專利名稱：膠原蛋白激活的血小板凝集抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)一種新的蛋白質(zhì)，它是一種很強(qiáng)的膠原蛋白激活的血小板活化和凝集的抑制劑，并且最重要的是它可以防止膠原蛋白和VonWillebrand′s因子間的相互作用。
人類的正常止血是由包含細(xì)胞和體液的生物化學(xué)成分在內(nèi)的一系列復(fù)雜的相互聯(lián)系的機(jī)理控制的。生物化學(xué)途徑包含完整的內(nèi)皮細(xì)胞受損，血小板的激活和凝集機(jī)制的活化。當(dāng)一個(gè)管壁受損時(shí)，首先是內(nèi)皮下膜暴露于血液。內(nèi)皮下的膠原蛋白被認(rèn)為是最早的刺激物之一，它導(dǎo)致血小板粘附，隨后是形狀的改變，凝集并形成血栓。
因此，在血小板粘附和/或血小板凝集的水平上的干涉療法對預(yù)防和治療大部分血栓疾病有益。
已知知道水蛭唾液含有幾種能抑制血小板凝集的因子水蛭素是一種眾所周知的化合物(MerckIndex1983No.4613;FEBSLett.165.180(1984))。水蛭素通過結(jié)合到凝血酶上形成1∶1化學(xué)計(jì)量復(fù)合物可防止凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。這樣就抑制了凝血酶催化的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。
一種低分子量受體介導(dǎo)的血小板活化因子拮抗劑被公開在EP-A-0348208中，它來自水蛭(Hirudinidae)唾液中，具有抑制通過凝集因子如PAF-acether誘導(dǎo)的血小板凝集的活性。
一種膠原酶被公開在WO/87/00860中，它可通過膠原蛋白分子的肽鏈螺旋區(qū)的肽鍵水解斷裂來特別降解膠原蛋白。
醫(yī)用水蛭(Hirudomedicinalis)不僅使用水蛭素來阻止被叮咬的部分的血栓形成，被水蛭叮咬后的最顯著的特征是流血時(shí)間可延長10至24小時(shí)以上，但水蛭素看來在15-30分鐘內(nèi)就被沖刷出傷口。因此，一定有不同于水蛭素的其他物質(zhì)與這種作用有關(guān)。
近來從醫(yī)用水蛭中得到一種分子量為65KD被稱為“Calin”的蛋白質(zhì)(WO92/07005)，它能阻止膠原蛋白激活的血小板凝集。另一種低分子量(16KD)膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板凝集抑制劑，被稱為LAPP，是從藥用南美水蛭屬(Haementeriaofficinalis)中發(fā)現(xiàn)的(EP-A-0480651)。
這兩種蛋白質(zhì)中沒有一種顯示可影響VonWillebrand′s因子(vWF)介導(dǎo)的血小板粘附這一重要特征。這種因子是一種糖蛋白的多聚體復(fù)合物，它在血小板功能上具有重要的作用。在血管損傷部位正常血小板粘附于暴露的內(nèi)皮下膜及正常血小板栓形成時(shí)需要它。vWF的功能在小口徑管腔中最為重要，因在這些部位血管壁的切應(yīng)力普遍高?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到vWF作用的根本機(jī)理在于與內(nèi)皮下膜成分及血小板膜上特異受體這間的相互作用(Ruggeri等，1992，Meth.Enz.215，263-275)。因此，相應(yīng)的蛋白質(zhì)干擾vWF可以在治療應(yīng)用上提供另外一種好方法。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一種新的分子量為15KD的蛋白質(zhì)，可作為膠原蛋白激活的血小板凝集和粘附的強(qiáng)抑制劑，最重要的是它可阻止膠原蛋白和vWF之間的相互作用。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有抑制膠原蛋白激活的血小板凝集能力和阻止膠原蛋白與vWF之間相互作用的基本純的蛋白，它可從醫(yī)用水蛭的唾液中得到。
本發(fā)明的這種新蛋白質(zhì)分子量為14-15.5KD，優(yōu)選14.5-15.0(由使用方法決定)，它阻止膠原蛋白和vWF之間的相互作用。與此結(jié)果相比，已知的LAPP分子量為16KD，是從藥用南美水蛭屬中分離出來的。LAPP對vWF的影響現(xiàn)在還不能被證明。另外一個(gè)重要的特征是LAPP和本發(fā)明的這種蛋白質(zhì)(Brandinin)的氨基酸序列不同。
