專利名稱：脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的制作方法
連到脯氨酸的肽鍵似乎對廣泛專一肽酶有相當(dāng)?shù)哪褪?Mentlein，1988)，說明水解含有脯氨酸的肽鍵可能在含脯氨酸肽的代謝作用中是重要的(Atack，et al.，Eur.J.of pharm.，205，157-163(1991))。脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶在含脯氨酸的生物活性肽的代謝中看來起著這種作用。這種酶水解許多含脯氨酸的生物活性肽，如催產(chǎn)素，促甲狀腺激素釋放激素，促黃體激素釋放激素，血管緊張素II，血管舒緩激肽，物質(zhì)P，神經(jīng)降壓素和后葉加壓素。
脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶作為羧基末端脯氨酸裂解酶能將活性肽降解。具體地，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶能夠水解脯氨酸殘基的羧基側(cè)的肽鍵。脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶從機(jī)理上被認(rèn)為是絲氨酸蛋白酶，通過類似其它絲氨酸蛋白酶如α-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的機(jī)理裂解肽鍵。
盡管這種酶普遍作用在含脯氨酸衍生物的肽鍵上，但這種酶的形式在不同組織源表現(xiàn)是不同的，其中該酶在底物專一性方面表現(xiàn)出差異。已經(jīng)可以從多種植物(胡蘿卜，蘑菇)，微生物(Flavobacterium menigosepticum)和動物組織中被純化脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶。在動物全身普遍發(fā)現(xiàn)這種酶，然而，通常在CNS中發(fā)現(xiàn)的脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶濃度最高(Wilk，1983)。用于試驗(yàn)抗動物源的底物的常規(guī)酶源是牛，大鼠和鼠腦。
人們已經(jīng)研究了脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶的低分子抑制劑。這些抑制劑一般是脯氨酸或含末端脯氨酸的小肽的化學(xué)衍生物。已經(jīng)顯示，芐氧羰基-脯氨酰-脯氨酸是這種酶專一過渡狀態(tài)的抑制劑(Milk，S.and Orloeski，M.，J.Neurochem.，41，69(1983)，F(xiàn)riedman，etal.，Neurochem.，42，237(1984))。L-脯氨酸或L-脯氨酰-吡咯烷的N-端取代物(Atack，et al.，Eur.J.of Pharm.，205，157-163(1991)，JP0356,460，EP384,341)，以及含脯氨酸的N-芐氧羰基(Z)二肽在羧基端的各種替代物已經(jīng)被合成為脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑(Nishikata，et al.，Chem.Pharm.Bull.，34(7)，2931-2936(1986)；Baker，A.，et al.，Bioorganic & M edicinalChem.Letts.，1(11)，585-590(1991))。已有報道，核心結(jié)構(gòu)的硫代脯氨酸、噻唑烷和氧代吡咯烷的取代物可抑制脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Tsuru，et al.，J.Biochem.，94，1179(1988)，Tsuru，et al.，J.Biochem.，104，580-586(1988)，Saito，et al.，J.Enz.In-hib.，5，51-75(1991)，Uchida，I.，et al.，PCT Int Appl.WO9012,005，JP0356,461，JP0356,462)。類似地，已經(jīng)對脯氨酸羧基末端進(jìn)行了各種修飾，包括各種氟化酮衍生物(Henning，EP4,912,127)。氟化酮衍生物的一般性合成已經(jīng)被公開(Angelastro，M.R.，et al.，Tetrahedron Letters 33(23)，3265-3268(1992))。已經(jīng)證明，通過其它化合物如?；?脯氨酸或?；?脯氨酸(Z-Gly-Pro-CH2Cl)的氯甲基酮衍生物烷基化這種酶的活性部位可抑制該酶。(Yoshimoto，T.，et al.，Biochemistry 16，2942(1977))。
本發(fā)明要求保護(hù)式I的肽衍生物，包括其所有立體異構(gòu)體式I 其中A為芐基或叔丁基；X1為-S-或-CH2-；及X2為-S-或-CH2-B為-CF3或-CF2CF3。
應(yīng)該理解，在馬庫什大組內(nèi)應(yīng)包括式I的優(yōu)選化合物，因此可進(jìn)一步分組以形成含有所選取代基的小組。式I的優(yōu)選分組以進(jìn)一步包括這里所示的實(shí)施例為佳。
