專利名稱：核酸的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移所用的多功能配體系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的改良方法和所用試劑。
對于將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)而言，基因構(gòu)建體結(jié)合到細(xì)胞表面即使不是足夠的和必要的，也是必需的。這種結(jié)合越緊密，基因構(gòu)建體被細(xì)胞成功接納并在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的可能性則越大。這種結(jié)合的細(xì)胞特異性越強(qiáng)，基因構(gòu)建體越可能占優(yōu)勢地或單獨(dú)地與靶細(xì)胞結(jié)合并被此細(xì)胞接納。當(dāng)除了基因構(gòu)建體和靶細(xì)胞以外，還存在另一種類型的細(xì)胞，但基因構(gòu)建體優(yōu)先地或全部地由靶細(xì)胞接納時，基因構(gòu)建體與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性尤其重要。
已開發(fā)出多種能使基因構(gòu)建體以細(xì)胞特異性方式結(jié)合的技術(shù)，所有這些技術(shù)的共同之處是它們利用了(1)配體與其受體的結(jié)合，后者表達(dá)于細(xì)胞膜上，或(2)抗體與其抗原或半抗原的結(jié)合，所述抗原、半抗原暴露于細(xì)胞膜上。這些技術(shù)的例子包括將如heregulin(Han etal.，PNAS 92，9747(1995))，促紅細(xì)胞生成素(Kasahara et al.，Science266，1373(1994))的配體，如單鏈Fv(Marin et al.，J.Virol.70，2957(1996)的抗體片段或如Fc受體胞外部分的受體(Dougherty etal.，Transfusion Science 17，121(1996)摻入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的外被糖蛋白并以此方法造成靶細(xì)胞特異性的重組方法。
也已使用了化學(xué)方法將如脫唾液酸糖蛋白(Wu et al.，J.Biol.Chem.269，1152(1994)或此蛋白質(zhì)合成衍生物(Marwin et al.，Bioconjugate Chem.5，612(1994))的配體與多聚賴氨酸相連，并且或者將后者與基因構(gòu)建體絡(luò)合，或者將其化學(xué)結(jié)合到腺病毒載體的外被蛋白上。另一種方法是將配體結(jié)合到抗生蛋白鏈菌素上，后者轉(zhuǎn)而與生物素結(jié)合，所述生物素與脂質(zhì)體的磷脂頭部基團(tuán)綴合，脂質(zhì)體被基因構(gòu)建體絡(luò)合(Redelmeir et al.，Drug Deliv.J.Deliv.Targeting Therap.Agents 2，98，(1995))。第一個配體系統(tǒng)由Fominaya et al.，J.Biol.Chem.271，10560，1996提供，此配體系統(tǒng)含有特異于腫瘤細(xì)胞上的ErbB2受體的抗體片段，假單胞菌融合肽外毒素A和酵母菌Gal-4蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)與插入含轉(zhuǎn)移基因之質(zhì)粒的相應(yīng)Gal-4結(jié)合序列結(jié)合。盡管此配體系統(tǒng)導(dǎo)致靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)染，但它仍會碰到酵母菌Gal-4蛋白免疫原性的不利之處。
這些公開的方法無一能以靶細(xì)胞特異性的方式充分解決結(jié)合載體的難題，缺乏特異性的主要原因包括(1)經(jīng)修飾的病毒載體功能的削弱；(2)所用配體系統(tǒng)相當(dāng)大的復(fù)雜性和大??；(3)異源或經(jīng)修飾蛋白質(zhì)或所用抗生蛋白鏈菌素-生物素偶聯(lián)系統(tǒng)的免疫原性和相容性；和(4)結(jié)合的基因構(gòu)建體影響靶細(xì)胞特異性細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的不足。
這些局限性的結(jié)果是很需要易于制備，功能上有用的配體以用于將病毒和非病毒載體結(jié)合到靶細(xì)胞上。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移核苷酸序列的配體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)相對已知系統(tǒng)而言，是非免疫原性的，并且較易制備和使用。另一個目的是增加載體與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性，從而改善將核酸轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的效力和選擇性。
為了實(shí)現(xiàn)這些和其他目的，本發(fā)明的一個方面提供了用于靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移核苷酸序列的多功能配體系統(tǒng)，它含有至少一個靶細(xì)胞特異性配體，至少一個含有抗體或抗體部分的基因構(gòu)建體特異性配體，以及連接這兩個配體的接頭，其中所述系統(tǒng)是非免疫原性的。在一個有利的實(shí)施方案中，至少一個配體是人源化抗體或抗體片段。在另一個有利的實(shí)施方案中，提供了治病的組合物，它含有用于靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移核苷酸序列的多功能配體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有至少一個靶細(xì)胞特異性配體，至少一個含有抗體或抗體部分的基因構(gòu)建體特異性配體，以及連接這兩個配體的接頭，其中所述系統(tǒng)是非免疫原性的，它在適當(dāng)?shù)妮d體中被提供以施用給病人。
在另一個有利的實(shí)施方案中，配體系統(tǒng)含有將兩個配體連接在一起的連接物，所述連接物含有兩個接頭。另一個有利的實(shí)施方案所提供的配體系統(tǒng)含有(a)TS配體，它含有抗-NCAM重組單鏈Fv片段，其中通過短肽序列使Fv片段的可變重鏈和輕鏈共價相連；(b)含有融合肽的接頭，所述融合肽具有序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID No.1)；和(c)GS配體，它含有N-6--甲基腺嘌呤的重組抗體。
在另一個有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的配體系統(tǒng)用于制備藥物的用途，所述藥物可預(yù)防或治療皮膚病，粘膜病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，內(nèi)部器官疾病，血液凝結(jié)疾病，造血系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，肌肉系統(tǒng)疾病，和支持組織或關(guān)節(jié)病。將配體系統(tǒng)作為疫苗局部施用或注射給病人或，可選擇地，施予得自病人的細(xì)胞以預(yù)防或治療與由皮膚，粘膜，神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)部器官，血液凝結(jié)，造血系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)，支持組織和關(guān)節(jié)組成的組中的一個或多個相關(guān)的疾病。
根據(jù)本發(fā)明，通過連接細(xì)胞特異性配體和基因構(gòu)建體可能會有利。
從下列詳細(xì)描述中看，本發(fā)明的其他目的，特征和益處將是顯而易見的。然而應(yīng)理解，指示本發(fā)明較優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，因為從此詳細(xì)描述中得到的多種改變和修飾在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1表示三個可選擇的配體系統(tǒng)，由靶細(xì)胞特異性配體和基因構(gòu)建體特異性配體組成。其中配體由“接頭”(圖1a和1b)或“連接物”(圖1c)連接。
圖2表示圖1C配體系統(tǒng)的實(shí)施方案，其中“連接物”含有抗體的絞鏈區(qū)。
圖3表示圖1C配體系統(tǒng)的另一個實(shí)施方案，其中“連接物”含有Gal 80蛋白和Gal4的Gal80-結(jié)合區(qū)。
圖4表示的實(shí)施方案中融合肽被用來連接兩個抗體片段。
