專利名稱：新的化合物LeustroducsinH，它的制備方法及其治療性應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種被本發(fā)明人稱為LeustroducsinH的新化合物，它具有下文所示的通式(Ⅰ)，本發(fā)明還提供制備該化合物的方法以及含該化合物的組合物和應用該化合物的治療方法。
本發(fā)明的化合物是一種能刺激血小板產(chǎn)生并因此而可用于治療血小板減少的新化合物。血小板減少可由多種原因所致，例如，癌癥病人進行化療或放療后的免疫異常或不良反應可引起血小板減少。血小板減少是一種嚴重的疾病，如果病情繼續(xù)加重，可引起全身出血，有時甚至導致死亡。目前，治療血小板減少唯一可靠的辦法是利用包括血小板輸注的對癥治療。
已知有不同類型的具有造血活性的細胞激活素。它們包括某些白介素，例如白介素6(下文縮寫為IL-6)、白介素11(下文縮寫為1L-11)和白血病抑制因子(下文縮寫為LIF)。已知這些化合物的其它活性中包括刺激血小板產(chǎn)生，因此被期望應用于臨床[Ishibashi et al，Blood 74，1241-1244，(1989);Asano et al，Blood 75，1602-1605，(1990);Okada et al，Blood Tumor 22，23-31，(1991)]。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將這些化合物本身以不同途徑施用于人體會產(chǎn)生明顯的藥理作用，這就使得這些化合物可能被用于治療中。然而，據(jù)認為這些化合物基本上是由某些種類的細胞(例如淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞)通過一種復雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)在體內(nèi)產(chǎn)生的，并且它們在各種血細胞的產(chǎn)生過程中起穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的作用，因此，如果對這種調(diào)節(jié)機制的精細平衡不加考慮地施用這些化合物，則將觀察到幾種副作用，它們可由調(diào)節(jié)機制的失衡所致;這類副作用的例子包括肝組織損傷、體重減輕、發(fā)熱和寒顫。
還已知，多種低分子量的免疫激活劑(如胞壁酰二肽，下文縮寫為MDP)能夠增加血小板總數(shù)[R.Nakajima等，Arzneimittel-Forsch./Drug Research 41，60-65(1989)]。據(jù)認為，這些化合物通過單核細胞和巨噬細胞的激活而間接刺激IL-6的產(chǎn)生。然后，所產(chǎn)生的IL-6引起血小板數(shù)量的增加。然而，也已知道，與此同時還存在基于巨噬細胞激活作用的其它生理作用(或許是不需要的)，例如單核細胞因子(如IL-1和腫瘤壞死因子(TNF))的形成。也觀察到一些副作用，如發(fā)熱[Jap.J.Radiotherapy 48(4)，514(1988)]。
因此，很顯然目前依然需要一種能刺激血小板形成從而能用于治療血小板減少的藥劑，但它不會引起內(nèi)調(diào)節(jié)機制的失衡或?qū)е氯缟纤龅母弊饔谩?br> EP506，463公開了稱為Leustroducsin A、B和C的一些新的吡喃酮衍生物，它們具有下列通式
其中R代表5-甲基己?；?-甲基辛?；?-甲基辛?；＿@些化合物由微生物普拉特鏈霉菌中分離出，并被公開在下列方面具有活性減輕由癌癥化療或放療所致的副反應、防止感染、激活巨噬細胞、改善大腦功能以及作為抗真菌劑的活性。
