專利名稱：：聚乙二醇化試劑及由其形成的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及聚乙二醇的活性衍生物和相關(guān)的親水性聚合物，并涉及在修飾表面和分子特性中所使用的合成方法。本發(fā)明也涉及與此活性物共價(jià)結(jié)合的多肽和制備該多肽的方法。
背景技術(shù)：
：已研究將聚乙二醇(“PEG”)用于藥物中，人造植入物上和其它生物相容性重要的應(yīng)用中。已提出各種PEG衍生物具有允許PEG與藥物和植入物和與分子和表面結(jié)合的活性部分。例如，已建議使PEG與表面偶合的PEG衍生物，以控制濕潤(rùn)、靜態(tài)組合和其它類型的分子與表面的結(jié)合，包括蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)殘基。也已提出將PEG用于如從細(xì)胞塊中親和分離酶類。在親和性分離中，PEG衍生物包含與酶可逆偶聯(lián)的官能團(tuán)，該酶包含在細(xì)胞塊中。從細(xì)胞塊中分出PEG和酶的共軛物，如果需要，然后從PEG衍生物上分出酶。在另外的例子中，需要使PEG衍生物(“聚乙二醇化”)偶聯(lián)來克服在臨床中使用生物活性分子時(shí)所遇到的障礙。公開的PCT公開號(hào)WO92/16221中描述例如，已發(fā)現(xiàn)許多具有有效治療作用的蛋白質(zhì)在血清中的半衰期短。就絕大部分而言，通過腎臟將蛋白質(zhì)從血液中清除了。系統(tǒng)攝入較多的蛋白質(zhì)(特別是人系統(tǒng)之外的那些蛋白質(zhì))時(shí)，會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這樣可導(dǎo)致通過形成免疫復(fù)合物而從體內(nèi)快速排斥該蛋白質(zhì)。對(duì)于其它蛋白質(zhì)來說，溶解性和凝集問題也妨礙了蛋白質(zhì)的最佳配制。聚乙二醇化通過增加分子的表觀分子量來減小從血液中的清除速率。對(duì)于一定大小的分子來說，蛋白質(zhì)濾過腎小球的速率與蛋白質(zhì)大小成反比。所以聚乙二醇化減小清除的能力通常不是吸附在蛋白質(zhì)上PEG基團(tuán)多少的函數(shù)，但與改變的蛋白質(zhì)的總分子量有關(guān)。清除速率的減小可使功效比非聚乙二醇化的物質(zhì)有所增加。如參見Conforti等，藥物研究通信第19卷，287頁(yè)(1987)和Katre等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，第84卷，1487頁(yè)(1987)。另外，聚乙二醇可減小蛋白質(zhì)的凝集作用(Suzuki等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)第788卷，248頁(yè)(1984))，改變蛋白質(zhì)的免疫原性(Abuchowski等生物化學(xué)雜志，第252卷，3582頁(yè)(1977))，并增加蛋白質(zhì)的溶解性，如在PCT公開號(hào)WO92/16221中所述。蛋白質(zhì)的聚乙二醇化說明了在將PEG吸附在表面和分子上時(shí)所遇到的一些問題。絕大多數(shù)聚乙二醇化試劑與多肽中游離的伯胺基進(jìn)行反應(yīng)。大多數(shù)這樣的游離胺是賴氨酸殘基的ε氨基。通常的蛋白質(zhì)含有大量的賴氨酸。其結(jié)果是，隨機(jī)吸附多個(gè)PEG分子而常常使蛋白質(zhì)失活。另外，如果打算將聚乙二醇化的蛋白質(zhì)用于治療，由非特異的聚乙二醇化所產(chǎn)生的多種物質(zhì)混合物導(dǎo)致難以制備具有再現(xiàn)性和可定性的產(chǎn)物。這種非特異性的聚乙二醇化使得難以評(píng)價(jià)其治療作用，也難以建立其效能和劑量信息。該類蛋白質(zhì)位點(diǎn)選擇性聚乙二醇化可產(chǎn)生再現(xiàn)性修飾的物質(zhì)，獲得所需的PEG化而沒有失活。對(duì)再現(xiàn)性地生產(chǎn)連接兩個(gè)或多個(gè)生物活性分子或化合物的復(fù)合物的需求也是存在的。在某些情況下，使用含有多于一個(gè)的生物活性多肽或藥物的多聚體(multimeric)復(fù)合物產(chǎn)生協(xié)同性的有益作用。例如，與單體(monomeric)多肽相比，含有兩個(gè)或多個(gè)相同結(jié)合多肽的復(fù)合物與配體或活性部位的親和性可有很大增加。另外，含有(1)在體內(nèi)的特定部位起作用的生物活性蛋白質(zhì)和(2)可將復(fù)合物導(dǎo)向特定部位的分子可能是特別有利的。對(duì)水解穩(wěn)定的激活的聚合物也存在著需要，該聚合物形成水解穩(wěn)定的鍵。否則的話，在某些情況下，所需反應(yīng)進(jìn)行之前活性基團(tuán)失活或反應(yīng)后所形成的共軛物在水性介質(zhì)(如血液或血漿)中半衰期短。例如，Zalipsky的美國(guó)專利5122614描述用氧羰基-N-二甲酰亞氨(oxycarbonyl-N-dicarboximide)官能團(tuán)活化的PEG分子可在水性堿性條件下通過尿烷鍵合被結(jié)合到多肽的氨基上。表明活化的PEG-N-琥珀酰亞胺碳酸鹽與胺基形成穩(wěn)定的水解耐受的尿烷鍵。顯示胺基在約8.0到9.5的堿性pH下反應(yīng)性更強(qiáng)，而在低pH下，反應(yīng)活性急劇下降。然而在pH8.0到9.5時(shí)，未偶聯(lián)的PEG衍生物的水解也急劇增加。Zalipsky通過使用過量的PEG衍生物與蛋白質(zhì)結(jié)合來避免未偶聯(lián)PEG衍生物與水反應(yīng)速率增加的問題。通過使用過量的PEG衍生物，在PEG衍生物水解和不能反應(yīng)之前，將足量的活性氨基部位結(jié)合到PEG上來修飾蛋白質(zhì)。Zalipsky的方法足以將蛋白質(zhì)的賴氨酸部分非特異性地連接到PEG衍生物的PEG上的一個(gè)活性部位。然而，如果PEG衍生物的水解速率大時(shí)，可產(chǎn)生與PEG分子上的多個(gè)反應(yīng)部位結(jié)合的問題，因?yàn)楹?jiǎn)單的過量不減慢水解的速度。例如，在每個(gè)末端具有活性部位的線性PEG在一個(gè)末端與蛋白質(zhì)結(jié)合而另一末端的反應(yīng)部位可與水反應(yīng)形成較不活潑的羥基部分而未使PEG連接兩個(gè)蛋白質(zhì)。如果需要將一個(gè)分子通過PEG連結(jié)劑偶聯(lián)到表面上，出現(xiàn)類似的問題，因?yàn)镻EG首先與表面連結(jié)或偶聯(lián)到分子上，并且PEG衍生物的另一端必須保持活性以便隨后進(jìn)行反應(yīng)。如果有水解問題，那么另一端通常是失活的。Zalipsky的美國(guó)專利5122614也描述了由先有的專利獲得的一些其它PEG衍生物。表明PEG-琥珀酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯形成限制水介質(zhì)中穩(wěn)定性的酯鍵。表明PEG-氰尿酰氯是有毒的并與可導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活的蛋白質(zhì)上的特定官能基發(fā)生非特異性反應(yīng)。PEG-苯基碳酸酯產(chǎn)生有毒的疏水性苯酚殘基，該殘基對(duì)蛋白質(zhì)有親和性。用羰基二咪唑(carbonyldiimidizole)活化的PEG在與蛋白質(zhì)官能基反應(yīng)時(shí)非常緩慢，需要長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間來獲得足夠修飾的蛋白質(zhì)。已提出其它與非賴氨酸ε氨基官能基連結(jié)的PEG衍生物。例如，馬來酰亞胺特異于半胱氨酸的巰基但馬來酰亞胺官能度易于水解。因此，需要存在再現(xiàn)性地產(chǎn)生其各部分由非抗原性的高度溶解的生物惰性分子連結(jié)的分子的試劑和方法。本發(fā)明滿足了對(duì)此復(fù)合物的需求并產(chǎn)生了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明也滿足了對(duì)形成水解穩(wěn)定性共軛物所需的水解穩(wěn)定性試劑的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及生物活性的共軛物，它含有具有反應(yīng)性硫羥部分的生物活性分子和具有與反活應(yīng)硫羥部分形成鍵的活性砜部分的非肽聚合物。生物活性分子可以是合成的，天然產(chǎn)生的或修飾天然產(chǎn)物獲得的分子。可將擁有所需生物活性的分子修飾為含有反應(yīng)性硫羥部分的。特別有用的生物活性分子包括腫瘤壞死因子(“TNF”)抑制劑，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(“IL-lra′s”)，CR1，PDGF的外顯子6肽和白細(xì)胞介素-2(“IL-2”)抑制劑和受體(“IL-2r”)。本發(fā)明聚合物含有至少一個(gè)活性砜部分并具有式P-SO2-C-C*-，其中P為聚合物且C*為與硫羥部分鍵合的反應(yīng)性部位。硫羥和活性砜的連結(jié)之處為C*，且可用式P-SO2-C-C*S-R來表示，其中R為生物活性分子。有用的活性砜部分包括，如，乙烯砜和氯乙基砜。各種聚合物可被活化用于本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，包括水溶性聚合物如聚乙二醇(“PEG”)和相關(guān)的親水性聚合物。本發(fā)明也提供用砜活化的聚合物來制備上文所述生物活性共軛物的方法。該方法包括下列步驟(a)將具有反應(yīng)性硫羥部分的生物活性分子與具有活性砜部分的非肽聚合物反應(yīng)而形成共軛物；和(b)分離該共軛物。含有該共軛物的藥物組合物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及用于偶聯(lián)各種分子、化合物和表面的砜活化的聚合物。該活化的砜部分與上文所述相同。特別有用的活化聚合物包括用砜部分PEG分子的一個(gè)部位和用NHS-酯或馬來酰亞胺官能度在另一個(gè)部位活化的雙官能PEG衍生物。本發(fā)明還包括基本純的具有式R1-X-R2的生物活性化合物，稱作“啞鈴”)，其中當(dāng)化合物分離時(shí)，至少R1或R2之一為保留其生物活性的生物活性分子。生物活性分子具有反應(yīng)性硫羥部分，它與非肽聚合物上的邁克爾受體基團(tuán)形成鍵。適用于本發(fā)明的生物活性分子包括上文所述的那些。有用的邁克爾受體基團(tuán)包括，如，乙烯砜和馬來酰亞胺?？捎眠~克爾受體功能基活性的聚合物包括上文所述的水溶性聚合物。R1和R2可為相同或不同的部分。當(dāng)R基團(tuán)相同時(shí)，該化合物為均勻啞鈴(homodumbbell)；當(dāng)R基團(tuán)不同時(shí)，該化合物為不均勻啞鈴(heterodumbell)。特別有用的均勻啞鈴如包括PEG連結(jié)的TNF抑制劑和PEG連結(jié)的IL-lra′s。有用的不均勻啞鈴如包括由IL-2r-α和IL-2r-β形成的、抑制補(bǔ)體系統(tǒng)常規(guī)通道的不均勻啞鈴和由IL-lra和PDGF的外顯子6形成的不均勻啞鈴。制備啞鈴化合物的方法包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。制備啞鈴R1-X-R2的方法包括下列步驟(a)X與R1和R2反應(yīng)形成R1-X-R2；和(b)純化R1-X-R2。在上文制備啞鈴方法的步驟(a)中可進(jìn)一步包括下列步驟保護(hù)X的一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)以在X上形成保護(hù)基；將具有保護(hù)基的X與R1反應(yīng)形成R1-X；脫去X上的保護(hù)基；和將R1-X與R2反應(yīng)形成R1-X-R2。另外，步驟(a)還可包括下列步驟過量的X與R1反應(yīng)形成R1-X；和R1-X與R2反應(yīng)形成R1-X-R2。含有基本上純的R1-X-R2化合物的藥物組合物也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明提供生物活性軛合物，它含有(1)具有反應(yīng)性硫羥部分的生物活性分子，和(2)具有與生物活性分子的硫羥部分形成鍵的活性砜部分的非肽聚合物?！败椇衔铩币庵笍?fù)合物，它由具有活性硫羥部分的生物活性分子與具有活性砜部分的非肽聚合物通過硫羥和砜之間的鍵結(jié)合而成。如上所述，本發(fā)明的軛合物為生物活性的?！吧锘钚缘摹币庵冈隗w外或體內(nèi)能夠產(chǎn)生生物作用。生物活性分子包括但不局限于能在天然生物分子之間或在生物系統(tǒng)如細(xì)胞或生物上誘導(dǎo)生物作用的任何化合物。證明生物活性的方法包括體外生物測(cè)定法，許多在本領(lǐng)域中公知的測(cè)定方法。例如，可通過測(cè)定抑制劑是否與TNF結(jié)合或抑制劑是否阻斷某些細(xì)胞的TNF-介導(dǎo)的溶解來測(cè)量腫瘤壞死因子“(TNF”)抑制劑的生物活性。在公開的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?01136739中描述了后者的生物測(cè)定法，該文獻(xiàn)引入本文供參考。生物活性分子包括但不局限于藥物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物、核酸、氨基酸、多肽、酶輔助因子、甾類化合物、碳水化合物、器官物質(zhì)如肝素、含金屬的試劑、受體激動(dòng)劑、受體拮抗劑、結(jié)合蛋白質(zhì)、受體或部分受體，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面分子、抗原、半抗原、靶基團(tuán)和螯合劑。關(guān)于受體包括所有形式的受體，不管其是否是以單一形式存在。本文中使用的“多肽”和“蛋白質(zhì)”為同義詞，意指基本上為天然蛋白樣性質(zhì)的任何化合物。