圖5表示在本發(fā)明中有用的表達(dá)載體pHENIS和pAB1。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過圖1所示的接頭可以將靶細(xì)胞特異性配體與基因構(gòu)建體特異性配體相互連接，而不會形成免疫原性的復(fù)合物。而且，尤其是通過使用圖1C和圖2和3所示的“連接物”所構(gòu)建的配體系統(tǒng)可以克服現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞免疫原性，特異性差，效力低的缺陷。
本文術(shù)語“靶細(xì)胞特異性配體”(TS配體)是與靶細(xì)胞表面決定簇結(jié)合的分子，即與靶細(xì)胞特異性配體的結(jié)合伙伴，如受體或粘著分子結(jié)合的分子。
“接頭”在最簡單的例子中是連接靶細(xì)胞特異性配體和基因構(gòu)建體特異性配體的分子，并且有利地具有融合特性，即允許新的配體系統(tǒng)穿入細(xì)胞膜和/或溶酶體膜，即從溶酶體進(jìn)入胞質(zhì)的特性。在本發(fā)明有利的實(shí)施方案中，接頭也具有融合特性。
“基因構(gòu)建體特異性配體”(GS配體)是通過抗體或其部分直接或間接與基因構(gòu)建體結(jié)合的分子。
在本發(fā)明適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案中，TS配體和GS配體通過“連接物”連接，另外，任一或兩個配體可含有獨(dú)立的接頭，依據(jù)所用的特殊GS配體和TS配體，利用連接物的實(shí)施方案可采取不同的形式(例如1×接頭，2×TS配體，1×GS配體或1×接頭，1×TS配體，2×GS配體)。
通過共價結(jié)合[技術(shù)描述見Sedlacek et al.Contrib.to Oncol.32，42-49和81-85，Karger Verlag Munich(1988)]或如以電荷差異為基礎(chǔ)的非-共價方式(離子結(jié)合)可實(shí)現(xiàn)TS配體，接頭和GS配體之間的偶聯(lián)。然而，也可使用重組技術(shù)將配體系統(tǒng)制備成融合蛋白的形式，這一點(diǎn)在EP-Al-0 464 533中已有描述。
通過本發(fā)明的配體系統(tǒng)被導(dǎo)入靶細(xì)胞的核酸序列可以是裸露的RNA或DNA，與非病毒載體或病毒混合的裸露RNA或裸露DNA。使用時將本發(fā)明配體系統(tǒng)與基因構(gòu)建體相混合，將所得復(fù)合物加到欲被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中，或者可以將復(fù)合物施予病人。
對本發(fā)明有用的靶細(xì)胞特異性配體，基因構(gòu)建體特異性配體，接頭和連接物的例子列于下文以闡明經(jīng)發(fā)明人仔細(xì)考慮過的一些可能的組合。TS配體在本發(fā)明的上下文中，TS配體可以是與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合的活性化合物，活性化合物的一部分或活性化合物的類似物。內(nèi)源性物質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)部分和其他模擬內(nèi)源性物質(zhì)一個或多個表位的物質(zhì)是有利的，因為與大多數(shù)外源物質(zhì)相比，當(dāng)導(dǎo)入體內(nèi)時它們的免疫原性較低。
這種活性化合物的例子是生長因子，如VEGF，PDGF，EGF，TGFα，TGFβ，KGF，SDGF，F(xiàn)GF，IGF，HGF，NGF，BDNF，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，BMF，鈴蟾肽，M-CSF，血小板生成素，促紅細(xì)胞生成素，SCF，SDGF，制癌蛋白，PDEGF和內(nèi)皮膚1；細(xì)胞因子，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14和IL-15；干擾素α，β和γ；腫瘤壞死因子TNFα和TNFβ；趨化因子，如RANTES，MCAF，MIP-1α，MIP-1β，NAP和β-血小板球蛋白；肽激素，如SRH，SIH，STH，MRH，MSH，PRH，PIH，促乳素，LH-RH，F(xiàn)SH-RH，LH/ICSH，F(xiàn)SH，TRH，TSH，CRH，ACTH；血管緊張肽，細(xì)胞分裂素，或組胺或它們的同系物或類似物；類固醇激素，如雌激素，孕激素，雄激素，糖皮質(zhì)激素或鹽皮質(zhì)激素，或它們的同系物或類似物；和維生素，如葉酸。
在本發(fā)明的上下文中，TS配體也可以是粘附分子，粘附分子的一部分或粘附分子的類似物，它們與位于細(xì)胞膜中的相應(yīng)的粘附分子結(jié)合或與特異性結(jié)合粘附分子的靶細(xì)胞的另一結(jié)構(gòu)結(jié)合。
這種能作為TS配體起作用的粘附分子的例子是Lewis X(對GMP-140而言)，S-Lewis X(對ELAM-1而言)，LFA-1(對ICAM-1和ICAM-2而言)，MAC-1(對ICAM-1而言)，VLA-4(對VCAM-1而言)，PECAM(對PECAM而言)，玻連蛋白(對玻連蛋白受體而言)，GMP-140(對于Lewis X)，S-Lewis X(對于ELAM-1)，ICAM-1，ICAM-2(對于LFA-1，MAC-1)，VCAM-1(或VLA-4)，纖連蛋白(對于VLA-4)，層粘連蛋白(對于VLA-6)，纖連蛋白，層粘連蛋白(對于VLA-1，VLA-2，VLA-3)，纖連蛋白(對于VLA-4)，血纖蛋白原(對于GPIIb-IIIa)，B7(對于CD28)，CD28(對于B7)，CD40(對于CD40L)和CD40L(對于CD40)。
在本發(fā)明上下文中，TS配體也可以是Fc受體的胞外部分(Dougherty et al.，Trahsfusion Science 17，121(1996))，特異于靶細(xì)胞的抗體通過其Fc部分與之結(jié)合。
在本發(fā)明上下文中，TS配體也可以是VDL受體或LDL受體(如LDL受體，LDL-相關(guān)受體蛋白，IgG的FC-受體(如FcγRII-B2，F(xiàn)cγRI)；88 KDa糖蛋白受體，乙?；疞DL受體，氧化LDL受體或megalin)的配體。這種特性的配體已被詳細(xì)描述于文獻(xiàn)中，它們是例如含有羧基末端部分的載脂蛋白B-100或其片段，載脂蛋白E，蛋白酶/抑制劑復(fù)合物，如tPA/PAI-1復(fù)合物，2-巨球蛋白，血小板反應(yīng)蛋白或其結(jié)合肝素的氨基末端區(qū)(如氨基酸1-214)，氧化的LDL，乙酰化的LDL或乙?；阴；腖DL，乙酰化的賴氨酸，脫唾液酸化LDL，丙二醛-綴合的LDL，甲醛-處理或戊二醛-處理過的白蛋白，馬來?；陌椎鞍祝?9KDa受體-相關(guān)的蛋白質(zhì)或其片段，例如那些含有氨基酸18-112，113-218和219-323或氨基酸1-114和114-319的蛋白質(zhì)，乳鐵蛋白，抑蛋白酶肽，脂蛋白脂肪酶，淀粉樣前體蛋白(蛋白酶微管連接蛋白2)和假單胞菌外毒素。
在本發(fā)明的上下文中，TS配體也可以是抗體分子或抗體分子的表位-結(jié)合部分。
如使用鼠單克隆抗體，應(yīng)優(yōu)選使用其人源化的形式以限制其免疫原性，人源化可由Winter et al.(Nature 349，293(1991))和Hoogenboom etal.(Rev.Tr.Trahsfus.Hemobiol.36，19(1993))所描述的方式實(shí)現(xiàn)?？筛鶕?jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)成方法制備抗體片段，如通過Winter et al.，Nature349，293(1991)，Hoogenboom et al.Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993)，Girol，Mol.Immunol. 28，1379(1991)或Huston et al.，Int.Rev.Immunol.10，195(1993)描述的方法。
重組抗體片段可從現(xiàn)成的雜交瘤直接制備，或也可使用噬菌體-展示技術(shù)(Smith，Science 228，1315(1985))(Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12，433(1994))從鼠或人抗體片段文庫中分離，然后在基因水平上直接使用這些抗體片段以進(jìn)一步操作(例如與其他蛋白質(zhì)融合)。