1993年8月24日公開的JP平5-213758描述了Leustroducsin A、B和C在治療血栓形成中的應用。
EP329，361公開了一些與本發(fā)明化合物類似的新的2-吡喃酮衍生物，不同之處在于歐洲申請中的化合物以類似于上述EP506，463中化合物取代的方式被取代。而且，這些現(xiàn)有技術(shù)中的化合物僅被說明用作農(nóng)用生物殺傷劑，并未表明這些化合物具有本發(fā)明化合物所具有的有價值的和出乎預料的治療及預防活性。
日本專利申請公開平2-186描述了與EP329，361所述化合物非常相似且基本具有相同用途的另一些化合物。
抗生素雜志(The Journal of Antibiotics，42，1989，1331-1343)公開了一種新的抗腫瘤化合物，它被作者稱為“Phospholine”，是由微生物鏈霉菌屬的放線菌產(chǎn)生，該化合物與本發(fā)明的化合物一樣具有氨基和磷酸基，但兩者的分子式不同。因此，該化合物顯然有別于本發(fā)明的化合物。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有有價值的藥理活性的新的Leustroducsin。
更確切地說，本發(fā)明的化合物被認為在治療血小板減少，尤其是由癌癥化療或放療和免疫異常所致的血小板減少中具有極大的應用潛力。
因此，本發(fā)明提供具有下列通式(Ⅰ)的化合物及其藥用鹽。該化合物被稱為LeustroducsinH 本發(fā)明也提供制備LeustroducsinH的方法，這將在下文作詳細描述。
本發(fā)明還提供含LeustroducsinH或其藥用鹽的藥用組合物，該組合物中含有藥用稀釋劑或載體。
本發(fā)明還進一步提供治療或預防血小板減少的方法，特別是由癌癥放療或化療所致的血小板減少。所述方法包括給患有或易患血小板減少的哺乳動物(可以是人)施用有效量的LeustroducsinH或其藥用有效的鹽。
由上文的通式清楚可見本發(fā)明的Leustroducsin含有許多不對稱的碳原子和數(shù)個雙鍵。因此，它能形成多種旋光和幾何異構(gòu)體。盡管這些化合物在本文都由單個分子式所代表，但本發(fā)明包括單獨的、分離的異構(gòu)體和混合物(包括其外消旋物)。應用立體有擇合成技術(shù)或以旋光性化合物作為起始物，可直接制備單獨的異構(gòu)體;另一方面，如果制備的是異構(gòu)體的混合物，則可用常規(guī)拆分技術(shù)得到單獨的異構(gòu)體。
本發(fā)明的Leustroducsin既含有酸性基團(磷酸基)又含有堿性基團(氨基)，因此能形成鹽。只要這些鹽在應用于治療的場合是藥學上可接受的，那么對這些鹽的性質(zhì)沒有特別的限制。當這些鹽將進行非治療性應用，例如作為制備其它可能更具活性的化合物的中間體時，就連上述的唯一限制條件也不適用。本發(fā)明的化合物能與堿形成鹽。這類鹽的例子包括堿金屬(如鈉、鉀或鋰)鹽、堿土金屬(如鋇或鈣)鹽、其它金屬(如鎂或鋁)鹽、有機堿鹽(如與二環(huán)己基胺的鹽)和堿性氨基酸(如賴氨酸或精氨酸)鹽。本發(fā)明的化合物也能形成酸加成鹽。這類酸加成鹽的例子包括與無機酸，特別是氫鹵酸(如氫溴酸、氫碘酸或鹽酸)、硝酸、高氯酸、碳酸、硫酸或磷酸形成的鹽;與低級烷基磺酸(如甲烷磺酸、三氟甲烷磺酸或乙烷磺酸)形成的鹽;與芳基磺酸(如苯磺酸或?qū)妆交撬?形成的鹽;與有機羧酸(如乙酸、富馬酸、酒石酸、乙二酸、馬來酸、蘋果酸、丁二酸或檸檬酸)形成的鹽和與氨基酸(如谷氨酸或天冬氨酸)形成的鹽。
本發(fā)明的Leustroducsin可以通過水解具有下列通式(Ⅱ)的化合物或其鹽來制得 其中Z代表?；S后，還可任選將所得的化合物成鹽。