然而，多肽組可含有某些非肽成分。例如，糖基化的多肽或合成修飾的蛋白質(zhì)包括在本發(fā)明定義的范圍之內(nèi)?！鞍谢鶊F(tuán)”可為位于生物系統(tǒng)中的化合物?？赏ㄟ^其對(duì)特定配體的親和性來描述結(jié)合蛋白質(zhì)和受體。在公開的PCT公開號(hào)WO92/16221中描述了許多本發(fā)明中有用的多肽，該文獻(xiàn)引入本文供參考。這些蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中是公知的。特別有用的多肽為TNF結(jié)合蛋白質(zhì)，也稱作TNF抑制因子。在本文中將“TNF結(jié)合蛋白質(zhì)“定義為結(jié)合TNF的蛋白質(zhì)。TNF結(jié)合蛋白質(zhì)(“TNFbp”)為p55TNF受體或TNF受體I的胞外部分。在體內(nèi)，脫下的受體的胞外部分在血液中作為與TNF結(jié)合的30kDa糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行循環(huán)。該結(jié)合的蛋白質(zhì)也被作TNFbp-I或30kDaTNFbp。在出版的歐洲專利申請(qǐng)90113673.9中描述了該TNF結(jié)合蛋白質(zhì)的純化方法和氨基酸及核酸序列，該文獻(xiàn)引入本文供參考。該出版的文獻(xiàn)也指導(dǎo)重組生產(chǎn)該TNF抑制劑的糖基化和脫糖基化形式。盡管該抑制劑脫糖基化形式的實(shí)際分子量約為18kDa，但術(shù)語(yǔ)“30kDaTNF抑制劑”包括糖基化和脫糖基化形式。本文所使用的“天然產(chǎn)生的”、“天然的”和“野生型”為同義詞。歐洲專利申請(qǐng)90113673.9(本文參考文獻(xiàn))也描述了另一種TNF抑制劑(稱作40kDaTNF抑制劑)的純化和氨基酸及核酸序列。該天然產(chǎn)生形式的抑制劑(也稱作TNFbp-II)為p75或p85TNF受體的糖基化胞外部分。歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?0112673.9也教導(dǎo)了重組生產(chǎn)該“40kDa”抑制劑的糖基化和脫糖基化形式。在該出版的文獻(xiàn)中描述了天然40kDaTNF抑制劑的核酸和氨基酸序列。盡管脫糖基化形式的分子量不為40kDa，但將TNFbp的糖基化形式和脫糖基化形式均稱作“40kDaTNF抑制劑”。歐洲專利申請(qǐng)90112673.9(本文參考文獻(xiàn))還教導(dǎo)了重組生產(chǎn)兩種TNF抑制劑，它們?yōu)槿L(zhǎng)“40kDa”結(jié)合蛋白質(zhì)的一部分。這兩種截短物被稱作“Δ51”和“Δ53”TNF抑制劑。在該出版參考文獻(xiàn)中描述了Δ51和Δ53抑制劑的氨基酸和核酸序列。其它特別有用的多肽包括白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(“IL-lra′s”)(在美國(guó)專利5075222中描述，引入本文供參考)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白質(zhì)(“IGFbps”)，CTLA4和血小板衍生生長(zhǎng)因子(“PDGF”)的外顯子6、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(“GDNF”)。睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(“CNTF”)、白細(xì)胞介素-4-受體(“IL-4r”)和抑制劑、以及白細(xì)胞介素-1受體(“IL-2r”)。Hannum等在美國(guó)專利5075222中描述了編碼天然產(chǎn)生的IL-lra的核酸和在大腸桿菌中表達(dá)該蛋白質(zhì)的方法。在出版的PCT公開號(hào)WO92/16221中討論了IL-2受體和CR1的特征、編碼它們的核酸及其制備方法，該文獻(xiàn)引入本文供參考。本發(fā)明軛合物中連結(jié)聚合物的生物活性分子在形成鍵之前具有反應(yīng)性硫羥部分?！胺磻?yīng)性硫羥部分”意指能與本文所述活性聚合物反應(yīng)的-SH基團(tuán)。反應(yīng)性硫羥基的例子是氨基酸半胱氨酸的-SH。許多蛋白質(zhì)沒有游離的半胱氨酸(不包含在二硫鍵中的半胱氨酸)或任何其它反應(yīng)性硫羥基團(tuán)。另外，半胱氨酸的硫羥基不適于與聚合物鍵合，因?yàn)榱蛄u基是生物活性所必需的。另外，蛋白質(zhì)為了活性必須折疊成一定的構(gòu)型。在活性構(gòu)型中，半胱氨酸不能與砜反應(yīng)，因?yàn)樗宦癫卦诘鞍踪|(zhì)的內(nèi)部。而且，甚至易接近的半胱氨酸硫羥基(不是活性所必需的)可能是位于不適于與聚合物形成鍵的部位?；钚缘姆潜匦璋被岜环Q作“非必需的”。非必需半胱氨酸可能是不適于結(jié)合的部位，因?yàn)榕c活性部位有關(guān)的半胱氨酸的位置在與聚合物結(jié)合后導(dǎo)致多肽失活。象蛋白質(zhì)一樣，許多其它生物活性分子具有不適于與聚合物結(jié)合(出于上文所述的類似原因)的反應(yīng)性硫羥基或不含有反應(yīng)性硫羥基。因此，當(dāng)必需或合乎需要時(shí)，本發(fā)明期望將反應(yīng)性硫羥基引入生物活性分子中。也可將硫羥基引入非活性分子來形成生物活性分子只要硫羥-砜鍵不破壞所需活性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法來引入反應(yīng)性硫羥基。可用多肽或非肽分子來進(jìn)行化學(xué)修飾，且包括單獨(dú)或作為較大基團(tuán)的部分(如半胱氨酸殘基)將硫羥基引入分子中。Jue，R.等在Biochemistry，17，pp，5399-5406(1978)中描述了化學(xué)引入硫羥基的例子。也可通過用如DTT化學(xué)還原半胱氨酸而在多肽中產(chǎn)生游離的半胱氨酸。在某一位置被修飾為含氨基酸殘基的多肽被稱作“突變型蛋白”，該位置在修飾之前的天然蛋白質(zhì)中是不存在的。為了產(chǎn)生半胱氨酸的突變型蛋白，用可加到多肽上的半胱氨酸或半胱氨酸殘基取代非必需氨基酸。引入非天然半胱氨酸的可能部位包括糖基化部位和多肽的N端或C端。賴氨酸突變?yōu)榘腚装彼嵋彩呛线m的，因?yàn)樵谄浠钚詷?gòu)型的蛋白質(zhì)的表面上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)賴氨酸殘基。另外，在選擇可能的突變部位中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何關(guān)于多肽結(jié)合或活性部位的已知信息。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可使用公知的重組DNA技術(shù)來制備半胱氨酸突變型蛋白。通過標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)突變可改變編碼天然多肽的核酸來編碼突變型蛋白。Kunkel，T.A.在ProcNat.Acad.Sci.，第82卷，第488-492(1985)中和Kunkel，T.A.等在MethodsEnzymol.，第154卷，第367-382(1987)中描述了標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)的例子，為兩篇均引入本文供參考。另外，可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)化學(xué)合成編碼突變型蛋白的核酸。可使用DNA合成儀并如從AppliedBiosystem(FosterCity，CA)購(gòu)得?？稍诟鞣N表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所需突變蛋白的核酸，包括動(dòng)物、昆蟲和細(xì)菌系統(tǒng)。當(dāng)在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中重組生產(chǎn)突變型蛋白時(shí)，進(jìn)行下列步驟1)通過定點(diǎn)突變編碼天然多肽的核酸來產(chǎn)生編碼所需突變型蛋白的核酸；2)在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所需突變型蛋白的核酸；3)從細(xì)菌中分離突變型蛋白并純化；4)如果未適當(dāng)折疊，在半胱氨酸或另一個(gè)含硫羥基的化合物存在下將突變型蛋白質(zhì)重新進(jìn)行折疊；5)分離重新折疊的突變型蛋白并純化；6)用弱還原劑處理純化并重新折疊的靶突變型蛋白；7)在無氧條件下，將反應(yīng)混合物透析。如下文所述，在與聚合結(jié)合之前，從反應(yīng)混合物中分出突變型蛋白，但并不總需要這樣。在步驟6中特別有用的還原劑是二硫蘇糖醇(“DTT”)或三-(羧基乙基磷化氫)(“TCEP”)。TCEP是有用的，因?yàn)樵谟昧蛄u特異性PEG試劑軛合前不需要被移走。見Burns，J.A.等，J.org.Chem.第56卷，第8期，第2648-2650頁(yè)(1991)。制備所需突變蛋白之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)該突變型蛋白進(jìn)行生物測(cè)定，并將該突變型蛋白的活性與天然多肽進(jìn)行比較。按照下文更充分的討論，甚至在突變型蛋白的相對(duì)活性被降低時(shí)，由突變型蛋白形成軛合物可能也是特別有用的。例如，相對(duì)于未共軛的分子來說，該軛合物在生物系統(tǒng)中溶解性增加、抗原性或免疫原性減小或清除時(shí)間縮短。生物活性分子在藥代動(dòng)力學(xué)方面的這種改善可增加該分子在各種治療應(yīng)用方面的價(jià)值。溶解性的增加也可提高該分子體外診斷應(yīng)用的價(jià)值。表1列出所生產(chǎn)的IL-lra的突變型蛋白。在出版的PCT專利公開WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))中描述了IL-lra突變型蛋白的制備和純化。按WO92/16221所述序列給殘基編號(hào)，“O”表示加成到N端的氨基酸；“C”指半胱氨酸和“S”指絲氨酸。例如“COS116”意指將半胱氨酸插入N端且絲氨酸插入116位。天然IL-lra在66、69、116和122位上有游離半胱氨酸殘基。表1IL-lra的突變型蛋白表2顯示也已被制備的30kDaTNF抑制劑的突變型蛋白質(zhì)。天然30kDaTNF抑制劑(不象IL-lra)沒有任何游離的半胱氨酸殘基。這些突變型蛋白按出版的PCT公開號(hào)WO92/16221(本文的參考文獻(xiàn))所述方法來制備，并按該文獻(xiàn)所述的氨基酸序列來編號(hào)。表230kDaTNF抑制劑的突變型蛋白本發(fā)明的突變型蛋白和其它多肽包括蛋白質(zhì)序列的等位變異和基本上等同的蛋白質(zhì)?！盎旧系韧币庵妇哂袠O高程度的氨基酸殘基同源性(通常見，M.Dayhoff，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖，第5卷，124頁(yè)，(1972)，NationalBiochemicalResearchFoundation，Washington，D.C.，引入本文供參考)并具有相似的生物活性?；旧媳３痔烊欢嚯幕蛲蛔冃偷鞍椎纳锘钚缘奶烊欢嚯幕蛲蛔冃偷鞍椎慕囟绦问揭舶ㄔ诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的軛合物除含具有反應(yīng)性硫羥部分的生物活性分子之外，還含有非肽聚合衍生物，它具有活性砜部分?！胺请摹币庵妇哂猩儆?0％(重量)的α氨基酸殘基。聚合衍生物的聚合物部分如可為聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇(“PPG”)、聚氧乙烯化的甘油(“POG”)和其它聚氧乙烯化的多元醇、聚乙烯醇(“PVA”)和其它聚亞烷基氧化物、聚氧乙烯化的山梨糖醇或聚氧乙烯化的葡萄糖。聚合物可為上文所列單體的、直鏈或分支的、取代或未取代的均聚物、隨機(jī)或嵌段共聚物，三元共聚物，只要其至少具有一個(gè)活性砜部分。聚合部分可為任意長(zhǎng)度或任何分子量但這些特征可影響生物特性。對(duì)于藥用時(shí)減小清除速率特別有用的聚合物的平均分子量為2,000到35,000道爾頓。另外，如果將兩個(gè)基團(tuán)分別連結(jié)在聚合物的兩端時(shí)，聚合物的長(zhǎng)度可影向兩基團(tuán)間的有效距離和其它空間關(guān)系。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變聚合物的長(zhǎng)度來優(yōu)化或賦予所需的生物活性。如果聚合物為直鏈PEG，以(Z)n(其中Z為聚合物的聚合單元)來表示，聚合物特別有用的長(zhǎng)度包括n具有50-500的范圍，在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，n大于6且優(yōu)選大于10。將單甲氧基聚乙二醇稱作mPEG。術(shù)語(yǔ)“PEG”意指任何數(shù)次縮合的1，2-亞乙基二醇的聚合物。PEG也被稱作聚氧乙烯、聚乙烯氧化物、聚乙二醇和聚醚乙二醇?？勺鳛橐蚁┭趸锖驮S多其它單體的共聚物來制備PEG。許多生物或生物技術(shù)的應(yīng)用中，會(huì)使用基本上線型的直鏈的乙烯基砜活化的PEG，它除乙烯基砜外基本上是未代的。出于一些原因，PEG在生物應(yīng)用中是有用的。PEG通常是透明、無色、無氣味、溶于水、對(duì)熱穩(wěn)定、對(duì)許多化學(xué)試劑惰性、不水解和無毒性的。聚乙二醇化可通過增加分子的表觀分子量來改善分子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。增加的表觀分子量減小皮下或系統(tǒng)給藥后從體內(nèi)的清除速率。在許多情況下，聚乙二醇化可減小抗原性和免疫原性。