為了由雜交瘤制備重組的抗體片段，通過分離mRAN，逆轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，隨后使用聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki et al.，Science230，1350(1985))和與可變片段的5’和3’末端分別互補(bǔ)的寡核苷酸(Orlandi et al.，PNAS-USA 86，3833(1989))擴(kuò)增可得到編碼抗體的抗原-結(jié)合區(qū)(VH，VL)的遺傳信息。然后以例如Fv片段(Skerra&Pluckthun，Science 240，1038(1988))，單鏈Fv片段(sc-Fc)(Bird et al.，Science 242，423(1988)，Huston et al.，PNAS-USA 85，5879(1988))或Fab片段(Better et al.，Science 240，1041(1988))的形式將VH和VL片段克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中。
也可使用噬菌體-展示技術(shù)從鼠或人源的抗體文庫(免疫文庫，首次用于實(shí)驗的文庫)中直接分離新的抗體片段。在抗體片段的噬菌體展示中，抗原-結(jié)合區(qū)作為與絲狀噬菌體的g3P外被蛋白的融合蛋白，以scFv片段(McCafferty et al.，Nature 348，552(1990))或Fab片段(Hoogenboom et al.，Nucl.Acid Res.19，4133(1991)，Barbas et al.，PNAS-USA 88.7978(1991))的形式，或被克隆到噬菌體基因組中(McCafferyt al.，Nature 348，552(1990))，或被克隆到噬粒載體中(Breitling et al.，Gene 104，147(1991))。在載有抗原的塑料容器(淘選) (Marks et al.，J.Mol.Biol.222，581(1991))上，在與抗原綴合的順磁珠(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992))上或通過與細(xì)胞表面結(jié)合(Marks et al.，Bio/Technol.11，1145(1993))來選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。
通過PCR擴(kuò)增得自人源化動物(Sastry et al.，PNAS-USA 86，5728(1989)，Ward et al.，Nature 341，544(1989)，Clackson et al.，Nature352，624(1991)或病人(Mullinax et al，.PNAS-USA87，8095(1990)，Barbas et al.，PNAS-USA 88，7978(1991))的B淋巴細(xì)胞的可變抗體片段可制備免疫文庫。為此目的利用了特異于鼠(Orlandiet al.，PNAS-USA 86，3833(1989)，Sastry et al.，PNAS-USA86，5728(1989))或人免疫球蛋白基因(Larrick et al.，BBRC160，1250(1989))或特異于人免疫球蛋白基因家族(Marks et al.，Eur.J.Immunol.21，985(1991))的寡核苷酸的組合。
通過使用未被免疫接種的供體作為免疫球蛋白基因的來源可制備天然的基因文庫(Marks et al.，J.Mol.Biol.222，581(1991))。另外，可使用免疫球蛋白種系基因制備半合成的抗體所有組成成分，同時使用簡并的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增可變片段的互補(bǔ)-決定區(qū)3(Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227，381(1992)，Barbas et al.，PNAS-USA 89.4457(1992)，Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994)，Griffiths et al.，EMBO J.13，3245(1994))。與免疫文庫相比，這些所謂的單-擊(single-pot)文庫具有優(yōu)點(diǎn)，即可從一個單庫中分離抗大量抗原的抗體片段(Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994))。
通過使用噬菌體-展示技術(shù)仍可進(jìn)一步增加抗體片段的親和性，通過隨機(jī)誘變(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992)，Gram et al.，PNAS-USA 89，3576(1992))，以密碼子為基礎(chǔ)的誘變(Glaser et al.，J.Immunol.149，3903(1992))或定點(diǎn)誘變(Balint&Larrick，Gene 137，109(1993))，通過使用得自首次用于實(shí)驗的所有組成成分的片段使各個區(qū)鏈改組(Marks et al.，Bio/Technol.10，779(1992))或使用細(xì)菌增變株(Low et al.，J.Mol.Biol.260，359(1996))，在嚴(yán)緊條件下重新選擇分離出具有改良特性的抗體片段(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992))可由現(xiàn)存的抗體片段制備新的文庫。另外，通過逐步用人所有組成成分取代一個可變區(qū)，然后用原始抗原選擇(指導(dǎo)選擇)可使鼠抗體片段人源化(Jespers et al.，Bio/Technol.12，889(1994))。另外，通過用原始鼠抗體的相應(yīng)區(qū)特異性取代人抗體的超變區(qū)也可使鼠抗體人源化(Jones et al.，Nature 321，522(1987))。
在本發(fā)明上下文中，TS配體也可以是通過其包膜蛋白與選定細(xì)胞特異性結(jié)合的病毒的包膜蛋白或包膜蛋白的一部分。TS配體的選擇取決于欲被基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。
對本發(fā)明有用的配體的例子包括的物質(zhì)可激活內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；結(jié)合肌肉細(xì)胞，造血細(xì)胞，滑液細(xì)胞和炎性細(xì)胞；結(jié)合被病毒感染的細(xì)胞；結(jié)合如肝細(xì)胞的組織細(xì)胞；結(jié)合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；和結(jié)合白血病細(xì)胞。此處只概括了這些配體的一些代表性例子。激活內(nèi)皮細(xì)胞的TS配體在本發(fā)明的意義上，這些配體包括針對于內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，這一點(diǎn)描述于例如Burrows et al.，Pharmac.Ther.64，155(1994)，Hughes et al.，Cancer Res.，49，6214(1989)和Maruyama et al.，PNAS-USA 87，5744(1990)。具體地說這些配體包括抗VEGF受體的抗體。
TS配體也包括與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性化合物。例如這些配體包括在末端位置含有甘露糖的物質(zhì)，而且還包括IL-1或生長因子，或它們的片段或其部分序列，這些配體能與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，所述受體為例如PDGF，bFGF，VEGF或TGFβ(Pusztain et al.，J.Pathol.169，191(1993))。
TS配體也包括針對LDL受體的配體，例如針對乙?；疞DL受體，氧化的LDL受體，LDL-相關(guān)受體蛋白(LRP)，88KDa糖蛋白受體和IgG的Fc受體的配體。這種性質(zhì)的配體已在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。
TS配體進(jìn)一步包括與激活的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的粘附分子，這種性質(zhì)的粘附分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻連蛋白已經(jīng)被描述(見Augustin-Voss et al.，J.Cell.Biol.119，483(1992)，Pauli et al.，Cancer Metast.Rev.9，175(1990)和Honn etal.，Cancer Matast.Rev.11，353(1992))。在本發(fā)明的意義上，TS配體具體地包括對內(nèi)皮細(xì)胞具有嗜性的病毒外被糖蛋白，這些病毒的例子有線狀病毒，例如帶有其GP(糖蛋白)和sGP(第二糖蛋白)外被蛋白的馬堡病毒或在每種場合下都帶有其GP和sGP外被蛋白的Ebola病毒，特別地具有其gB蛋白的巨細(xì)胞病毒，人α疤疹病毒1型，HIV-1病毒，麻疹病毒，漢坦病毒，甲病毒原，如寒姆利基森林病毒，流行性出血熱病毒，背髓灰質(zhì)炎病毒，以及如ECHO9，ECHO12或柯薩奇B3病毒的腸道病毒。激活巨噬細(xì)胞和/或激活淋巴細(xì)胞的TS配體在本發(fā)明的意義上，配體可包括與免疫細(xì)胞表面特異性結(jié)合的物質(zhì)，這種物質(zhì)包括針對于免疫細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，例如Powelson et al.，Biotech.Adv.11，725(1993)中有述。