水解反應可用任何通常用于該類反應的水解劑例如水解酶或堿進行。
在上述通式(Ⅱ)中，Z代表?；?。?；拇_切性質(zhì)對于本發(fā)明并非關(guān)鍵，只要它能經(jīng)水解作用去除而產(chǎn)生通式(Ⅰ)的化合物。我們已普遍發(fā)現(xiàn)，適于作為起始物的化合物中Z代表直鏈或支鏈脂族?；颦h(huán)脂族?；?，所含碳原子數(shù)為2-6。當Z代表這類?；鶗r，它可以是，例如丁酰基、異丁酰基、異戊?；?、2-甲基丁酰基、4-甲基戊酰基、環(huán)己烷羰基、4-甲基己酰基、5-甲基己酰基、6-甲基庚?；?、環(huán)己基乙基羰基、辛?；?-甲基辛?；?-甲基辛酰基。
人們已知并描述過(例如，Journal of Antibiotics 42，1019-1036，1989)在本發(fā)明方法中用作起始物的具有通式(Ⅱ)的化合物，其中，Z代表異丁?；?、異戊?；?、4-甲基戊?；?、環(huán)己烷羰基或4-甲基己?；?。
人們已知并公開過(例如EP329，361)在本發(fā)明方法中用作起始物的具有通式(Ⅱ)的化合物，其中Z代表丁?；?、異丁?；?、異戊酰基、2-甲基丁?；h(huán)己烷羰基、4-甲基己酰基、6-甲基庚?；?、環(huán)己基乙基羰基或辛酰基。通過培養(yǎng)微生物普拉特鏈霉菌SAM0654并從培養(yǎng)液中分離所需化合物即可制得Z為上述基團之一的起始物。與EP329，361相關(guān)的普拉特鏈霉菌SAM0654已于1988年1月22日保藏于Fermentation ResearchInstitute，Agency of Industrial Science and Technology，保藏號為FERM BP-1668。培養(yǎng)微生物和分離所需化合物的適宜技術(shù)已在EP329，361中描述。
人們也已知并描述過(例如EP506，463)具有通式(Ⅱ)的其中Z表示5-甲基己酰基、6-甲基辛酰基或7-甲基辛?；幕衔?。
已知通式(Ⅱ)中Z代表4-甲基己酰基、5-甲基己?；?、6-甲基庚?；?、環(huán)己基乙基羰基、辛酰基、6-甲基辛?；?、或7-甲基辛?；幕衔?，它們在本發(fā)明的方法中用作起始物，并可通過例如先培養(yǎng)普拉特鏈霉菌SANK60191菌株繼而從培養(yǎng)液中分離的方法制備。培養(yǎng)這種微生物的適宜條件已在例如EP506，463中描述。與EP506，463有關(guān)的普拉特鏈霉菌SANK60191已于1991年2月20日保藏于Fermen tation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，保藏號為FERM BP-3288。
方法1應用水解酶在該方法中，通式(Ⅰ)的化合物由通式(Ⅱ)的化合物與水解酶反應制備。
所用酶的確切性質(zhì)并非本發(fā)明的關(guān)鍵，任何通常被用于該類反應的水解酶都能應用于此。一般我們喜歡選用例如豬肝酯酶(PLE)、脂酶、乙酰酯酶、高淀粉酶或膽固醇酯酶。
水解反應通常且最好是在溶劑中完成。只要溶劑對反應或?qū)λ迷噭o不利影響，并且溶劑至少在某種程度上能溶解反應試劑，那么對所用溶劑的性質(zhì)無特別限制。適宜溶劑的例子包括醇(例如甲醇或乙醇)與緩沖液(優(yōu)選pH6-8的磷酸鹽緩沖液)的混合物，或是酮(例如丙酮或甲基乙基酮)與緩沖液(優(yōu)選pH6-8的磷酸鹽緩沖液)的混合物。
我們特別優(yōu)選用PLE或脂酶作為水解酶，在含有磷酸鹽緩沖液(pH6-8)與丙酮或甲醇的混合溶劑中進行水解反應。