另外，聚乙二醇化可增加生物活性分子的溶解性。本發(fā)明的聚合物衍生物具有活性砜部分?！盎钚皂俊币庵附Y(jié)合有兩個(gè)碳基團(tuán)的砜基，具有在約pH9或低于pH9時(shí)可使硫羥基特異地偶聯(lián)在來自砜基團(tuán)的第二個(gè)碳的反應(yīng)性部位?；钚皂康睦影ǖ幌抻谝蚁╉亢突罨囊一?。活性乙基砜的例子為-SO2-CH2-CH2-Z，其中Z為鹵素或另一個(gè)能通過硫羥取代而形成砜-硫羥鍵-SO2-CH2-CH2-R的離去基團(tuán)，其中R表示生物活性分子。砜活性的聚合物可進(jìn)一步被取代，只要在約pH9或低于此pH時(shí)保持第二個(gè)碳原子的硫羥特異的反應(yīng)性?？梢栽谥辽偎牟街泻铣杀景l(fā)明的砜活性的聚合物。簡(jiǎn)而言之，第一步是例如通過活化或取代來增加聚合物一個(gè)部位(通常為端基)的反應(yīng)性。第二步是以一種可轉(zhuǎn)化為具有類似反應(yīng)特性的乙基砜或乙基砜衍生物的形式將硫直接連接到聚合物的碳原子上。在第三步中，將硫氧化為砜。在第四步中，活化距離砜基團(tuán)的第二個(gè)碳原子。以合成砜活化的PEG為例，下文更詳細(xì)地描述砜活化的聚合物的合成。第一步是PEG中羥基部分的活化。術(shù)語(yǔ)“羥基活化”在本文中意指取代以及酯化和采用其它方法對(duì)羥基活化。通常在羥基活化中，將酸或酸的衍生物如鹵代酸與PEG反應(yīng)形成反應(yīng)性酯，其中PEG和酸部分通過酯鍵來連結(jié)。酸部分通常比羥基部分更具反應(yīng)性。通常酯為磺酸酯、碳酸酯和磷酸酯。適用于本發(fā)明的磺酰鹵(Sulfonylacidhalide)如包括甲磺酰氯(也稱作mesylchloride)和對(duì)-甲苯磺酰氯(也稱作tosylchloride)。甲磺酸酯有時(shí)被稱作mesylates。甲苯磺酸酯有時(shí)被稱作tosylates。在取代型的羥基活化中，通過更為反應(yīng)性的部分(通常為鹵化物)取代PEG上的整個(gè)羥基。例如，亞硫酰氯可與PEG反應(yīng)形成更為反應(yīng)性的氯取代的PEG。因此，當(dāng)PEG為原料時(shí)，第一步的通常反應(yīng)產(chǎn)物為酯或鹵化物取代的PEG。在第二步中，通過醇來取代酯或鹵化物，該醇含有吸附有乙基的反應(yīng)性硫羥基(硫代乙醇部分)。硫代乙醇(Thioethanol)是合適醇的一個(gè)例子。在該步驟中，硫羥基中的硫直接與聚合物中的碳鍵合。接著，在第三步中，將硫氧化為砜。有用的氧化劑包括如過氧化氫、過硼酸鈉或過氧酸。在第四步中，將步驟二中使用的醇的羥基部分活化。該步的反應(yīng)順序類似于第一步。通常用鹵化物取代形成鹵代乙基砜或其在砜部分的第二個(gè)碳原子上有反應(yīng)性部位的衍生物。通常，乙基上的第二個(gè)碳原子將通過氯化物或溴化物的鹵原子來激活。羥基的活化將產(chǎn)生一個(gè)類似反應(yīng)性的部位如磺酸酯。合適的反應(yīng)物如酸、?；u和其它前文在第一步反應(yīng)中描述的物質(zhì)。亞硫酰氯對(duì)于用氯原子取代羥基來說是特別有用的。所得聚合物活化的乙基砜是穩(wěn)定的、可分離的并適于硫羥選擇性的偶聯(lián)反應(yīng)。PEG氯代乙基砜在pH約為7或更低的水中是穩(wěn)定的，然而可將其用于在堿性高達(dá)至少約pH9的條件下的硫羥選擇性的偶合反應(yīng)中。當(dāng)pH高于9時(shí)，硫羥的選擇性被減小且砜部分有時(shí)變得更易于與氨基反應(yīng)。與硫羥基反應(yīng)形成的鍵也是水解穩(wěn)定的。在可加入合成的第五步中，將活化的乙基砜與堿反應(yīng)來形成(from)PEG乙烯砜或其用于硫羥選擇性偶聯(lián)的活性衍生物之一。合適的堿包括如氫氧化鈉或三乙基胺。類似于活化的乙基砜，乙烯砜是水解穩(wěn)定的、可分離的、硫羥選擇性的并與硫羥反應(yīng)形成水解穩(wěn)定的鍵。本文所使用的“水解穩(wěn)定的”意指聚合物和砜部分之間的和軛合后砜-硫羥之間的鍵在低于約11的pH下至少三天不與水發(fā)生反應(yīng)。水解穩(wěn)定性是需要的，因?yàn)槿绻馑俾适敲黠@的，那么在聚合物和生物活性分子之間發(fā)生反應(yīng)前，該聚合物可被失活。如上文所述，例如在各端都有活性部位的線性PEG在一端結(jié)合蛋白質(zhì)，但如果水解速率明顯時(shí)，另一端會(huì)與水反應(yīng)而變?yōu)檩^不易反應(yīng)的羥基部分，而非與結(jié)合的蛋白質(zhì)或其它所需基在其兩端形成“啞鈴”分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)通過PEG連結(jié)劑將分子偶合到表面時(shí)發(fā)生類似問題，因?yàn)镻EG首先被吸附到表面或與該分子偶合，而PEG衍生物的另一端必須保持其活性以便以后的反應(yīng)。如果存在水解的問題，那么另一端通常失活。另外，通過將具有砜部分的連結(jié)劑結(jié)合到用不同功能基活化的PEG(或其它聚合物)上來制備砜活化的衍生物。例如，在約9或更低的pH合適條件下，將氨基活化的PEG與一個(gè)小分子進(jìn)行反應(yīng)，該分子在一端具有琥珀酰亞胺基(Succinimidyl)活性酯部分并在其它端具有乙烯砜。氨基活化的PEG與琥珀酰亞胺基酯形成穩(wěn)定的鍵。用乙烯砜活化所得PEG的末端并且是水解穩(wěn)定的PEG-NH-OC-CH2-CH2-SO2CH＝CH2。通過胺反應(yīng)性PEG(如琥珀酰亞胺基活性酯PEG，PEG-CO2-NHS)與在一端具有胺部分且其它端有乙烯部分的小分子反應(yīng)形成類似的活化的PEG。按實(shí)施例1所述方法制備PEG氯乙基砜和PEG乙烯砜。在實(shí)施例2中顯示了PEG乙烯砜和氯乙基砜的硫羥選擇反應(yīng)性。實(shí)施例3顯示了兩個(gè)化合物的聚合物砜鍵的水解穩(wěn)定性。硫羥和砜之間的鍵的水解穩(wěn)定性顯示在實(shí)施例16中。當(dāng)聚合物沒有羥基部分，首先在進(jìn)行上文所述步驟前通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法加上羥基。本發(fā)明的活化聚合物衍生物可具有一個(gè)以上的羥基。該衍生物可為單官能、雙官能或多官能的。反應(yīng)性基團(tuán)可為相同的(同官能的)或不同的(異官能的)，只要至少有一個(gè)活性砜部分。兩個(gè)特別有用的同二官能衍生物為PEG-二-氯砜和PEG-二-乙烯砜。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以以末端具有羥基部分的PEG為原料并按上文所述的常規(guī)方法來合成那些分子。也可合成異二官能衍生物。兩個(gè)特別有用異二官能衍生物包括如在一端具有乙烯砜或馬來酰亞胺而另一端為N-羥基琥珀酰亞胺酯(“NHS-酯”)的線型PEG。NHS-酯為胺特異的。具有一端為NHS-酯且另一端為活化砜部分的PEG可與賴氨酸和半胱氨酸殘基結(jié)合。剩余的水解穩(wěn)定的未反應(yīng)砜隨后與硫羥反應(yīng)形成穩(wěn)定的胺鍵。按實(shí)施例5和6中所述方法合成了這兩種異二官能PEG衍生物。如果為馬來酰亞胺NHS-酯，使用直鏈PEG來制備雜二官能試劑，PEG用(Z)n來表示，其中Z為單體單元，n大于6且優(yōu)選大于10。異功能砜活化的PEG的其它活性基團(tuán)可選自各種各樣的化合物。為了生物和生物技術(shù)的應(yīng)用，該取代物通常選自在PEG化學(xué)中常用來激活PEG的反應(yīng)性部分如醛、三氟乙基磺酸酯(有時(shí)稱作tresylate)、n-羥基琥珀酰亞胺酯、氰尿酰氯、氰尿酰氟、酰基疊氮、琥珀酸、對(duì)-二偶氮苯甲基、3-(對(duì)-二偶氮苯氧基)-2-羥基丙氧基和其它。除砜之外的活性部分的例子顯示在Davis等美國(guó)專利4179337；Lee等美國(guó)專利4296097和4430260；Iwasaki等4670417；Katre等美國(guó)專利4766106、4917888和4931544；Nadagawa等美國(guó)專利4791192；Nitecki等美國(guó)專利4902502和5089261；Saifer美國(guó)專利5080891；Zalipsky美國(guó)專利5122614；Shadle等美國(guó)專利5153265；Rhee等美國(guó)專利5162430；歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)0247860；和PCT國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朥S86/01252；GB89/01261；GB89/01262；GB89/01263；US90/03252；US90/06843；US9I/06103；US92/00432；和US92/02047，這些文獻(xiàn)均引入本文供參考。三官能衍生物的例子為結(jié)合含有三個(gè)乙烯砜PEG部分的甘油骨架。該分子式可用下式來表示該衍生物按實(shí)施例12所述的方法來制備。多官能衍生物的另一個(gè)例子為“星狀”分子。在Merrill美國(guó)專利5171264中全面地描述了星狀分子，該文獻(xiàn)引入本文供參考。星狀分子具有結(jié)合有多個(gè)PEG鏈或“臂”的核心結(jié)構(gòu)?？墒褂庙坎糠謥碓趶脑摵诵难由斐龅腜EG末端提供活性的官能基并作為將官能基或其它部分與星狀分子的臂結(jié)合的連結(jié)劑。用上文所述的活化的聚合物來運(yùn)載各種各樣的取代基和取代基的組合物對(duì)專業(yè)技術(shù)人員來說是顯而易見的。如上文所述，通過含硫羥的生物活性分子與砜活化的聚合物反應(yīng)形成本發(fā)明的軛合物。硫羥反應(yīng)基和砜活化的聚合物之間的鍵為共價(jià)鍵。制備本發(fā)明軛合物的總的方法包括下列步驟(1)選擇所需的生物活性分子并通過本領(lǐng)域公知的方法來確定該分子是否擁有游離硫羥基。如參見，Allen，G.“蛋白質(zhì)和多肽測(cè)序”，第153-54頁(yè)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，Work，T.S.，和Burdon，R.H.，編(1972)，引入本文供參考。如果該分子具有游離硫羥基，進(jìn)行步驟3。如果該分子沒有硫羥基，進(jìn)行步驟2。(2)如果在該分子中沒有存在游離硫羥基，按上文所述方法加上硫羥基。加上硫羥基后，進(jìn)行生物測(cè)定以確定是否保留所需生物活性或部分生物活性。(3)按上文所述方法合成所需砜活化的聚合物。(4)將活化的聚合物與具有游離硫羥基的分子進(jìn)行反應(yīng)。(5)使用本領(lǐng)域公知的色譜層析技術(shù)分離反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)于蛋白質(zhì)軛合物來說，可參見Scopes，R.，蛋白純化，Cantor，C.R.編，Springer-Verlag，NewYork(1982)。對(duì)于非蛋白質(zhì)分子來說，參見Still，W.C.等J.org.Chem.，43，第2923-2925頁(yè)(1978)。如果沒有軛合物形成，將硫羥基加到生物活性分子的另一個(gè)位置上并重復(fù)步驟(4)和(5)。(6)使用相關(guān)的生物測(cè)定方法，測(cè)定所形成的軛合物的生物活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可加或減去某些步驟。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可不測(cè)定步驟2中的生物活性或根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)可在聚乙二醇化之后推測(cè)生物活性。技術(shù)人員也可增加改變連結(jié)劑大小，長(zhǎng)度或分子量的步驟來優(yōu)化或賦予生物活性。已制備了一些軛合物。按實(shí)施例10描述的方法將上文所述30kDaTNFbpc105突變型蛋白與PEG乙烯砜結(jié)合。實(shí)施例8顯示在相似條件下用含有四個(gè)游離半胱氨酸的天然IL-lra進(jìn)行反應(yīng)。c84IL-lra突變型蛋白質(zhì)也很好地進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)施例13顯示3個(gè)30kDaTNF抑制劑突變型蛋白質(zhì)與3個(gè)結(jié)合在甘油骨架上的PEG鏈結(jié)合。本發(fā)明的軛合物可用于各種目的，包括但不限于體外診斷測(cè)定和制備藥物組合物。本發(fā)明的許多軛合物與未軛合分子相比較至少具有一個(gè)下列特性(1)增加在水溶液中的溶解性；(2)減小抗原性或免疫原性；(3)由于表觀分子量的增加而減小皮下或系統(tǒng)給藥后的清除速率。含有IL-lra的軛合物的藥物制劑是特別有用的。單獨(dú)或與30kDaTNF結(jié)合蛋白組合的IL-lra可用于治療關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸疾病、敗血病休克、局部缺血損傷、再灌注損傷、骨質(zhì)疏松、哮喘、胰島素型糖尿病、髓性和其它的白血病、牛皮癬、成人呼吸窘迫綜合癥、惡病質(zhì)/厭食和肺纖維化。含有TNF結(jié)合蛋白(“TNFbps”)的軛合物也是特別有用的。此軛合物可用于治療TNF-介導(dǎo)的疾病如成人呼吸窘迫癥、肺纖維化、關(guān)節(jié)炎、敗血病休克、炎癥性腸疾病、多發(fā)性硬化、移植排斥和出血損傷。本發(fā)明生物活性軛合物可進(jìn)一步包括非生物活性部分。本發(fā)明也包括基本上純的具有式R1-X-R2的化合物，其中R1和R2中至少一個(gè)為生物活性分子，該分子具有與X(邁克爾受體活化的聚合物)形成共價(jià)鍵的反應(yīng)性硫羥部分。在本發(fā)明中，R1-X-R2的生物活性保留R1或R2的生物活性。具有式R1-X-R2的分子在本文中稱作“啞鈴”分子。