專利名稱：用作自身免疫性疾病治療劑的肽的制作方法
自身免疫性疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，潰瘍性結(jié)腸炎，自身免疫性眼色素層炎和許多其它疾病)是自身的防御系統(tǒng)(免疫系統(tǒng))不再耐受自身器官的結(jié)構(gòu)而象對待侵入的病原體一樣進(jìn)行攻擊疾病。從而損傷或甚至破壞自身組織且因此發(fā)生疼痛和身體缺陷(例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)僵硬；在多發(fā)性硬化中一般性運(yùn)動受阻，失禁，語言障礙；在潰瘍性結(jié)腸炎中嚴(yán)重腹瀉，營養(yǎng)缺陷和有致病后果的腸穿孔；在眼色素層炎中損傷視覺分辨力，并甚至能導(dǎo)致失明)。
眼色素層炎與虹膜，睫狀體，玻璃體，視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜的眼內(nèi)炎癥有關(guān)。炎癥使虹膜常發(fā)生疼痛并能通過與其前面的角膜和/或與其后面的晶狀體發(fā)生虹膜粘連而導(dǎo)致封閉瞳孔反應(yīng)。在角膜和內(nèi)側(cè)的晶狀體的細(xì)胞沉淀物以及在眼前房和玻璃體的細(xì)胞滲入物有時接著形成混濁的膜，它象一層簾子伸展玻璃體或貼在視網(wǎng)膜上，從而損傷視力。視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜發(fā)炎出現(xiàn)水腫，細(xì)胞滲入物和在晚期的萎縮病變。涉及發(fā)炎的視網(wǎng)膜管也不少見。視神經(jīng)乳突的水腫性腫脹可能進(jìn)一步導(dǎo)致由光刺激引起的神經(jīng)加工障礙。盡管以上描述的現(xiàn)象是部分可逆的，但因?yàn)橐暰W(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的破壞是一種不可逆事件，它導(dǎo)致視力的持久損傷并甚至失明。
所述的眼色素層炎癥狀可能是其它自身免疫性疾病伴隨癥狀，例如，風(fēng)濕性或類感染疾病發(fā)生后的病癥。炎癥由免疫系統(tǒng)起動，并在其進(jìn)一步過程中還有其它細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)。
在大多數(shù)情況下自身免疫疾病是慢性的，要么復(fù)發(fā)，要么持續(xù)惡化。已被免疫系統(tǒng)破壞的組織能再生的情況很少。如果涉及神經(jīng)組織如在多發(fā)性硬化或眼色素層炎中，再生是絕不可能的。這些自身免疫性疾病產(chǎn)生的原因在很大程度上是未知的，猜測在有些情況下是感染，由此誤導(dǎo)免疫系統(tǒng)。
常規(guī)引入的治療免疫疾病措施涉及的不僅免疫系統(tǒng)的自身反應(yīng)(自身攻擊)部分，而且抑制普通免疫反應(yīng)細(xì)胞，這些細(xì)胞本來應(yīng)該應(yīng)用于防御侵入的病原體或腫瘤細(xì)胞。除了損傷一般的免疫防御和可能形成腫瘤外，常規(guī)的免疫抑制劑諸如甾類化合物，環(huán)孢菌素A和細(xì)胞抑制藥也經(jīng)常不具有免疫性且有時會有威脅生命的副作用。
對于許多(自身免疫性)疾病，根據(jù)疾病與某些組織相容性抗原(HLA，起初描述為移植抗原)的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性猜測是遺傳誘因。作為一種機(jī)制，假設(shè)免疫系統(tǒng)混淆了病原體抗原(細(xì)胞，病毒)與自身HLA抗原。
在過去的一些年中進(jìn)行了許多嘗試來干擾免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，以便重建自身耐受性與病原體防御間的正常平衡。在其它方面，已進(jìn)行了許多嘗試通過機(jī)體的“免疫學(xué)特許”位點(diǎn)(“immun-privilegierte”Bereiche)誘導(dǎo)免疫耐受性。一個特許位點(diǎn)的例子是哺乳動物消化道，可用于誘導(dǎo)對蛋白質(zhì)分子(“抗原”)的耐受性(“口服耐受性”)。這一機(jī)制假設(shè)持續(xù)引起對消化的食物的免疫反應(yīng)抑制。因此口服“自身抗原”(自身蛋白質(zhì)，在自身免疫性疾病的情況下誘導(dǎo)抗該蛋白質(zhì)的攻擊性免疫反應(yīng))能誘導(dǎo)耐受性，即對自身組織的非反應(yīng)性，即使自身攻擊位點(diǎn)它是受攻擊的組織在空間上遠(yuǎn)離消化道。口服耐受性誘導(dǎo)是一種免疫抑制形式，它具有高度特異性，即免疫反應(yīng)僅影響涉及的抗原。因此預(yù)期不會有與那些一般免疫抑制相比的副作用。在自身抗原的口服應(yīng)用中尚未觀察到且預(yù)期不會有不期望的藥理-毒理學(xué)影響。
