專利名稱：Notch蛋白及其配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在T-細(xì)胞活化的修飾中治療化合物的應(yīng)用。尤其涉及在調(diào)節(jié)Notch蛋白家族成員和它們配件之間相互作用的應(yīng)用以及在治療狀態(tài)如移植排斥、自身免疫、過敏反應(yīng)、哮喘、感染疾病和腫瘤下這些化合物的應(yīng)用。
T細(xì)胞之間以及抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞之間的控制的相互作用對人免疫系統(tǒng)的功能是至關(guān)重要的。然而在某些病理狀態(tài)下，對這個相互作用的正或負(fù)的修飾在治療上有益。例如在狀態(tài)如自身免疫、過敏反應(yīng)或移植排斥下，通過促進(jìn)負(fù)T細(xì)胞或T細(xì)胞-APC的相互作用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的下調(diào)是合乎需要的?！案腥灸褪堋焙汀敖Y(jié)合抑制”的模型表明在少數(shù)T細(xì)胞中可以誘導(dǎo)耐受，然后這些T細(xì)胞將此耐受傳遞給其它T細(xì)胞，從而防止了有效的免疫攻擊。在其它病理條件下如腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制、寄生的病毒或細(xì)菌感染，免疫抑制是一個普遍特征。在這些條件下，抑制傳遞感染耐受的T細(xì)胞相互作用是合乎需要的。
然而，至今還未理解T細(xì)胞以及T細(xì)胞-APC相互作用的機(jī)制。
WO 92/19734公開了人Notch和Delta基因的核苷酸序列以及它們所編碼蛋白的氨基酸序列。此公開內(nèi)容表明Notch基因家族其良好特征在于作為糾正昆蟲如果蠅屬的胚胎細(xì)胞譜系發(fā)育是必不可少的。
屬于Notch家族的蛋白是轉(zhuǎn)膜受體，具有7個保守肽結(jié)構(gòu)域。家族中的每一蛋白表現(xiàn)特征性的細(xì)胞外EGF(表皮生長因子)樣的重復(fù)以及近膜Lin-12/Notch結(jié)構(gòu)域。此外每種蛋白在細(xì)胞質(zhì)尾部具6-8錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域與PEST序列在一起。Notch配體具有鑒別DSL結(jié)構(gòu)域(D，Delta，S，Serrate，L.Lag2)，在細(xì)胞外表面蛋白氨基端與3-8 EFF一樣重復(fù)之間包含20-22個氨基酸。蛋白有不具有保守功能結(jié)構(gòu)域的短細(xì)胞質(zhì)尾巴。
近來證據(jù)表明Notch信號在胸腺中作用于未成熟T細(xì)胞的譜系定型，偏向胸腺細(xì)胞向CD8+譜系的發(fā)育，CD8+譜系是獨立于MHC識別的(Robey E，等.細(xì)胞1996，87483-492)。在胸腺成熟的過程中，T細(xì)胞獲取了分辨自身抗原和非自身抗原的能力，此過程稱作自我耐受(von Boehmer H，等，免疫學(xué)年度評論，1990；8531)。在周邊也存在誘導(dǎo)和維持耐受的機(jī)制，在許多方面它們的重要性被低估。許多移植排斥、自身免疫疾病和對過敏原特異反應(yīng)的實驗?zāi)Ｐ颓宄乇砻髟诳乖庖叩氖荏w中誘導(dǎo)特異的無應(yīng)答狀態(tài)(耐受或過敏)的能力。從這些系統(tǒng)中產(chǎn)生兩個重要的發(fā)現(xiàn)。首先，在選擇的條件下用抗原的肽片段免疫不僅可以抑制對本身的特異反應(yīng)。而且可以抑制具有相同分子其它區(qū)域的完整蛋白激發(fā)免疫的特異反應(yīng)。(結(jié)合抑制；Hoyne GF，等，實驗醫(yī)學(xué)雜志1993；178183和Metzler B，Wraith DC，國際免疫學(xué)1993；51159)。其次，在移植實驗?zāi)Ｐ椭凶詈妹枋龅氖恰案腥灸褪堋爆F(xiàn)象，其中假定對特異抗原產(chǎn)生耐受的免疫活性細(xì)胞能抑制其它細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)一步這些第二細(xì)胞群體變成調(diào)節(jié)和耐受的群體(Qin SX，等，科學(xué)1993；258974)。至今還未發(fā)現(xiàn)這些現(xiàn)象下的免疫機(jī)制的特征。
本發(fā)明是由于發(fā)現(xiàn)了Notch受體家族和其配體而得到的，Delta和Serrate在外周免疫系統(tǒng)正常成體細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)。
因而根據(jù)本發(fā)明提供Notch-配體在用于免疫治療的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
以前并未描述過Notch受體家族以及它們的配體在正常外周成體免疫系統(tǒng)中的表達(dá)方式，但本發(fā)明者已表明T細(xì)胞組成地表達(dá)Notch 1mRNA，而Delta的表達(dá)只限于外周淋巴組織中T細(xì)胞的一個亞群。Serrate的表達(dá)好象限制于外周中抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的一個亞群(

圖1)。因而如在其它組織中所表明的那樣這受體配體家族在胚胎發(fā)育之后可以繼續(xù)在免疫系統(tǒng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)決定(Ellisen LW，等，細(xì)胞1991；66649)。Notch信號可以在外周無應(yīng)答性(耐受或過敏)的誘導(dǎo)中具有核心作用，并可以對結(jié)合抑制和感染耐受提供物理解釋。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在治療T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)中Notch-配體的應(yīng)用。已觀察到在過敏原或抗原存在時通過將原初T細(xì)胞群體暴露給APC所表達(dá)的Notch-配體，Notch-配體能使T細(xì)胞群體對所述過敏原或抗原產(chǎn)生耐受。進(jìn)一步，此T細(xì)胞群體，繼續(xù)暴露于天然T細(xì)胞的第二群體時能夠使第二個群體對所述過敏原或抗原產(chǎn)生耐受。