TS配體進(jìn)一步包括上文已有描述的LDL受體的所有配體，TS配體也可進(jìn)一步包括通過其結(jié)合抗原的可變部分與免疫細(xì)胞上的Fc-y或Fc-ε或Fc-μ受體結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或抗體片段(Rojanasakul et al.，Pharm.Res.11，1731(1994))。
這些配體也包括人單克隆或多克隆免疫球蛋白的Fc片段，通過例如使用重組DNA的基因操作法或根據(jù)Haupt et al.，Klin Wschr.47，270(1969)，Kranz et al.，Dev.Biol.Standard 44，19(1979)；Fehr et al.，Adv.Clin.Pharmac 6，64(1974)，Menninger et al.，Immunochem.13，633(1976)的方法可制備具有此特性的Fc片段。
TS配體進(jìn)一步包括與免疫細(xì)胞表面的膜受體結(jié)合的所有物質(zhì)，這些配體包括細(xì)胞因子，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα，GM-CSF和M-CSF，和生長因子，如EGF，TGF，F(xiàn)GF，IGF或PDGF或它們的片段或其部分序列，所述配體與免疫細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合。
TS配體進(jìn)一步包括與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，如脾臟、肝臟、肺和其他組織巨噬細(xì)胞上的甘露糖6-磷酸酯受體結(jié)合的粘附分子和其他配體。這些配體和膜結(jié)構(gòu)的選擇見Perales et al.，Eur.J.Biochem.226，255(1994)。
在本發(fā)明的意義上，TS配體也包括來自對淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞有嗜性之病毒的包膜糖蛋白。感染巨噬細(xì)胞的這些病毒的例子是HIV-1，特別是那些在gP120的V3區(qū)具有突變的毒株，所述突變可導(dǎo)致對巨噬細(xì)胞的結(jié)合增加，HIV-2，漢坦病毒，例如Punmala病毒，巨細(xì)胞病毒，呼吸道合胞病毒，單純疤疹病毒和線狀病毒。
感染淋巴細(xì)胞的病毒的例子是人α皰疹病毒3型(VZV)，疤疹病毒6型(HHV-6)，狂犬病病毒，HIV-1，HTLV-II，HTLV-I，丙型流感病毒(因為丙型流感病毒通過血凝素-酯酶融合(HEF)蛋白與N-乙酰基-β-乙酰基神經(jīng)氨酸(Neu5，9Ac)結(jié)合，這一事件優(yōu)先在B淋巴細(xì)胞上發(fā)生，而在較低程度上或根本不在T淋巴細(xì)胞上發(fā)生)；在核苷酸位置872(編碼HEF氨基酸序列的284位)處具有突變的丙型流感病毒，例如用異亮氨酸取代蘇氨酸，因為具有此突變的HEF表面蛋白與野生型病毒的相比，對N-乙酰基-9-O-乙?；窠?jīng)氨酸受體有明顯更強(qiáng)的親和性；丙型流感病毒HEF裂解產(chǎn)物，它含有與N-乙酰基-9-β-乙?；窠?jīng)氨酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)，因為這一結(jié)合結(jié)構(gòu)是由催化的三聯(lián)體絲氨酸71，組氨酸368或369和天冬氨酸261確定的；人γ疤疹病毒4型，因為EBV感染B細(xì)胞，人α皰疹病毒2型，因為HSV-2感染T細(xì)胞，和麻疹病毒。肌肉細(xì)胞的TS配體與肌肉細(xì)胞表面結(jié)合的配體包括例如針對于肌肉細(xì)胞，尤其是平滑肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段。這一特性的抗體的例子是抗體10F3，抗肌動蛋白的抗體，抗血管緊張肽II受體的抗體或抗生長因子受體的抗體或針對于例如EGF受體，PDGF受體或FGF受體的抗體或抗內(nèi)皮肽A受體的抗體。
TS配體進(jìn)一步包括與肌肉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性物質(zhì)，這些配體包括例如生長因子或其片段或其部分序列，所述配體與平滑肌細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，所述受體如PDGF；EGF；TGFβ；TGFα；FGF和內(nèi)皮肽A。
在本發(fā)明的意義上，TS配體也包括對肌肉細(xì)胞有嗜性的那些病毒的包膜糖蛋白，這些病毒包括例如巨細(xì)胞病毒。造血細(xì)胞的TS配體TS配體包括針對于相對未分化的血細(xì)胞上表達(dá)的受體的抗體或抗體片段，例如針對下列受體的這一特性的抗體已被描述干細(xì)胞因子受體，IL-1受體(I型)，IL-1受體(II型)，IL-3受體α，IL-3受體β，IL-6受體和GM-CSF受體。
TS配體也可進(jìn)一步包括通過其恒定區(qū)與免疫細(xì)胞上的Fc-γ受體結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或抗體片段。TS配體也包括與相對未分化的血細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有物質(zhì)，這些配體包括例如與血細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的生長因子，如SCF，IL-1，IL-3，IL-6和GM-CSF或其片段或其部分序列?；杭?xì)胞和炎性細(xì)胞的TS配體這些配體包括通過其可變區(qū)與滑液細(xì)胞或炎性細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或抗體片段，這種膜結(jié)構(gòu)的例子是波形蛋白，纖連蛋白和Fc受體。這些配體也包括通過其恒定區(qū)與Fc受體結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或抗體片段。這些配體進(jìn)一步包括與滑液細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性化合物，這些化合物包括例如細(xì)胞因子或生長因子或其片段或其部分序列，它們與滑液細(xì)胞表達(dá)的受體如IL-1-RA，TNFα，IL-4，IL-6，IL-10，IGF和TGFβ結(jié)合。這些配體進(jìn)一步包括必需成分為末端甘露糖的TS配體，它與巨噬細(xì)胞上的甘露糖6-磷酸酯受體結(jié)合。被病毒感染的細(xì)胞的TS配體TS配體也可以是針對于被病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的病毒抗原的抗體或抗體片段，例如，被HBV，HCV，HSV，HPV，HIV，EBV和HTLV病毒感染的細(xì)胞的這一特性的抗體已被描述。肝細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的TS配體TS配體包括與肝細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有物質(zhì)，這些配體包括例如與此類細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的生長因子，如細(xì)胞因子，EGF，TGF，F(xiàn)GF或PDGF或其片段或其部分序列，這些配體進(jìn)一步包括與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的TS配體，所述細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對于特殊組織而言是選擇性的。例如
