一種幽門螺旋桿菌四價(jià)黏附因子多表位疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及到一種新型幽門螺旋桿菌四價(jià)黏附因子多表 位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp)的感染呈全球分布，它與慢性胃炎、消 化性胃潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤（MALT)等胃部疾病相關(guān)，被世界衛(wèi)生組織歸為 I類致癌因子。在不同國(guó)家之間和同一國(guó)家不同地區(qū)之間，甚至不同民族之間，Hp感染率存 在明顯差異，在發(fā)達(dá)國(guó)家Hp感染率為30 % -50 %，我國(guó)屬于世界上感染率較高的地區(qū)，感染 率高達(dá)58. 07%，且呈現(xiàn)明顯的家庭聚集現(xiàn)象。目前Hp感染的治療主要基于抗生素藥物療 法，雖然在臨床中已被證明是一種根除Hp感染的有效方法，但抗生素藥物療法存在諸多弊 端：（1)服用藥物劑量較大和治療周期較長(zhǎng)，病人的依從性較差。（2)抗生素藥物療法存在 毒副作用。（3)抗生素藥物療法導(dǎo)致Hp耐藥性增強(qiáng)。（4)抗生素藥物療法治療后難以避免 Hp的重復(fù)感染。（5)抗生素藥物療法主要是針對(duì)有癥狀的病人，而無(wú)癥狀的病人仍可能發(fā) 展為嚴(yán)重的Hp感染性相關(guān)胃病。因此，研制有效的預(yù)防性或治療性Hp疫苗，既可誘發(fā)特異 性免疫應(yīng)答預(yù)防或根除Hp感染，毒副作用少，又可避免Hp的重復(fù)感染，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者競(jìng) 相研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0003] 幽門螺旋桿菌對(duì)胃粘膜屏障的破壞作用主要涉及二種關(guān)鍵因子：（1)黏附因子 (黏附素）：主要指Hp表面的一類蛋白質(zhì)。Hp可通過(guò)黏附因子附著在胃黏膜細(xì)胞上，對(duì)Hp 的胃部定植起著重要作用。（2)毒力因子：主要指Hp可直接作用于胃黏膜細(xì)胞的毒力蛋白， 對(duì)胃黏膜細(xì)胞起破壞作用。因此，Hp對(duì)人類胃部的感染，關(guān)鍵的第一步是通過(guò)黏附因子黏 附胃黏膜細(xì)胞，而Hp表面的一些關(guān)鍵黏附因子蛋白，主要有Hp尿素酶、黏附素 HpaA、外膜蛋 白Lpp20、CagL等蛋白。幽門螺旋桿菌含有豐富的尿素酶（Ure)，約占全菌體蛋白的5%~ 10%，在Hp內(nèi)部和表面廣泛表達(dá)，尿素酶由A和B兩個(gè)亞單位（UreA和UreB)組成。一般細(xì) 菌難以在胃部的高酸環(huán)境中存活，但Ure能水解尿素產(chǎn)生氨來(lái)中和胃酸，并可對(duì)胃黏膜造 成病理性損傷。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。幽門螺旋桿菌黏附素 HpaA 是Hp鞭毛鞘膜蛋白，幾乎存在于所有臨床分離的Hp菌株表面，是Hp主要的黏附因子之一， 且氨基酸序列高度保守，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明HpaA是定植的必要因子，是Hp疫苗研制的一種理 想的保護(hù)性抗原。Lpp20是Hp的另一種外膜蛋白，有研究表明，Lpp20具有良好的免疫原性 和免疫保護(hù)性，天然Lpp20蛋白的分離純化比較困難，給制備Lpp20亞單位疫苗帶來(lái)了困 難。CagL為幽門螺桿菌外膜伴侶蛋白的一種，由Hp的細(xì)胞毒素相關(guān)基因毒力島（cagPAI) 編碼并表達(dá)于Hp IV型分泌系統(tǒng)（Type IV secretion system，TFSS)菌毛結(jié)構(gòu)的表面蛋白， 橋聯(lián)TFSS與靶細(xì)胞的特異性黏附，不但能激活整合素依賴的細(xì)胞信號(hào)通路，還具有與纖維 黏連蛋白相似的功能，能直接誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞形成黏著斑、刺激AGS細(xì)胞的擴(kuò)散。
[0004] 本發(fā)明的思路如下：根據(jù)機(jī)體對(duì)Hp的免疫保護(hù)性機(jī)制，合理預(yù)測(cè)和篩選Hp尿素酶 A和B雙亞基、三種外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的優(yōu)勢(shì)Th和B細(xì)胞抗原表位或表位區(qū) 段和分子內(nèi)黏膜佐劑CTB，通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)抗原表位或區(qū)段的連接順序、間隔序列和 多重拷貝數(shù)，加以分析和確定，設(shè)計(jì)出一個(gè)科學(xué)合理、結(jié)構(gòu)新穎的Hp四價(jià)黏附因子多表位 疫苗CFAdE。利用Western Blot、ELISA等多種免疫學(xué)方法檢測(cè)Hp四價(jià)黏附因子多表位疫 苗CFAdE的免疫原性和免疫特異性，研究表明Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE能夠激發(fā) BALB/c小鼠產(chǎn)生針對(duì)Hp尿素酶A和B雙亞基、三種外膜蛋白（Lpp20、HpaA、CagL)的T細(xì) 胞免疫應(yīng)答和高滴度特異性抗體，具有很好的免疫原性和免疫特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種可針對(duì)Hp四種關(guān)鍵黏附因子尿素酶、Lpp20、 HpaA和CagL的Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供了 Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是公布了 Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗的用途。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種針對(duì)Hp關(guān)鍵黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和 CagL蛋白的Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE。該Hp多價(jià)表位疫苗主要由黏附因子多表 位肽FAdE和霍亂毒素 B亞基構(gòu)成，黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如（序列3)所示， Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE的整體氨基酸序列如（序列1)所示。