在有些自身免疫性疾病中自身抗原是已知的，因此可用于特異性治療。在有些情況下，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)僅針對一種抗原(在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中是膠原II，在糖尿病中是胰島素)，在自身免疫性眼色素層炎的例子中，已知來自眼光感受器層的兩種蛋白質(zhì)能在動物模型中誘導(dǎo)眼色素層炎，并且在眼色素層炎病人中可檢測到針對它們的免疫反應(yīng)。
它們是視網(wǎng)膜S-抗原和光感受器內(nèi)視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白(IRBP)。此外在這些蛋白質(zhì)內(nèi)的某些特定部分(抗原決定基)如果作為肽使用也能誘導(dǎo)眼色素層炎。如果口服利用S-抗原，IRBP或由此衍生的(口服耐受性)時可抑止由這些物質(zhì)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性眼色素層炎(例如參見Thurau，S.R.，Chan，C.-C.，Suh，E.，Nussenblatt，R.B.；Induction of oral tolerance toS-antigen induced experimental autoimmune uveitis by a uveitogenic 20merpeptide.J.Autoimm.4.507-516(1991))。
蛋白質(zhì)抗原的供應(yīng)是主要的困難。而且有許多缺點(diǎn)1)一般來說該抗原必須從天然組織中分離。在這一過程中可能出現(xiàn)感染(病毒、類病毒、細(xì)菌)或用(逆轉(zhuǎn)錄)病毒或細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)染。
2)該抗原最好用耗資巨大的遺傳技術(shù)合成。
3)在不同情況下，蛋白質(zhì)如蛋白質(zhì)抗原的長期貯存是困難的。在不利情況下，即使昂貴的保存條件僅能在短期內(nèi)保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，活性和效力。
4)由于細(xì)胞表面交聯(lián)的出現(xiàn)形成象食物過敏或接觸過敏的過敏反應(yīng)的危險隨蛋白質(zhì)抗原而增加。這在自身免疫性疾病病人中尤其重要，因?yàn)檫^敏反應(yīng)的病人數(shù)增加。
這些問題構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)，并設(shè)法解決。
該問題將以權(quán)利要求書中所述的肽來解決。
一方面本發(fā)明涉及具有下列序列的由7到30個氨基酸殘基組成的肽A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，其中B和C各為一個氨基酸或多個氨基酸，A和D各為單聚體的或多聚體的有機(jī)基團(tuán)。
而且還表明與上述核心序列Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-相比羧基末端延伸兩個氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的肽也具有顯著的治療特性。
因此本發(fā)明的另一權(quán)利要求是由具有下列序列的9到30個氨基酸組成的肽A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-Asp-Glu-D，其中B和C也是各為一個氨基酸或多個氨基酸，A和D各是單聚體的或多聚體的有機(jī)基團(tuán)。