如本文所述，本發(fā)明的化合物基本上是純的。本文中的“基本上是純的”意指“均勻組合物”。均勻組合物含有分子式R1-X-R2和基本上不含有(1)偏離R1或R2組分的化合物或(2)通過不止一個(gè)活化聚合物連結(jié)在一起的化合物。均勻組合物可含有長(zhǎng)度不同的X的R1-X-R2分子。對(duì)于直鏈聚合物；用(Z)n來表示，其中Z為單體單元，n大于6且優(yōu)選大于10。為了獲得均勻組合物，R1和R2不需與X上的相同部位或R基團(tuán)的相同部位連接。X為具有第一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)和第二個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)的非肽聚合物?！胺磻?yīng)性基團(tuán)”是能與R反應(yīng)的基團(tuán)。X上至少一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)為邁克爾型受體。術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)性基團(tuán)”和“官能基團(tuán)”在本文為同義詞。上文也討論了適用于本發(fā)明的聚合物且如包括PEG、POG和PVA?！斑~克爾受體”是易于進(jìn)行邁克爾加成的官能基?！斑~克爾加成”包括在毗鄰Pi系統(tǒng)(具有負(fù)電的原子)的親電中心上進(jìn)行親核攻擊。具有負(fù)電原子的π系統(tǒng)的實(shí)例包括亞砜基、磺?；Ⅳ驶碗s環(huán)芳香物。親核物加到親電中心。邁克爾受體可用下式來表示其中E為電負(fù)性原子。在4位上發(fā)生加成反應(yīng)形成下式結(jié)構(gòu)其中Nu表示現(xiàn)于4位原子結(jié)合的親核物。邁克爾受體功能基包括但不是限于馬來酰亞胺和乙烯砜。形成啞鈴的活化的聚合物可以但不是必須含有邁克爾受體的乙烯砜種類。本發(fā)明的活化聚合物包括具有兩個(gè)或多個(gè)邁克爾受體基團(tuán)的PEG，如包括PEG-二-乙烯砜和PEG-二-馬來酰亞胺。按實(shí)施例7所述方法來制備PEG-二-乙烯砜?？砂碢CT公開WO92/16221所述方法制備PEG-二-馬來酰亞胺(該文獻(xiàn)為本文的參考文獻(xiàn))。與X或X-R偶聯(lián)前，R1和R2至少之一是生物活性的?！吧锘钚缘摹倍x同上。如上文所述，生物活性分子包括但不局限于結(jié)合蛋白和靶基團(tuán)。R1和R2均可以是生物活性的但不是必須的。在某些情況下，如果R1和R2對(duì)相同配體具有親和性啞鈴分子比單獨(dú)的R1或R2對(duì)配體具有更強(qiáng)的親和性。出版的PCT公開號(hào)WO92/16221顯示通過PEG聚合物連結(jié)的含有兩個(gè)30kDaTNFbp分子的啞鈴分子在體外測(cè)定中比單獨(dú)的30kDa分子在抑制TNFs細(xì)胞毒性方面更好。在某些情況下，R1可為引導(dǎo)R1-X-R2化合物到達(dá)生物系統(tǒng)中特定部位的分子而R2對(duì)那個(gè)部位的配體具有親和性。另外，在R1-X-R2化合物中R1和R2僅有一個(gè)為生物活性的。非生物活性基團(tuán)可為表面或任何其它生物惰性分子或化合物。在本發(fā)明中，生物活性R基團(tuán)具有反應(yīng)性硫羥部分。生物活性R基團(tuán)可為合成的分子。本文所使用的“合成分子”意指加上反應(yīng)性硫羥部分的分子。合成分子如包括含非天然半胱氨酸的突變型蛋白。硫羥部分與聚合物的邁克爾型受體反應(yīng)而形成共價(jià)鍵。形成共價(jià)鍵之后，生物活性分子保持其生物活性。本發(fā)明中R基團(tuán)“保留其生物活性”是指在與活化的聚合物反應(yīng)后，至少具有與聚合物反應(yīng)前十分之一的生物活性，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％。制備啞鈴分子一般方法為(1)選擇具有所需生物活性的R基團(tuán)，例如，蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白質(zhì)(TNFbp)。(2)使用相關(guān)的生物測(cè)定法測(cè)量其活性。(3)采用本領(lǐng)域已知的方法，測(cè)定游離硫羥基的數(shù)目，如未包含在二硫鍵中的半胱氨酸殘基。在A11en，G.，“蛋白質(zhì)和多肽測(cè)序，”第153-54頁(yè)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，work，T.S.，和Burdon，R，H.編(1972)中描述了這樣的方法。如果沒有游離的半胱氨酸，進(jìn)行4(a)步。如果有一個(gè)游離的半胱氨酸，或僅有一個(gè)易于接觸聚乙二醇化試劑，進(jìn)行4(c)反應(yīng)步驟。如果蛋白質(zhì)具有多于一個(gè)的游離半胱氨酸，進(jìn)行第5步。(4)當(dāng)R為多肽且沒有游離半胱氨酸存在時(shí)(a)通過插入一個(gè)半胱氨酸或用半胱氨酸取代非半胱氨酸殘基來產(chǎn)生突變型蛋白。有用的突變型蛋白部位包括蛋白質(zhì)的N或C末端，糖基化部位或賴氨酸殘基。突變型蛋白質(zhì)如上文所述可通過化學(xué)合成或重組技術(shù)來常規(guī)性地制備。另外，以化學(xué)方式加上硫羥部分。(b)測(cè)量活性并將該活性與步驟2中所測(cè)的活性進(jìn)行比較。(c)如果該突變型蛋白保留了步驟2中所測(cè)的活性，將該突變型蛋白與具有單個(gè)硫氫基優(yōu)選的反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物(如PEG)進(jìn)行反應(yīng)。如果該突變型蛋白質(zhì)與單個(gè)反應(yīng)性PEG結(jié)合(變?yōu)镻EG化的)，測(cè)量活性并將該活性與步驟2中所測(cè)量的活性進(jìn)行比較。如果聚乙二醇化的突變型蛋白保留了步驟2中所測(cè)定的活性，將未聚乙二醇化的突變型蛋白與具有兩個(gè)硫羥特異的邁克爾受體(如二-馬來酰亞胺)的PEG反應(yīng)而產(chǎn)生啞鈴分子。重復(fù)生物測(cè)定來確定啞鈴分子保留了生物活性。如果本領(lǐng)域技術(shù)人員需要R1和R2不同，可將二-反應(yīng)性的聚合物基團(tuán)依次與R1和R2反應(yīng)。聚合物與R1反應(yīng)前，將具有兩個(gè)官能基的聚合物中的一個(gè)阻斷或通過化學(xué)領(lǐng)域的公知方法來保護(hù)以在X上形成保護(hù)基。參見Greene，T.W.等有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，JohnWiley和Sons，Inc.(1991)，該文獻(xiàn)引入本文供參考。在本文中“保護(hù)”意指官能基不進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)具有保護(hù)基的X與R1反應(yīng)時(shí)，形成R1-X而不是R1-X-R1。形成R1-X之后，與R2反應(yīng)前除去阻斷或保護(hù)基?！懊摫Ｗo(hù)”意指去除保護(hù)基或使官能基能夠進(jìn)行反應(yīng)。另外，可通過R1與過量的雙活化的聚合物反應(yīng)而迫使形成R1-X來形成異形啞鈴。反應(yīng)后，采用本領(lǐng)域公知的色譜層析技術(shù)(如包括離子交換色譜層析)來從反應(yīng)混合物中分離R1-X。然后使R1-X與R2反應(yīng)而形成R1-X-R2。(d)如果由4(a)步中產(chǎn)生的突變型蛋白或由步驟4(c)中形成的聚乙二醇化的突變型蛋白基本上不保留生物活性，用天然蛋白質(zhì)開始，產(chǎn)生不同的突變型蛋白質(zhì)，并重復(fù)步驟4(b)和4(c)。另外，聚合物X的長(zhǎng)度或分子量可被改變來優(yōu)化或賦予生物活性。(5)對(duì)于含有一個(gè)以上游離半胱氨酸的蛋白質(zhì)來說，進(jìn)行單聚乙二醇化、生物測(cè)定并與雙官能的聚乙二醇化試劑反應(yīng)。如果形成高級(jí)(high-ordered)結(jié)構(gòu)，即PEG連結(jié)了兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)，通過本領(lǐng)域已知的色譜層析法分離啞鈴分子。出于任何原因此分離不合乎需要時(shí)，去除或用另外的氨基酸置換游離的半胱氨酸并進(jìn)行步驟4(b)。(6)對(duì)于非蛋白生物活性R基團(tuán)來說，利用游離的硫氫基來與聚合物X結(jié)合。如果需要，將游離的硫氫基加到分子上。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇性地改變、增加或減去某些步驟。例如，可以選擇使反應(yīng)性蛋白質(zhì)與雙官能的PEG反應(yīng)并跳過單聚乙二醇化步驟。已制備了本發(fā)明的某些啞鈴分子。公開的PCT申請(qǐng)WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))描述了用二-馬來酰亞胺基-PEG來制下列啞鈴分子30kDaTNF抑制劑均勻啞鈴，Il-2抑制劑異型啞鈴、抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑的異型啞鈴和Il-Ira和PDGF異型啞鈴?？芍苽浜卸喾N本發(fā)明軛合物或化合物(總稱為“軛合物”)的藥物組合物。這些軛合物可被混入藥用可接受的載體而形成本發(fā)明藥物組合物。術(shù)語(yǔ)“藥用可接受的載體”在本文中意指無毒的對(duì)活性組分通常為惰性的賦型劑，它對(duì)組分或給予該組合物的病人不產(chǎn)生不利的影響。在經(jīng)典的藥物教課書中可找到合適的賦型劑或載體，如Remington’sPharmaceuticalSciences，第16版，MackPublishingCo.，Easton，PA(1980)，引入本文供參考。這類載體如包括水溶液如碳酸氫鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、林格(Ringer’s)溶液和生理鹽水。另外，該載體可包括其它改善或維持制劑的pH、滲透性、粘滯性、澄明度、顏色、無菌、穩(wěn)定性、溶出速度或氣味的藥用可接受的賦型劑。通過本領(lǐng)域已知的方法可制備本發(fā)明的藥物組合物，如包括通過簡(jiǎn)單混合各組分的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何根據(jù)使用目的和給藥方式來選擇藥物載體并制成合適的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可預(yù)料到由載體和軛合物構(gòu)成生理上相容的緩慢釋放的劑型。作為載體的主要溶劑可為本質(zhì)上為水性的或非水性的。另外，該載體可包含其它改善或維持制劑的pH、滲透性、粘度、澄明度、顏色、無菌性、穩(wěn)定性、溶出速度或氣味的藥理可接受的賦型劑。類似地，該載體還可包含其它改善或維持軛合物的穩(wěn)定性、溶出速度、釋放或吸收的藥理可接受的賦型劑。這類賦型劑是那些常規(guī)和習(xí)慣上用于配制以單位劑量或多劑量形式非胃腸道給藥劑型的物質(zhì)。一旦制成藥物組合物，可將其作為溶液、混懸液、凝膠、乳劑、固體或脫水的或冷凍干燥的粉劑貯存在無菌小瓶中。該制劑或者以備用形式貯存或以給藥前重新配制形式貯存。該制劑優(yōu)選在至少低于4℃的溫度下貯存，更優(yōu)選-70℃。含有軛合物的這類制劑也優(yōu)選在近生理pH下貯存并使用。現(xiàn)相信制劑在高pH(即大于8)或低pH(即低于5)下使用是不合乎要求的。含軛合物制劑的系統(tǒng)釋放給藥方式可為皮下、肌內(nèi)、靜脈、口腔、鼻內(nèi)或陰道或直腸栓塞。含軛合物制劑的局部釋放給藥的優(yōu)選方式為關(guān)節(jié)內(nèi)、氣管內(nèi)或吹入或吸入呼吸道。另外，通過合適制劑或裝置口服給予軛合物來將軛合物給到消化道的特定部位可能是合乎需要的。在另一個(gè)治療骨質(zhì)疏松和其它骨損失疾病的合適方式中，如開始靜脈給予TNF抑制劑軛合物IL-1抑制劑軛合物的團(tuán)狀注射液，然后繼續(xù)靜脈輸注TNF抑制劑軛合物和IL-1抑制劑軛合物。對(duì)于口服給藥來說，軛合物是被包囊的?？捎没虿挥昧?xí)慣上用于制備固體劑型的藥用可接受的載體來配制包囊的軛合物。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)為膠囊，以便制劑的活性部分釋放到胃腸道的生物利用度最大而系統(tǒng)前降解最小的部位上。其它賦型劑可包括促進(jìn)軛合物吸收的。稀釋劑、香味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、混懸劑、片劑崩解劑和粘合劑也可被使用。不管給藥方式如何，具體劑量按患者的大約體重來計(jì)算。決定合適劑量的其它因素可包括被治療或預(yù)防的疾病、給藥的途徑和患者的年齡、性別和醫(yī)療條件。在某些實(shí)施方案中，將劑量和使用方法設(shè)計(jì)為在患者血液中產(chǎn)生預(yù)定濃度范圍的軛合物。例如，相信維持TNF抑制劑和IL-1抑制劑的循環(huán)濃度低于0.01ng/ml血漿可能不是有效的組合物，同時(shí)，長(zhǎng)期維持高于10μg/ml的循環(huán)濃度也可能具有不合乎需要的副作用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)性地進(jìn)行對(duì)測(cè)定治療的合適劑量(包括各個(gè)上文所述的制劑)所必須的進(jìn)一步的精確計(jì)算，而且這種計(jì)算屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作且不需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，特別是按照本文所公開的劑量信息和測(cè)定方法。