反應可在一個較寬的溫度范圍內(nèi)進行，盡管優(yōu)選的溫度可根據(jù)所用起始物和酶以及溶劑的性質(zhì)不同而變化，但精確的反應溫度并非本發(fā)明的關(guān)鍵。通常，我們發(fā)現(xiàn)在10℃-40℃優(yōu)選20℃-40℃的溫度下很容易進行上述反應。
反應所需的時間也可隨許多因素的不同而有很大的變化，特別是反應溫度以及所用起始物、酶和溶劑的性質(zhì)。然而，假如反應是在上述的優(yōu)選條件下進行，那么通常足夠的反應時間是12小時-30天，優(yōu)選的反應時間為3-15天。
反應完成后，用常規(guī)技術(shù)從反應混合物中萃取并純化通式(Ⅰ)的化合物。適宜技術(shù)的一個例子包括用減壓蒸餾除去易與水混溶的溶劑(如丙酮)，接著用有機溶劑(如乙酸乙酯)萃取所得的水層，然后進一步分餾和純化水層，例如用一種Cosmosil(注冊商標)空心柱。
方法2應用堿在本方法中通式(Ⅰ)的化合物由通式(Ⅱ)的化合物與堿反應制備。
對于所用堿的性質(zhì)沒有特殊的限定，只要堿對分子的任何部分或?qū)υ噭o不利影響，任何普遍被用于這類水解反應的堿都能夠應用于此。優(yōu)選的堿的例子包括無機堿，例如堿金屬碳酸鹽(如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈰或碳酸鋰)、堿金屬碳酸氫鹽(如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或碳酸氫鋰)、堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰)或堿土金屬氫氧化物(如氫氧化鋇、氫氧化鎂或氫氧化鈣)。在這些堿中，優(yōu)選堿金屬碳酸鹽或堿金屬碳酸氫鹽，最優(yōu)選碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸氫鈉。
上述反應一般且優(yōu)選在溶劑中進行。只要溶劑對反應或?qū)λ婕暗脑噭o不利影響，并且它至少在某種程度上能溶解反應試劑，那么所用溶劑的性質(zhì)無特別限定。適宜溶劑的例子包括醇(如甲醇或乙醇)與水的混合物或酮(如丙酮或甲基乙基酮)與水的混合物。
反應可在一個較寬的溫度范圍內(nèi)進行，盡管優(yōu)選溫度可隨起始物和堿的性質(zhì)以及溶劑的性質(zhì)不同而變化，但精確的反應溫度并非本發(fā)明的關(guān)鍵。通常我們發(fā)現(xiàn)在0℃～40℃(優(yōu)選5℃～30℃)的溫度下很容易進行上述反應。
反應所需時間也可隨許多因素的不同而有很大的變化，特別是反應溫度以及所用起始化合物、堿和溶劑的性質(zhì)。然而，假如反應是在上述優(yōu)選條件下進行，那么足夠的反應時間通常為3小時～5天，優(yōu)選為3小時～2天。
反應完成后，可利用常規(guī)技術(shù)從反應混合物中萃取并純化通式(Ⅰ)的化合物。適宜技術(shù)的例子包括用減壓蒸餾法除去易與水混溶的溶劑(如丙酮)，接著用有機溶劑(如乙酸乙酯)萃取所得的水層，然后進一步分餾和純化水層，例如用一種Cosmosil(注冊商標)空心柱。
生物活性。
下面的測定證明了本發(fā)明化合物作為血小板生成劑的活性。本發(fā)明所用的“血小板生成劑”意指給藥后能在體內(nèi)誘導血小板產(chǎn)生的藥劑以及可用于治療各種原因(如免疫異常和癌癥化療或放療后的不良反應)引起的血小板減少的藥劑。
實驗1經(jīng)靜脈注射Leustroducsin H后在小鼠體內(nèi)增強血小板的生成。
可以利用Ishibashi等人的方法(Blood 74，1241-1244，1989)測定本發(fā)明化合物的血小板生成活性。