這樣，本發(fā)明也涉及在影響結(jié)合耐受和/或旁觀者耐受(在本領(lǐng)域中也已知為感染耐受)中的Notch-配體的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及Notch-配體在功能性Notch-蛋白表達(dá)或Notch信號通路的調(diào)控中的應(yīng)用。
在上面描述的本發(fā)明實施方案中，在過敏原或抗原存在下，通過將T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(APCs)孵育/混合，將Notch配體暴露給T細(xì)胞，表達(dá)或過表達(dá)Notch-配體。通過用能表達(dá)Notch-配體的基因轉(zhuǎn)染APCs或通過將APCs暴露給能上調(diào)內(nèi)源Notch-配體基因表達(dá)的藥物，可引起Notch-配體基因的(過)表達(dá)。
影響Notch-配體表達(dá)的合適藥物包括影響Delta和/或Serrate基因表達(dá)的藥物。例如對于Delta的表達(dá)，細(xì)胞外BMPs(骨形態(tài)發(fā)生蛋白，Wilson，P.A和Hemmati-Brivanlou A.1997神經(jīng)元18699-710，Hemmati-Brivanlou，A和Melton，D，1997細(xì)胞8813-17)和它們受體的結(jié)合由于抑制了Achaete/Scute復(fù)合轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)導(dǎo)致了Delta轉(zhuǎn)錄的下調(diào)。我們認(rèn)為此復(fù)合物直接參與了Delta表達(dá)的調(diào)控。這樣任何抑制BMPs和它們的受體結(jié)合的藥物都能造成Delta和/或Serrate表達(dá)的增加。這些藥物包括頭蛋白、Chordin、Folhstatin、Xnr3、FGFs、Fringe以及其衍生物和變異體(見參考文獻(xiàn)，頭蛋白-Smith W.C.和Harland，R.M細(xì)胞70829-840，Chordin-Sasai，Yet等，1994細(xì)胞79779-790)。頭蛋白和Chordin與BMPs的結(jié)合，因而防止了它們信號級聯(lián)的活化，此信號級聯(lián)導(dǎo)致Delta轉(zhuǎn)錄的下降。
在某些疾病狀態(tài)，機(jī)體可以是無免疫應(yīng)答的，為了克服強(qiáng)加的免疫抑制下調(diào)Delta和/或Serrate的表達(dá)是合乎需要的。在此條件下可以使用抑制Delta和/或Serrate表達(dá)的藥物。抑制Delta和/或Serrate表達(dá)的藥物的例子包括Toll蛋白(Medzhitov，R.等，1997自然388394-397)、BMPs以及降低或干擾頭蛋白、Chordin、Follistatin、Xnr3、FGFs和Fringe合成的其它藥物。這樣，本發(fā)明進(jìn)一步涉及在用于逆轉(zhuǎn)細(xì)菌感染或腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制的藥物生產(chǎn)中使用能下降Delta或Serrate蛋白表達(dá)的藥物。
如上面所討論的，本發(fā)明也涉及在細(xì)胞膜上或信號通路中Notch-蛋白表達(dá)或呈遞的修飾。已表明這些參與T-細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，而此反應(yīng)參與耐受(結(jié)合的和/或旁觀者)的誘導(dǎo)。加強(qiáng)完整功能的Notch-蛋白在細(xì)胞表面呈遞的藥物包括基質(zhì)金屬蛋白酶，例如果蠅屬Kuzbanian基因的產(chǎn)物(Dkuz，Pan，D和Rubin，G.M.1997細(xì)胞90271-280)和其它ADAMALYSIN基因家族成員。降低或干擾它們作為完整功能細(xì)胞膜蛋白呈遞的藥物可以包括MMP抑制劑，如hydroxymate抑制劑。
如此處所用的術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞等”，并不意味著限于APCs。技術(shù)人員將理解為可以使用任何將所需要Notch-配體呈遞給T細(xì)胞的載體，為了方便用術(shù)語APCs指所有這些。這樣合適的APCs的例子包括樹突細(xì)胞、L細(xì)胞、雜交瘤、淋巴瘤、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞或合成的APCs如脂膜。
當(dāng)APCs用能表達(dá)Notch-配體的基因轉(zhuǎn)染時，通過病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒，或通過能將基因傳遞給細(xì)胞的任何其它載體或方法可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這包括在基因治療中有效的任何載體或方法，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體、電穿孔、其它病毒如腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、牛痘、磷酸鈣沉淀DNA、DEAE葡聚糖幫助的轉(zhuǎn)染、微注射、聚乙二醇、蛋白-DNA復(fù)合物。
單獨或聯(lián)合使用這些載體或方法，有可能定點將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的特異群體，這樣能夠體內(nèi)執(zhí)行本發(fā)明的方法。例如，為了提高DNA吸收的效率病毒可以和脂質(zhì)體聯(lián)合使用。通過在病毒外殼或脂質(zhì)體中加入特異的蛋白(如和樹突細(xì)胞/巨噬細(xì)胞CD11c反應(yīng)的單鏈抗體)可以獲得點特異的傳遞。