式I化合物是重要的脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑。這種新的抑制劑是含有羧基末端五氟乙基取代基的二脯氨酰肽衍生物。在二脯氨酰肽衍生物中，當(dāng)X1和X2為硫時，脯氨酸部分可任意被硫代脯氨酸衍生物取代。本發(fā)明肽類似物對脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶具有很強(qiáng)的抑制活性，因此，從科學(xué)意義上和對于重要的治療來說，本發(fā)明化合物可用于治療遺忘癥和記憶缺陷以及提高記憶能力。而且，噻唑烷官能團(tuán)的存在可增強(qiáng)這些化合物的效力和延長其作用時間。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是抑制脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶的蛋白酶解活性，并且作為一種恢復(fù)和提高記憶力的輔助治療的模型。抑制蛋白酶解活性可以控制不需要的高水平的酶。已有報道，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑對多組大鼠和小鼠模型具有抗記憶缺陷效果(參見Yoshimoto，et al.，J.Pharmacobio-Dyn.，10，730(1983)和Saito，et al.，J.Enz.Inhib.，3，163(1990)，Uchida，I.，et al.，PCT Int Appl.WO90 12,005)。然而，不應(yīng)受理論束縛，應(yīng)該相信，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制性與提高記憶力的相互關(guān)系應(yīng)歸因于該酶降解后葉加壓素的能力。再有，脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑已顯示出逆轉(zhuǎn)由東莨菪堿誘發(fā)的小鼠記憶力缺陷的效果(Atack，et al.，Eur.J.of Pharm.，205，157-163(1991))。
本發(fā)明二肽的合成如流程I所示，并在下面加以說明。
脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的合成流程I，步驟A至G說明了式I化合物的合成

用Angelastro，M.，Tetrahedron Letters，33(23)，3265-3268(1992)和Nahm，S.and Weinreb，S.M.，Tetrahedron Letters，22，3815(1981)所述方法基本上可制備用于合成含有羧基末端五氟乙基酮(化合物IVa和IVb)或甲氧基甲氨基酰胺(化合物IIa和IIB)的式I化合物的必要中間體。
流程I，步驟A說明了式IIa和IIb的甲氧基甲基氨基酰胺的一般制備方法。式IIa和IIb化合物可通過叔-丁氧羰基保護(hù)的脯氨酸(2-吡咯烷羧酸，1，1-二甲基乙酯)和硫代脯氨酸(噻唑烷-3，4-二羧酸，1，1-二甲基乙酯)衍生物與N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽反應(yīng)制備。該反應(yīng)基本上按Nahm，S.and Weinreb，S.M.，Te-trahedron Letters，22，3815(1981)所述方法進(jìn)行。一般，用適宜的偶聯(lián)劑如水溶性碳化二亞胺等可進(jìn)行N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽的偶聯(lián)，并且用現(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)分離方法進(jìn)行純化。
步驟B說明了用適宜的酸如鹽酸在乙酸乙酯中處理式IIa，可除去式IIa的硫代脯氨酸的叔丁氧羰基保護(hù)基，并產(chǎn)生相應(yīng)的N-甲氧基-N-甲基-4-噻唑烷甲酰胺，一鹽酸鹽(化合物III)。然后用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
通過步驟C可將化合物II轉(zhuǎn)化為IVa和IVb的五氟乙基酮衍生物。與五氟乙基鋰(從五氟乙基碘和甲基鋰·溴化鋰復(fù)合物就地產(chǎn)生的)的反應(yīng)是化合物IIa和IIb的異羥肟酸酯分別轉(zhuǎn)化為式IVa和IVb化合物的適宜方法。該反應(yīng)基本上按Angelastro，M.R.，etal.，Tetrahedron Letters，33(23)，3265-3268(1992)所述方法進(jìn)行。用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