更具體地說，將待測的本發(fā)明的化合物溶解于1.25%(體積)含水乙醇的生理鹽溶液中。該混合物的樣品在5天的實驗期中以24小時的間隔經(jīng)靜脈注射給G57BL小鼠(雌性，每只7周齡)。對照鼠只注射1.25%(體積)含水乙醇的生理鹽溶液。最后一次注射后72小時，從動物眼眶采集血樣，并計算樣品中血小板的數(shù)目。測定是借助電阻法利用一個自動血細胞計數(shù)器(K-1000，Toa-Iyo Denshi Co.)進行，所得結(jié)果列于表1中。
表1化合物劑量(mg/kg)實驗周期血小板計數(shù)(×104/μl)對照 0 5 93.31±6.34*Leustroducsin H0.055130.08±1.670.15125.71±6.600.55121.18±9.2215127.70±3.34＊＝均數(shù)±標準差上述的精確反應條件并不是確定血小板計數(shù)所必需的，還可包括各種變化，例如實驗所用動物、給藥方式和總的實驗時間及給藥的周期。因此，例如測試的動物可以是大鼠、小鼠、狗或猴，并且/或者待測的化合物可經(jīng)腸道外、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射給藥。
實驗2毒性研究給BALB/C小鼠靜脈注射Leustroducsin H(4mg/kg)。10天后未觀察到死亡。
從上述兩個實驗結(jié)果可以清楚地看到，本發(fā)明的Leustroducsin H在體內(nèi)顯示優(yōu)良的生血小板活性和低毒性，因此它可用作治療各種原因，特別是免疫異常或癌癥化療或放療后的不良反應所致的血小板減少癥的治療劑。
為此目的，通式(Ⅰ)的化合物可以片劑、膠囊、顆粒、粉劑或糖漿的形式口服，或通過靜脈、皮下或肌內(nèi)注射、栓劑等經(jīng)胃腸外途徑給藥。這些藥用制劑可將本發(fā)明的化合物與一種或多種佐劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、矯正劑、稀釋劑等一起混合制備。所說的佐劑例如賦形劑，其中又如有機賦形劑，包括糖的衍生物(如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇或山梨糖醇)、淀粉衍生物(如玉米淀粉、土豆泥、α-淀粉、糊精或羧甲基淀粉)、纖維素衍生物(如晶狀纖維素、低級羥丙基取代的纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣或內(nèi)橋式羧甲基纖維素鈉)、阿拉伯膠、葡聚糖和支鏈淀粉;無機賦形劑，包括硅酸鹽(如輕質(zhì)硅酸酐、合成硅酸鋁、或偏硅酸鋁鎂)、磷酸鹽(如磷酸鈣)、碳酸鹽(如碳酸鈣)和硫酸鹽(如硫酸鈣)。所說的潤滑劑例如硬脂酸金屬鹽(如硬脂酸、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂)、滑石、膠體二氧化硅、蠟(如蜂蠟或鯨蠟)、硼酸、己二酸、硫酸鹽(如硫酸鈉)、乙二醇、富馬酸、苯甲酸鈉、DL-亮氨酸、脂肪酸鈉鹽、十二烷基硫酸鹽(如十二烷基硫酸鈉或十二烷基硫酸鎂)、硅酸鹽(如硅酸酐或硅酸水合物)以及上述淀粉衍生物。所說的粘合劑例如聚乙烯吡啶酮、聚乙二醇及類似于上述賦形劑的化合物。所說的崩解劑例如類似于上述賦形劑的化合物以及經(jīng)化學改性的淀粉纖維素(如焦連羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉或橋連聚乙烯吡咯烷酮)。所說的穩(wěn)定劑例如對羥基苯甲酸酯(如羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯)、醇類(如氯代丁醇、苯甲醇或苯乙醇)、氯芐烷銨、酚類(如苯酚或甲酚)、乙基汞硫代水楊酸鈉、脫氫乙酸和山梨酸。所說的矯正劑例如那些常規(guī)使用的增甜劑、醋或香料等。