優(yōu)選使用這樣的構(gòu)建物，通過此構(gòu)建物基因(如serrate)的表達(dá)和抗原的表達(dá)相結(jié)合。(過)表達(dá)Serrate的APCs因而也表達(dá)高水平的相關(guān)抗原，所以優(yōu)先和具有合適特異性的T細(xì)胞相互作用。
本發(fā)明另一個實施方案涉及一個分子，它包含和T細(xì)胞過敏原或抗原部分可操作連接的Notch-配體部分，這樣一旦暴露給T細(xì)胞，兩部分都能和其各自位點結(jié)合。這個分子能使抗原/過敏原特異的T細(xì)胞對抗原或過敏原部分所依據(jù)的抗原或過敏原產(chǎn)生耐受，因為Notch-配體部分所需的特異性由過敏原或抗體部分的極近端提供。
抗原或過敏原部分可以是合成的MHC-肽復(fù)合物。這是帶有抗原溝的MHC分子的一個片段，而抗原溝帶有抗原的元件。此復(fù)合物已在Altman JD等，科學(xué)1996 27494-6中描述過。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，化合物是融合蛋白，包含Notch的區(qū)段或Notch配體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白Fc區(qū)段，優(yōu)選IgGFc或IgMFc。
在上面描述的所有本發(fā)明的實施方案中，優(yōu)選Notch-配體是Serrate家族蛋白或Delta家族蛋白、其衍生物、片段或類似物。
可以描述為由T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或感染狀態(tài)包括下面的任一個或更多哮喘、過敏反應(yīng)、移植排斥、自身免疫、腫瘤誘導(dǎo)的對T細(xì)胞系統(tǒng)的異常(abberations)以及感染疾病如由瘧原蟲屬、微絲蚴屬、蠕蟲、分枝桿菌、HIV、巨細(xì)胞病毒、假單胞桿菌屬、弓形蟲屬、棘球?qū)?、流感嗜血桿菌B型、麻疹、丙型肝炎或Toxicara所引起的疾病。這樣使用合適的過敏原或抗原，按照本發(fā)明，Notch-配體可用以治療所述疾病或感染。
本發(fā)明也提供用于檢測由侵入有機(jī)體誘導(dǎo)的免疫抑制的方法。這些有機(jī)體可以產(chǎn)生Serrate、Notch和/或Delta家族成員的可溶形式或其衍生物、或者體內(nèi)影響它們表達(dá)的蛋白，這樣誘導(dǎo)了感染耐受免疫抑制。此方法包括檢測體內(nèi)非膜結(jié)合的Serrate、Delta、Notch或其衍生物的存在，并優(yōu)選包括對Serrate、Delta或Notch或其衍生物的抗體。
在檢測增加或降低的Notch、Delta/Serrate表達(dá)和/或加工的篩選實驗中所使用的方法包括1.在培養(yǎng)中將分離的細(xì)胞暴露給檢測化合物后用以下評估Delta/Serrate、Notch和Fringe的表達(dá)(a)在蛋白水平，使用免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)通過特異抗體染色。
(b)在RNA水平，通過定量的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。使用對Notch 1和Notch 2、Serrate 1和Serrate 2、Delta 1和Delta 2、Delta 3和Fringe特異的引物RT-PCR使用有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的對照質(zhì)粒檢測內(nèi)源基團(tuán)的表達(dá)。當(dāng)新配體要鑒定時可以修改此構(gòu)建物。
(c)在功能水平，用細(xì)胞粘著試驗。
增加的Delta/Serrate或Notch表達(dá)會導(dǎo)致表達(dá)Notch的細(xì)胞和其配體Delta/Serrate之間粘著的增加。檢測細(xì)胞在培養(yǎng)中將經(jīng)過特定處理，并在上面鋪上放射標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的靶細(xì)胞(用Notch/Delta/Serrate蛋白轉(zhuǎn)染的)。細(xì)胞混合物將于37℃培養(yǎng)2小時。沖掉非粘著細(xì)胞，在平板表達(dá)通過放射活性/免疫熒光水平測量粘著水平。
使用此方法有可能檢測影響Notch-蛋白或Notch-配體表達(dá)或加工的化合物或Notch-配體。本發(fā)明也涉及由這些檢測方法可檢測的化合物或Notch-配體。
本發(fā)明也包括一種檢測方法，包括將(a)Notch蛋白以及能和Notch蛋白結(jié)合的配體與(b)化合物相接觸；確定是否化合物影響配體與Notch蛋白的結(jié)合，其中優(yōu)選伴隨T細(xì)胞的Notch蛋白。
本發(fā)明使用的Notch-配體優(yōu)選Delta或Serrate家族成員蛋白或多肽或其衍生物。這些通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)的基本操作技術(shù)可優(yōu)選獲得。產(chǎn)生本發(fā)明這些化合物的合適基因序列可以從公開文獻(xiàn)WO 97/01571、WO 96/27610和WO 92/19734中獲得。然而發(fā)明并不受這些公開文獻(xiàn)所公開的Notch、Delta和Serrate序列限制。更優(yōu)選地，這些Notch、Delta或Serrate或家庭成員、其蛋白或多肽或衍生物是Notch、Delta或Serrate、或家族成員細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域片段或這些片段的衍生物。如此處所使用，術(shù)語“Notch配體”進(jìn)一步包括和Notch蛋白家族成員相互作用的任何配體或配體家族成員，以及一組稱為“toporythmic蛋白”的蛋白，即Delta，Serrate、Deltex和破裂基因增強(qiáng)子基因的蛋白產(chǎn)物以及其基因家族的其它成員的蛋白產(chǎn)物，它們可通過如下方式鑒定基因序列可和Notch、Delta或Serrate蛋白雜交或同源，抑或它們的基因顯示出表型相互作用的能力。