步驟D說明了IVa或IVb的叔丁氧羰基保護(hù)基對酸是不穩(wěn)定的并且可用適宜的酸處理除去，如在乙酸乙酯中用鹽酸處理。用酸處理產(chǎn)生相應(yīng)的式Va或Vb化合物(分別為4-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-噻唑烷，一單鹽酸鹽或2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-吡咯烷，鹽酸鹽)。用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
步驟E概括地說明了兩個適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的縮合形成2-〔〔(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-吡咯烷羧酸，苯基甲酯(VIIb)或4-〔〔(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯(VIIa)等。兩個保護(hù)的氨基酸的縮合形成介于兩個氨基酸間的酰氨鍵在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。幾種已知的縮合方法包括化合物IV的羧基末端酸與草酰氯在適宜的溶劑如二甲基甲酰胺中縮合(如流程所示)。然后草酰氯可與Vb的α-氨基縮合。用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
步驟F說明了化合物VIII的二噻唑烷衍生物，如4-〔〔4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷基〕羰基-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯的制備?；衔锶鏘a與III和偶聯(lián)劑縮合形成介于兩個保護(hù)的氨基酸間的酰氨鍵在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。幾種已知的縮合方法包括用各種碳化二亞胺如水溶性碳化二亞胺的縮合。用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
如同步驟C，步驟G說明了具有末端甲氧基甲氨基羰基的二肽被取代?？捎镁偷禺a(chǎn)生的五氟乙基鋰(參見步驟C)進(jìn)行化合物VIII取代，形成相應(yīng)的4-〔〔4-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)羰基〕-3-噻唑烷基〕羰基-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯。取代后用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)分離技術(shù)適當(dāng)純化最終產(chǎn)物。
天然得到的脯氨酸衍生物含有手性碳原子。具體地，脯氨酸和硫代脯氨酸的氮環(huán)的α-碳原子是手性的。因此，脯氨酸和噻唑脯氨酸衍生物存在著一個或多個可能的立體異構(gòu)體。除非另有說明，這里涉及的光學(xué)活性的氨基酸是L-構(gòu)型。然而，手性可具體標(biāo)明為D-或L-構(gòu)型。
可以理解，酮官能團(tuán)以酮和水合酮或兩種狀態(tài)的混合物的形式存在。例如，五氟乙基酮基可被命名為2，2，3，3，3-五氟-1，1-二羥基丙基或2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基取代基。
用于多肽序列的每個氨基酸的α-氨基保護(hù)基可以是在現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何這種保護(hù)基。在所說的這類α-氨基保護(hù)基中有(1)?；捅Ｗo(hù)基如甲?；阴；?，鄰苯二甲?；?，甲苯磺酰基(tosyl)，苯磺?；?，硝基-苯基亞磺?；郊谆鶃喕酋；?，鄰硝基苯氧乙酰基和α-氯丁?；?；(2)芳香尿烷型保護(hù)基如芐氧羰基和取代的芐氧羰基，如對-氯芐氧羰基，對-硝基芐氧羰基，對-溴芐氧羰基，對甲氧基芐氧羰基，1-(對-聯(lián)苯基)1-甲基乙氧羰基，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基和二苯甲氧羰基；(3)脂肪尿烷保護(hù)基如叔-丁氧羰基(Boc)，二異丙基甲氧羰基，異丙氧羰基，乙氧羰基和烯丙氧羰基；(4)環(huán)烷基尿烷型保護(hù)基如環(huán)戊氧羰基，金剛烷氧羰基和環(huán)己氧羰基；(5)硫尿烷型保護(hù)基如苯基硫代羰基；(6)烷基型保護(hù)基如三苯基甲基(trityl)和芐基；和(7)三烷基硅烷如三甲基硅烷。優(yōu)選的α-氨基保護(hù)基是叔丁氧羰基(Boc)或芐氧羰基。
式I化合物作為治療劑的應(yīng)用及其給藥方式將在以下說明。
治療應(yīng)用本發(fā)明化合物作為提高記憶力的應(yīng)用包括改進(jìn)腦容量，回憶過去的能力和記住運(yùn)動原活性。正是本發(fā)明化合物，它們可用于患有失語癥，失用癥，失認(rèn)癥，或任何類型的遺忘癥，包括退化性和創(chuàng)傷后的遺忘癥，良性健忘和科爾薩科夫綜合征的病人(Merck Manual ofDiognosis and Therapy，15th Additing(1987))。因?yàn)楸景l(fā)明化合物對提高記憶力和功能恢復(fù)是非常有用的，所以還可用其預(yù)防或減緩記憶力缺失。