在研究過程中可證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的肽與T-細(xì)胞受體和HLA(人白細(xì)胞抗原)的結(jié)合不連續(xù)地分布于核心序列內(nèi)的幾個氨基酸上。在這些結(jié)合所必須的氨基酸之間有些位點(diǎn)是不參與結(jié)合的殘基，因此可以替換。看來連續(xù)的氨基酸序列對功能是非決定性的。但同時與T細(xì)胞受體和HLA抗原相互作用的肽內(nèi)的單個位置是決定性的。
因此，分別在具有7或9個氨基酸的核心序列前和后(位置A或位置D)以及在核心序列內(nèi)(位置B和C)，氨基酸交換不會丟失主要的生物學(xué)功能。
可變位置B和C位于7或9個殘基長的核心序列內(nèi)，代表1個或幾個氨基酸。此變化僅限于毗鄰范圍內(nèi)，因?yàn)楹诵男蛄袃?nèi)的空間條件對核心序列的單個位置與HLA分子和T細(xì)胞受體的生物學(xué)有關(guān)相互作用起關(guān)鍵性作用。我們的研究表明B和C優(yōu)選分別代表單個氨基酸。
特別是本發(fā)明涉及根據(jù)上述特征的肽，其中B代表絲氨酸或蘇氨酸。在實(shí)驗(yàn)中已反復(fù)證實(shí)，核心序列中位置B的氨基酸可替換。在研究過程中還表明，用精氨酸替代基團(tuán)B不產(chǎn)生治療活性肽。
根據(jù)本發(fā)明的肽的優(yōu)選形式中，C指蘇氨酸，色氨酸，谷氨酸或絲氨酸。但在這種情況下，也可在核心序列的該位置導(dǎo)入其它氨基酸而不明顯改變治療效果。因此，在根據(jù)本發(fā)明的肽的位置C中的氨基酸似乎對HLA-肽-T細(xì)胞受體-復(fù)合物內(nèi)的結(jié)合并非十分重要。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的肽整合進(jìn)HLA-肽-T細(xì)胞-受體復(fù)合物時，關(guān)于核心序列的氨基和羧基末端的基團(tuán)A和D似乎位于結(jié)合位點(diǎn)外面，因此幾乎不具有生物學(xué)功能的意義。因此許多不同長度和不同位阻的基團(tuán)可位于該位置而不明顯影響該肽的治療效力。
例如單體或多聚體的有機(jī)基團(tuán)A和D各自獨(dú)立地包含一個或幾個氨基酸，有機(jī)脂肪族基團(tuán)，特別是飽和的或不飽和的脂肪酸基團(tuán)或還有脂多糖。
如果A和D是氨基酸殘基，那么權(quán)利要求1的序列的氨基和羧基末端殘基數(shù)根據(jù)下列規(guī)律來計算氨基末端基團(tuán)A為0到23個氨基酸，氨基末端基團(tuán)D為0或高達(dá)最大值(23-氨基末端基團(tuán)A的氨基酸數(shù))的氨基酸殘基。
對于根據(jù)權(quán)利要求9的其核心區(qū)序列在羧基末端延伸兩個氨基酸的肽來說，氨基和羧基末端殘基的數(shù)目根據(jù)下面規(guī)律來計算氨基末端基團(tuán)A為0到21個氨基酸，羧基末端基團(tuán)D為0或高達(dá)最大值(21-氨基末端基團(tuán)A的氨基酸數(shù))的氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語肽還涉及那些出現(xiàn)了N-末端和C末端取代的氨基酸鏈。用于取代的例子有乙酰化，用脂肪酸酯化，用糖連接，用C1到C12烷基或烷酰基烷基化。
以上定義的根據(jù)本發(fā)明肽優(yōu)選包括7或9到20個氨基酸的殘基，特別是8或9到16個氨基酸殘基。
該肽優(yōu)選包含下面的序列Am-Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr-Dn，其中A和D是一個或幾個氨基酸，m和n代表根據(jù)下面公式的氨基酸殘基數(shù)m＝0到16，n＝0或高達(dá)最大值(16-m)。
可鑒別一個肽，它不是來自視網(wǎng)膜蛋白，但關(guān)于其治療效力比前面描述的視網(wǎng)膜S-抗原衍生物有效得多。如果口服用藥，這一具有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr的本發(fā)明的14聚體肽在抑制眼色素層炎中最有效。到目前為止，這種肽尚未以任何方式與眼色素層炎有著功能性聯(lián)系，無論是該疾病的誘導(dǎo)，還是其治療。
這種肽的另一具體特征是當(dāng)口服給藥時，它既抑制S-抗原特異性免疫反應(yīng)的能力，又降低蛋白質(zhì)化學(xué)上與IRBP無關(guān)的反應(yīng)性。