Notch、Delta和Serrate首先在果蠅屬中描述，因而分別代表Notch受體和Notch-配體家族成員的典型蛋白。在許多無脊椎和脊椎動物種中已描述了多個Notch蛋白和配體，但它們的命名不同于蠅中所用的命名。例如Notch是Lin 12和Glp 1的同系物，Serrate/Delta是Jagged、Apx 1和Lag-2的同系物。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的原理可以制成本發(fā)明的藥物配方。這樣賦形劑的性質(zhì)和活性的量依賴于要制成的本發(fā)明化合物。
優(yōu)選藥物組合物是單位劑量形式。
以藥物配方形式要施用給患者的本發(fā)明化合物的劑量可由合適的醫(yī)師確定。
本發(fā)明配方優(yōu)選的用藥途徑是普通用藥方法中的任一個，包括肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)吸收、肺吸入、皮下、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、體表以及通過胃腸道(例如通過淋巴集結(jié))。
與本發(fā)明蛋白或多肽相關(guān)，如此處所用的術(shù)語“衍生物”包括從序列中替代、變異、修飾、置換、刪除或加入一個(或多個)氨基酸殘基，只要得到的多肽蛋白具有調(diào)節(jié)Notch-Notch配體相互作用的能力。
與本發(fā)明蛋白或多肽相關(guān)，如此處所用的術(shù)語變異體包括從序列中替代、變異、修飾、置換、刪除或加入一個(或多個)氨基酸殘基，只要得到的蛋白具有調(diào)節(jié)Notch-Notch配體相互作用的能力。
與本發(fā)明蛋白或多肽相關(guān)，如此處所用的術(shù)語“類似物”包括任何肽模擬，即以與親本蛋白或多肽相似方式具有調(diào)節(jié)Notch-Notch配體相互作用能力的化學(xué)化合物。這些包括可以興奮或拮抗Notch-蛋白或Notch-配體表達(dá)或活性的化合物。
如果化合物能抑制或增強(qiáng)Notch與其配體的相互作用，優(yōu)選至足夠提供治療效應(yīng)的程度，我們認(rèn)為此化合物調(diào)節(jié)Notch-Notch配體相互作用。
如此處所用術(shù)語“Notch-Notch配體”表示Notch家族成員和能與一個或多個此成員相結(jié)合的配體之間的相互作用。
如此處所用術(shù)語治療應(yīng)該包括診斷和預(yù)防應(yīng)用。
術(shù)語“醫(yī)學(xué)的”包括人和獸醫(yī)應(yīng)用。
如此處所用，術(shù)語蛋白和多肽可以認(rèn)為是同義詞，廣義上蛋白僅表示比多肽中存在更長的氨基酸序列。
通過無限制實施例的方法現(xiàn)在將描述本發(fā)明，參考伴隨的附圖，其中圖1表示如此處實施例1所述進(jìn)行的原位雜交的結(jié)果。
圖2表示實施例4中所述實驗結(jié)果。
圖3表示實施例5中所述實驗結(jié)果。
圖4表示實施例6中所述實驗結(jié)果。
圖5表示實施例7中所述實驗結(jié)果。
圖6表示實施例8中所述實驗結(jié)果。
圖7表示實施例9中所述實驗結(jié)果。
圖8a和8b表示實施例10中所述實驗結(jié)果。
圖9表示實施例11中所述實驗結(jié)果。
實施例1在外周免疫系統(tǒng)中表達(dá)的Notch、Delta和Serrate合成對Notch 1、Delta 1和Serrate 1特異的反義RNA探針并摻入地高辛標(biāo)記-UTP。每一個探針在雜交緩沖液中溶解，加熱至70℃、5-10分鐘，加到TESPA包被的、含10mm脾或胸腺切片的玻片上，脾或胸腺切片已用4％低聚甲醛+PBS固定。玻片于65℃過夜雜交。第二天，玻片用1×SSC/50％甲酰胺/1％Tween 20在65℃洗滌兩次、室溫(RT)洗滌兩次。玻片在RT用0.1M馬來酸/0.15MNaCl/0.1％tween 20 pH 7.5(MABT)緩沖液洗滌兩次，然后用MABT+20％山羊血清+296 Boehringer封閉劑(BBR)封閉兩小時。玻片室溫用抗-地高辛Fab片段過夜溫育。用MABT洗滌四次后，玻片進(jìn)一步在堿性底物緩沖液中洗滌兩次。通過在黑暗中在含NBT+BCIP的底物緩沖液中溫育玻片檢測結(jié)合的反義RNA探針的存在。玻片用蘇木精復(fù)染，并在Depx封固劑中封片。結(jié)果雜交結(jié)果顯示于圖1中，表明在3月齡小鼠的脾中，Delta和Serrate在動脈周圍鞘而非生發(fā)中心(gc)的分離細(xì)胞中表達(dá)。Notch在動脈周圍鞘中的許多細(xì)胞中表達(dá)。
實施例2Delta-Fc融合蛋白的合成pIG-1[D.Simmons，“通過在哺乳細(xì)胞中瞬時表面表達(dá)克隆細(xì)胞表面分子”pp93-128，發(fā)育中細(xì)胞的相互作用，編輯D.Hartley，出版Ox.Uni.Press(1993)]表達(dá)載體允許含有與人IgGl-Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合的Delta 1細(xì)胞外部分的融合蛋白合成。只含Delta 1蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的限制酶片段克隆進(jìn)pIG-1載體。得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MC 1061，并在含10μg/ml四環(huán)素/氨芐青霉素的SOB上生長。純化的載體用于體外轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。COS細(xì)胞生長至50-75％匯合度，通過DEAE-葡聚糖的方法每皿用10μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時用含1％FCS的培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，細(xì)胞體外繼續(xù)培養(yǎng)3-6天。細(xì)胞5000 rpm離心5分鐘形成細(xì)胞沉淀和碎片，去除上清并儲藏至需要時。通過將2ml 50％蛋白懸浮液加至瓊脂糖(phamacia)中并于4℃過夜轉(zhuǎn)動從培養(yǎng)上清中純化Delta-Fc融合蛋白。通過將培養(yǎng)上清通過0.45mm濾膜分離瓊脂糖珠，洗滌并轉(zhuǎn)移至10ml塑料柱上。用2ml洗脫液pH4.0洗脫Delta-Fc融合蛋白。加入1M Tris堿中和洗脫物。