表1膜結(jié)構(gòu) TS配體 組織細(xì)胞脫唾液酸糖蛋白 脫唾液酸血清類粘蛋 肝細(xì)胞白受體新糖蛋白(neoglycoprotein)半乳糖運(yùn)鐵蛋白受體運(yùn)鐵蛋白肝臟和其他組織細(xì)胞胰島素受體 胰島素 肝臟和其他組織細(xì)胞甘露糖6-磷酸酯 甘露糖 脾、肝、肺和其他組織受體中的巨噬細(xì)胞Fc-γ受體 免疫球蛋白G 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和其他組織這些配體和膜結(jié)構(gòu)參見Perales et al.，Eur.J.Biochem.226，255(1994)。在本發(fā)明意義上，TS配體具體包括對選擇性細(xì)胞有嗜性的病毒的包膜糖蛋白，如支氣管細(xì)胞呼吸道合胞病毒的糖蛋白，肝細(xì)胞丙型肝炎病毒，線狀病毒，乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒的糖蛋白。例如，肝細(xì)胞通過脫唾液酸糖蛋白受體與馬堡病毒結(jié)合或者肝細(xì)胞優(yōu)選通過脫唾液酸糖蛋白受體與HBV的pre S2和pre S1區(qū)結(jié)合。另一例子是肝臟竇狀細(xì)胞乙型肝炎病毒的糖蛋白，因為HBV通過纖連蛋白被結(jié)合。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的TS配體這些配體包括已由例如Mirsky et al.，Coakham et al.，和Mckeeveret al良導(dǎo)的針對于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，這些膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括如N-CAM的神經(jīng)粘附分子，尤其是它的多肽C鏈。
這些配體也包括與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性化合物，例如，這些配體包括在末端位置攜有甘露糖的物質(zhì)，所述物質(zhì)與甘露糖6-磷酸酯受體結(jié)合，還包括胰島素和胰島素樣生長因子和PDGF，以及與相關(guān)膜受體結(jié)合的這些生長因子的那些片段。
在本發(fā)明意義上，TS配體具體包括對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有嗜性的那些病毒的包膜糖蛋白，這些病毒的例子是HIV-1亞型JRF1和人α疤疹病毒I型。白血病細(xì)胞的TS配體這些配體包括針對于白血病細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，已描述了大量用于診斷和治療法的這一特性的單克隆抗體(見Kristensen，Danish Medical Bulletin 41，52(1994)；Schranz，TherapiaHungarica 38，3(1990)；Drexler et al.，Leuk，Res.10，279(1986)；Naeim，Dis.Markers 7，1(1989)；Stickney et al.，Curr.，Opin，Oneol，4，847(1992)；Drexler et al.，Blut 57，327(1988)；Freedman et al.，CancerInvest，9，69(1991))。根據(jù)白血病的類型，下述單克隆抗體或其與抗原結(jié)合的抗體片段適于用作配體(1)對于AML細(xì)胞，膜抗原CD13，CD14，CD15，CD33，CAMAL，Sialosyl-Le；(2)對于B-CLL膜抗原CD5，CD1c，CD23，膜免疫球蛋白的獨(dú)特型和同種型；(3)對于T-CLL膜抗原CD33，M38，IL-2受體，T細(xì)胞受體；(4)對于ALL膜抗原CALLA，CD19，非-霍奇金淋巴瘤。
TS配體進(jìn)一步包括與白血病細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性化合物，這些配體包括例如與白血病細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的生長因子或其片段或其部分序列。
這一特性的生長因子已被描述(見Cross et al.，Cell64，271(1991)；Aulitzky et al.，Drugs 48，667(1994)；Moore，Clin.CancerRes.1，3(1995)；和Van Kooten et al.，Leuk.Lymph，12，27(1993))。例如在非-霍奇金淋巴瘤的情況下為IFNα；IL-2，尤其在T細(xì)胞白血病的情況下；在T細(xì)胞，單核細(xì)胞，骨髓，紅細(xì)胞和成巨核細(xì)胞白血病的情況下為FGF；在白血病的情況下為TGFβ以及，在急性前髓細(xì)胞白血病的情況下為類視色素，如視黃酸。腫瘤細(xì)胞的TS配體這些配體包括針對于腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體和這些抗體的片段，這一特性的抗體已描述于例如Sedlacek et al.，Contrib，toOncol.32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib.toOncol.43，Karger Verlag，Munich(1992)。
其他例子的抗體抗Sialyl Lewis，被T細(xì)胞識別的腫瘤上的肽，由癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，如GD3，GD2，GM2，9-0-乙?；鵊D3和Fucosyl GM1的神經(jīng)節(jié)苷脂，血類抗原和它們的前體，多形內(nèi)皮粘蛋白上的抗原和熱休克蛋白上的抗原。接頭接頭的選擇取決于TS配體和GS配體的化學(xué)性質(zhì)以及用來通過接頭將TS配體和GS配體互相連接的方法。如果配體是肽或蛋白質(zhì)，則優(yōu)選使用肽或蛋白質(zhì)作為接頭，優(yōu)選利用肽鍵使接頭將TS配體和GS配體相互連接。優(yōu)選使用重組DNA技術(shù)將這一特性的TS配體-接頭-GS配體或TS配體-GS配體-接頭分子制備成融合蛋白。一般，有利的接頭將是內(nèi)源生成的物質(zhì)或類似內(nèi)源性物質(zhì)以限制其免疫原性。
如果TS配體不是肽或蛋白質(zhì)，最簡單形式的接頭將是連接TS配體和GS配體的結(jié)構(gòu)。用于將分子與蛋白質(zhì)上的氨基基團(tuán)，羥基基團(tuán)，SH基團(tuán)，羰基基團(tuán)或醛基結(jié)合的不同的化學(xué)綴合法可得到這一特性的結(jié)構(gòu)(見Sedlacek et al.，Contrib.to Oncol.32，42-49和81-85，KargerVerlag，Munich(1988))。
在各種情況下，接頭和GS配體自身也可以是肽或蛋白質(zhì)，此時，優(yōu)選通過肽鍵和通過使用一個化學(xué)綴合法與接頭連接實(shí)現(xiàn)接頭與GS配體間的連接，尤其在本發(fā)明實(shí)施方案C)中應(yīng)用了此方法。
接頭的選擇還取決于被GS配體結(jié)合的基因構(gòu)建體的特性，如果基因構(gòu)建體是或單獨(dú)或與非病毒載體復(fù)合的裸露的RNA或裸露的DNA，接頭優(yōu)選為具有融合特性的分子。這些融合特性便于基因構(gòu)建體穿過細(xì)胞膜并突破溶酶體從而進(jìn)入胞質(zhì)。
如果基因構(gòu)建體是病毒，可選擇具有融合特性的分子作為接頭。在本發(fā)明的意義上，優(yōu)選使用具有融合特性的接頭。接頭的融合特性可以補(bǔ)償因GS配體與病毒的結(jié)合造成的病毒外被蛋白融合特性的損害，或增強(qiáng)病毒外被蛋白的融合特性。
在本發(fā)明的意義上，病毒或細(xì)菌肽或蛋白質(zhì)以及合成肽(例如在核內(nèi)體的酸環(huán)境中形成α-螺旋的那些肽)可用作具有融合特性的接頭。具有融合特性的分子的例子是含有假單胞菌外毒素A的移位區(qū)(III區(qū))的肽(Wels et al.，Cancer Res.52，6310(1992)；Fominaga et al.，J.Biol.Chem.271，10560(1996))，含有肽GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID NO.1))的肽(Gottschalk et al.Gene Ther.3 448(1996))，含有肽AALAEA[LAEA]4LAAAAGC(SEQ ID No2))的肽(Wang etal.，Technol. Advances in Vector SVst.For Gene Ther.，May 6-7，1996，Coronado，IBC Conference)，含有麻疹病毒融合蛋白肽FAGVVLAGAALGVAAAAQI(SEQ ID NO.3)的肽(Yeagle et al.，Biochem.Biophys.Acta 1065，49(1991))，含有甲型流感病毒HA2蛋白肽GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG(SEQ ID NO.4)的肽(Luneberg et al.，J.Biol.Chem.270，27606(1995))，含有肽GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO.5)的肽(Burger et al.，Biochem.30，11173(1991))或肽GLFGAIAGFIE；(SEQ ID NO.6)，ALFGAIAGFIE；(SEQID NO.7)，LFLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.8)，LLLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.9)，LILGAIAGFIE；(SEQ IDNO.10)，GIFGAIAGFIE；(SEQ ID NO.11)，GLLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.12)，GLFAAIAGFIE；(SEQID NO.13)，GLFEAIAGFIE；(SEQ ID NO.14)，GLFGAMAGFIE；(SEQ ID NO.15)GLFGAIAGLIE(SEQ IDNO.16)或肽GLFGAIAGFIV(SEQ ID NO.17)(Steinhauer etal.，J.virol.69，6643(1995))或肽GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG(SEQ ID No.18)或肽GLLEALAELLEGGWEGLLEG(SEQ IDNO.19)(Ishiguro et al.，Biochem.32 9792(1993))。