通過使用測(cè)定使用劑量以及合適的量效數(shù)據(jù)所建立的測(cè)定方法可確定這些劑量。應(yīng)當(dāng)注意到本文所述軛合物制劑可用于獸醫(yī)學(xué)和人類醫(yī)學(xué)且術(shù)語(yǔ)“患者”不應(yīng)以限定方式來解釋。在獸醫(yī)使用時(shí)，劑量范圍應(yīng)與上文所述相同。下列實(shí)施例描述本發(fā)明但不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例1合成如下概括性地說明反應(yīng)步驟(1)(2)(3)(4)(5)下文詳細(xì)描述上述反應(yīng)的各步驟反應(yīng)1該反應(yīng)表示制備聚乙二醇的甲磺酸酯，它也可被稱作Polyethyleneglycol的methanesulfonate或mesylate?？赏ㄟ^相似的方法制備甲苯磺酸酯和鹵化物，相信這對(duì)技術(shù)人員來說是顯而易見的。為了制備甲磺酸酯，通過在150ml甲苯中共沸蒸來干燥25g分子量為3400的PEG。在干燥PEG中大約有一半的甲苯被蒸去。將40ml的二氯甲烷加到甲苯和PEG溶液中，然后在冰浴冷卻。在冷卻溶液中，加入1.23ml蒸餾的甲磺酰氯(它相對(duì)于PEG羥基為1.6當(dāng)量)并加入2.66ml的無水三乙基胺(它相對(duì)于PEF羥基為1.3當(dāng)量)?！爱?dāng)量”在本文中可被看作是“化合量”并指將與一當(dāng)量PEG羥基反應(yīng)的化合物的重量。允許反應(yīng)進(jìn)行過夜，并在此期間溫?zé)岬绞覝?。用鹽酸三乙基胺進(jìn)行沉淀并過濾除去該沉淀物。然后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將體積減至20ml。加入100ml冷的無水乙醚使甲磺酸酯沉淀。核磁共振(NMR)分析顯示羥基100％地轉(zhuǎn)化為甲磺酸基。反應(yīng)2該步驟表示通過甲磺酸酯與巰基乙醇反應(yīng)形成聚乙二醇巰基乙醇。該反應(yīng)使得PEG中的甲磺酸基團(tuán)被置換。巰基乙醇基團(tuán)中的硫被直接連結(jié)到PEG碳-碳骨架上的碳上。20g由反應(yīng)步驟1獲得的甲磺酸酯溶于150ml蒸餾水。浸入冰浴中使甲磺酸酯和水的溶液冷卻。在冷卻溶液中加入2.37ml的巰基乙醇(它相對(duì)于PEG羥基來說為3當(dāng)量)。也加入16.86ml的2NNaOH堿。將反應(yīng)回流3小時(shí)，其意思是由加熱反應(yīng)產(chǎn)生的蒸汽被連續(xù)縮合并允許其流回到反應(yīng)中。用二氯甲烷提取聚乙二醇巰基乙醇產(chǎn)物三次，每次使用大約25ml的二氯甲烷。收集有機(jī)部分并用無水硫酸鎂干燥。將體積減至20ml并通過加入150ml冷的無水乙醚而使產(chǎn)物沉淀。在d6-DMSO(二甲基亞砜)中進(jìn)行NMR分析獲得下列峰PEG-SCH2CH2OH2.57ppm，三重，-CH2-S-；2.65ppm，三重，-S-CH2-；3.5ppm，骨架單峰；和4.76ppm，三重，-OH。-S-CH2-峰的積分表明100％取代。反應(yīng)3該步驟表示過氧化物氧化聚乙二醇巰基乙醇產(chǎn)物而使硫(S)轉(zhuǎn)化為砜(SO2)。產(chǎn)生PEG-β-羥基砜。將20gPEG-SCH2CH2OH溶于30ml的0.123M鎢酸溶液并在冰浴中冷卻。通過將該酸溶于pH11.5的氫氧化鈉溶液，然后用冰醋酸將pH調(diào)到5.6來制備鎢酸溶液。將20ml的蒸餾水和2.88ml的30％過氧化氫(它相對(duì)于羥基來說為2.5當(dāng)量)加到鎢酸和聚乙二醇巰基乙醇溶液中并允許反應(yīng)溫?zé)徇^夜到室溫。用二氯甲烷提取氧化產(chǎn)物三次，每次使用25ml二氯甲烷。用稀的碳酸氫鈉水溶液洗滌收集的有機(jī)部分并用無水硫酸鎂干燥。將體積減至20ml。加入冷的無水乙醚沉淀PEG-β-羥基砜產(chǎn)物。在d6-DMSO中的NMR分析獲得PEG-SCH2CH2OH的下列峰3.25ppm，三重，-CH2-SO2-；3.37ppm，三重，-SO2-CH2-；3.50ppm，骨架；3.77ppm，三重，-CH2OH；5.04ppm，三重，-OH。5.04ppm羥基峰表明85％取代。然而，3.37ppm的-SO2-CH2-峰表明100％取代并被認(rèn)為是非常可靠的。反應(yīng)4該反應(yīng)表示聚乙二醇氯代乙基砜的合成、分離和表征的最后步驟。為了合成產(chǎn)物，將20g的PEG-SO2CH2CH2OH(PEG-β-羥基砜)溶于100ml的新鮮蒸餾的亞硫酰氯并將該溶液回流過夜。該亞硫酰氯已被蒸過喹啉。蒸餾除去過量的亞硫酰氯。加入50ml的甲苯和50ml二氯甲烷并經(jīng)蒸餾除去。為了分離產(chǎn)物，將PEG氯乙基砜溶于20ml的二氯甲烷中并加入100ml冷的無水乙醚進(jìn)行沉淀。用50ml乙酸乙酯重結(jié)晶沉淀物來分離產(chǎn)物。使用核磁共振來對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。在d6-DMSO中對(duì)PEG-SO2CH2CH2Cl進(jìn)行NMR分析獲得下列峰3.50ppm，骨架；3.64ppm，三重，-CH2SO2-；3.80ppm，三重，-SO2-CH2-。在3.94ppm處顯示小量羥基雜質(zhì)的三重峰。難以計(jì)算該譜的取代百分?jǐn)?shù)，因?yàn)橹匾姆遴徑诤艽蟮墓羌芊?。反?yīng)5該步驟表示將反應(yīng)步驟4中獲得的聚乙二醇氯代乙基砜轉(zhuǎn)化為聚乙二醇乙烯砜并分離和表征該乙烯砜產(chǎn)物。通過將固體PEG氯代乙基砜溶于二氯甲烷溶劑中，然后加入2當(dāng)量的NaOH堿，易于制備PEG乙烯砜。過濾溶液以除去堿并蒸去溶劑以分離最終產(chǎn)物PEG-SO2-CH＝CH2(PEG乙烯砜)。通過在d6-DMSO(二甲基亞砜)中進(jìn)行NMR分析來對(duì)PEG乙烯砜進(jìn)行表征。NMR分析顯示下列峰3.50ppm，骨架；3.73ppm，三重，-CH2SO2-；6.21ppm，三重，＝CH2；6.97ppm，雙重雙重，-SO2-CH-。-SO2-CH-的6.97ppm峰表示84％取代。＝CH26.21ppm的峰表明94％取代。用巰基乙醇和2，2′-二硫代二吡啶研制表明95％取代。實(shí)施例2硫羥選擇性反應(yīng)實(shí)施例2顯示PEG乙烯砜及其前體PEG氯代乙基砜與硫羥基(-SH)的反應(yīng)明顯比與氨基(-NH2)或亞氨基(-NH-)容易的多。含有硫羥基的化合物是有機(jī)化合物，類似于醇(含有羥基-OH)，只是在硫羥基中，羥基的氧原子被硫置換。硫羥有時(shí)也被稱作硫氫或巰基。PEG乙烯砜含有乙烯砜基團(tuán)-SO2-CH＝CH2。PEG氯代乙基砜含有氯代乙基砜基團(tuán)-SO2CH2CH2Cl。在蛋白質(zhì)的修飾中，硫羥的選擇性是重要的，因?yàn)檫@意味著對(duì)半胱氨酸單位(含-SH)的修飾會(huì)優(yōu)先于對(duì)賴氨酸單元(含-NH2)和組氨酸單元(含-NH-)的修飾。PEG乙烯砜對(duì)硫羥的選擇性意味著PEG可選擇性地與半胱氨酸單元結(jié)合，因此，保護(hù)了具體蛋白的蛋白活性并控制蛋白質(zhì)結(jié)合到PEG分子上的數(shù)目。通過測(cè)量PEG乙烯砜和N-α-乙酰賴氨酸甲酯以及和巰基乙醇的反應(yīng)速率來確定PEG乙烯砜與硫羥和氨基的相對(duì)反應(yīng)性。N-α-乙酰賴氨酸甲酯是含有氨基的賴氨酸模式并被縮寫為L(zhǎng)ys-NH2。巰基乙醇起含有硫羥基的半胱氨酸模式作用并被縮寫為Cys-SH。對(duì)PEG氯代乙基砜的相對(duì)反應(yīng)性也進(jìn)行類似的測(cè)定。該分子可作為乙烯砜的“保護(hù)”形式起作用，因?yàn)樗谒嶂惺欠€(wěn)定的但在加堿時(shí)轉(zhuǎn)化為PEG乙烯砜。在pH8.0、pH9.0和pH9.5時(shí)研究了PEG乙烯砜和PEG氯乙基砜前體的反應(yīng)性?？刂苝H的緩沖液是在pH8.0時(shí)為0.1M的磷酸鹽而在pH9.0和pH9.5時(shí)為0.1M的硼酸鹽。為了測(cè)量巰基乙醇的反應(yīng)性，將5mM乙二胺四乙酸(EDTA)加到兩種緩沖液中來防止硫羥基轉(zhuǎn)化為二硫化物。為了使本發(fā)明的PEG衍生物與Lys-NH2進(jìn)行反應(yīng)，在攪拌下，將3mMPEG衍生物溶液分別加到在合適緩沖液中的0.3mMLys-NH2溶液中，該緩沖液具有3個(gè)堿性pH值。通過將熒光胺(fluorescamine)加到反應(yīng)溶液中而因與剩余的氨基反應(yīng)產(chǎn)生熒光衍生物來檢測(cè)反應(yīng)。該檢測(cè)步驟是通過將50μl的反應(yīng)物加到pH8.0的1.95ml的磷酸鹽緩沖液中然后在劇烈攪拌下加入1.0ml的熒光胺來進(jìn)行的。熒光胺溶液為每毫升丙酮含有0.3mg熒光胺?；旌虾?0分鐘測(cè)量熒光。在390nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行激發(fā)。在475nm下產(chǎn)生光的發(fā)射。在24小時(shí)中，pH8.0時(shí)的PEG乙烯砜或PEG氯代乙基砜未觀察到有反應(yīng)發(fā)生。pH9.5時(shí)，該反應(yīng)是緩慢的，但幾天后所有的氨基都被反應(yīng)。為了使PEG乙烯砜和PEG氯代乙基砜前體與Cys-SH進(jìn)行反應(yīng)，將2mMPEG衍生物溶液分別加到在合適緩沖液中的0.2mM的Cys-SH溶液中，該緩沖液具有3個(gè)堿性pH值。通過將4-二硫代吡啶加到反應(yīng)溶液中來檢測(cè)反應(yīng)。4-二硫代吡啶化合物與Cys-SH反應(yīng)產(chǎn)生4-硫代吡啶酮而吸收紫外光。該檢測(cè)步驟是通過將50μl反應(yīng)混和物加到pH8.0并含有5mMEDTA的0.95ml0.1M磷酸鹽緩沖液中然后在相當(dāng)緩沖液中加入1ml2mM的4-二硫代吡啶來進(jìn)行的。測(cè)量324nm處的4-硫代吡啶酮的吸光度。PEG乙烯砜和PEG氯乙基砜均顯示對(duì)Cys-SH的反應(yīng)性而PEG乙烯砜的反應(yīng)性更強(qiáng)。在pH9.0時(shí)，使用乙烯砜，反應(yīng)在兩分鐘內(nèi)結(jié)束而使用氯代乙基砜，反應(yīng)在15分鐘內(nèi)結(jié)束。然而，對(duì)于測(cè)定準(zhǔn)確的速度常數(shù)來說，這些反應(yīng)太快。pH8.0時(shí)，該反應(yīng)是較慢的，乙烯砜在1小時(shí)中完成，氯代乙基砜在3小時(shí)內(nèi)完成。氯代乙基砜轉(zhuǎn)化為乙烯砜明顯比乙烯砜與Cys-SH的反應(yīng)要慢。因此顯示氯代乙基砜與Cys-SH的反應(yīng)速度取決于氯代乙基砜轉(zhuǎn)化為乙烯砜的速度。然而，這些反應(yīng)速度仍比Lys-NH2的反應(yīng)快的多。上述動(dòng)力學(xué)的研究表明下列觀點(diǎn)PEG乙烯砜與硫羥基的反應(yīng)比與氨基的反應(yīng)容易的多，表明PEG乙烯砜與含有半胱氨酸和賴氨酸的蛋白質(zhì)的結(jié)合主要通過與半胱氨酸反應(yīng)來進(jìn)行。因?yàn)榕c氨基的反應(yīng)性類似于與亞氨基的反應(yīng)性，那么與組氨酸亞單位的反應(yīng)性也會(huì)比與半胱氨酸亞單位的反應(yīng)性低得多。而且，在較低的pH值下，PEG氯代乙基砜和PEG乙烯砜對(duì)硫羥基的選擇性是重要的，盡管PEG氯代乙基砜的反應(yīng)慢點(diǎn)。許多PEG衍生物的利用受到了限制，因?yàn)樗麄兣c水快速進(jìn)行反應(yīng)，試圖通過在水性條件下將該衍生物與分子和表面結(jié)合來進(jìn)行干擾。以下實(shí)施例3顯示PEG乙烯砜和PEG氯化乙基砜在水中的穩(wěn)定性。實(shí)施例3水解穩(wěn)定性將PEG乙烯砜溶于重水中(D2O，氧化氘)，并用NMR檢測(cè)。未發(fā)生反應(yīng)。PEG氯代乙基砜的溶液在用硼酸緩沖到pH9.0的重水中產(chǎn)生PEG乙烯砜。用NMR檢測(cè)顯示一旦產(chǎn)生PEG乙烯砜在重水中穩(wěn)定三天。PEG氯代乙基砜在水中是穩(wěn)定的直到溶液變?yōu)閴A性，此時(shí)，它被轉(zhuǎn)化為乙烯砜。通過將PEG氯代乙基砜溶于pH7的水和溶于pH9的硼酸緩沖液中來證明轉(zhuǎn)化為乙烯砜。將PEG衍生物提取到二氯甲烷中，除去二氯甲烷再用NMR分析顯示PEG氯代乙基砜在中性pH7.0下是穩(wěn)定的而與堿反應(yīng)產(chǎn)生PEG乙烯砜。乙烯砜在水中穩(wěn)定幾天，甚至在堿性pH下也是如此。PEG乙烯砜的廣泛的水解穩(wěn)定性和硫羥特異的反應(yīng)性意味著PEG乙烯砜及其前體物對(duì)于在水性條件下修飾分子和表面是有用的，如下述實(shí)施例4所示。實(shí)施例4與BSA的軛合以兩種不同方法將PEG衍生物與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合來說明蛋白質(zhì)的修飾作用。BSA為一種蛋白質(zhì)。天然未修飾的BSA含有沒有硫羥基的半胱氨酸。半胱氨酸單元被束縛成二硫化物鍵(S-S)。在第一種方法中，室溫下在pH9.5的0.1M硼酸緩沖液中，將m-PEG(單甲氧基-PEG)乙烯砜(分子量為5,000)與未修飾的BSA反應(yīng)24小時(shí)。每毫升該溶液含有1mg的BSA和1mg分子量為5000的m-PEG乙烯砜。由實(shí)施例2的模式化合物所得結(jié)果已表明在該較堿性的條件下并且不存在能反應(yīng)的游離硫羥時(shí)賴氨酸亞單位(和可能的組氨酸亞單位)會(huì)被修飾。以兩種方法表明與賴氨酸亞單位的結(jié)合。首先，大小排阻色譜層析法顯示蛋白質(zhì)的分子量大約增加50％，因此表明10個(gè)PEG與該蛋白質(zhì)結(jié)合。第二，熒光胺分析顯示BSA分子中賴氨酸基團(tuán)的數(shù)目大約減小10個(gè)。在第二種方法中，用三丁基膦處理BSA以將二硫化物S-S鍵還原為硫羥基(SH)，該基團(tuán)可進(jìn)行反應(yīng)。