實施例3用于研究Notch-配體信號通路的模型的實施例對自身抗原外周的耐受在T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因小鼠中得到分析，其中TCR配體只在外周中作為自身抗原表達(dá)。在幾種方法中可以誘導(dǎo)對移植抗原的外周耐受，包括T細(xì)胞抗體的受體預(yù)處理或共刺激的阻斷。因而有可能顯示結(jié)合抑制和感染抑制。通過鼻內(nèi)轉(zhuǎn)移過敏原來源的肽可以誘導(dǎo)對過敏原的外周耐受。在過敏原吸入和顯示的耐受修飾后在收集到導(dǎo)氣管內(nèi)的細(xì)胞或/和淋巴組織上測量Notch-Notch配體的表達(dá)。進(jìn)一步，在使用感染劑的感染實驗?zāi)Ｐ椭?，在生物體(病原體)和宿主的免疫活性細(xì)胞上測量Notch-Notch配體的表達(dá)。
實施例4表達(dá)Delta的雜交瘤能夠抑制已接觸抗原的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)用含有住宅塵螨過敏原(HDM)Der p1(p110-31)免疫顯性表位的合成肽或用卵白蛋白(OVA，母鳴卵白蛋白)免疫小鼠。一周后去除淋巴結(jié)細(xì)胞(LNCs)并制備細(xì)胞懸液。來自不同抗原免疫的動物的淋巴結(jié)保持分離。這些細(xì)胞稱作已接觸抗原的LNCs。
T細(xì)胞雜交瘤用全長Delta或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染，這樣Delta作為膜蛋白表達(dá)。兩天后照射培養(yǎng)的雜交瘤以防止它們增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子。因此在實驗中所測量的反應(yīng)只來自淋巴結(jié)細(xì)胞。
已照射的雜交瘤以增加的數(shù)目加到含有已接觸抗原的LNCs。加入合適的抗原(即p110-131或OVA)，細(xì)胞培養(yǎng)24小時。收集上清液，測量IL-2(主要的T細(xì)胞生長因子)含量。72小時后也可以測量淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果如圖2所顯示，在表達(dá)對照質(zhì)粒的已照射雜交瘤存在下培養(yǎng)的淋巴結(jié)細(xì)胞仍然增殖，當(dāng)培養(yǎng)時用合適抗原刺激時可以分泌IL-2。它們的反應(yīng)性保持在1∶1 LNC雜交瘤的比率。相反當(dāng)淋巴結(jié)細(xì)胞在表達(dá)全長Delta(1∶1的比率)的雜交瘤存在下培養(yǎng)并用合適抗原刺激時，淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖反應(yīng)和IL-2的合成降低至少88％。用對照病毒(圓形)、Delta病毒(正方形)轉(zhuǎn)染雜交瘤。圖2顯示數(shù)據(jù)為培養(yǎng)開始后72小時3H-Tdr摻入的每分鐘計數(shù)(cpm)。與表達(dá)Delta或?qū)φ諛?gòu)建物的雜交瘤一起培養(yǎng)的淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)的cpm?？偟募?xì)胞數(shù)目/孔＝4×105(即LNCs的數(shù)目根據(jù)雜交瘤對LNC的比率而變化，所以cpm將會變化)。p110-131 LNC是已接觸抗原Derp1(p110-131)的細(xì)胞，OVA LNC是已接觸抗原OVA的細(xì)胞。2BB11和2BC3是兩種不同Der p1反應(yīng)的雜交瘤。
這些數(shù)據(jù)表明表達(dá)Delta的T細(xì)胞所產(chǎn)生反應(yīng)的抑制可以反式傳遞。盡管在此培養(yǎng)系統(tǒng)中，對Der p1特異的Delta表達(dá)的T雜交瘤能抑制已接觸OVA的T細(xì)胞的反應(yīng)，但特異性的明顯缺乏是由于培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的緊密鄰近。的確，圖8a和8b顯示的數(shù)據(jù)表明在動物中表達(dá)delta的雜交瘤要對免疫原的免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)效應(yīng)，則表達(dá)Delta的雜交瘤必須與此免疫原共同享有抗原的特異性。在此情況下，如果表達(dá)delta的T細(xì)胞在相同APC上識別相同抗原，則只能把它們與反應(yīng)T細(xì)胞靠近。
實施例5表達(dá)Serrate的樹突細(xì)胞防止T淋巴細(xì)胞的抗原激活樹突細(xì)胞(DCs)是免疫系統(tǒng)中主要的抗原呈遞細(xì)胞，對刺激T細(xì)胞反應(yīng)是關(guān)鍵的。從脾中獲取DCs，并用允許表達(dá)全長Serrate蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒或?qū)φ漳孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。DCs也用HDM肽p110-13137℃體外受脈沖作用3小時。然后洗滌DCs并用105細(xì)胞/小鼠皮下免疫原初(首次用于實驗的)小鼠。7天后收集引流的LNCs并在培養(yǎng)中在4×105細(xì)胞/孔用肽再刺激。因為小鼠只用肽-接觸的DCs免疫，這使我們可以測量這些細(xì)胞激活免疫反應(yīng)的能力。結(jié)果圖3表示顯示的數(shù)據(jù)為來自對照轉(zhuǎn)染(圓形)或serrated轉(zhuǎn)染(正方形)樹突細(xì)胞(DCs)免疫的動物、培養(yǎng)后72小時LNCs的cpm。
和對照DCs免疫相比，用表達(dá)Serrate的DCs免疫的小鼠在從淋巴結(jié)收集的細(xì)胞數(shù)目上降低10倍。和來自用對照DCs免疫的小鼠的細(xì)胞相比，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)來自用DCs+Serrate免疫的小鼠的LNCs不能增殖(在對照值上下降93％，圖3)或分泌IL-2。