這些和其他不同將在下文舉例說明，以區(qū)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)與其他具有抑制血小板凝集活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括所公開的純化蛋白質(zhì)的變異，它們保留所分離蛋白質(zhì)活性，包括片段，亞單位，自然發(fā)生的突變和隨機(jī)產(chǎn)生的人工突變體。也包括雜種蛋白質(zhì)如從所公開蛋白質(zhì)中衍生來的融合蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種用本身已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備該新蛋白質(zhì)的方法。因此，本發(fā)明的目的是提供一種基本純的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，這種蛋白質(zhì)具有抑制膠原蛋白激活的血小板凝集和阻止膠原蛋白和VonWillebrand′s因子間相互作用的能力，分子量為14到15.5KD，其特征在于任選用制備性電泳一步純化法從醫(yī)用水蛭唾液中分離純化得到。本發(fā)明的典型方法包括醫(yī)用水蛭的冷凍干燥粗唾液在pH7.5-8.5的常規(guī)緩沖系中重建，及至少經(jīng)過一個(gè)常規(guī)層析步驟，優(yōu)選凝膠滲透層析來純化。
此外，本發(fā)明涉及藥物制劑和醫(yī)學(xué)裝置。因此，本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物制劑，它包括如上所定義的活化成分蛋白質(zhì)，以及一種或多種藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
本發(fā)明的藥物制劑任選可以包括另外的活性成分如抗凝血?jiǎng)┤缢嗡鼗蚋嗡鼗蛉芙庋ǖ囊蜃尤缋w維蛋白溶酶原活性劑或hementin。
本發(fā)明的新蛋白質(zhì)和藥物制劑，分別地可用于治療各種血栓栓塞疾病，包括靜脈的血栓形成、外周動(dòng)脈的血栓形成、腦血管的血栓形成和心肌梗塞，也適用于動(dòng)靜脈短路的病人，或進(jìn)行冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)的病人。該藥物制劑也用于治療自身免疫疾病，包括紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多結(jié)節(jié)性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的藥物制劑也用來模仿被水蛭叮咬后長時(shí)間流血現(xiàn)象，所以可全部或部分代替現(xiàn)稱為水蛭治療的那些方法中的水蛭。
本發(fā)明的新蛋白質(zhì)可與任何無毒性的有機(jī)或無機(jī)酸形成藥學(xué)上可接受的鹽。無機(jī)酸是例如鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸和酸的金屬鹽如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。有機(jī)酸例如為一、二和三元羧酸如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸和磺酸如甲磺酸。末端氨基酸殘基的羧基的鹽包括與任何適當(dāng)?shù)臒o機(jī)或有機(jī)堿形成的無毒性的羧酸鹽。這些堿包括例如堿金屬如鈉和鉀，堿土金屬如鈣和鎂，ⅢA組的輕金屬包括鋁，和有機(jī)伯、仲和叔胺如三烷基胺，包括三乙胺、普魯卡因、二芐胺、1-乙烯胺、N，N′-二芐乙二胺、二氫樅胺和N-烷基哌啶。
本發(fā)明的制劑可作為單位劑量給藥，它包含常規(guī)的無毒性藥用載體、稀釋劑、佐劑和賦形劑，一般為非胃腸道給藥?！胺俏改c道”一詞包括皮下的、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和氣管內(nèi)的注射和輸入技術(shù)。本發(fā)明的單位劑量可包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的日需要量，或少量多次以達(dá)到要求劑量。給病人(哺乳動(dòng)物，包括人)的最佳治療劑量取決于多方面因素，如所用具體活性物質(zhì)的活性、年齡、體重、身體狀況、性別、飲食、給藥的時(shí)間和途徑、清除率等等。因此，抑制膠原蛋白對血小板凝集的刺激所需血液濃度優(yōu)選在0.1mg/l到50mg/l范圍內(nèi)。