然后室溫下在pH8.0的0.1M磷酸緩沖液中用PEG氯代乙基砜處理修飾的BSA1小時(shí)。每毫升該溶液含有1mg修飾的BSA和1mg分子量為5000的m-PEG氯代乙基砜。該結(jié)果顯示在該條件下賴氨酸基團(tuán)未進(jìn)行反應(yīng)。然而，硫羥基進(jìn)行了反應(yīng)。通過大小排阻色譜層析法表明PEG與蛋白質(zhì)結(jié)合，顯示蛋白質(zhì)的分子量增加大約25％。熒光胺分析表明蛋白質(zhì)中賴氨酸的數(shù)目沒有變化，因此證明PEG未與賴氨酸亞單位結(jié)合。由此證明取代發(fā)生在硫羥基團(tuán)上。實(shí)施例5乙烯砜NHS-酯異雙官能PEG(3400)試劑的合成簡(jiǎn)要地來說，在幾步中合成PEG(3400)-ω-乙烯砜-α-丙酸琥珀酰亞胺基酯。首先，PEG(3400)-ω-羥基-α-丙酸的乙基酯被合成。第二，將乙基酯轉(zhuǎn)化為ω-甲磺酸酯。第三，用甲磺酸酯制備ω-乙硫醇衍生物。第四將乙硫醇衍生物轉(zhuǎn)化為ω-羥基砜。第五，將羥基砜轉(zhuǎn)化為ω-乙烯砜。在第六步中將后面的α-乙基酯轉(zhuǎn)化為α-丙酸。最后，將丙酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺基酯。詳細(xì)合成過程描述如下步驟1.將15.0克的PEG(3400)-ω-羥基-α-丙酸，75ml無水乙醇和3ml硫酸加熱回流1小時(shí)。冷卻到室溫后，將50ml水加到反應(yīng)混合物中并用碳酸氫鈉將pH調(diào)至7。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在55℃下減壓蒸發(fā)1.5小時(shí)來蒸去乙醇。用60、50和40ml二氯甲烷提取反應(yīng)產(chǎn)物。用無水硫酸鎂干燥提取物、濃縮至50ml并加到400ml的冷的二乙基醚中。濾出沉淀物并減壓干燥。產(chǎn)生13.1克乙基酯。NMR分析顯示49％丙酸乙基酯基團(tuán)和51％PEG-OH基團(tuán)。步驟2.將13.0g(0.0038mol)的步驟1中形成的乙基酯衍生物、100ml甲苯和2.0gBHT的混合物加熱回流共沸干燥。其次，在5℃溫度下，加入15ml無水二氯甲烷、0.60ml(0.0043mol，1.15倍過量)三乙基胺和0.31ml(0.0040mol，1.07倍過量)甲磺酰氯并在室溫和氮?dú)猸h(huán)境下將混合物攪拌過夜。加入2ml無水乙醇并將混合物攪拌15分鐘。然后過濾該混合物并減壓蒸出大約70ml的溶劑而產(chǎn)生PEG-ω-甲磺酸酯-α-丙酸乙基酯。步驟3.將下列物質(zhì)加到大約40ml(0.00375mol)的步驟2中獲得的PEG-ω-甲磺酸酯-α-丙酸乙基酯溶液中150ml無水乙醇，1.79ml(0.0139mol，3.69倍過量)巰基乙醇和0.45g(0.0011mol，3.0倍過量)溶于20ml無水乙醇的氫氧化鈉，在58-62℃氮?dú)猸h(huán)境中將混合物加熱3小時(shí)。冷卻到室溫后，用乙酸將pH調(diào)到大約6.5并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55℃下減壓蒸餾40分鐘而蒸去140ml乙醇。蒸餾后，將50ml二氯甲烷加到殘?jiān)小Ｓ谜麴s水洗滌所得溶液并用無水硫酸鎂干燥，將該溶液濃縮至30ml并加到350ml冷的二乙基醚中，濾出沉淀產(chǎn)物并減壓干燥。產(chǎn)生11.5乙硫醇衍生物。NMR分析顯示52％巰基乙醇基、35％丙酸乙基酯基團(tuán)和13％PEG-OH部分。步驟4.接著，制備11.5gPEG-ω-乙硫醇-α-丙酸乙基酯在12ml蒸餾水中的溶液，如下也制備鎢酸溶液0.14g鎢酸、12.0ml蒸餾水和溶于6.0ml水中的0.05g氫氧化鈉被混合形成pH11.5的溶液。在鎢酸溶液中加入10％的NaH2PO4溶液使pH調(diào)到6.6。然后將12ml的乙基酯溶液加到pH6.6鎢酸溶液中并用0.1MNaOH再將pH調(diào)到6.6。加入1.1ml30％過氧化氫并將反應(yīng)混合物攪拌19小時(shí)。反應(yīng)后pH為6.7。加入1MNaOH將pH調(diào)至7.2并將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。將5g溶于45ml蒸餾水的氯化鈉加到反應(yīng)混合物中。用50ml二氯甲烷提取反應(yīng)產(chǎn)物3次。如下用硫酸鎂干燥提取物；10g粉狀硫酸鎂被加到提取物中并在兩小時(shí)后濾去硫酸鎂。將硫酸鎂干燥的提取物濃縮至40ml并加到350ml冷乙醚中。濾出沉淀的產(chǎn)物并減壓干燥。產(chǎn)量為9.7g且含有50％的羥基砜基團(tuán)，39％丙酸乙基酯基團(tuán)和11％PEG-OH基團(tuán)，是通過NMR來決定。步驟5.室溫?cái)嚢柘略诘獨(dú)猸h(huán)境中，將3.00ml(0.0215mol，3.97倍過量)三乙基胺和0.80ml(0.010mol，3.81倍過量)甲磺酰氯加到以下混合物中9.6g(0.00271mol)的PEG-ω-羥基砜-α-丙酸，乙基酯(在步驟4中合成的)、50ml二氯甲烷和0.01g(0.1wt％/PEG)BHT。攪拌反應(yīng)混合物15分鐘、過濾并用150ml二氯甲烷稀釋。然后用25ml1MHCl、25ml10％NaCl和25ml水洗滌所得混合物。加入小量Na2HPO4來將水層pH調(diào)至7。然后用硫酸鎂干燥反應(yīng)混合物并濃縮至40ml。將所得溶液加到400ml冷的乙醚中。濾出沉淀產(chǎn)物并減壓干燥而獲得9.1g。NMR分析顯示下列官能度43％乙烯砜，16％甲磺酸酯和35％丙酸乙基酯。步驟6.將1.0MNaOH加到9.0gPEG-ω-乙烯砜-α-丙酸，乙基酯衍生物的50ml蒸餾水溶液中來將pH調(diào)到12.0。并在保持pH在11.9到12.1(周期性地加入1.0MNaOH)的同時(shí)將溶液攪拌1.5小時(shí)。接著用草酸將pH調(diào)至3.0，在溶液中加入5gNaCl，并用50ml二氯甲烷提取反應(yīng)產(chǎn)物3次。用無水硫酸鎂干燥提取物、濃縮至30ml并加到350ml冷乙醚中。濾出沉淀物并減壓干燥。產(chǎn)量為6.8g。通過NMR分析鑒定官能基為乙烯砜40％，丙酸29％，丙酸乙基酯4％和17％甲磺酸酯。通過在DEAESepharoseFF柱上進(jìn)行離子交換色譜層析來純化沉淀物。純化后的產(chǎn)量為3.2g且NMR分析顯示50％丙酸基團(tuán)，38％乙烯砜基團(tuán)和8％甲磺酸酯基團(tuán)。步驟7，室溫下在氮?dú)猸h(huán)境中，將3.0gPEG-ω-乙烯砜-α-丙酸，0.12gN-羥基琥珀酰亞胺、0.21gDCC(N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺)在20ml二氯甲烷中的混合物攪拌過夜。然后過濾反應(yīng)混合物并加到250ml冷乙醚中。濾出沉淀產(chǎn)物并減壓干燥得到2.90g。NMR顯示下列基團(tuán)琥珀酰亞胺50％，38％乙烯砜，10％甲磺酸酯和2％羥基砜。實(shí)施例6合成馬來酰亞胺，NHS-酯異雙官能PEG(3400)試劑在兩步中合成馬來酰亞胺，NHS-酯PEG試劑。在第一步中，合成馬來酰亞胺基-PEG-OH。具體地來說，將0.130g馬來酰亞胺基琥珀酰亞胺基丙酸鹽溶于5ml無水二氯甲烷中并冷卻到0℃。接著，加入按下文所述方法制備的0.5gPEG-單胺，然后加兩滴三乙基胺。室溫下兩小時(shí)后，TLC表明反應(yīng)完全。使用4∶1∶1的正-BUOH-ACOH-H2O進(jìn)行TLC。蒸發(fā)反應(yīng)混合物至干并將殘?jiān)苡?5ml蒸餾水中。使用15ml0.5MHCl將溶液pH調(diào)至3并用10mlCH2Cl2提取。用硫酸鎂干燥有機(jī)層、過濾、濃縮至15ml并傾入75ml冷乙醚中。過濾沉淀物并真空干燥。產(chǎn)量為0.300g。NMR分析顯示77％馬來酰亞胺基團(tuán)和100％PGE-OH。在第二步中，將馬來酰亞胺基-PEG-OH轉(zhuǎn)化為馬來酰亞胺-PEG-NHS-酯。在室溫下氮?dú)猸h(huán)境中，攪拌2mlCH2Cl2、0.05ml吡啶(1當(dāng)量)、1ml乙腈和0.266g馬來酰亞胺基-PEG-OH。將0.070g(2.5當(dāng)量)N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯加到混合物中并將反應(yīng)物放置過夜。然后將反應(yīng)混合物傾入大約50ml冷乙醚中。過濾并真空干燥。NMR顯示有雜質(zhì)并將產(chǎn)物進(jìn)行第二次沉淀，最終產(chǎn)量為0.230g。在下列三步中制備上文第一步中使用的PEG-單胺。第一步，制備PEG-甲磺酸酯衍生物。由甲磺酸酯制備胺。最后，從未衍生的PEG和二胺中分離單胺。步驟1，將PEG-3400(120g，0.07164當(dāng)量的OH)溶于580ml甲苯，共沸干燥，然后加入90ml二氯甲烷、1.80ml三乙基胺(0.01291mol)和0.83ml甲磺酰氯(0.01072mol)。室溫下反應(yīng)過夜后，減壓從反應(yīng)混和物中蒸去90ml溶劑，過濾混合物，然后減壓蒸去500ml甲苯。將殘余物加到800ml冷乙醚中。濾出沉淀產(chǎn)物并減壓干燥。產(chǎn)量為118g且取代物為15％。步驟2，將118g步驟1中形成的甲磺酸酯和80g氯化銨溶于1600ml濃氨水中并在室溫下攪拌44小時(shí)。用600，400和200ml二氯甲烷提取反應(yīng)產(chǎn)物。用170ml2％KOH和170ml水洗滌提取物、用硫酸鎂干燥、濃縮至200ml并加到800ml冷乙醚中。濾出沉淀產(chǎn)物并減壓干燥。產(chǎn)量為106g且取代物為15.6％。步驟3，將45g步驟2中形成的胺溶于9L水并裝在SP-SepharoseFF(300ml用1000ml檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液(0.4％，pH3.0)平衡的凝膠，然后用水洗脫)上。從Pharmacia，Uppsala，Sweden處購(gòu)得SP-SepharoseFF。用水將未衍生的PEG從柱中洗出。接著，用800ml20mMNaCl洗脫P(yáng)EG單胺。用1MNaOH將洗脫液的pH調(diào)到11并用二氯甲烷提取PEG單胺、用硫酸鎂干燥，并蒸去溶劑。產(chǎn)量為9克。實(shí)施例7PEG-α、ω-二乙烯砜的合成使用PEG二醇和上文所述的總的方法來合成3400和20000kDaPEG二-乙烯砜。PEG二醇購(gòu)自FlukaChemicalCorporation(Ronkonkoma，NewYouk)或NipponOil和Fat(Tokyo，Japan)。實(shí)施例8使用PEG-20,000-α，ω-二乙烯砜來聚乙二醇化IL-lra按出版的PCT申請(qǐng)WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))所述方法制備IL-lrac84突變型蛋白。在25℃溫度下pH6.75-7.5的檸檬酸緩沖液中，于1ml管中用PEG-α，ω-二乙烯砜(3400或20,000kDa)軛合c84突變型蛋白或天然(野生型)IL-lra，同時(shí)改變PEG和蛋白質(zhì)濃度。在30mg/ml的蛋白質(zhì)濃度時(shí)，18小時(shí)內(nèi)獲得好的轉(zhuǎn)化為啞鈴分子的結(jié)果。0.94mg/ml蛋白質(zhì)濃度時(shí)，獲得大多數(shù)單個(gè)加成結(jié)果。100mg/ml蛋白與0.03當(dāng)量的PEG時(shí)優(yōu)先形成啞鈴物質(zhì)。用PCT公開WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))所述的色譜層析技術(shù)可純化啞鈴。在其它實(shí)驗(yàn)中，用0.53摩爾當(dāng)量的20kDaPEG-二乙烯砜在25℃溫度下處理含有30mg/ml野生型IL-lra的pH8.5，0.1MTris-HCl緩沖液18小時(shí)。SDSPAGE分析顯示轉(zhuǎn)化為啞鈴和單加成物。在3.1mg/ml蛋白質(zhì)濃度和1摩爾當(dāng)量PEG試劑時(shí)，僅觀察到有單加成物?？傊?，c84突變型蛋白與PEG試劑的反應(yīng)比野生型分子與PEG的反應(yīng)容易。實(shí)施例9IL-lra啞鈴的生物活性使用PCT申請(qǐng)公開WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))所述測(cè)定法分析比較上述產(chǎn)生的c84啞鈴分子和未聚乙二醇化的重組IL-lra對(duì)小鼠EL-4細(xì)胞的受體結(jié)合親合力。結(jié)果顯示兩種分子具有類似的結(jié)合親合力。實(shí)施例10用PEG-20,000-α，ω-二乙烯砜使TNFbpc105突變型蛋白聚乙二醇化按出版的PCT公開WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))所述方法制備TNFbp的c105突變型蛋白。另外，如下制備c105突變型蛋白。通過離心收集表達(dá)c105突變型蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞。通過加入純水將細(xì)胞沉積物調(diào)節(jié)到40％的濕重固體。然后再用等體積的破裂緩沖液(50mM氨基丁三醇、4mMEDTA，pH7.2)稀釋混合物而獲得大約20％濕重固體的混懸液。將細(xì)胞沉積物五次通過以大約8000psi運(yùn)轉(zhuǎn)的高壓勻漿機(jī)來產(chǎn)生細(xì)胞勻漿。每一次通過勻漿機(jī)之前，都將勻漿冷卻到低于或等于10℃。將勻漿離心并保留含c105的固體部分。將固體稀釋并再一次離心而獲得浸潤(rùn)(washed)包涵體。加入8M脲和150mM半胱氨酸(在50mMTRIS，pH9.5)使浸潤(rùn)包涵體溶解。重新折疊之前在室溫下攪拌該混合物2小時(shí)。在這種條件下，c105突變型蛋白被變性和還原。