在本發(fā)明的上下文中，進(jìn)一步使用了具有融合特性的病毒蛋白質(zhì)，大量病毒具有融合的外被蛋白，例如副粘病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒(Gaudin et al.，J.Gen.Virol.76，1541(1995))。大量病毒還具有對病毒吸附和隨后的細(xì)胞膜融合起作用的糖蛋白(Gaudin et al.，J.Gen.Virol.76，1541(1995))，通過如甲病毒屬，彈狀病毒和正粘病毒可形成此特性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明意義上的病毒融合蛋白已被描述于Hughson，Curr.Biol.5，265(1995)；Hoekstra，J.Bioenergetics Biomembranes 22，675(1990)；White，Ann.Rev，Physiol.52，675(1990))。本發(fā)明意義上的融合蛋白的例子是甲型或乙型流感病毒的血凝素，尤其是HA2成分，甲型流感病毒的M2蛋白，或單獨(dú)或與流感病毒血凝素或缺乏酶活性但卻帶來血凝作用的甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的突變體聯(lián)合使用(Ohuchi et al.，J.Virol.68，920(1994))，流感病毒血凝素的肽類似物，丙型流感病毒的HEF蛋白，HEF蛋白的融合活性通過將HEF0裂解為HEF1和HEF2亞單位而被激活，線狀病毒的跨膜糖蛋白，例如馬堡病毒和歐鮑拉病毒的跨膜糖蛋白，狂犬病病毒的跨膜糖蛋白，水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白(G)，HIV病毒的融合蛋白，尤其是gp41成分及其融合成分，仙臺病毒的融合蛋白，尤其是F1成分的33個氨基末端氨基酸，寒姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白，尤其是E1成分，蜱傳腦炎病毒的跨膜糖蛋白，人呼吸道合胞病病毒(RSV)的融合蛋白(尤其是gP37成分)，乙型肝炎病毒的融合蛋白(S蛋白)，麻疹病毒的融合蛋白，新城疫病毒的融合蛋白，維斯納病毒的融合蛋白，鼠白血病病毒的融合蛋白(尤其是p15E)，HTL病毒的融合蛋白(尤其是gp21)和猴免疫缺損病毒(SIV)的融合蛋白。
通過Mannio et al.，BioTechniques 6，682(1988)所述的借助于去污劑(如β-D-辛基吡喃葡糖苷)溶解病毒濃縮液中的外被蛋白并通過離心分離之，或者利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)方法可得到病毒融合蛋白。下述融合蛋白的制備已被描述，例如流感病毒血凝素，流感病毒血凝素的融合片段，乙型流感病毒的M2蛋白，丙型流感病毒的HEF蛋白，線狀病毒，例如馬堡病毒和歐鮑拉病毒的跨膜糖蛋白，狂犬病病毒的跨膜糖蛋白；水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白，寒姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白，蜱傳腦炎病毒的跨膜糖蛋白和HIV-1病毒的跨膜糖蛋白?；驑?gòu)建體特異性配體在本發(fā)明的上下文中，GS配體是直接或間接與基因構(gòu)建體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，它含有整個抗體分子或抗體的結(jié)合表位的片段。優(yōu)選使用人源化形式的鼠單克隆抗體以限制其免疫原性，人源化的實(shí)現(xiàn)已被描述于“TS配體的描述”這一節(jié)，是以Hoogenboom等人(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))和Winter等人(Nature 349，293(1991)所描述的方式。根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法和“TS配體的描述”這一節(jié)中已述的方法制備抗體片段和重組的Fv片段。
是否使用二價或單價片段取決于抗體特異性和基因構(gòu)建體的選擇，如果選定的抗體損害了病毒基因構(gòu)建體外被蛋白的融合活性則優(yōu)選單價抗體片段(例如Ubol et al.，J.Virol.69 1990(1995)所述)。
抗體的特異性取決于所用基因構(gòu)建體的特性，如果基因構(gòu)建體是裸露的RNA或裸露的DNA，或單獨(dú)或與非病毒載體復(fù)合，本發(fā)明的一個新實(shí)施方案是抗體的特異性是針對于那些已被引入DNA中的表位。
通過DNA的一種或多種修飾，引入或不引入外源基團(tuán)(外源基因物質(zhì))可產(chǎn)生這一特性的表位。此例包括將DNA與順式鉑氨交聯(lián)，用如氮芥，苯丙氨酸氮芥或苯丁酸氮芥的烷基化劑使鳥嘌呤的N7烷基化，將如阿霉素或道諾霉素的蒽類嵌入DNA的雙螺旋中。
具有抗經(jīng)修飾的DNA表位的結(jié)合特異性的單克隆抗體的例子包括針對于甲基化DNA，O6-乙基脫氧鳥苷(用乙基亞硝基脲處理DNA后)，N7-乙基鳥嘌呤，N5-甲基-N5-甲酰基-2，5，6-三氨基-4-羥基嘧啶，O6-甲基-2’-脫氧鳥苷，O6-乙基-2’-脫氧鳥苷，O6-正-丁基-2’-脫氧鳥苷，O6-異丙基-2’-脫氧鳥苷，O4-甲基-2’-脫氧胸苷，O4-乙基-2’-脫氧胸苷，苯丙氨酸氮芥和DNA和蒽類的加成產(chǎn)物。本申請上下文中的一些有用的表位是那些通過在DNA代謝過程中DNA的甲基化在DNA中產(chǎn)生的。
已知大腸桿菌菌株可使已引入細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA甲基化，甲基化作用發(fā)生在腺嘌呤的N6位(Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones，p18/19，VCH Publisher，Weinheim(1987))。細(xì)菌具有DNA腺嘌呤甲基化酶，該酶在細(xì)菌復(fù)制過程中特異地使N6位的腺嘌呤甲基化(Hattman et al.，J.Mol.Biol.126，367(1978))。因此，本發(fā)明具體地涉及在新的配體系統(tǒng)中，抗甲基化DNA的單克隆抗體的用途，更具體地涉及抗甲基化的腺嘌呤N6的單克隆抗體的用途。
如果基因構(gòu)建體與非病毒載體復(fù)合，本發(fā)明另一個特定的實(shí)施方案是抗體的特異性為針對于載體上的表位，這些載體包括陽離子聚合物，肽，蛋白質(zhì)，多胺或陽離子類脂，如陽離子類脂和磷脂?？惯@一特性載體的抗體的例子是抗亞精胺，精胺，腐胺，多聚賴氨酸，白蛋白和磷脂的抗體。
如果基因構(gòu)建體是病毒，抗體的特異性為抗病毒外被蛋白一個或多個相同或不同的表位。由于所用配體系統(tǒng)中的接頭優(yōu)選為融合肽或蛋白質(zhì)，也可使用通過與外被蛋白結(jié)合而損害細(xì)胞粘附和/或病毒的融合活性的抗體?？箍捎米鬏d體的病毒的外被蛋白的抗體的例子是抗鼠白血病病毒，尤其是抗外被蛋白gp70和p15的抗體，抗HIV病毒，腺病毒，單純疤疹病毒，尤其是抗此病毒的糖蛋白B，糖蛋白H，糖蛋白L和糖蛋白D的抗體，抗巨細(xì)胞病毒，尤其是抗糖蛋白B(gpB)，小鼠微小病毒，腺相關(guān)病毒，尤其是抗cap和rep蛋白，新培斯病毒，尤其是抗包膜蛋白E2或E以及牛痘病毒的抗體。
在本發(fā)明另一個有利的實(shí)施方案中，GS配體是細(xì)胞外Fc受體的一部分，上文提及的利用其抗原結(jié)合區(qū)與基因構(gòu)建體直接或間接結(jié)合的抗體之一通過其Fc部分與此Fc受體結(jié)合。
在另一個有利的實(shí)施方案中，GS配體是能與基因構(gòu)建體復(fù)合的陽離子結(jié)構(gòu)單位，如陽離子的氨基酸，陽離子的肽或蛋白質(zhì)或來源于生物的胺。這些陽離子結(jié)構(gòu)單位的例子包括賴氨酸，多聚賴氨酸，精氨酸，多聚精氨酸，組氨酸，多聚組氨酸，含有至少一個賴氨酸，一個精氨酸和/或一個組氨酸的肽以及多胺，如尸胺，亞精胺，精胺，鯡精胺或腐胺。