實施例6表達(dá)Delta的T細(xì)胞雜交瘤在動物中能夠抑制對Der p1抗原的免疫發(fā)展T細(xì)胞雜交瘤(用Der p1激活)用含小鼠Delta的逆轉(zhuǎn)錄病毒或用對照病毒轉(zhuǎn)染，此Delta在細(xì)胞表面表達(dá)。C57 BL小鼠用1×107已照射的雜交瘤腹腔內(nèi)注射，并用乳化在完全弗氏佐劑(CFA)中的50微克Der p1皮下免疫。7天后收集引流的淋巴結(jié)細(xì)胞，以4×105細(xì)胞/孔用Der p1(10微克/ml)、Der p1的肽110-131(10微克/ml)、或Der p1的肽81-102(10微克/ml)培養(yǎng)。培養(yǎng)物37℃培養(yǎng)72小時，在最后8小時的培養(yǎng)中加入氚化的胸苷。圖4顯示來自用對照轉(zhuǎn)染(puro)或Delta轉(zhuǎn)染(Delta-FL)注射的動物的細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果。結(jié)果在Der p1、肽110-131或肽81-102存在時在培養(yǎng)中增殖。來自用對照病毒轉(zhuǎn)染的雜交瘤注射的動物的LNC產(chǎn)生高水平的IL-2，相反，來自用表達(dá)Delta的雜交瘤注射的動物的細(xì)胞對Der p1抗原的任一個都無反應(yīng)(圖4)。
實施例7表達(dá)Delta的人T細(xì)胞能封閉正常T細(xì)胞流感激活的人T細(xì)胞克隆(HA 1.7)用含小鼠Delta的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物轉(zhuǎn)染以允許細(xì)胞表面表達(dá)Delta蛋白。將此細(xì)胞群和正常HA1.7的混合防止了這些正常HA 1.7用肽HA 306-318和抗原呈遞細(xì)胞的隨后活化。5×105HA 1.7和1×106已照射的DRB1*0101外周血單核細(xì)胞(PBMC)+1微克HA 306-318混合，并在37℃培養(yǎng)。6小時后5％lymphocult(含IL-2的培養(yǎng)基)加至1ml的總體積中。開始培養(yǎng)后24小時加入Delta或?qū)φ漳孓D(zhuǎn)錄病毒或不加任何東西。開始培養(yǎng)后7天，收獲、沖洗細(xì)胞，并照射轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以2∶1的比率和未處理的HA 1.7混合，并培養(yǎng)2天。然后收獲混合培養(yǎng)物，沖洗并以2×104可成活細(xì)胞和下列一起鋪盤a)2.5×104DRB 1*0101 PBMCs(培養(yǎng)基)b)2.5×104DRB1*0101 PBMCs+肽(Ag+APC)c)5％lymphocult(IL-2)培養(yǎng)68小時，在最后8小時加入氚化的胸苷后收獲細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖5。結(jié)果單獨培養(yǎng)或與對照病毒轉(zhuǎn)染的HA 1.7培養(yǎng)后，未處理的HA 1.7對肽+抗原呈遞細(xì)胞有很好的反應(yīng)。與Delta轉(zhuǎn)染的已照射HA 1.7一起培養(yǎng)完全防止了未處理HA 1.7對抗原+APC的反應(yīng)。然而這些細(xì)胞與未處理或?qū)φ詹《九囵B(yǎng)的HA 1.7一樣對IL-2有反應(yīng)，表明它們不僅僅是不能增殖(圖5)。
實施例8抗原呈遞細(xì)胞的Serrate表達(dá)防止T細(xì)胞的反應(yīng)克隆HA 1.7在表達(dá)HLA-DRB1*0101的L細(xì)胞(作為抗原呈遞細(xì)胞)存在下與肽HA 306-318(1.0微克/ml)混合，每種細(xì)胞類型使用2×104。L細(xì)胞用對照(puro)或表達(dá)Serrate(Serrate L細(xì)胞)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。72小時以后，最后8小時的培養(yǎng)加入氚化胸苷，測量增殖反應(yīng)。對HA 1.7培養(yǎng)物的結(jié)果顯示于圖6a)單獨
b)+IL-2
c)+肽+DRB1*0101-L細(xì)胞
d)+肽+用對照病毒轉(zhuǎn)染的DRB1*0101-L細(xì)胞
e)+肽+用serrate病毒轉(zhuǎn)染的DRB1*0101-L細(xì)胞
結(jié)果與由對照轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞所激活的HA 1.7相比，由表達(dá)serrate的L細(xì)胞所激活的HA 1.7對抗原反應(yīng)很弱(圖6)。
實施例9表達(dá)Serrate的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞克隆HA 1.7在2％IL-2存在下和肽HA 306-318以及L細(xì)胞(表達(dá)DRB1*0101，作為抗原呈遞細(xì)胞)混合。L細(xì)胞用對照或表達(dá)serrate的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)7天后，與新鮮HA 1.7混合之前收獲、沖洗并照射HA 1.7(每種細(xì)胞群用2×104)。用肽(1.0微克/ml)+正常的抗原呈遞細(xì)胞(DRB1*0101 PBMCs)刺激之前細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)2天。培養(yǎng)72小時后，最終8小時的培養(yǎng)加入氚化的胸苷，測量增殖反應(yīng)。對新鮮HA 1.7的結(jié)果顯示于圖7a)單獨
b)+IL-2
c)+對照病毒誘導(dǎo)的HA 1.7，然后肽+DRB1*0101 PBMC
d)+serrate病毒誘導(dǎo)的HA 1.7，然后肽+DRB1*0101 PBMC
結(jié)果由表達(dá)serrate的L細(xì)胞誘導(dǎo)的HA 1.7阻止了正常HA 1.7對正?？乖碳さ姆磻?yīng)(圖7)。這表明由暴露給serrate所耐受的細(xì)胞將它們的耐受傳遞給原初細(xì)胞群的能力(感染/旁觀者耐受)。