所用劑量根據(jù)病人的狀況和年齡的不同以及給藥途徑和類型的不同而變化，但是，例如本發(fā)明的化合物可以日劑量0.01-10mg/kg(優(yōu)選為0.01-1mg/kg)給藥，每日一次或分次給藥。
本發(fā)明的某些化合物的制備將通過下面的實施例做進一步說明。隨后的制備過程將說明如何制備用于本發(fā)明這些實施例中的某些起始物。
實施例15.16g粗品油狀物(由下述的制備方法1步驟B獲得)溶于130ml丙酮中。然后加入1400ml 0.05M磷酸鹽緩沖液(NaH2PO4/Na2HPO4，pH6.7)，并攪拌所得的混合物。向混合物中加入807mg豬肝酯酶(PLE，Product of Amano Pharm.Co.，Ltd.)，然后在35℃下攪拌混合物。起始物在高效液相色譜上有8.8分鐘的保留時間，因而可用色譜技術(shù)監(jiān)測其反應過程。在兩周內(nèi)將PLE于35℃以0.82g、1.52g、1.02g和0.9g的量加至混合物中，并將所得的混合物攪拌兩周。攪拌結(jié)束后，利用Celite(注冊商標)助濾劑過濾反應液，以除去PLE。然后用乙酸乙酯萃取濾液，所得的水層通過400g Cosmosil75C18-OPN(注冊商標，Nakaraitesque Inc.)柱色譜用含水甲醇作為洗脫劑分餾并純化，得到1.73g Leustroducsin H。
在下列條件下進行高效液相色譜處理柱Cosmosil 5C18-ARTM4.6×250mm;
(Nakaraitesque Inc.產(chǎn)品)洗脫溶劑20%(體積)乙腈0.5%(體積)三乙胺79.5%(體積)磷酸鹽緩沖液(pH3.0);
流速1.0ml/分;
波長230nm。
快原子轟擊質(zhì)譜M/Z＝530(m+1)，528(m-1)核磁共振譜(270MHz，D2O)δppm7.02(1H，dd，J＝5.4&9.8Hz);
6.21(1H，dd，J＝11.7&20.5Hz);
6.12(1H，dd，J＝12.2&20.5Hz);
5.93-5.84(2H，m);
5.71(1H，d，J＝16.6Hz);
5.32-5.25(2H，m);
3.94(1H，dt，J＝3.4&10.3Hz);
3.48(1H，m);
2.93(2H，t，J＝7.8Hz);
2.53-2.40(2H，m);
2.03(1H，m);
1.80-0.73(13H，m);
0.73(3H，t，J＝7.8Hz)。
實施例2將上述通式(Ⅱ)中Z代表4-甲基己酰基的化合物[如下文制備方法1步驟B所述而制得]20mg溶解于少量甲醇中。所得的溶液用磷酸鹽緩沖液(pH6.7)稀釋后再加入10mgPLE(Amano Pharm.Co.，Ltd)，將混合物于30℃攪拌6天。攪拌結(jié)束后，過濾反應液。通過減壓蒸餾由濾液中除去殘留甲醇，所得的水溶液通過C18-Cosmosil柱用含水甲醇作洗脫液分餾并純化。用20%(體積)含水甲醇洗脫的餾分可得13mg化合物，它顯示出與上述實施例1所得化合物相同的物理性質(zhì)。
實施例3由50mg上述通式(Ⅱ)中Z代表5-甲基己酰基的化合物[如下文制備方法1步驟B所述而制得]，用類似于上述實施例2中所述的方法得到30mg LeustroducsinH。
