專利名稱：腦蛋白水解液—腦樂注射液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從動(dòng)物、特別是豬腦中提取腦蛋白水解物一腦樂的方法，本發(fā)明還涉及所述腦蛋白水解物的注射液及其制備方法。
腦蛋白水解物最早由奧地利EBEWE藥廠以Cerebrolysin為商品名出售，其中含有多種人體必需的氨基酸以及非必需氨基酸，并且含有分子量為10，000或更低的肽。盡管其應(yīng)用早已公開(參見EP452299等)，但是其提取方法至今未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種從動(dòng)物腦、尤其是豬腦中提取腦蛋白水解物(下文簡(jiǎn)稱為“腦樂”)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備腦樂注射液的方法。
下文將詳細(xì)說明本發(fā)明的目的。


圖1概括了腦樂的提取方法及制備成注射液的方法；圖2為進(jìn)口腦活素注射液對(duì)照品肽含量HPLC色譜圖；圖3為進(jìn)口腦活素201468肽含量HPLC色譜圖；圖4為進(jìn)口腦活素901724肽含量HPLC色譜圖；圖5為進(jìn)口腦活素912950肽含量HPLC色譜圖6為腦樂注射液930401肽含量HPLC色譜圖；圖7為腦樂注射液930402肽含量HPLC色譜圖；圖8為腦樂注射液930403肽含量HPLC色譜圖；圖9為腦活素肽Ⅱ(MW5270)純品HPLC色譜圖；圖10為腦活素肽Ⅰ(MW1770)純品HPLC色譜圖。
本文所述的腦樂注射液是通過以下過程制備的(1)勻漿將新鮮豬腦去腦膜脂肪，剪成小塊，于勻漿機(jī)中勻漿，重復(fù)一次，得腦勻漿液；(2)脫脂將腦勻漿液倒入帶蓋缸中，邊攪拌邊加入冷丙酮，然后于4℃放置4小時(shí)后，傾去上清液，重復(fù)2-3次，將沉淀物倒入瓷盤中，置通風(fēng)櫥吹干，研磨成粉，過篩，得脫脂干腦粉；(3)水解取干腦粉，加酶液，置37℃水浴保溫8小時(shí)，然后離心，棄去沉淀物，得到水解液；(4)濃縮將水解液用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器濃縮；(5)離心濃縮液用冷凍、高速、大容量離心機(jī)離心(10000-20000rpm)，取上清液；(6)超濾離心后的上清液經(jīng)超濾器一萬分子量截留膜超濾，得到棕黃色澄明溶液；
(7)精制將超濾后的溶液經(jīng)DEAE-SephadexA-25柱色譜分離，用Tris-HCl緩沖液和含NaCl的緩沖液洗脫，用紫外分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)，并收集各主峰餾分，得精制清液；(8)滅菌將所得精制清液滅菌，得無菌注射液。
實(shí)施例取新鮮豬腦，去腦膜脂肪，剪成小塊，于勻漿機(jī)中兩次勻漿。將勻漿液倒入帶蓋缸中，邊攪拌邊加入冷丙酮，然后于4℃放置4小時(shí)，傾去上清液，重復(fù)此過程兩次。將沉淀物倒入瓷盤中，置通風(fēng)櫥中吹干，研磨成粉，過篩，得脫脂干腦粉。向干腦粉中加入酶液，于37℃水浴中保溫8小時(shí)，然后離心，棄去沉淀，得水解液。用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器濃縮水解液。將濃縮液于冷凍、高速、大容量離心機(jī)上離心(15000rpm)，取上清液。將離心后的上清液經(jīng)超濾器一萬分子量截留膜超濾，得棕黃色澄明溶液。所得溶液經(jīng)DEAE-SephadexA-25柱色譜分離，方法如下(1)配制Tris-HCl緩沖液，作為基礎(chǔ)緩沖液；向部分基礎(chǔ)緩沖液中加入NaCl，作為洗脫液。
(2)裝DEAE-SephadexA-25柱(5×120cm)，DEAE-SephadexA-25預(yù)先用Tris-HCl基礎(chǔ)緩沖液浸泡1-2天，裝柱后用基礎(chǔ)緩沖液平衡。
(3)將超濾完的溶液用吸管緩緩加入層析柱的上面，待樣品滲入膠中加少許基礎(chǔ)緩沖液，然后封柱，啟動(dòng)恒流泵，控制流速為60ml/小時(shí)，每次上樣6克。
(4)用洗脫液與基礎(chǔ)緩沖液，在梯度儀容量瓶中進(jìn)行梯度洗脫。
(5)流出液經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定并繪出光密度與管數(shù)的吸收曲線，收集各主峰餾分。
(6)經(jīng)HPLC凝膠柱分離該樣品的肽成分，得到國(guó)內(nèi)外均未報(bào)道的二個(gè)肽成分，其含量超過90%。所得餾分經(jīng)滅菌制成無菌注射液。分析方法如下一、樣品奧地利依比威大藥廠批號(hào)901724，912950。
