中黃曲霉毒素 Bl含量，得米曲霉菌發(fā)酵六神曲中黃曲霉 毒素 Bl含量為14. 25 μ g/kg，含量超標；產(chǎn)黃青霉菌發(fā)酵六神曲中黃曲霉毒素 Bl含量為 1. 63 μ g/kg，符合含量限制要求。
[0023] -種純種發(fā)酵制備六神曲的方法，其特征在于以單一發(fā)酵菌種，以六種原料包括： 面粉（和或麥麩）、赤小豆、苦杏仁、青蒿、辣寥、蒼耳草制成培養(yǎng)基，在適宜的條件下，發(fā)酵 而成六神曲藥材。
[0024] -種用于純種發(fā)酵制備六神曲的微生物菌種，其特征在于所述菌株為產(chǎn)黃青霉菌 (Penicillium chrysogenum)〇
[0025] -種以產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)為發(fā)酵菌種，純種發(fā)酵制備六神 曲的方法。
[0026] -種以產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)純種發(fā)酵制備六神曲的方法，其 特征在于如下步驟：
[0027] 稱取一定量的青蒿、蒼耳草及辣寥制汁，用作制取發(fā)酵軟材的粘合劑；稱取麥 麩、面粉，二者的配比為1 : 5~5 : 1，加入占麥麩和面粉混合物重量比3~7%的苦 杏仁粉，再加入占麥麩和面粉混合物重量比3~7%的赤小豆粉，以上材料混合均勻共同 組成發(fā)酵所需的固體培養(yǎng)基，提供發(fā)酵所需的碳源、氮源；將產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)菌種按每100g混合固體培養(yǎng)基加入1~5g菌種的比例拌入固體培養(yǎng)基中， 混合均勻制成軟材，再制成曲塊，置于28~32°C恒溫條件下，濕度70~80%，培養(yǎng)5~10 天，至表面遍布黃衣，停止發(fā)酵，取出，切成約Icm 3大小的曲塊，烘干，即得純種發(fā)酵的六神 曲。
[0028] 本發(fā)明中六神曲的制備方法，與現(xiàn)市售六神曲的制備存在明顯不同。本方法采用 直接發(fā)酵法，將青蒿、蒼耳及辣寥水制汁后，置于面粉和（或）麥麩、苦杏仁粉及赤小豆粉混 合制成的培養(yǎng)基中，將通過生物技術(shù)分離得到的產(chǎn)黃青霉菌接種后進行發(fā)酵，規(guī)定了確切 的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度，減少了雜菌污染，簡化了操作。該方法所制備的六神曲保存了傳統(tǒng) 六神曲的特色，改進了傳統(tǒng)發(fā)酵的不足，新法的發(fā)酵品可以更好地發(fā)揮藥效，對常見人體致 病菌具有顯著地抑菌、殺菌活性，而發(fā)揮消食作用，而且該方法適合工業(yè)化的大生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1為黃曲霉毒素 Bl的標準曲線。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0031 ] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技 術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0032] 實施例一：產(chǎn)黃青霉菌實驗室發(fā)酵制備六神曲
[0033] 稱取干青蒿、干蒼耳、干辣寥各25g，加入10倍量，8倍量，6倍量蒸餾水煎煮三次， 每次40min，合并水煎液，濃縮至250mL，轉(zhuǎn)移至500mL滅菌錐形瓶中，密封，置于潔凈工作 臺中放涼，備用。
[0034] 稱取麥麩500g、面粉500g、苦杏仁粉和赤小豆粉各40g，盛裝于1000 mL燒杯中， 將八層紗布置于牛皮紙中間，密封燒杯口，于103. 4kPa、121. 3°C，高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌 20min，滅菌結(jié)束后立即取出，轉(zhuǎn)移至潔凈工作臺中放涼，備用。
[0035] 將以上處理過的藥汁及20g產(chǎn)黃青霉菌體拌入無菌培養(yǎng)基中，混合均勻，制成直 徑約12cm，厚度約Icm圓餅狀，盛裝于滅菌后的18cm 口徑培養(yǎng)皿中，倒置于28°C恒溫箱中， 相對濕度為70 %，培養(yǎng)7天，至有黃衣出現(xiàn)，停止發(fā)酵，取出，切成約I cm3大小曲塊，烘干，收 取貯存，注意防蟲蛀。
[0036] 實施例二：產(chǎn)黃青霉菌生產(chǎn)制備六神曲
[0037] 稱取新鮮的青蒿、蒼耳、辣寥各5kg，榨取鮮汁，作為粘合劑備用。
[0038] 稱取麥麩30kg、面粉20kg、苦杏仁粉和赤小豆粉各2kg，將以上處理過的鮮汁及 100g產(chǎn)黃青