在另一個有利的實(shí)施方案中，GS配體是具有轉(zhuǎn)基因的病毒的外被蛋白的受體，已描述了下述病毒的這一特性的受體涉及CD4分子(可溶的或天然的)和半乳糖神經(jīng)酰胺的HIV，涉及IL-6受體和膜聯(lián)蛋白或載脂蛋白的HBV，涉及IL-2受體(β和γ鏈)的HTLV，涉及CD46分子的麻疹病毒，涉及促紅細(xì)胞生成素受體的Friend白血病病毒，涉及人免疫球蛋白G的Fc片段的人α疤疹病毒3型，涉及血型糖蛋白的仙臺病毒，涉及N-乙酰基-9-乙酰氨基-9-脫氧神經(jīng)氨酸和9-O-乙?；?N-乙酰神經(jīng)氨酸的丙型流感病毒，涉及整聯(lián)蛋白αVβ3的口蹄疫病毒，涉及補(bǔ)體受體2(CD21)的EBV和涉及275KDa甘露糖6-磷酸酯受體或46KDa甘露糖6-磷酸酯受體的單純疤疹病毒。作為至少兩個分子的復(fù)合物(“連接物”)的接頭在本發(fā)明特殊實(shí)施方案c)的意義上，連接物是含有至少兩個分子或成分的特殊類型的接頭。連接物的一個分子或成分與至少一個基因構(gòu)建體特異性配體結(jié)合，連接物的另一個分子或成分與至少一個靶細(xì)胞特異性配體結(jié)合。復(fù)合物進(jìn)一步有利地含有至少一個其他“可供選擇的接頭”，可供選擇的接頭可以是融合肽。在不止一種接頭的情況下，可供選擇的接頭在化學(xué)上可以是相同或是不同的。融合肽有利于核酸進(jìn)入靶細(xì)胞，在本發(fā)明上下文中另一個可供選擇的接頭可以是產(chǎn)生如放射性同位素的物質(zhì)的信號以允許檢測進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)合物的量。
有利的連接物的例子是抗體的絞鏈區(qū)，籍此抗體的兩條重鏈相互連接(Burbon，TIBS 15，64，(1990)；Oi et al.，Nature 307，136(1984)；Alt etal.，Science 238，1079(1987)；Lorenz，degree dissertationKonstruktionund Expression von rek.Antikorper-Enzym-Hvbridmolekulen fur dieTumortherapie[Construction and expression of rec.antibody/enzyme hybrid molecules for tumor therapy]，F(xiàn)aeulty of HumanMedicine，Marburg University(1991))。
例如，圖2的簡圖C1)中顯示了絞鏈區(qū)新的排列，絞鏈區(qū)優(yōu)選以融合蛋白的形式通過肽鍵與接頭和與GS和TS配體連接，所述融合蛋白是使用重組DNA技術(shù)制備的。
連接物的另一個例子是根據(jù)圖3中的簡圖C2)，與Gal4的Gal80-結(jié)合區(qū)(Leuther et al.，Science 256，1333(1992))聯(lián)合的Gal80蛋白(Leuther et al.，Science 256，1333(1992))。
下述實(shí)施例的目的是為了闡明而不是限制本發(fā)明，實(shí)施例中顯示了如圖4所示多功能系統(tǒng)的構(gòu)建。
實(shí)施例1TS配體的制備抗-NCAM單克隆抗體575/100/2的雜交瘤被用作TS配體的起始物質(zhì)(Jaques et al.，Cancer 72，418(1993))。通過離心分離了此雜交瘤的大約107個細(xì)胞，使用Pharmacia mRNA提取試劑盒從這些細(xì)胞中提取mRNA，然后通過使用cDNA合成試劑盒和隨機(jī)六寡核苷酸(Pharmacia)的逆轉(zhuǎn)錄將此mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，此cDNA被用作通過使用特定的引物(Clackson et al.，Nature 352，624(1991))的聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki et al.，Science 230，1350(1985))擴(kuò)增免疫球蛋白的可變重鏈或可變輕鏈的起始物質(zhì)。同時，引物引入了限制性酶切位點(diǎn)以將片段克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pHENIS(從pHENI衍生而來；Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.19，4133(1991)；見圖5)。此載體含有pelB信號序列以供外周質(zhì)分泌，myc標(biāo)記物以供用單克隆抗體9E10來檢測，組氨酸標(biāo)記物以通過固定化的金屬親和層析(IMAC)純化，還含有重鏈和輕鏈的編碼區(qū)和編碼14個氨基酸長的甘氨酸-絲氨酸接頭的短序列。另外，為了在噬菌體表面展示，應(yīng)與g3β蛋白融合。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?VH用SfiI和ShoI；VL用ApaLI和NotI)消化重鏈和輕鏈并依次克隆到載體中，從而得到含有通過短肽序列共價連接的可變重鏈和輕鏈的重組單鏈Fv片段。
實(shí)施例2GS配體的制備通過在N6-甲基腺嘌呤-BSA或N6-甲基腺嘌呤-甲狀腺球蛋白綴合物上生物淘選(Beiser et al.，Methods Enzymol.XII，889(1968)從天然或半合成的抗體文庫中選擇對N6-甲基腺嘌呤(Sigma)有特異性的重組抗體(Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994))。通過ELISA在被抗原包被的微量滴定板中鑒定陽性抗體片段(Nissim et al.，EMBOJ.13，692(1994))。得自這些文庫中的抗體已經(jīng)是所需的單鏈Fv形式，可被直接用于隨后的克隆。
實(shí)施例3接頭的制備具有氨基酸序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ IDNO.1，Gottschalk et al.，1996)的融合肽被用作接頭，編碼此肽的DNA被制備成雙鏈合成寡核苷酸，在其末端偶聯(lián)有適當(dāng)?shù)南拗菩郧懈钗稽c(diǎn)(Ascl和XbaI)。為此，根據(jù)制造商的說明，使用T4多多核苷酸激酶(Gibco)使兩個合成的寡核苷酸O1(5’GGCCGCAGGCTTATTTGAGGCCCTTCTGGAATTGCTAGAGAGCCTCTGGGAATTGCTTCTGGAGGCAT，SEQ ID No.20)和O2(5’CTAGATGCCTCCAGAAGCAATTCCCAGAGGCTCTCTAGCAATTCCAGAAGGGCCTCAAATAAGCCTG，SEQ ID No.21)磷酸化，加熱至80℃達(dá)5分鐘，然后緩慢冷至室溫，此雙鏈DNA片段被直接用于隨后的克隆。
實(shí)施例4多功能配體的制備在表達(dá)載體pAB1(按與pHENIS相似的方法構(gòu)建，但不包括與g3p融合；見圖5)中以3-片段克隆的形式制備完整的配體系統(tǒng)。被限制性酶SfiI和NotI切割的抗-NCAM單鏈Fv片段(TS配體)，含有克隆位點(diǎn)NotI和XbaI的接頭以及抗-N6-甲基腺嘌呤單鏈Fv片段(GS配體)被用作起始物質(zhì)。為了克隆，使用分別在N末端和C末端插入限制性切割位點(diǎn)XbaI和AscI的引物重新擴(kuò)增GS片段，這些片段被克隆到已被限制性酶SfiI和AscI切割的pAB1載體中，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌菌株TG1中，配體系統(tǒng)的表達(dá)受細(xì)菌lacZ啟動子的調(diào)節(jié)，并通過加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)配體系統(tǒng)的表達(dá)(如McCafferty et al.，Appl.Biochem.Biotech.47，157(1994)所述)。根據(jù)Griffiths et al.，EMBO J.13，3245(1994)的方法使用IMAC從外周質(zhì)制品中純化經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)，總蛋白質(zhì)的分子量約為55,000道爾頓，表現(xiàn)為單聚體。
實(shí)施例5檢測多功能配體的運(yùn)作使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖表達(dá)NCAM的腫瘤細(xì)胞(小細(xì)胞支氣管癌)并分離之。通過在大腸桿菌中繁殖質(zhì)粒(含有β-葡糖醛酸酶的結(jié)構(gòu)基因，見專利申請WO96/06940)來制備腺嘌呤的N6已甲基化的DNA。