本研制樣品批號(hào)930401，930402，930403。
中國(guó)藥品生物制品檢定所生化藥品室腦活素肽Ⅰ及肽ⅡHPLC純標(biāo)準(zhǔn)品二、方法HPLC凝膠過濾法1、試劑磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、異丙醇。
2、儀器WatersHPLC，510型泵，481型檢測(cè)器、740型數(shù)據(jù)處理器。
3、色譜分析條件流動(dòng)相為0.1M(PH=7)的磷酸鹽緩沖液，流速0.3ml/分；凝膠柱柱溫30℃±0.1，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
4、操作方法取待測(cè)樣品10ul，進(jìn)樣，記錄分析結(jié)果，計(jì)算出肽的百分比含量。
三、結(jié)果1、進(jìn)口腦活素注射液與本研制品肽成分分析的HPLC色譜圖；(1)、腦蛋白水解物中肽Ⅰ和肽Ⅱ的HPLC純品的色譜圖；(2)、進(jìn)口腦活素(見圖)901724批，912950批；(3)、本研制品腦樂注射液(見圖)930401，930402，930403批。
2、HPLC分析進(jìn)口腦活素和本研制品腦樂注射液肽成分的百分含量和保留時(shí)間的數(shù)理統(tǒng)計(jì)。
表1肽Ⅰ和肽Ⅱ的HPLC保留時(shí)間與含量的數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果
表2肽總量與其比值的結(jié)果 小結(jié)1、用HPLC凝膠柱Protein60分離腦活素或腦樂注射液中的肽成分。得二個(gè)主成分肽Ⅰ和肽Ⅱ。本制品所得肽Ⅰ和肽Ⅱ與進(jìn)口樣肽Ⅰ和肽Ⅱ其保留時(shí)間一致。亦與HPLC純的肽Ⅰ和肽Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品相一致。說明本研制品與標(biāo)準(zhǔn)品、國(guó)外同類樣品其肽Ⅰ和肽Ⅱ成分相同。(見色譜圖與表1)。
2、進(jìn)口腦活素中肽Ⅰ其百分含量為12.86～15.59，肽Ⅱ其百分含量為63.19～65.83。
本研制品中肽Ⅰ其百分含量為18.11～18.29，肽Ⅱ其百分含量為74.00～74.33。
結(jié)果說明本研制品的主要成分不但成分與進(jìn)口樣品相同，且含量與純度高于同類進(jìn)口樣品。(見表1)。
3、進(jìn)口腦活素肽的總含量為77.38～79.66%，其肽Ⅰ/肽Ⅱ比值0.20～0.24。本研制品肽的總含量為92.11～92.62%，其肽Ⅰ/肽Ⅱ比值為0.25。(見表2)。
結(jié)果得出本研制品主要成分肽的總含量已超過國(guó)外產(chǎn)品。
對(duì)腦樂注射液和進(jìn)口樣品腦活素注射液進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其游離氨基酸的結(jié)果十分一致。分析結(jié)果見下表3
表3進(jìn)口腦活素和本研制品腦樂注射液的游離氨基酸分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.腦樂注射液的制備方法，其特征在于(1)將動(dòng)物腦勻漿，(2)用丙酮脫脂，干燥，研成粉末，過篩，(3)向干粉中加酶液于37℃保溫8小時(shí)后離心，棄去沉淀物，得水解液，(4)濃縮水解液，(5)以10000-20000rpm在冷凍、高速、大容量離心機(jī)上離心濃縮液，取上清液經(jīng)超濾器一萬分子量截留超濾，(6)超濾后的溶液經(jīng)DEAE-SephadexA-25柱色譜分離，收集主峰餾分，得精制清液，(7)將精制清液滅菌，得無菌注射液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從動(dòng)物腦、特別是豬腦中提取腦蛋白水解物——腦樂的方法，本發(fā)明還提供了所述腦蛋白水解物的注射液及其制備方法。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1110915SQ9410451
公開日1995年11月1日 申請(qǐng)日期1994年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月26日
發(fā)明者徐康森, 朱炯, 孫磊, 楊昭鵬, 滕毓敏 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心