本發(fā)明的主題是本發(fā)明的肽在制備用于治療自身免疫性疾病和具體用于治療眼色素層炎的治療組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一主題是根據(jù)本發(fā)明的肽在制備用于針對視網(wǎng)膜S-抗原，針對光感受器內(nèi)視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白(IRBP)和/或針對人白細(xì)胞抗原進(jìn)行免疫的藥物中的應(yīng)用，所述肽含有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-ALa-Asp-Thr。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的上述藥物組合物可作為溶液，懸液或壓縮形式使用。在這些情況下，除活性成份之外通常加入添加劑和載體。
施用藥物后，可經(jīng)口服途徑誘導(dǎo)耐受性。應(yīng)每日施用每千克體重10μg到10mg肽的劑量。
根據(jù)本發(fā)明的肽的效力基于對與其它自身抗原交叉反應(yīng)的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效力。因此本發(fā)明的肽可期望應(yīng)用于多種自身免疫性疾病的治療。
在本文中免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性并不局限于血液淋巴細(xì)胞。體液免疫反應(yīng)(抗體)，巨噬細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞也可以是根據(jù)本發(fā)明的肽的可能靶點(diǎn)。
在動物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)了治療效力。用肽B27PD，相應(yīng)的視網(wǎng)膜蛋白(視網(wǎng)膜S-抗原(S-Ag)或IRBP)，視網(wǎng)膜S-抗原的肽(形式P35PDSAg的截短等價物)，不相關(guān)對照蛋白質(zhì)(雞蛋卵清蛋白(OVA))，不相關(guān)對照肽(B7PD)或生理鹽水溶液(PBS)飼喂幾組8-16只Lewis大鼠(年齡6-8周，體重大約200克)。
上述肽B27PD，PDSAg和B7PD的氨基酸序列如下，以一個字母代碼給出氨基酸命名B27PDA-L-N-E-D-L-S-S-W-T-A-A-D-TPDSAgF-L-G-E-L-T-S-S-E-V-A-T-E-VB7PD A-L-N-E-D-L-R-S-W-T-A-A-D-T。
這些肽中，B27PD和PDSAg是致眼色素層炎的，即用這些肽免疫受試者后它們將患眼色素層炎。與此相反B7PD不具有任何致眼色素層炎特征。
以每次200μg劑量肽，1mg劑量的蛋白，溶于PBS的劑量隔日口服使用這些肽。經(jīng)過第三次和最后分別施用蛋白質(zhì)或肽2天后，經(jīng)過用視網(wǎng)膜抗原(S-抗原或IRBP，分別為35或20μg/動物在佐劑中乳化)免疫誘導(dǎo)眼色素層炎，這在大鼠模型中誘導(dǎo)眼色素層炎是眾所周知的。
未口服耐受的對照動物，在免疫后10到14天出現(xiàn)疾病。出于動物的保護(hù)原則，在陽性對照組中最后動物發(fā)病后2到4天終止實(shí)驗(yàn)。
口服施用抗原的保護(hù)效果表現(xiàn)為疾病的好轉(zhuǎn)過程或臨床癥狀完全消失，這經(jīng)過組織學(xué)檢查得以證實(shí)。組織學(xué)評價包括組織發(fā)炎癥狀和視網(wǎng)膜的破壞分級，臨床分級涉及明顯可見的眼結(jié)膜和前面部分的發(fā)炎癥狀，并且不必與視覺分辨率相聯(lián)系。
在上述動物模型實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果描繪于下面圖中。


圖1顯示了口服施用不同抗原(口服耐受性)后S-抗原誘導(dǎo)的眼色素層炎的強(qiáng)度。
圖2顯示了口服施用不同抗原(口服耐受性)后IRBP誘導(dǎo)的眼色素層炎的強(qiáng)度。
圖1證實(shí)在用S-抗原誘導(dǎo)的情況下，通過口服B27PD(PDSAg9％，S-Ag41％)與飼喂對照蛋白質(zhì)(卵清蛋白)的組相比臨床癥狀可減少到16％。
另一組織學(xué)評價揭示在B27PD飼喂的動物組中與卵清蛋白的飼喂的對照組相比眼色素層炎減輕57％，飼喂S-抗原后，眼色素層炎也減輕57％，飼喂S-抗原肽后，眼色素層炎僅減輕14％。