在本文中，“藥用載體”一詞意為一種惰性的、無毒的固體或液體填充劑、稀釋劑或制作膠囊的物質(zhì)，對活性化合物或病人沒有不利反應(yīng)。適當(dāng)?shù)?、?yōu)選的液體載體是本領(lǐng)域已知的，如無菌水、鹽水、葡萄糖水、糖溶液、乙醇、乙二醇和油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成油如花生油、大豆油和礦物油。本發(fā)明的載體還有藥用的適合使用前包衣的凝膠或乳膏、通常是由塑料物質(zhì)和合成纖維制成醫(yī)學(xué)裝置(見下面)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種可植入的或體外的醫(yī)學(xué)裝置，用于與體液接觸以使該裝置表面基本抗血栓，該裝置已被如上所定義的固定化蛋白質(zhì)包被。本發(fā)明的這種蛋白質(zhì)被固定在該醫(yī)學(xué)裝置上以使其表面具有生物相容和抗血栓性能。這種裝置有時(shí)具有典型地誘導(dǎo)血小板凝集的可浸潤表面，這點(diǎn)是它們被用作可植入的和體外的裝置與血液或其他液體相接觸時(shí)不利之處。例如這些裝置是假體、人造器官、縫線、人造血管節(jié)、導(dǎo)管、滲析器、運(yùn)送血液的管道和容器。
包被醫(yī)學(xué)裝置和固定蛋白質(zhì)的方法是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的(如US4，885，207)。
最后，本發(fā)明還涉及如上所定義的蛋白質(zhì)用來制備藥物的用途，這種藥物抑制體內(nèi)或體外的膠原蛋白激活的血小板凝集和vWF與膠原蛋白結(jié)合，并可進(jìn)行體外治療。


圖1從水蛭唾液中經(jīng)凝膠滲透層析法純化Brandinin。在實(shí)施例2中詳細(xì)說明。劃黑的區(qū)域表示活性流份。曲線下面的數(shù)字(3-14)表示流份。
圖2Brandinin通過SDS-凝膠電泳的純化。詳細(xì)說明見實(shí)施例4。標(biāo)出的是流份號(hào)(8-12)和標(biāo)記(M)。流份10和11在實(shí)施例1所述實(shí)驗(yàn)中為陽性。
圖3經(jīng)AzocollR測淀的溶膠原活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。詳細(xì)說明見實(shí)施例4?？v軸在560nm處的光密度(OD)，橫軸膠原酶活性(mU/實(shí)驗(yàn))。
圖4a膠原蛋白激活的血小板凝集的劑量依賴性抑制。詳細(xì)說明見實(shí)施例5?？v軸凝集百分?jǐn)?shù)，橫軸Brandinin的濃度(nM)。
圖4b抑制血小板凝集的膠原蛋白特異性。詳細(xì)說明見實(shí)施例5?？v軸凝集百分比，橫軸1＝對照，2＝膠原蛋白，3＝ADP。
圖5vWF與膠原蛋白結(jié)合的劑量依賴性抑制。詳細(xì)說明見實(shí)施例6?？v軸405nm處的光密度(OD);橫軸純化蛋白質(zhì)的濃度(nM)。
…▲…純化蛋白質(zhì);…·…對照w/o蛋白質(zhì)以下實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明
實(shí)施例1從醫(yī)用水蛭屬中得到的作為膠原蛋白激活的血小板凝集的抑制劑的蛋白質(zhì)的體外活性。
在醫(yī)用水蛭的粗制唾液中能夠檢出在富含血小板的血漿(PRP)中由于膠原蛋白的存在而引起的劑量依賴性的血小板凝集的抑制活性。
用終濃度為0.38%的枸椽酸鈉來抗凝從志愿者中抽出的血液。通過差數(shù)離心來制備富含血小板和很少含有血小板的血漿。
在凝集儀PAP-4(Biodata)中通過加入不同濃度的膠原蛋白hormR(Hormonchemie)來進(jìn)行血小板凝集反應(yīng)。參數(shù)為加入膠原蛋白后最大的消除(extinction)?？寡▌┬纬蓜p低該值。
上面所述的實(shí)驗(yàn)，用于跟蹤下列蛋白純化和表征本發(fā)明的純化蛋白。
實(shí)施例2蛋白質(zhì)的分離和層析純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)可從醫(yī)用水蛭屬的粗制唾液中分離出來。凍干的唾液可在20mMTris-HCl、10mMCaCl2pH8.0(TC-緩沖液)中重建，濃度為20mg/ml。唾液被加到-CM-FraktogelR柱上(E.Merck，Darmstadt，F(xiàn)RG)，并且同的緩沖液中的NaCl梯度來洗脫。在實(shí)例1中所述血小板抑制實(shí)驗(yàn)中有活性的柱流份不含水蛭素活性。最后的純化是在二醇改性的硅膠柱上，在20mMTris-HCl、10mMCaCl2、200mMNaCl，pH8.0(TCN-緩沖液)中經(jīng)凝膠滲透層析進(jìn)行的。這個(gè)純化步驟的典型例子如圖1所示。純化蛋白的量與粗制唾液的蛋白量相比占5%。同其他實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)量在2%到7%之間。