實施例10由表達(dá)delta的T細(xì)胞所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)是抗原特異的用107delta或?qū)φ漳孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞注射小鼠。雜交瘤是2BC3，它對Der p1的肽110-131具有特異性。同時動物接受乳化于完全弗氏佐劑中的Der p1或卵白蛋白。7天后，去除淋巴結(jié)細(xì)胞，在Der p1或卵白蛋白(用與它們被免疫時相同的抗原)存在下培養(yǎng)4×105細(xì)胞。
開始培養(yǎng)后24小時測量IL-2的合成。對用對照(puro)或Delta(delta)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的雜交瘤注射的動物，IL-2合成的刺激指數(shù)顯示于圖8a(用Der p1免疫的動物的反應(yīng))和8b(用OVA免疫的動物的反應(yīng))。結(jié)果在用表達(dá)delta的2BC3雜交瘤注射的動物中對Der p1的反應(yīng)基本上完全取消，而對卵白蛋白的反應(yīng)則無影響。數(shù)據(jù)顯示于圖8a和8b，其中每一點作為對照反應(yīng)(無抗原加入)的刺激指數(shù)(SI)代表由每個小鼠對抗原的IL-2的合成。
實施例11耐受誘導(dǎo)的過程中Delta在T細(xì)胞上表達(dá)在缺少APCs、存在肽HA 306-318(50μg/ml)時培養(yǎng)HA 1.7。此條件在HA 1.7中產(chǎn)生耐受狀態(tài)。0、30、120、240或360分鐘后收獲細(xì)胞(1.5×106)、沉淀并冷凍。通過在硫氰酸胍中勻漿接著通過CsCl密度離心從細(xì)胞沉淀中制備RNA。使用oligo dT引物將1μgRNA轉(zhuǎn)換成cDNA。使用對人delta同系物特異的引物將得到的cDNA的1/20用于PCR(40個循環(huán))。凝膠電泳分析PCR樣品(圖9)，其中第一道、標(biāo)記、第2道、t＝0、第3道、t＝30分鐘、第4道、t＝120分鐘、第5道、t＝240分鐘、第6道、t＝360分鐘、第7道是負(fù)對照。結(jié)果檢測的HA 1.7并不表達(dá)Delta mRNA，但在耐受試驗開始2小時內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物。
實施例12耐受誘導(dǎo)過程中通過免疫組織學(xué)和原位雜交分析Notch 1、Serrate 1和Delta 1在連續(xù)三天內(nèi)用100μg Der p1肽110-131或?qū)φ杖芤?磷酸鹽緩沖液，PBS)鼻內(nèi)處理C57 BL/6J小鼠。已知此種方法鼻內(nèi)施用抗原可誘導(dǎo)對抗原的耐受。通過將50μg Der p1/CFA皮下注射進(jìn)尾基部用抗原再激發(fā)之前，一些動物休息2周。在此后幾個時間點(do是鼻內(nèi)處理或抗原再激發(fā)的第一天)收獲表層的淋巴結(jié)及動物的脾，并進(jìn)行免疫組織學(xué)或原位雜交。對免疫組織學(xué)，冷凍組織并切3μm的切片，在冰預(yù)冷的丙酮中固定并用對Notch 1和Serrate 1特異的單克隆抗體染色。用以二氨基聯(lián)苯胺為底物的辣根過氧化酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體檢測結(jié)合抗體。對此研究未得到Delta 1特異的抗體。對原位雜交，冰凍組織切片并在4％多聚甲醛中固定。在65℃切片用對Notch 1、Serrate1及Delta 1特異的地高辛偶聯(lián)反義RNA探針雜交。通過堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗地高辛抗體檢測結(jié)合抗體接著用NBT和BCIP作為底物檢測對顯示于表1和表2的數(shù)據(jù)分別是免疫組織學(xué)和原位雜交。數(shù)據(jù)代表單獨鼻內(nèi)肽(PBS/p110-131最初的)或鼻內(nèi)和皮下抗原(PBS/p110-131再激發(fā))后從5個不同小鼠中所取組織的分析。+弱染、++中度染色、+++強(qiáng)染結(jié)果在只接受PBS的對照小鼠中表達(dá)基本水平的Notch、Delta和Serrate。鼻內(nèi)施用PBS并皮下注射抗原的小鼠在再激發(fā)的8天內(nèi)三種分子的表達(dá)都表現(xiàn)中度的增加。單獨鼻內(nèi)施用肽或鼻內(nèi)施用肽接著用抗原再激發(fā)的動物表現(xiàn)出相同方式的Notch、Delta和Serrate增加的表達(dá)，它比對照小鼠增強(qiáng)快得多并且大得多。
表1誘導(dǎo)免疫耐受過程中Notch和Serrate蛋白的表達(dá)處理 0天 1天 4天 8天12天Notch 1PBS首次+ ++ + +PBS再刺激 + ++ +/++ +/++p110-131首次 + +++++++++p110-131再刺激 + +++++++++Serrate 1 PBS首次+ ++ + +PBS再刺激 + ++ +/++ +/++p110-131首次 + +++++++++p110-131再刺激 + +++++++++表2誘導(dǎo)免疫耐受過程中Notch、Delta和Serrate轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)處理 0天 1天4天8天12天Notch 1PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++Serrate 1 PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++Delta 1PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++