治療用量當(dāng)用本發(fā)明二肽衍生物給需要治療的患者時，其適當(dāng)?shù)膭┝繛槊抗矬w重每天0.2mg/kg至250mg/kg，這種劑量還取決于其它因素如具體的患者和所選擇的肽衍生物。對于具體患者適當(dāng)?shù)膭┝亢苋菀状_定。優(yōu)選每天給藥1-4劑量，每劑量具體地為5mg至100mg。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易確定所需本發(fā)明肽的量。
這里使用的術(shù)語“患者”一般為哺乳動物如靈長類，包括人，羊，馬，牛，豬，狗，貓，大鼠和小鼠。
雖然一些肽衍生物口服給藥后未被腸吸收，因此，申請人優(yōu)選非口服給藥，例如，皮下，靜脈，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)；通過存儲注射(de-pot injection)給藥；通過灌輸制劑；或在粘液膜，如鼻，喉和支氣管的粘液膜上給藥，例如，以含有本發(fā)明肽衍生物的氣霧劑形式如噴霧劑或干粉形式。
對于非腸道給藥，可用本發(fā)明化合物可注射溶液或懸浮液劑量給藥，這種溶液或懸浮液是由本發(fā)明化合物溶解在生理上可接受的稀釋劑(可以是滅菌液體如水和油，并有或沒有添加表面活性劑和其它藥物上可接受的添加劑)中組成的?？捎糜谶@些制劑的油類有石油，動物或蔬菜油，或天然油(synthetic origin)如花生油，大豆油和礦物油。一般，水、鹽水和葡萄糖水溶液和相應(yīng)的糖溶液，乙醇和二醇類如丙二醇或聚乙二醇均為具體用于注射溶液的優(yōu)選液體載體。
作為藥理上有用的藥劑，式I化合物可以各種方式給要治療的患者進(jìn)行給藥以達(dá)到所需效果，因此，該化合物既可以單獨(dú)給藥也可以與藥物上可接受的載體一起給藥。
以下所列縮寫用于描述本發(fā)明化合物或應(yīng)用的實(shí)施例中?？s寫B(tài)oc-L-Pro-OHN-叔丁氧羰基-L-脯氨酸CBZ-L-Pro-OHN-芐氧羰基-L-脯氨酸CBZ-L-Pro-ClN-芐氧羰基-L-脯氨酰氯CBZ-L-ThioPro-OHN-芐氧羰基-L-硫代脯氨酸CBZ-Gly-Pro-p- N-芐氧羰基-甘氨酰-L-脯氨酸-nitroanilide對-硝基苯胺cm 厘米DMAP4-二甲氨基吡啶DMSO二甲亞砜
DTT二硫蘇糖醇EDTA 乙二氨基四乙酸HEPES4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪-乙磺酸〔I〕 抑制劑的濃度Ki抑制常數(shù)KOH 氫氧化鉀NMMN-甲基嗎啉H-NMR氫-1核磁共振F-NMR 氟-19核磁共振M摩爾濃度MH+質(zhì)子化母體離子峰ml 毫升min 分鐘mol 摩爾mmol 毫摩爾nm 納米pH 氫離子濃度的負(fù)對數(shù)〔S〕 底物濃度TLC薄層色譜WSCDI 水溶性碳化二亞胺即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽v0起始動力學(xué)速度實(shí)施例通過下列實(shí)施例(這些實(shí)施例純粹是用來示范本發(fā)明的應(yīng)用)的說明本發(fā)明將更加明了。根據(jù)這里所公開的本發(fā)明說明書或?qū)嵗景l(fā)明其它實(shí)例對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的。本發(fā)明由表1中所給的非限定性實(shí)施例來說明，并在以下作進(jìn)一步描述。
表1化合物 實(shí)施例號/ 經(jīng)驗(yàn)式流程1MDL號 結(jié)構(gòu)2-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例I氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕 100，527-01 C20H21F5N2O4VIIb-1-吡咯烷羧酸，苯基甲酯4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例II氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕 102，916-01 C19H19F5N2O4S VIIa-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯4-〔〔4-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例IV C15H20F5N2O4S2氧丙基)-1-噻唑烷基〕羰基〕 100，676-01 IX-3-噻唑烷羧酸，1，1-二苯基乙酯實(shí)施例1I.2-〔〔 2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-1-吡咯烷羧酸，苯基甲酯(流程I，化合物VIIb)的合成IA.