圖2顯示，在用IRBP PBS，S-抗原和對S-抗原有活性的PDSAg誘導(dǎo)無治療特性。然而與在PBS飼喂組中獲得的最大病癥相比，經(jīng)B27PD飼喂可將臨床癥狀減少到75％，飼喂IRBP本身后，眼色素層炎的臨床強(qiáng)度減輕到25％。
可證實(shí)肽B27PD發(fā)生多種改變而不明顯損失其效力，這些改變包括1)可在N末端和C末端延長該肽。
2)可在N末端和C末端將肽截短一些(高達(dá)6個)氨基酸殘基。
權(quán)利要求
1.一種7到30個氨基酸的肽它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，在此B和C各自為1個氨基酸或各個氨基酸，A和D各自為單體的或多聚體的有機(jī)基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的肽，其中B是絲氨酸或蘇氨酸。
3.權(quán)利要求1或2的肽，其中C是蘇氨酸，色氨酸，谷氨酸或絲氨酸。
4.權(quán)利要求1至3之一的肽、其中單體的或多聚體的有機(jī)基團(tuán)A和D彼此獨(dú)立地包含一個或幾個氨基酸，有機(jī)脂肪族殘基或脂多糖。
5.權(quán)利要求4的肽，其中A和/或D是飽和的或不飽和的脂肪酸殘基。
6.權(quán)利要求1至5之一的肽，它包含7到20個氨基酸。
7.權(quán)利要求6的肽，它包含8到16個氨基酸。
8.權(quán)利要求1的肽，它具有序列Am-Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr-Dn，此處A和D是一個或幾個氨基酸，m和n代表根據(jù)下式的氨基酸數(shù)m＝0到16，n＝0或高達(dá)最大值(16-m)。
9.一種9到30個氨基酸的肽，它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-Asp-Glu-D，此處B和C分別為一個氨基酸或幾個氨基酸，A和D分別為單體或多聚體有機(jī)基團(tuán)。
10.權(quán)利要求9的肽，其中B是絲氨酸或蘇氨酸。
11.權(quán)利要求9或10的肽，其中C是蘇氨酸、色氨酸、谷氨酸或絲氨酸。
12.權(quán)利要求9到11之一的肽，其中單體的或多聚體的有機(jī)基團(tuán)A和D彼此獨(dú)立地包含一個或幾個氨基酸殘基，有機(jī)脂肪族基團(tuán)或脂多糖。
13.權(quán)利要求12的肽，其中A和/或D是飽和的或不飽和的脂肪酸殘基。
14.權(quán)利要求9至13之一的肽，它包含9到20個氨基酸。
15.權(quán)利要求14的肽，它包含9到16個氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15之一的肽在治療自身免疫性疾病或治療眼色素層炎中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1至15之一的肽在抗視網(wǎng)膜S-抗原的免疫，抗光感受器內(nèi)視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白質(zhì)(IRBP)的免疫，或抗人白細(xì)胞抗原的免疫中的應(yīng)用，所述肽含有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含7到20個氨基酸的肽，它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，此處B和C各為一個氨基酸或多個氨基酸，A和D各為單體或多聚體的有機(jī)基團(tuán)，特別是其中B是絲氨酸、蘇氨酸或亮氨酸和/或其中C是蘇氨酸、色氨酸、谷氨酸或絲氨酸。特別是單體或多聚體有機(jī)基團(tuán)可互相獨(dú)立地包含一個或幾個氨基酸殘基，有機(jī)脂肪族殘基，特別是脂肪酸或脂多糖。根據(jù)本發(fā)明的肽優(yōu)選用于制備治療自身免疫性疾病，特別是治療眼色素層炎的藥物組合物。優(yōu)選地在本文中根據(jù)本發(fā)明的肽用于制備抗視網(wǎng)膜S-抗原或光感受器內(nèi)視網(wǎng)膜結(jié)合蛋白的免疫中的藥物組合物。
文檔編號A61P27/02GK1146208SQ95192646
公開日1997年3月26日 申請日期1995年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月21日
發(fā)明者格希爾德·韋爾納, 斯蒂芬·圖勞 申請人:格希爾德·韋爾納, 斯蒂芬·圖勞