以20∶1的摩爾比將多功能配體系統(tǒng)與質(zhì)粒DNA混合，將混合物置于37℃下保溫30分鐘，通過ELISA檢查質(zhì)粒DNA的結(jié)合，將含有多功能配體和質(zhì)粒的復(fù)合物與腫瘤細(xì)胞以10∶1的比例相混合，混合物置于37℃下保溫1小時，洗滌腫瘤細(xì)胞部分，通過免疫熒光法檢查復(fù)合物與這些腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，余下的腫瘤細(xì)胞再保溫24小時，通過使用4-甲基繖形基-β-葡糖苷酸作為底物檢測培養(yǎng)基中β-葡糖苷酸酶的酶活性可測定復(fù)合物被成功地攝入細(xì)胞，接頭介導(dǎo)的從核內(nèi)體中的釋放以及效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
權(quán)利要求
1.用于靶細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移核苷酸序列的多功能配體系統(tǒng)，含有至少一種靶細(xì)胞特異性配體，至少一種含有抗體或抗體部分的基因構(gòu)建體特異性配體，和連接這兩個配體的接頭，其中所述系統(tǒng)是非免疫原性的。
2.如權(quán)利要求1所要求的配體系統(tǒng)，進(jìn)一步含有將所述兩個配體連接在一起的連接物，其中連接物含有兩個接頭。
3.如權(quán)利要求1或2所要求的配體系統(tǒng)，其中所述靶細(xì)胞特異性配體與靶細(xì)胞表面結(jié)合。
4.如權(quán)利要求1-3中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述靶細(xì)胞特異性配體選自由下列物質(zhì)組成的組生長因子，細(xì)胞因子，干擾素，腫瘤壞死因子，趨化因子，肽激素、血管緊張肽，細(xì)胞分裂素，組胺，類固醇激素，粘附分子，VDL受體的配體，LDL受體的配體，氧化的LDL受體的配體，LDL相關(guān)受體蛋白的配體，IgGFc受體的配體，88KDa糖蛋白受體的配體，乙酰化的LDL受體的配體，megalin配體和維生素。
5.如權(quán)利要求1-3中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述靶細(xì)胞特異性配體是與靶細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片段。
6.如權(quán)利要求5所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體片段選自由下列物質(zhì)組成的組F(ab)2片段，F(xiàn)ab片段，雙鏈Fv片段，單鏈Fv片段和Fc片段。
7.如權(quán)利要求1-3中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述靶細(xì)胞特異性配體是由抗體Fc片段識別的Fc受體的細(xì)胞外區(qū)。
8.如權(quán)利要求5-7中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體或抗體片段至少部分來源于人。
9.如權(quán)利要求1-8中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述基因構(gòu)建體特異性配體選自由下列物質(zhì)組成的組抗體，抗體片段，陽離子結(jié)構(gòu)單位和病毒外被蛋白的受體。
10.如權(quán)利要求9所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體片段選自由下列物質(zhì)組成的組F(ab)2片段，F(xiàn)ab片段，雙鏈Fv片段和單鏈Fv片段。
11.如權(quán)利要求1-8中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述基因構(gòu)建體特異性配體是由抗體Fc片段識別的Fc受體的細(xì)胞外區(qū)。
12.如權(quán)利要求1-11中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體或抗體片段至少部分來源于人。
13.如權(quán)利要求1-12中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體或所述抗體片段與通過將外源物質(zhì)與核酸結(jié)合，使核酸甲基化或使核酸烷基化而引入的核酸表位特異性結(jié)合。
14.如權(quán)利要求1-13中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體或所述抗體片段與非病毒載體上的表位結(jié)合。
15.如權(quán)利要求14所要求的配體系統(tǒng)，其中所述非病毒載體選自由下列物質(zhì)組成的組陽離子聚合物，肽，蛋白質(zhì)，生物來源的胺、多胺，類脂和磷脂。
16.如權(quán)利要求1-15中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述抗體或所述抗體片段與病毒外被蛋白的表位結(jié)合。
17.如權(quán)利要求16所要求的配體系統(tǒng)，其中所述病毒選自由下列物質(zhì)組成的組鼠白血病病毒，HIV，腺病毒，單純皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒，小鼠的微小病毒，腺相關(guān)病毒，新培斯病毒和牛痘病毒。
18.如權(quán)利要求9所要求的配體系統(tǒng)，其中所述陽離子結(jié)構(gòu)單位單獨(dú)或聯(lián)合含有至少一個賴氨酸殘基，至少一個精氨酸，至少一個組氨酸和至少一個多胺。
19.如權(quán)利要求2-18中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述連接物含有與功能性殘基共價連接的組成成分，功能性殘基選自由下列物質(zhì)組成的組氨基殘基，羥基殘基，SH殘基，羰基殘基和醛殘基。
20.如權(quán)利要求2-19中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中至少一個所述接頭是融合物質(zhì)。
21.如權(quán)利要求20所要求的配體系統(tǒng)，其中所述融合物質(zhì)選自由下列物質(zhì)組成的組合成融合肽，細(xì)菌融合膚或蛋白質(zhì)和膚或蛋白質(zhì)與病毒之間的融合產(chǎn)物。
22.如權(quán)利要求2-21中任一個所要求的配體系統(tǒng)，其中所述連接物含有抗體絞鏈區(qū)或與Gal4蛋白結(jié)合的Gal80蛋白。
23.如權(quán)利要求1所要求的配體系統(tǒng)，含有(a)含有抗NCAM重組單鏈Fv片段的靶細(xì)胞特異性配體，其中通過短肽序列使Fv片段的可變重鏈和輕鏈共價連接；(b)含有融合肽的接頭，所述融合肽具有序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID No.1)和(c)含有N6-甲基腺嘌呤的重組抗體的基因構(gòu)建體特異性配體。
24.如權(quán)利要求23所要求的配體系統(tǒng)，進(jìn)一步含有基因構(gòu)建體。
25.如權(quán)利要求24所要求的配體系統(tǒng)，其中所述基因構(gòu)建體選自由下列物質(zhì)組成的組裸露的RNA，質(zhì)粒，與陽離子聚合物，肽，蛋白質(zhì)，或類脂結(jié)合的裸露的核酸或質(zhì)粒，和病毒。
26.權(quán)利要求1-25中任一個所要求的配體系統(tǒng)在制備用于預(yù)防或治療皮膚病，粘膜病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，內(nèi)部器官疾病，血凝結(jié)疾病，造血系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，肌肉系統(tǒng)疾病和支持組織或關(guān)節(jié)病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及非免疫原性的可對核苷酸序列進(jìn)行細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移的多功能配體系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括至少一種靶細(xì)胞特異性配體,至少一種接頭和至少一種基因構(gòu)建體特異性配體,基因構(gòu)建體特異性配體有利地含有直接或間接與基因構(gòu)建體結(jié)合的抗體或其部分。本發(fā)明還涉及配體系統(tǒng)在制備用于預(yù)防或治療皮膚病,粘膜病,神經(jīng)系統(tǒng)疾病,內(nèi)部器官疾病,血液凝結(jié)疾病,造血系統(tǒng)疾病,免疫系統(tǒng)疾病,肌肉系統(tǒng)疾病和支持組織或關(guān)節(jié)病的藥物或疫苗中的用途。
文檔編號A61K48/00GK1188149SQ9710858
公開日1998年7月22日 申請日期1997年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月28日
發(fā)明者H－H·塞德拉西克, R·默勒 申請人:赫徹斯特股份公司