(R)-2-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-1-吡咯烷羧酸，1，1-二苯基乙酯(流程I，化合物IIb)的合成在氬氣下向攪拌著的Boc-L-Pro-OH(4.31g；20.0mmol)和DMAP(2.44g；20.0mmol)的二氯甲烷(125ml)溶液中加入N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(1.95g；20.0mmol)和NMM(2.20ml；20.0mmol)。然后向溶液中加入水溶性碳化二亞胺(3.83g；20.0mmol)。使其反應(yīng)過夜后濃縮至約20ml。將懸浮液裝入8×14cm硅膠柱上通過快速色譜法純化濃的懸浮液，用乙酸乙酯/己烷(60∶40)洗脫。合并含有標(biāo)題化合物(Rf＝0.32)的流分并濃縮得到無色油狀物(3.21g)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝259.1655〔C12H23N2O4理論質(zhì)譜為MH+＝259.1658〕。IB.2-(2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷羧酸，1，1-二苯基乙酯(流程I，化合物IVb)的合成在氬氣及-78℃下向攪拌著2-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-1-吡咯烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(實(shí)施例IA的化合物；1.03g；4.00mmol)的乙酸乙酯(35ml)溶液中加入五氟乙基碘(1.5ml 12.8mmol)，接著加入甲基鋰.溴化鋰(1.5M于乙醚；7.5ml；11.25mmol)。在-78℃30分鐘后，使溶液在冰-水浴中溫?zé)嶂?℃。加入KHSO4(1.36g；10.0mmol)的H2O(8ml)淬滅反應(yīng)。劇烈攪拌幾分鐘使兩相懸浮液均變清后將之轉(zhuǎn)移到含有水(50ml)的分液漏斗中。分離兩相并先后用半飽和NaHCO3水溶液(50ml)和鹽水(25ml)洗滌有機(jī)相。用硫酸鎂干燥有機(jī)相并濃縮得到淡黃色油(1.3g)。用快速色譜法在5×15cm硅膠上純化產(chǎn)物，先后用1.3升乙酸乙酯/己烷(15∶85)和乙酸乙酯/己烷(60∶40)洗脫，得到無色液體(0.94g)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝318.1135〔C12H17F5NO3理論質(zhì)譜為MH+＝318.1129〕。IC.2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)吡咯烷鹽酸鹽(流程I，化合物Vb)的合成向攪拌著的和在冰浴中冷卻至0℃的2-(2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(實(shí)施例IB的化合物；121mg，0.38mmol)的乙酸乙酯(15ml)中通入HCl氣體5分鐘。停止通入HCl氣體并蓋住反應(yīng)，再攪拌2小時。然后濃縮反應(yīng)至成為無色油狀物，用KOH片高真空干燥3小時產(chǎn)生固化產(chǎn)物(103mg)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝218.0601〔C7H9F5NO理論質(zhì)譜為MH+＝218.0604〕。ID.2-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-1-吡咯烷羧酸，苯基甲酯(流程I，化合物VIIb)的合成氬氣下向攪拌的CBZ-L-Pro-OH(0.62g，2.49mmol)和有一滴DMF的二氯甲烷(10ml)溶液中加入草酰氯(0.26ml；2.99mmol)，造成氣體劇烈產(chǎn)生。氣體產(chǎn)生停止之后，將反應(yīng)再攪拌30分鐘。濃縮反應(yīng)，得到N-芐氧羰基-L-脯氨酰氯(CBZ-L-Pro-Cl)為淺黃色油。
在CBZ-L-Pro-Cl中加入二氯甲烷(10ml)，然后在氨氣下與2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)吡咯烷鹽酸鹽(從實(shí)施例IC得到的化合物；2.49mmol)和溶解于二氯甲烷(7ml)的N-甲基嗎啉(0.54ml；4.98mmol)的懸浮液反應(yīng)。2.5小時后將反應(yīng)濃縮并放入二氯甲烷(1ml)，產(chǎn)物在硅膠上用快速色譜法純化，用乙酸乙酯/己烷(50∶50)洗脫。收集含產(chǎn)物流分并濃縮，得到所需產(chǎn)物(0.52g)為無色油。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝449.1508〔C2OH22F5N2O4理論質(zhì)譜為MH+＝449.1500〕。II.4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯(流程I，化合物VIIa)的合成IIA.