通過用1.1M脲、50mMTris稀釋來重新折疊還原變性的c105突變型蛋白質(zhì)而獲得含有200μg/mlc105突變型蛋白質(zhì)、1.5M脲、7.5mM半胱氨酸、50mMTris(pH9.7)的最終重新折疊的溶液。該重新折疊的混合物在被6-10℃下放置兩天。通過反相HPLC和陽(yáng)離子交換HPLC來檢測(cè)重新折疊的效率。加入乙酸和HCl重新折疊的混合物的pH為5.0。將重新折疊混合物裝在陽(yáng)離子交換柱(S-Sepharose大顆粒樹脂)上，使用前用25mM乙酸鈉、65mMNaCl(pH5)在4℃下進(jìn)行平衡。裝柱后，用同樣的平衡緩沖液洗滌柱子。用65到350mMNaCl在25mM乙酸鈉(pH5)中的梯度液洗脫柱子。在大約200mMNaCl時(shí)洗下c105突變型蛋白質(zhì)并收集在一起。用1.5倍體積的5MNaCl稀釋含c105突變型蛋白的收集液，用40mM磷酸鈉將pH調(diào)至6并裝在疏水水性相互作用的柱上(ToyoButyl650M柱)，使用前以3MNaCl、20mM磷酸鈉(pH6)進(jìn)行平衡。裝完后，用平衡緩沖液洗滌柱子。使用在20mM磷酸鈉(pH6)中的3到1MNaCl的線性8個(gè)柱體積遞減鹽梯度液來洗脫c105突變型蛋白質(zhì)。將c105突變型蛋白收集在一個(gè)池中。然后將其濃縮到大約3g/Lc105突變型蛋白并對(duì)20mM磷酸鈉(pH6.0)透析濾過直到最終導(dǎo)電率低于4mmho(大約為6倍體積)。將透析液裝在以20mM磷酸鈉(pH6.0)平衡的SP-Sepharose高效柱上。裝完后，用另外的平衡緩沖液洗滌該柱并用從20mM磷酸鈉，50mMNaCl(pH6.0)到20mM磷酸鈉、50mM)NaCl(pH6.5)的pH/鹽組合梯度液進(jìn)行洗脫。大約在35mMNaCl的后半梯度中洗出c105突變型蛋白。此時(shí)可冷凍貯存該c105突變型蛋白質(zhì)。將c105突變型蛋白質(zhì)以1∶1、2∶1、4∶1、1∶2和0∶1(對(duì)照)的PEG試劑與蛋白質(zhì)的摩爾比來與聚乙二醇化試劑反應(yīng)。該反應(yīng)在22℃溫度下在pH7.520mM的磷酸鹽/20mM乙酸鹽緩沖液中進(jìn)行15小時(shí)。也在pH7.5或8.5的50mM磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。通過在MA7S柱上的陽(yáng)離子交換來確定轉(zhuǎn)化為啞鈴分子的百分?jǐn)?shù)。轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)的范圍大約為40-60％。以0.50-0.65PEG試劑與1.0的TNFbp突變型蛋白摩爾比在22℃溫度下pH7.5時(shí)將大約50mg/mlPEG試劑溶液加到蛋白質(zhì)中15小時(shí)使轉(zhuǎn)化為啞鈴分子最優(yōu)化。當(dāng)PEG與蛋白質(zhì)的比例增加時(shí)，促進(jìn)單加成物的生成。5∶1比例的PEG試劑與蛋白質(zhì)使單加成物的形成最優(yōu)化。在S-SepharoseHP柱上進(jìn)行色譜層析來純化軛合物。將反應(yīng)混合物pH調(diào)至3.0-4.2并裝在預(yù)先調(diào)到相同pH的柱上。用平衡緩沖液洗滌柱子并使用線性氯化鈉梯度液和以1.2-1.5cm/min洗脫啞鈴分子。以下列順序從柱中洗脫下物質(zhì)1)單取代物，2)啞鈴分子，3)未聚乙二醇化的TNFbp突變型蛋白和4)凝聚的突變型蛋白。實(shí)施例11TNFbpc105突變型蛋白啞鈴分子的生物活性通過在WO92/16221(本文參考文獻(xiàn))所述的L929細(xì)胞毒性測(cè)定中的比較，顯示不管是按PCT申請(qǐng)公開WO92/16221所述方法或是按本文所述方法由PEG-二馬來酰亞胺形成的c105啞鈴分子的活性比未聚乙二醇化30kDaTNF抑制劑強(qiáng)50到100倍。實(shí)施例12制備甘油基-PEG-三乙烯砜使用上文所述常規(guī)方法將甘油基-PEG-α，β，γ-三醇(10,000kDa和20,000kDa)轉(zhuǎn)化為乙烯砜衍生物。從UnionCarbide，Terrytown，NewYork購(gòu)得甘油基-PEG-α，β，γ-三醇。通過在堿中甘油的環(huán)氧乙烷聚合開環(huán)可合成甘油基PEG-α，β，γ-三醇。實(shí)施例13使用甘油基-PEG-三乙烯砜來合成TNFbpc105三啞鈴(trumbbell)將三個(gè)TNFbpc105突變型蛋白軛合到PEG-三乙烯砜上以產(chǎn)生“三啞鈴”分子。在大的PEG蛋白質(zhì)的范圍配比內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化為三啞鈴分子的特別有用的摩爾比為0.25-0.35PEG比1的蛋白質(zhì)。在典型實(shí)驗(yàn)中，25℃溫度下使溶于20mM磷酸鹽、20mM乙酸鹽緩沖液(pH7.5)的c105突變型蛋白質(zhì)與0.03摩爾當(dāng)量的甘油基-PEG-10,000-α，β，γ-三醇反應(yīng)18小時(shí)。經(jīng)陽(yáng)離子交換HPLC(BioRadMA7S柱，用氯化鈉梯度液洗脫)分析后者的反應(yīng)混合物表明以49％產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為三啞鈴分子并以34.9％產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為雙取代物。實(shí)施例14用甘油基-PEG-三乙烯砜合成IL-lra三啞鈴分子以下列PEG/蛋白質(zhì)摩爾比，將PEG-10,000-α，β，γ-三乙烯砜與20mg/ml野生型IL-lra在0.1M磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)0.10∶1；0.25∶1；0.35∶1；0.45∶1；0.55∶1；0.65∶1。將反應(yīng)在25℃保溫72小時(shí)。SDSPAGE分析顯示轉(zhuǎn)化為單、雙和三加成產(chǎn)物。觀察到在0.10∶1的PEG/蛋白質(zhì)配比時(shí)最適于轉(zhuǎn)化為三加成物。將反應(yīng)混合物裝在SSepharose高效柱上并用氯化鈉梯度液洗脫。實(shí)施例15合成c105TNFbp-PEG-IL-lra異型啞鈴以下列摩爾比和指定的IL-lra濃度使野生型IL-lra的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)與8mg/mlPEG-20,000-二乙烯砜-單-c105TNFbp加成物進(jìn)行反應(yīng)55∶1(12.5mg/ml)；85∶1(18.75mg/ml)；100∶1(25.0mg/ml)和150∶1(31.75mg/ml)。72小時(shí)后，經(jīng)SDSPAGE確定形成異型啞鈴。觀察到在1∶100的單加成物與IL-lra的配比時(shí)最適于轉(zhuǎn)化。用SSepharose高效柱對(duì)異型啞鈴進(jìn)行純化并用氯化鈉梯度液洗脫。實(shí)施例16PEG-乙烯砜多肽加成物的穩(wěn)定性研究c105TNFbp突變型蛋白質(zhì)和PEG-二乙烯砜之間的鍵的穩(wěn)定性。將已知量的c105啞鈴分子在PBS(pH7.4)中37℃溫度下保溫一周，在此期間不時(shí)取出等分試樣進(jìn)行SDSPAGE分析。觀察到c105啞鈴分子基本上沒有分解。在pH10、37℃保溫1周時(shí)，觀察到僅有5-10％的軛合物的分解物。實(shí)施例17TNFbpc105啞鈴分子對(duì)主動(dòng)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(“EAE”)的抑制已研究了用PEG-二乙烯砜制備的c105啞鈴分子的體內(nèi)活性。EAE是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫炎性脫髓鞘疾病的小鼠模型，經(jīng)常用作人MS的模型。如下文所述，c105啞鈴分子抑制大鼠的EAE。從CharlesRiver(Raleigh，NC)處購(gòu)得雌性Lewis大鼠(150-200g)，并在開始實(shí)驗(yàn)前至少飼養(yǎng)1周。它們自由進(jìn)食和進(jìn)水并在室內(nèi)溫度和光線控制(12小時(shí)/天)下飼養(yǎng)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的年齡是一致的。主動(dòng)誘導(dǎo)EAE用2％異氟烷+O2麻醉大鼠(通常每組6只)并在0天于大鼠左后肢的足掌部用0.1ml下列之一劑量的含髓磷脂堿性蛋白(“MBP”)的乳劑來免疫0，1，3，10或30μg(片斷68-84，Bachem.Bioscience，PA)。將MBP溶于磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中并用相同體積的含5mg/ml的結(jié)核桿菌H37Ra(DifcoLab，MI)的弗氏完全佐劑乳化(CFA)。對(duì)照大鼠在左后肢的足掌上，接受0.1ml不含MBP的PBS/CFA乳劑。EAE的臨床評(píng)價(jià)使用常規(guī)的0-5評(píng)分系統(tǒng)每天進(jìn)行臨床疾病的評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)單地來說，等級(jí)范圍為0為正常，0.5為部分失去尾部緊張，1為完全失去尾部緊張，2為拖動(dòng)一條后肢，3為兩條后肢都癱瘓，4為病態(tài)的和5為死亡。記錄各大鼠的每日體重并以相對(duì)于開始體重來說體重的減小和恢復(fù)來表示。MBP的免疫作用開始研究是在大鼠中評(píng)價(jià)上述乳劑中兩種不同劑量MBP(0.1-30μg/0.1ml)的臨床嚴(yán)重性。0.1和0.3μgMBP不產(chǎn)生明顯的臨床作用。與1μg劑量比較，30μg劑量的MBP產(chǎn)生最強(qiáng)的臨床作用。該作用具有高的顯著性(p＜0.001，Mann-WhitneyU-test)。總而言之，MBP劑量(1-30μg)的增加產(chǎn)生較早臨床作用，例如，1μgMBP開始的平均值±S.E.M為14.88±0.42(n＝9)而30μgMBP劑量數(shù)天時(shí)為12.35±0.16(n＝34；p＜0.01)。另外，觀察到MBP(1-30μg)劑量依賴的體重?fù)p失作用。在開始后的5-7天內(nèi)，動(dòng)物從臨床癥狀中自動(dòng)恢復(fù)。單獨(dú)給予CFA不產(chǎn)生臨床作用，然而未治療的對(duì)照組相比，有初始的短暫的體重?fù)p失。在所有這些研究中，觀察到在MBP的任何劑時(shí)無藥組(僅用MBP致免疫)和賦型劑劑量組(MBP致免疫并使用PBS)之間沒有顯著性差異。因此，賦型劑對(duì)疾病的嚴(yán)重程度沒有影響(見表3和4)。下文描述無藥組和賦型劑劑量組。EAE的治療在各種時(shí)間過程中皮下注射各種劑量的TNF抑制劑啞鈴分子(0.1-3mg/kg)或賦型劑(PBS)。在用MBP免疫后立即或在9天后開始治療并繼續(xù)到免疫后的21天。在各實(shí)驗(yàn)中，接受PBS的對(duì)照大鼠接受與治療組相同量的注射以減小因應(yīng)激而產(chǎn)生的任何繼發(fā)作用。也觀察了EAE誘導(dǎo)后未接受注射(無藥對(duì)照)的大鼠組。治療作用每日給藥評(píng)價(jià)從免疫之日起每日給予TNF抑制劑啞鈴分子共21天對(duì)EAE的影響。濃度為0.1、0.3、1或3mg/kg的啞鈴分子在1μg和30μgMBP組中對(duì)臨床癥狀嚴(yán)重程度的減小沒有明顯的影響。然而，觀察到3μgMBP劑量時(shí)所使用的所有啞鈴分子劑量都明顯改善臨床疾病。每隔一日給藥也試驗(yàn)了從免疫后第9天開始每隔一日給予0.1、0.3、1和3mg/kg劑量時(shí)的作用。如表3和4所示，與使用最高劑量MBP(30μg/0.1ml)的賦型劑對(duì)照組相比，劑量0.3(p＜0.008)、1.0(p＜0.001)和3.0mg/kg(p＜0.002，MannWhitney檢驗(yàn)，n＝6)時(shí)對(duì)臨床癥狀產(chǎn)生明顯的抑制作用。觀察到賦型劑和來治療對(duì)照組之間沒有明顯差異。最低劑量的TNF抑制劑啞鈴分子對(duì)臨床癥狀沒有明顯作用。1.0(p＜0.1)和3mg/kg(p＜0.05，MannWhitney檢驗(yàn))的啞鈴分子劑量明顯減輕由10μgMBP產(chǎn)生的臨床癥狀。盡管0.3和0.1mg/kg啞鈴分子減輕臨床癥狀，但這種減輕作用是不明顯的。0.1-3mg/kg劑量的啞鈴分子不明顯抑制由低劑量MBP(1或3μg)誘導(dǎo)的臨床癥狀。體重的減小是EAE開始的重要標(biāo)志。用3，10和30μgMBP免疫的大鼠接受c105啞鈴分子(1或3mg/kg)治療，與賦型劑組進(jìn)行比較其體重減小。表3.TNF抑制劑啞鈴分子對(duì)主動(dòng)誘導(dǎo)的EAE的預(yù)防作用表3A-3F啞鈴分子對(duì)每日平均臨床得分的影響-30μgMBP表3A表3B</tables>表3C</tables>表3D</tables>表3E</tables>表3F</tables>表的說明每日平均嚴(yán)重程度得分的大鼠是用30μgMBP免疫的并從MBP免疫后第9天開始每隔一日用TNF抑制劑啞鈴分子來治療的。賦型劑組接受PBS而無藥組在EAE誘導(dǎo)后不接受注射。表4用曲線下的面積來表示TNF抑制劑啞鈴分子的抑制作用</tables>表的說明用曲線下面積(任意單位)來表示c105啞鈴分子對(duì)臨床嚴(yán)重程度的抑制作用。測(cè)定各組的平均值±S.E.M(n＝6)并與賦型劑組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))。觀察到賦型劑組與無藥對(duì)照組之間沒有顯著性差異。0.3，1.0和3.0mg/kg(接上文給出的)的c105啞鈴分子明顯地(**P分別小于0.008、0.001和0.002)減輕臨床癥狀。