[0009] 本發(fā)明的Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE具有以下優(yōu)點(diǎn)：（I)Hp四價(jià)黏附因子 多表位疫苗CFAdE將尿素酶A和B雙亞基、三種外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的優(yōu)勢(shì)抗 原表位或區(qū)段和黏膜免疫佐劑CTB科學(xué)合理地整合在一起，可激發(fā)針對(duì)Hp尿素酶A和B雙 亞基、三種外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和特異性體液免疫應(yīng)答。（2) Hp尿素酶A和B雙亞基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL蛋白也存在一定的細(xì)胞生物學(xué)毒性， Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有這4種Hp黏附因子的優(yōu)勢(shì)Th和B細(xì)胞抗原表位 或區(qū)段，避免了其生物學(xué)毒性，且能夠激發(fā)針對(duì)這4種Hp黏附因子的高特異性抗體，具有更 高的免疫特異性，防止交叉反應(yīng)產(chǎn)生的免疫病理性傷害。（3)以Hp尿素酶A和B雙亞基、 外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL等制備Hp四價(jià)亞單位基因工程疫苗，存在重組蛋白過(guò)大，不 易表達(dá)、提取、純化等問(wèn)題，Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有這4種Hp黏附因子的 優(yōu)勢(shì)Th和B細(xì)胞抗原表位或區(qū)段，相對(duì)分子量較小，易于表達(dá)、提取及純化。（4) Hp黏附因 子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本發(fā)明的Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE 采取"偶聯(lián)分子內(nèi)免疫佐劑"和"抗原表位多重拷貝"兩種設(shè)計(jì)思路來(lái)增強(qiáng)Hp黏附因子抗 原表位肽的免疫原性，很好地解決了表位疫苗免疫原性普遍較低的缺陷，可誘發(fā)高滴度的 特異性抗體。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗的制備方法，其技術(shù)路 線詳述如下：
[0011] (I)Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
[0012] 根據(jù)機(jī)體對(duì)幽門螺旋桿菌的免疫保護(hù)性機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)軟件合理篩選Hp 尿素酶A和B雙亞基、三種外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的優(yōu)勢(shì)Th和B細(xì)胞抗原表位及 分子內(nèi)黏膜免疫佐劑CTB，并對(duì)抗原表位的連接順序、間隔序列和多重拷貝數(shù)，加以分析和 確定，設(shè)計(jì)出一個(gè)科學(xué)合理、結(jié)構(gòu)新穎的Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE。
[0013] (2)重組表達(dá)質(zhì)粒pCznl-CFAdE (含有融合基因 CFAdE)的構(gòu)建
[0014] 首先構(gòu)建一個(gè)含有霍亂毒素 B亞基（CTB)基因的重組表達(dá)載體pCznl-C ;然后通 過(guò)基因合成技術(shù)合成一個(gè)黏附因子多表位肽FAdE (含有Hp尿素酶A和B雙亞基、外膜蛋 白Lpp20、HpaA和CagL的優(yōu)勢(shì)抗原表位或區(qū)段）的核苷酸序列，并將其插入重組表達(dá)載體 pCznl-C中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCznl-CFAdE。
[0015] (3)重組蛋白CFAdE的原核表達(dá)及純化
[0016] 將重組表達(dá)載體pCznl-CFAdE轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Arctic Express中，構(gòu)建重組基因 工程菌株Arctic Express/pCznl-CFAdE。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)Ni-NTP鎳離子親和 層析能夠獲得高純度融合蛋白CFAdE，即為Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE。
[0017] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供了 Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE的用途。Hp四 價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE可用于預(yù)防和治療幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖I :Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)。
[0019] 圖2 :重組表達(dá)載體pCznl-CFAdE的雙酶切鑒定。
[0020] 泳道 M :DNAMarker ;泳道 I :pCznl_CFAdE/Nde I+Hind III ;泳道 2 :酶切前質(zhì)粒。
[0021] 圖3 :重組蛋白CFAdE的原核表達(dá)。
[0022] 泳道 M :蛋白質(zhì) Marker ;泳道 I :Arctic Express/pCznl-CFAdE 全菌蛋白（未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)）；泳道 2:Arctic Express/pCznl-CFAdE全菌蛋白（經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) Ih);泳道 3:Arctic Express/pCznl-CFAdE 全菌蛋白（經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) 2h);泳道 4:Arctic Express/ pCznl-CFAdE 包涵體蛋白（經(jīng) IPTG誘導(dǎo) 4h);泳道 5 :Arctic Express/pCznl-CFAdE 可溶性 蛋白（經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h)。
[0023] 圖4 :重組蛋白CFAdE的Ni-NTA親和層析純化。
[0024] 泳道M :蛋白質(zhì)Marker ;泳道I :CFAdE包涵體蛋白（上樣蛋白）；泳道2 :雜蛋白； 泳道3 :純化后的CFAdE蛋白樣品。
[0025] 圖5 :Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE誘發(fā)抗天然Hp尿素酶（Ure)抗體的檢 測(cè)。
[0026] Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE和天然Hp尿素酶都能誘發(fā)較高滴度抗尿素酶 抗體。
[0027] 圖6 :Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE誘發(fā)抗UreA抗體的檢測(cè)。
[0028] Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE和Hp尿素酶都能誘發(fā)較高滴度的抗UreA抗 體。
[0029] 圖7 :Hp四價(jià)黏附因子多表位疫苗CFAdE誘