噻唑烷-3，4-二羧酸，3-苯基-甲酯(流程I，化合物VIa)的合成向冷卻在冰水浴并劇烈攪拌的L-噻唑烷-4-羧酸(13.32g，0.10mol)中加入氯甲酸芐酯(15.70ml，0.11mmol)，并用20分鐘每次5ml地分批加入2N氫氧化鈉(55ml)。10分鐘后將反應(yīng)升至室溫并再攪拌30分鐘。然后用乙醚(3×75ml)萃取，水相用6N HCl(將近20ml)酸化。收集分離的有機(jī)相并將之溶解于乙醚(100ml)，然后用鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥然后濃縮，得到粘性無色油(20.4g)。IIB.4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯(流程I，化合物VIIa)的合成在氬氣和-17℃下，向攪拌的CBZ-L-ThioPro-OH(得自實(shí)施例IIa的化合物；267mg；1.00mmol)和NMM(0.12ml；1.05mmol)的二氯甲烷(15ml)中加入氯甲酸異丁酯(0.13ml；1.00mmol)。20分鐘后加入NMM(0.12ml；1.05mmol)，接著用幾分鐘時間加入2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)吡咯烷鹽酸鹽(化合物IC；253mg；1.00mmol)的乙腈(10ml)稀懸浮液。在-20℃1.5小時后將反應(yīng)升至室溫并攪拌1小時，然后濃縮反應(yīng)并加入二氯甲烷(3ml)。將剩余物被放在4×15cm的硅膠柱上，用400ml乙酸乙酯/己烷(30∶70)洗脫該柱，接著用乙酸乙酯/己烷(35∶65)洗脫。合并含有產(chǎn)物的流分并濃縮，得到粘性無色油(63mg)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝467.1053〔C19H20F5N2O4S理論質(zhì)譜為MH+＝467.1064〕。III.4-〔〔4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(流程I，化合物VIII)的合成IIIA.噻唑烷-3，4-二羧酸，3-(1，1-二甲基乙基)酯(流程I，化合物Ia)的合成向劇烈攪拌的L-噻唑烷-4-羧酸(10.0g；75.09mmol)的THF/H2O(1∶1；100ml)中加入碳酸鈉(11.94g；0.11mol)，接著加入二碳酸二叔丁酯(16.39g；75.09mmol)。所得懸浮液在室溫攪拌過夜。過濾反應(yīng)物，將濾液裝入盛有乙醚(100ml)的分液漏斗并分離各相。水相用新鮮乙醚(200ml)覆蓋并用1N鹽酸水溶液酸化。有機(jī)相依次用0.5N鹽酸水溶液和鹽水(50ml)洗滌，硫酸鎂干燥并濃縮，得到白色固體(14.56g)。1H-NMR譜與理論結(jié)構(gòu)相符
10.56(s-1H，CO2H)，4.78(m-1H，CH)，4.59 and4.39(pr d，2H，J＝8Hz；NCH2S)，3.22-3.36(m，2H，CH2S)，1.43〔s，9H，OC(CH3)3〕.IIIB.4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(流程I，化合物IIa)的合成在氬氣下向攪拌的噻唑烷-3，4-二羧酸，3-(1，1-二甲基乙基)酯(2.33g；9.99mmol)和DMAP(1.22g；9.99mmol)的二氯甲烷(40ml)中加入N，O-二甲基羥基-胺鹽酸鹽(0.98g；9.99mmol)和NMM(1.10ml；9.99mmol)的二氯甲烷(15ml)的懸浮液，然后在該溶液中加入水溶性碳化二亞胺(1.92g；9.99mmol)。反應(yīng)允許放置過夜，然后將反應(yīng)濃縮至約15ml。將所得懸浮液置于6×10cm硅膠柱進(jìn)行快速色譜純化，用乙酸乙酯/己烷(50∶50)洗脫。合并含有產(chǎn)物的流分(Rf＝0.39)并濃縮，得到無色油(1.95g)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝277.1216〔C11H21N2O4S理論質(zhì)譜為MH+＝277.1222〕。IIIC.N-甲氧基-N-甲基-4-噻唑烷-甲酰胺，一鹽酸鹽(流程I，化合物III)的合成向冷卻在冰水浴并攪拌的4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(得自實(shí)施例IIIB；1.05g；3.80mmol)的乙酸乙酯溶液中通入HCl氣10分鐘。加入上述氣體后將反應(yīng)蓋住，再攪拌2小時。然后濃縮反應(yīng)得到無色油，用KOH片高真空干燥3小時，得到固化的白色固體(0.76g)。IIID.4-〔〔4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(流程I，化合物VIII)的合成在氬氣下向攪拌的3，4-噻唑烷羧酸，3-(1，1-二甲基乙基)酯(得自實(shí)施例IIIA；0.81g；3.49mmol)和DMAP(0.43g；3.49mmol)的二氯甲烷(20ml)中添加NMM(0.38ml；3.49mmol)，接著加入N-甲氧基-N-甲基-4-噻唑烷甲酰胺，一鹽酸鹽(得自實(shí)施例IIIC；0.76g；3.49mmol)的二氯甲烷(10ml)和水溶性碳化二亞胺(0.69g；3.49mmol)。