實(shí)施例3用制備性電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)的一步純化另外，用制備性電泳可一步成功地分離得到蛋白質(zhì)。在“Perp-cell”R儀上按制造商的指示，一般用10%的丙烯酰胺聚合形成圓柱形的聚丙烯酰胺凝膠。將樣品加入電泳緩沖液。在電泳過程中，與電泳方向呈直角的一緩沖液流用于將洗脫出來的蛋白質(zhì)送到流份收集器中。這些流份用分析型SDS-聚丙烯酰胺電泳儀進(jìn)行分析，并根據(jù)分子量將15.0KD的流份混合。在另一不同實(shí)驗(yàn)中分子量指定為14.5KD。
實(shí)施例4蛋白質(zhì)的特征具有實(shí)施例1所述活性的純化蛋白質(zhì)分子量約為15000D，在SDS-PAGE中簡化條件下測定。圖2表示從如實(shí)施例2中所述典型的凝膠滲透層析中得到的有活性的流份。凝膠上的蛋白通過銀染顯色。
用純化的蛋白質(zhì)在一面描述的優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方法中我們沒有檢測到任何蛋白水解活性。經(jīng)resorufinR(Boehringer，Mannheim，F(xiàn)RG)共價(jià)修飾的酸氨被用作蛋白激酶K的底物，作為陽性對照。向50μl0.4%的resorufin標(biāo)記的酪氨酸溶液中加入50μl200mMTris、20mMCaCl2pH7.8的緩沖液和100μl樣品溶液。37℃孵育24小時(shí)后，加入450μl5%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物離心后，取400μl上清液轉(zhuǎn)移到含有600μlpH8.8的500mMTris的小杯中。在574nm處的吸光度可立即讀出。粗制唾液的24小時(shí)培養(yǎng)物顯示明顯的蛋白水解活性，而對于純化蛋白質(zhì)，觀察到吸光度略低于背景水平(表1，見下面)。
除了蛋白水解活性外(如上所述)粗制唾液還有溶膠原活性。檢測這種活性的優(yōu)選方法是以下述方式應(yīng)用azocoll，一種非特異的產(chǎn)色膠原酶底物。將AzocollR(Calbiochem)懸浮在50mMTris，200mMNaCl、0.1%Brij35、0.01%NaN3pH8.0(緩沖液A)中，濃度為20mg/ml，并用離心、抽吸、再懸浮洗滌兩次。將100μl樣品或?qū)φ站彌_液用移液管加到96孔微滴定板的孔中，作為緩沖液A中的連續(xù)稀釋，然后加入100μlazocoll懸浮液。該混合物在37℃下孵育18小時(shí)。將未消化的底物用1000×g離心10分鐘沉淀，以終止反應(yīng)。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微滴定板中并在560nm讀取吸光度。從溶組織梭狀芽胞桿菌(Sigma)中得到的膠原酶用來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。
表1唾液和純化蛋白質(zhì)的蛋白水解活性 均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3次試驗(yàn)表2含有用此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的典型測試的結(jié)果。與粗制唾液和另一名為Calin的水蛭蛋白質(zhì)相反(它們在azocoll實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出活性)，令人驚異地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)在背景水平以上沒有顯著的溶膠原活性。

實(shí)施例5純化蛋白對血小板凝集的劑量依賴性抑制富含血小板的血漿和實(shí)驗(yàn)化合物在37℃孵育2分鐘，通過加入膠原蛋白達(dá)到終濃度1.25μg/ml產(chǎn)生凝集。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(Brandinin)顯示IC50約為15nM。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果在0.5到100nM之間。唾液的粗提取物表現(xiàn)出膠原蛋白激活的及ADP激活血小板凝集。相反，Brandinin在最高可能濃度也無反應(yīng)。詳見圖4a和4b。
實(shí)施例6純化蛋白質(zhì)在體外對vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制除抑制血小板和膠原蛋白間的直接相互作用外，令人驚異的是本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)另外具有干擾vWF結(jié)合的能力。