用類似于上述實施例2所述的方法還可以由通式(Ⅱ)中Z代表下列基團的化合物制備具有實施例1所述特性的LeustroducsinH。起始物的量及本發(fā)明化合物的產(chǎn)量記錄如下表2實施例號Z起始物量產(chǎn)量4異丁?；?0mg14mg5異戊酰基20mg14mg62-甲基丁?；?0mg10mg7環(huán)己烷羰基20mg8mg實施例8將通式(Ⅱ)中Z代表6-甲基庚?；幕衔颷如下文制備方法1步驟B所述而制得]20mg溶解于少量含水甲醇。然后向混合物中加入碳酸氫鈉飽和水溶液，并將所得溶液攪拌一天。攪拌結(jié)束后，加入適量鹽酸液調(diào)節(jié)反應液的pH值至2，所得的混合物通過Cosmosil C18柱分餾并純化，得到3mgLeustroducsin H。
制備方法1起始化合物的培養(yǎng)和分離1(A)微生物培養(yǎng)取一鉑金環(huán)普拉特鏈霉菌SANK60191(FERM BP-3288)孢子接種入用擋板固定并含有100ml預先滅菌的培養(yǎng)基(所含成分描述如下)的500ml Erlenmeyer燒瓶中，在28℃下用一旋轉(zhuǎn)搖床于200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑為7cm)培養(yǎng)微生物3天。
培養(yǎng)基可溶性淀粉30g粗制酵母10g大豆粉7g魚粉(Fish meal) 5g玉米浸液2g肉提取物1g碳酸鈣1g加水至1000mlpH7(滅菌前)將15升培養(yǎng)基(與用于種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基相同)分別裝入四個30升的不銹鋼瓶式發(fā)酵罐中，并加熱至120℃維持30分鐘進行滅菌。然后加入150ml如上所述制備的種子培養(yǎng)液。在攪拌的同時以空氣流速15升/分的通氣條件下28℃培養(yǎng)上述混合物3天。為保證培養(yǎng)液中氧濃度維持在5ppm，攪拌速度自動控制于100-300rpm范圍內(nèi)。
1(B)分離將2.4kgCelite545(注冊商標，Johns &Manville Project Corporation，USA)作為助濾劑加至上述1(A)所述獲得的60升培養(yǎng)液中，過濾混合物，得到7.2kg細菌細胞。所得細胞用30升50%(體積)含水丙酮萃取一次，20升80%(體積)含水丙酮萃取兩次。將這些萃取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去有機溶劑。殘余物中加入足量的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)其pH值為2.0，然后分別用10升乙酸乙酯萃取混合物兩次。合并萃取液，加入10升1%(重量/體積)碳酸氫鈉水溶液?；钚圆糠洲D(zhuǎn)移到水層，除去乙酸乙酯層。該乙酸乙酯層再用5升1%(重量/體積)碳酸氫鈉水溶液萃取。合并碳酸氫鈉溶液，加入鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為2.0。該溶液用10升乙酸乙酯萃取兩次。合并有機萃取液，先用水再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。在連續(xù)加入甲醇的過程中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下將溶液濃縮，得到10ml油狀物。將該油狀物溶解于100ml60%(體積)含水甲醇中，所得溶液在Sep-Pak Vac 20cc C18Cartridges(商標名，Waters Co.USA)上被吸附，用30ml60%(體積)含水甲醇洗脫雜質(zhì)。然后用15ml 100%甲醇洗脫Leustroducsin，濃縮洗脫液得到800mg油狀物。該油狀物可不經(jīng)進一步純化而直接用于上述實施例1中。為了進行純化，可將該油狀物溶解于10ml甲醇中，經(jīng)高效液相色譜處理，收集在13分鐘、19分鐘和24分鐘附近顯示出峰的餾分，并分別稱為“粗餾分A”、“粗餾分B”和“粗餾分C”。