本發(fā)明的其它修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.Notch-配體在生產(chǎn)用于免疫治療的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中免疫治療涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或感染的治療。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或感染是由于下面疾病中的一個或更多過敏反應(yīng)、移植排斥、自身免疫、腫瘤誘導(dǎo)的對T細(xì)胞系統(tǒng)的異常以及感染疾病如由瘧原蟲屬、微絲蚴屬、蠕蟲、分枝桿菌、HIV、巨細(xì)胞病毒、假單胞桿菌屬、弓形蟲屬、棘球?qū)佟⒘鞲惺妊獥U菌B型、麻疹、丙型肝炎或Toxicara所引起的疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的應(yīng)用，其中Notch-配體選自serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
5.Notch-配體或其片段、衍生物或類似物，用于影響結(jié)合抑制。
6.Notch-配體或其片段、衍生物或類似物，用于影響感染耐受。
7.使T細(xì)胞對過敏原或抗原耐受的方法，包括在所述過敏原或抗原存在下，將所述T細(xì)胞和表達(dá)或過表達(dá)Notch-配體的抗原呈遞細(xì)胞培養(yǎng)/暴露。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中Notch-配體的(過)表達(dá)是由于用能表達(dá)所述配體的病毒轉(zhuǎn)染的APC。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中Notch-配體的(過)表達(dá)是由于由上調(diào)Notch-配體表達(dá)基因表達(dá)的藥物所刺激的APC。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中藥物選自頭蛋白、Chordin、Follistatin、Xnr3、成纖維細(xì)胞生長因子或其衍生物或片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求7、8、9或10的方法，其中APC選自樹突細(xì)胞、L細(xì)胞、雜交瘤、淋巴瘤、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞或合成的APCs如脂膜。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項的方法，其中Notch-配體選自Serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
13.一種分子，包括與T細(xì)胞過敏原或抗原部分可操作地連接的Notch抗原部分，從而在與T細(xì)胞接觸時兩部分都能與其各自位點結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的分子，其中Notch-配體部分選自Serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
15.一種融合蛋白，包括Notch配體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)段和免疫球蛋白Fc區(qū)段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的融合蛋白，其中Notch配體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域源于Notch、Delta或Serrate。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的融合蛋白，其中Fc區(qū)段是IgGFc或IgMFc。
18.試劑盒，包括固定化的Notch或其家族成員，以允許對源自病原體、移植物或移植宿主細(xì)胞的可溶Notch配體進(jìn)行測量。
19.一種檢測方法，包括將(a)Notch蛋白和能夠與Notch蛋白相結(jié)合的配體和(b)化合物相接觸；并確定是否化合物影響配體和Notch蛋白的結(jié)合。
20.能夠和病原生物體、腫瘤或移植物所表達(dá)或分泌的Delta或Serrate蛋白或它們的衍生物相結(jié)合的配體，用于醫(yī)學(xué)治療。
21.一種檢測方法，包括確定可溶的、游離的Serrate、Notch或Delta家族成員或其形式的體內(nèi)水平。
22.一種檢測化合物對有功能的Notch-蛋白或Notch配體表達(dá)或加工影響的測定方法，包括將表達(dá)Notch-蛋白或Notch配體的細(xì)胞和化合物相互接觸；并監(jiān)控所述蛋白或配體表達(dá)或加工的增加或降低。
23.由權(quán)利要求22的檢測方法可檢測到的化合物、Notch-配體、其衍生物、片段或類似物。
24.能夠下調(diào)Delta或Serrate蛋白的表達(dá)或降低作為細(xì)胞膜蛋白存在的制劑在制備用于逆轉(zhuǎn)細(xì)菌、感染或腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制的藥物中的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中制劑是Toll蛋白或骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
26.Notch-配體在調(diào)節(jié)有功能的Notch蛋白表達(dá)或Notch信號通路中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及T細(xì)胞修飾中治療化合物的應(yīng)用,T細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞(APC)相互作用和發(fā)病生物體與宿主免疫活性細(xì)胞相互作用。它尤其涉及這些化合物在Notch蛋白質(zhì)及其配體相互作用的修飾中的應(yīng)用以及這類化合物在移植排斥、自身免疫、過敏反應(yīng)和哮喘及傳染病治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61P33/00GK1242802SQ97181159
公開日2000年1月26日 申請日期1997年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月7日
發(fā)明者J·R·拉姆布, M·J·達(dá)爾曼, G·F·霍因 申請人:洛倫蒂斯有限公司