用從馬腱上得到的I型膠原蛋白包被96孔微滴定板來說明這一點(diǎn)，每孔用5μg。將膠原蛋白溶液在0.1M乙酸中，并用pH7.2的磷酸鹽緩沖液透析18小時(shí)。在37℃孵育1小時(shí)后，這些孔用250μl10mg/mlBSA的PBS緩沖液封閉，并且無BSA的PBS緩沖液洗三次。加入25μl含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的樣品，然后加入75μl在PBS中稀釋1∶80的人血漿，PBS中含有5mMEDTA、0.1%BSA、0.001%Tween80pH7.4，并在37℃孵育2小時(shí)。然后再洗，結(jié)合的vWF用結(jié)合到馬辣根過氧化物酶上的100μl稀釋1/4000的多克隆兔抗-vWF抗血清(Dako，Copenhagen，Denmark)進(jìn)行檢測。此抗血清在37℃孵育1小時(shí)。用ABTS在37℃顯色30分鐘，在405nm測定。在一些實(shí)驗(yàn)中用純化的vWF因子(Serbio，Remagen，F(xiàn)RG)代替人血漿，與血漿測定的結(jié)果非常相似。
血漿中和純化狀態(tài)的vWF的結(jié)合都可被本發(fā)明的純化蛋白Brandinin以劑量依賴性方式抑制。標(biāo)準(zhǔn)條件下50%抑制的濃度約為40nM(范圍在0.5nM到100nM)(圖5)。
通過與膠原蛋白結(jié)合，Brandinin不僅可抑制血小板和膠原蛋白之間的作用，而且抑制VonWillebrand因子與皮下基質(zhì)成分的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種能夠抑制膠原蛋白激活的血小板凝集并能阻止膠原蛋白與Von Willebrand′s因子(vWF)的相互作用的基本純的蛋白質(zhì)，它可從醫(yī)用水蛭(Hirudo medicinalis)的唾液中得到。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，它的分子量為14-15.5KD。
3.一種制備能夠抑制膠原蛋白激活的血小板凝集并能阻止膠原蛋白和Von Willebrand′s因子(vWF)的相互作用，分子量為14-15.5KD的基本純的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于從醫(yī)用水蛭的唾液中分離和純化此蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于用制備性電泳從粗品中一步分離該蛋白質(zhì)。
5.含有權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)作為活性成分，還含有一種或多種藥用載體、賦形劑或稀釋劑的藥物制劑。
6.權(quán)利要求5的藥物制劑，它還含有溶血栓劑或抗凝劑。
7.權(quán)利要求5或6的藥物制劑，其中所述載體包括適用于使用前包被醫(yī)用裝置的凝膠基質(zhì)或軟膏。
8.一種可植入或體外的醫(yī)用裝置，用于與體液接觸以使該裝置表面為基本生物非溶性和抗血栓性，該裝置用權(quán)利要求1或2的固定化蛋白質(zhì)包被。
9.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)用于制備抑制體內(nèi)、體外血小板凝集或進(jìn)行體外治療的藥物的用途。
10.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)用于制備阻止Von Willebrand′s因子(vWF)與膠原蛋白在體內(nèi)、體外或體外治療時(shí)結(jié)合的藥物的用途。
全文摘要
公開了一種從醫(yī)用水蛭屬粗制提取物中分離的蛋白質(zhì)，它能比較強(qiáng)的抑制血小板與膠原蛋白的結(jié)合以及由此產(chǎn)生的能導(dǎo)致血小板凝集和血栓形成的活化。此外此蛋白質(zhì)可阻止Von Willebrand因子與膠原蛋白的結(jié)合。本文描述了蛋白質(zhì)的分離純化方法及它在阻斷膠原蛋白激活的血小板凝集上的應(yīng)用。這種新蛋白質(zhì)(Brandinin)的分子量約為15KD，能結(jié)合膠原蛋白，但不具有膠原裂解活性。這種蛋白質(zhì)被用在血栓疾病的預(yù)防和治療，并用于包被血液接觸的物質(zhì)，使它們抗血栓。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1111058SQ94190422
公開日1995年11月1日 申請日期1994年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月1日
發(fā)明者J·赫姆博格, G·莫爾澤 申請人:默克專利股份有限公司