反應(yīng)完成之后將反應(yīng)濃縮至約10ml，然后裝入5×13cm硅膠柱進(jìn)行快速色譜分離，用丙酮/乙酸乙酯(8∶92)作洗脫劑。合并含有產(chǎn)物的流分(Rf＝0.66)并濃縮，得到白色泡沫(0.35g)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝392.1324〔C15H60N3O5S2理論質(zhì)譜為MH+＝392.1314〕。IV.4-〔〔4-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-3-噻唑烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(流程I，化合物IX)的合成IVA.4-〔〔4-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-3-噻唑烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(流程I，化合物IX)的合成在氬氣和-78℃下，向攪拌的4-〔〔4-〔(甲氧基甲氨基)羰基〕-3-噻唑烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，1，1-二甲基乙酯(得自實(shí)施例IIID；0.33g；0.84mmol)的乙醚(30ml)溶液中添加全氟乙基碘(0.32ml，2.70mmol)，接著加入甲基碘·溴化鋰(1.57ml，2.36mmol，1.5M于乙醚)。TLC指示反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物倒入含25g硅膠的100ml乙醚中。將燒瓶中剩余的產(chǎn)物溶解于乙醚，并加到硅膠/乙醚溶液中。接著，除去有機(jī)相，硅膠部分用乙醚(2×100ml)洗滌。合并的有機(jī)相用硫酸鈉和硫酸鎂干燥，然后過濾和蒸發(fā)，得到油狀白色泡沫(0.34g)。將該產(chǎn)物在4×10cm硅膠柱上進(jìn)行快速色譜分離，依次用0.4L乙酸乙酯/己烷(30∶70)和0.5L乙酸乙酯/己烷(75∶25)洗脫。合并含有產(chǎn)物的流分并濃縮成油(49mg)。
質(zhì)譜分析產(chǎn)物給出MH+＝451.0799〔C15H20F5N2O4S2理論質(zhì)譜為MH+＝451.0785〕。
合成測定合成反應(yīng)之后一般要在有展開劑乙酸乙酯∶己烷溶劑的Anal-tech硅膠盤上進(jìn)行TLC。通過用堿性高錳酸鉀然后加熱該盤來確定化合物。V.酶抑制性的測定除了用50mM HEPES(pH7.4)代替Tris緩沖劑外，基本上按照Yoshimoto et al.，(Biochem.，94，1179(1983))所述方法從牛腦部分純化得到脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶。這種酶制備方法適于常規(guī)抑制性測量；然而，該酶可以用下述方法進(jìn)一步純化。該酶的純度狀態(tài)希望不影響測量值Ki。將含有50-80％硫酸銨的切片重新溶解于勻化的緩沖劑，然后以1ml/min流速通過一個Pharmacia Mono Q柱(0.5×5cm)來脫鹽，用5ml緩沖劑A到緩沖劑B(全部緩沖劑為20ml；緩沖劑A＝50mM HEPES，pH7.4，1mM EDTA和1mMDTT；緩沖劑B＝緩沖劑A+0.5M NaCl)來洗滌該柱。酶活性在約〔NaCl〕＝0.25M洗脫。初步數(shù)據(jù)表明該酶長時間(超過1-2個月)貯存是不穩(wěn)定的。因此，優(yōu)選使用新制備的酶。
在緩沖劑A(3.0ml)，37℃和含有20μM底物(CBz-Gly-Pro-硝基-N-(某)酰苯胺)情況下對該酶進(jìn)行測定，監(jiān)測到在410nm(410nm＝8.4mM_1cm_1)處吸收增加。將抑制劑包容溶液放入DMSO。為表征可逆競爭抑制劑，在〔S〕＝50μM(底物的KM為11μM)條件下測量三種抑制劑濃度的初始速率。如果發(fā)現(xiàn)結(jié)合緩慢，則用最終平衡的速率計算。
競爭抑制劑的Ki用已知公式計算v0/vi＝(1+〔I〕/Ki，app)和Ki＝Ki，app/(1+〔S〕/KM)其中v0為無抑制劑存在時的初始速率；vi為有濃度為〔I〕的抑制劑存在時的初始速率；〔S〕為底物濃度。如果觀察到“緩慢結(jié)合”(即達(dá)到結(jié)合平衡是緩慢的)，則vi表示的是最終穩(wěn)定狀態(tài)的速率而非初始速率。
用上述方法對各式I化合物進(jìn)行測量并計算出酶抑制常數(shù)。表2給出了指定試驗(yàn)化合物的測定數(shù)據(jù)。