色譜所用條件如下
制備液相色譜柱Radial-Pak25×10(Waters，USA)洗脫溶劑50%(體積)含水乙腈，含0.5%三乙胺-磷酸鹽緩沖液，pH3.0。
流速9ml/分波長230nm。
上述峰的餾分被濃縮后，將所得餾分經(jīng)制備高效液相色譜處理。粗餾分A在下列條件下進行制備色譜并收集53和56分鐘附近峰的餾分，然后用Sep-Pak脫鹽和濃縮，得到22.03mg通式(Ⅱ)中Z代表4-甲基己?；幕衔锖?1.66mgLeustroducsin A。
粗餾分A的制備條件柱Cosmosil 5C18-AR20×250mm;
(Nakaraitesque Inc.)洗脫溶劑42%(體積)含水乙腈，含0.5%三乙胺-磷酸鹽緩沖液，pH3.0;
流速9ml/分波長230nm。
粗餾分B在下列條件下進行制備色譜處理，收集74分鐘、79分鐘和82分鐘附近出峰的餾分，用Sep-Pak脫鹽和濃縮，得到26.16mg通式(Ⅱ)中Z代表6-甲基庚?；幕衔?、23.24mg通式(Ⅱ)中Z代表環(huán)己基乙基羰基的化合物和3.24mg通式(Ⅱ)中Z代表辛?；幕衔?。
粗餾分B的制備條件柱Cosmosil 5C18-AR20×250mm;
(Nakaraitesque Inc.)洗脫溶劑47%(體積)含水乙腈，含0.5%三乙胺-磷酸鹽緩沖液，pH3.0;
流速9ml/分;
波長230nm。
粗餾分C在下列條件下進行制備色譜處理，收集47分鐘和51分鐘附近出峰的餾分。用Sep-Pak脫鹽和濃縮，得到9.83mgLeustroducsinB和5.22mg Leustroducsin C。
粗餾分C的制備條件柱Cosmosil 5C18-AR20×250mm;
(Nakaraitesque Inc.)洗脫溶劑47%(體積)含水乙腈，含0.5%三乙胺-磷酸鹽緩沖液，pH3.0;
流速9ml/分;
波長230nm。
制備方法2起始化合物的培養(yǎng)和分離根據(jù)EP329，361中所述方法培養(yǎng)普拉特鏈霉菌SAM-0654(FERM BP-1668)，并從培養(yǎng)物肉湯中分離通式(Ⅱ)中Z分別代表丁?；?、異丁?；愇祯；?、2-甲基丁?；?、環(huán)己烷羰基、4-甲基己?；?、6-甲基庚?；?、環(huán)己基乙基羰基和辛酰基的化合物。
配方1膠囊制劑Leustroducsin H100mg乳糖100mg玉米淀粉148.8mg硬脂酸鎂1.2mg總計350mg將上述成分混合，所得粉末過20目篩(Tyler standard)，然后填入膠囊中。
權(quán)利要求
1.通式(Ⅰ)的化合物及其藥用鹽。
2.含有與藥用稀釋劑或載體混合的如權(quán)利要求1的通式(Ⅰ)化合物或其藥用鹽的藥物組合物。
3.治療或預防血小板減少的方法，包括給患有或易患血小板減少的哺乳動物(可以是人類)施用有效量的如權(quán)利要求1的通式(Ⅰ)化合物或其藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開名為LeustroducsinH并具有通式(I)的新化合物及其藥用鹽。該化合物可以通過水解天然存在的Leustroducsin而制備，并可用于治療或預防血小板減少。
文檔編號A61P7/00GK1105027SQ9410462
公開日1995年7月12日 申請日期1994年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月23日
發(fā)明者杉村征夫, 柴田智之, 玉木和彥, 栗原伸和, 古濱孝文, 白石明郎, 小林知雄, 笹川和彥, 島崎尚美 申請人:三共株式會社