如表5所示，通過觀察臨床癥狀期內(nèi)數(shù)天的測(cè)量并計(jì)算所給出大鼠組的平均值表明每隔一日給藥也縮短疾病的期限。表5每隔一日給藥時(shí)的疾病期限*p＜0.05**p＜0.01單劑量給藥在免疫后第9天一次給予0.3或3mg/kg劑量的啞鈴分子與賦型劑對(duì)照相比很少或未減輕MBP(1-30μg)誘導(dǎo)的臨床癥狀。每三天給予一次TNF抑制劑啞鈴分子在MBP免疫后第9、12、15和18天給予0.1-3mg/kg的啞鈴分子或賦型劑。如表6所示，觀察到0.3(P＜0.05)、1.0(P＜0.01)和3mg/kg(P＜0.001Mann-Whitney-檢驗(yàn))劑量的c105啞鈴分子明顯減輕MBP(30μg)誘導(dǎo)的臨床癥狀。當(dāng)與賦型劑對(duì)照組相比時(shí)，0.1mg/kg劑量的c105啞鈴分子沒有作用。0.3、1.0和3.0mg/kg劑量的c105啞鈴分子減輕MBP(10μg)誘導(dǎo)的臨床癥狀。然而，僅在較高劑量的c105啞鈴分子時(shí)才觀察到明顯(分別為P＜0.05和0.03)的作用。盡管c105啞鈴分子(0.3-3mg/kg)以大約20-60％減輕由3μgMBP產(chǎn)生的臨床癥狀，但觀察到的作用與賦型劑對(duì)照組之間沒有顯著性差異。c105啞鈴分子通?？s短疾病的期限。例如1和3mg/kg劑量的c105啞鈴分子分別以37.3％和68.7％明顯縮短MBP(30μg)介導(dǎo)的癥狀的期限(見表10)。使用中間劑量的MBP(10μg)但不是最低劑量的MBP也觀察到了類似的趨勢(shì)(表7)。在用3mg/kgc105啞鈴分子治療的動(dòng)物中，10和30μgMBP組的疾病的發(fā)作明顯(分別為P＜0.047；P＜0.013；MannWhitneyU-檢驗(yàn))延遲。c105啞鈴分子特別是在1和3mg/kg劑量時(shí)，部分抑制了與EAE相關(guān)的體重減低。體重?fù)p失的減小是劑量依賴性的。不管MBP使用什么樣的劑量，c105啞鈴分子的這種作用都是類似的。表6每三天給藥一次的以面積表示的平均臨床嚴(yán)重程度</tables>表7每三天給藥一次的疾病的持續(xù)時(shí)間</tables>*p＜0.05**p＜0.01實(shí)施例18，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病理學(xué)測(cè)定由PEG-二乙烯砜合成的c105啞鈴分子對(duì)由MBP(0，10或30μg)免疫誘導(dǎo)的CNS疾病的治療作用。如上文所述來進(jìn)行MBP免疫(EAE誘導(dǎo))。MBP免疫后第9天開始每?jī)商旖o予一次0.3、3mg/kg的c105啞鈴分子或賦型劑。在第9、14或20天(注射MBP后)殺死(通過CO2)動(dòng)物。從每只大鼠中取出腦和脊髓并放在10％中性緩沖的甲醛中。固定至少72小時(shí)后，在視交叉尾部到垂體與腦橋橫向纖維連結(jié)處制備腦的橫切片。經(jīng)頸、胸和肢橫切成4-6斷來整理脊髓。縱向包埋與尾神經(jīng)連結(jié)的骶骨部分。將組織包埋在石蠟中并用蘇木精和伊紅染色。在不知道治療組的情況下進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。給每個(gè)片標(biāo)上1-4范圍內(nèi)的數(shù)值來表示炎癥和脫髓鞘的強(qiáng)度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下1＝最少，1-2根管具有炎性細(xì)胞的小的血管周套，2＝輕度，3或多根管具有炎性細(xì)胞的小的血管周套但很少將炎癥延伸到實(shí)質(zhì)中，3＝中度，3或多根管具有炎性細(xì)胞的明顯的血管周套并且炎癥中度地侵入實(shí)質(zhì)周圍，和4＝顯著，大多數(shù)管具有炎性細(xì)胞明顯的血管周套并在炎癥過程中廣泛地包含了神經(jīng)纖維網(wǎng)。確定每只動(dòng)物每個(gè)CNS區(qū)的總炎癥分?jǐn)?shù)。計(jì)算CNS每一部分的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分?jǐn)?shù)值平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤)并與賦型劑治療組的動(dòng)物進(jìn)行比較。測(cè)定每組動(dòng)物各個(gè)CNS區(qū)的平均炎癥得分并與賦型劑對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較(Students-t-檢驗(yàn))。表8和9中描述了這些得分。在MBP注射后第9天殺死的動(dòng)物中，CNS沒有顯著的組織學(xué)改變。在14天時(shí)的損傷由最小到顯著的通常血管周炎性細(xì)胞浸入的混合形式構(gòu)成(單核+某些中性粒細(xì)胞)。在腦中，炎癥趨向于腦膜、腦室周地區(qū)和小腦白色束，而腦干和小腦白色束受得影響最為嚴(yán)重。在這些區(qū)域，炎癥經(jīng)常從血管周區(qū)域延伸到實(shí)質(zhì)周圍并表明有脫髓鞘作用。在脊髓中，影響最嚴(yán)重的是腰部和骶骨部位?；屹|(zhì)和白質(zhì)都受到影響，且主要受損傷的是血管周。炎癥持續(xù)到20天，然而此時(shí)很少能看到中性粒細(xì)胞。在各組和幾乎所有組的動(dòng)物中都發(fā)生炎性強(qiáng)度的變化。表8和9表明c105啞鈴分子的存在減輕所研究CNS各個(gè)區(qū)的發(fā)炎程度。觀察到在脊髓特別是腰部和骶骨部位炎癥的減輕最明顯。c105啞鈴分子對(duì)CNS的較高區(qū)域大腦和小腦具有較小的作用。表8用30μgMBP免疫并用TNF抑制劑啞鈴分子治療的動(dòng)物的炎癥得分</tables>*p＜0.05(studentst-檢驗(yàn))組織學(xué)(30μgMBP劑量)表9用10μgMBP免疫并用TNF抑制劑啞鈴分子治療的動(dòng)物的炎性得分p＜0.01組織學(xué)(10μgMBP劑量)實(shí)施例19.c105TNFbp啞鈴分子防護(hù)內(nèi)毒素致死使用PEG-二乙烯砜合成的c105啞鈴分子保護(hù)Balb/c小鼠對(duì)抗致死劑量的內(nèi)毒素。給小鼠腹膜內(nèi)注射30mg/kg內(nèi)毒素，并在給予內(nèi)毒素的1小時(shí)或2小時(shí)時(shí)，靜脈一次給予0.1mlPBS或溶于0.1mlPBS的1mg/kg啞鈴分子。注射內(nèi)毒素1小時(shí)后靜脈給予1mg/kg啞鈴分子時(shí)幾乎對(duì)致死產(chǎn)生完全的防護(hù)作用。在兩小時(shí)時(shí)給予啞鈴分子對(duì)致死內(nèi)毒素的損傷不產(chǎn)生防護(hù)作用。c105啞鈴分子也保護(hù)Lewis大鼠對(duì)抗致死劑量的內(nèi)毒素。給大鼠靜脈注射12.5mg/kg的內(nèi)毒素。注射內(nèi)毒素的同時(shí)，給大鼠注射鹽水或0.1、0.5、3.0或4.5mg/kg劑量的c105啞鈴分子。所有劑量的啞鈴分子都產(chǎn)生類似的對(duì)致死損傷的防護(hù)作用。在給予10mg/kg劑量的內(nèi)毒素的同時(shí)同時(shí)給予1.5mg/kgc105啞鈴分子來進(jìn)行治療時(shí)，保護(hù)大鼠對(duì)抗肝和代謝紊亂。如表10所示，在給予內(nèi)毒素后24小時(shí)時(shí)評(píng)價(jià)肝和代謝參數(shù)。表10.c105啞鈴分子(1.5mg/kg)對(duì)由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的生化參數(shù)異常的治療作用<tablesid="table15"num="015"><tablewidth="802">參數(shù)對(duì)照+賦型劑內(nèi)毒素+賦型劑內(nèi)毒素+c105啞鈴分子葡萄糖(mg/dL)143±252±881±5*SGPT1(mu/mL)47±6679±118141±25*血尿氮(mg/dL)19±188±239±3*皮質(zhì)酮(ng/mL)164±62750±49489±43*1血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值為每組4到8只大鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤*與內(nèi)毒素處理組比較顯著性差異p＜0.05(成對(duì)比較的t-檢驗(yàn))</table></tables>可以理解到在本文教導(dǎo)之下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠把本發(fā)明的技術(shù)用于具體的表達(dá)系統(tǒng)或聚乙二醇化試劑。因此，對(duì)本發(fā)明的方法和產(chǎn)品進(jìn)行各種修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明應(yīng)該包含這些修飾和變化。權(quán)利要求1.一種生物活性軛合物，它含有選自IL-1抑制劑、腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑、CR1、PDGF受體、IL-2和PDGF的外顯子6肽的生物活性分子，其中所述生物活性分子具有反應(yīng)性硫羥基部分，和具有與所述硫羥基部分形成鍵的活性砜部分的非肽聚合物。2.權(quán)利要求1的生物活性軛合物，其中所述活性砜部分為乙烯砜。3.權(quán)利要求1的生物活性軛合物，其中所述活性砜部分為氯代乙基砜。4.權(quán)利要求1的生物活性軛合物，其中所述生物活性分子為選自30kDaTNF抑制劑、40kDaTNF抑制劑、Δ51TNF抑制劑和Δ53TNF抑制劑的TNF抑制劑。5.權(quán)利要求4的生物活性軛合物，其中所述TNF抑制劑為30kDaTNF抑制劑。6.權(quán)利要求4的生物活性軛合物，其中所述TNF抑制劑為40kDaTNF抑制劑。7.權(quán)利要求4的生物活性軛合物，其中所述TNF抑制劑為Δ51TNF抑制劑。8.權(quán)利要求4的生物活性軛合物，其中所述TNF抑制劑為Δ53TNF抑制劑。9.權(quán)利要求1的生物活性軛合物，其中所述生物活性分子為白細(xì)胞介素-1(IL-1)抑制劑。10.權(quán)利要求9的生物活性軛合物，其中所述IL-1抑制劑為白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-lra)。11.權(quán)利要求1的生物活性軛合物，其中所述非肽聚合物除所述活性砜部分外還具有反應(yīng)性NHS-酯。12.權(quán)利要求11的生物活性軛合物，其中所述活性砜部分為乙烯砜。13.一種基本上純化的式R1-X-R2的化合物，其中X含有具有第一反應(yīng)性基團(tuán)和第二反應(yīng)性基團(tuán)的非肽聚合物，其中所述第一反應(yīng)性基團(tuán)為邁克爾受體；R1含有選自IL-1抑制劑，腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑、CR1、PDGF受體、IL-2和PDGF的外顯子6肽的生物活性分子，該分子具有反應(yīng)性硫羥部分，將所述生物活性分子通過所述硫羥基部分與所述邁克爾受體反應(yīng)來與所述非肽聚合物共價(jià)結(jié)合，并且在所述反應(yīng)之后保留所述生物活性分子的生物活性；和R2含有通過與所述第二反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)而與所述非肽聚合物結(jié)合的生物活性分子或非生物活性基團(tuán)。14.權(quán)利要求13的基本上純化的化合物，其中所述邁克爾受體為乙烯砜。15.權(quán)利要求13的基本上純化的化合物，其中所述第二個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)為NHS-酯。16.權(quán)利要求13或15的基本上純化的化合物，其中所述邁克爾受體為馬來酰亞胺。17.權(quán)利要求13的基本上純化的化合物，其中所述非肽聚合物具有兩個(gè)邁克爾受體。18.權(quán)利要求17的基本上純化的化合物，其中所述邁克爾受體為馬來酰亞胺。19.權(quán)利要求17的基本上純化的化合物，其中所述邁克爾受體為乙烯砜。20.權(quán)利要求17的基本上純化的化合物，其中一個(gè)所述邁克爾受體為乙烯砜而另一個(gè)為馬來酰亞胺。21.權(quán)利要求13的基本上純化的化合物，其中所述生物活性分子為TNF抑制劑。22.權(quán)利要求21的基本上純化的化合物，其中所述TNFbp為30kDaTNF抑制劑。23.權(quán)利要求21的基本上純化的化合物，其中所述TNFbp為40kDaTNF抑制劑。24.權(quán)利要求21的基本上純化的化合物，其中所述TNFbp為Δ51TNF抑制劑。25.權(quán)利要求21的基本上純化的化合物，其中所述TNFbp為Δ53TNF抑制劑。26.權(quán)利要求13的基本上純化的化合物，其中所述生物活性分子為IL-1抑制劑。27.權(quán)利要求26的基本上純化的化合物，其中所述IL-1抑制劑為IL-lra。28.一種具有反應(yīng)性NHS-酯和馬來酰亞胺的水溶性聚合物。29.權(quán)利要求28的水溶性聚合物，其中所述聚合物選自聚亞烷基氧化物，聚氧乙烯化的多元醇和聚烯烴醇。30.一種藥物組合物，它含有溶于可藥用載體中的權(quán)利要求1的化合物。31.一種藥物組合物，它含有溶于可藥用載體中的權(quán)利要求13的化合物。全文摘要本文公開了由生物活性分子的硫羥基部分與具有活性砜部分的非肽聚合物反應(yīng)形成的生物活性軛合物。也公開了具有式R文檔編號(hào)A61K38/00GK1158089SQ95194463公開日1997年8月27日申請(qǐng)日期1995年6月14日優(yōu)先權(quán)日1994年6月14日發(fā)明者甲野忠彥,D·卡興斯基,M·哈里斯申請(qǐng)人:希爾沃特聚合物公司,安姆根博爾德有限公司