表2化合物 MDL號 酶抑制性2-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例I氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕 100，527-01 1.4×10-9M-1-吡咯烷羧酸，苯基甲酯4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例II氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕 102,916-01 1.0×10-9M-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯4-〔〔4-(2，2，3，3，3-五氟-1- 實(shí)施例IV氧丙基)-3-噻唑烷基〕羰基〕 100,676-01 1.0×10-9M-3-噻唑烷羧酸，1，1-二苯基乙酯化合物也可以在體內(nèi)用各種方法進(jìn)行試驗(yàn)，包括Atack(At-ack，Eur.J.Pharm.，205，157-163(1991))所述方法或本領(lǐng)域中所述或已知的其它方法。例如，可將化合物以鹽水形式或與載體如甲基纖維素一起經(jīng)腹膜內(nèi)注射給雄性BKTO小鼠(25-30g)，并在適當(dāng)時間處死后除下腦和腎。將這些器官的組織在10ml(約20倍體積)冰-冷卻的分析緩沖液中勻漿，通過如Lowry，et al.(Lowry，et al.，J.Biol.Chem.193，265(1951))所述方法用等分的勻漿測定蛋白質(zhì)的濃度。將199μl粗勻漿等分液在室溫培養(yǎng)2分鐘，處死動物到鑒定終止的總時間約為3分鐘，這樣，可使抑制劑的變異減少到最小。用每毫克中的蛋白質(zhì)活性表示活性，用相對于處理后的動物載體的百分比表示。
化合物對記憶力的行為作用可用各種方法進(jìn)行試驗(yàn)，包括At-ack(Atack，Eur.J.Pharm.，205，157-163(1991))所述方法?；衔飳τ洃浟Φ淖饔每赏ㄟ^用小鼠被動-無效模型測定東莨菪堿誘發(fā)記憶力缺陷的恢復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。在這個模型中，小鼠被分成幾組，各組分別接受(1)注射載體；(2)注射載體和東莨菪堿(即約0.2mg/ml)；或(3)注射各種劑量的化合物(即約0.1mg/ml-1.0mg/ml)，然后將小鼠放在亮/暗兩室盒子的亮室中。在小鼠進(jìn)入暗室一側(cè)時將動物電激一下(即約2秒，約0.4mA)。記錄進(jìn)入暗室所花費(fèi)的時間(徘徊時間)。第二天，將小鼠移回到盒子的亮室一側(cè)，再記錄進(jìn)入暗室時的徘徊時間。在此模型中，記憶力缺失與否跟接連兩天走入暗室所花費(fèi)的時間差直接相關(guān)。如果第二天花費(fèi)的時間較長，則說明尚有記憶力；否則，若兩次的時間無差別，則表示記憶力缺失。
在具體描述性實(shí)例中不脫離本發(fā)明范圍的變化和修改是允許的，這個范圍僅由所附權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.式I化合物，包括其全部立體異構(gòu)體，式I 其中A是芐基或叔丁基保護(hù)基；X1是-S-或CH2；和X2是-S-或CH2；B是CF3或CF2CF3的條件是至少X1和X2其中之一是-S-。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中化合物是4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯。
4.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1-2之一的化合物和藥物上可接受的載體。
5.一種藥物組合物用于提高記憶力，包括使用有效量的權(quán)利要求1-2之一的化合物或藥物組合物以及藥物上可接受的載體。
6.一種藥物組合物用于預(yù)防或減緩遺忘癥的影響，包括使用有效量的權(quán)利要求1-2之一的化合物以及藥物上可接受的載體。
7.一種藥物組合物用于預(yù)防或減緩記憶力缺失，包括使用有效量的權(quán)利要求1-2之一的化合物以及藥物上可接受的載體。
8.一種制備式I化合物，包括其全部立體異構(gòu)體的方法，式(I) 其中A是芐基或叔丁基保護(hù)基；X1是-S-或CH2；和X2是-S-或CH2；B是CF3或CF2CF3的條件是至少X1和X2其中之一是-S-；包括縮合下列適當(dāng)保護(hù)的氨基酸
9.一種制備式I化合物的方法，其中化合物是4-〔〔2-(2，2，3，3，3-五氟-1-氧丙基)-1-吡咯烷基〕羰基〕-3-噻唑烷羧酸，苯基甲酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)化合物，包括其全部立體異構(gòu)體，組合物和制備它們的方法。本發(fā)明化合物由于其藥物活性而直接用作脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶抑制劑，并因此提供了提高記憶力，預(yù)防或延緩遺忘癥影響或記憶力缺失的方法。
文檔編號A61P25/28GK1136806SQ94194374
公開日1996年11月27日 申請日期1994年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月2日
發(fā)明者N·P·皮特, J·P·布克哈特, S·米哈迪 申請人:默里爾藥物公司